Organes sensoriels

240 rats vont être utilisés, tous tués après le dernier test pour récupérer leurs pattes, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Sous anesthésie, 180 d'entre eux subissent une incision de la plante de la patte, puis tous passent jusqu'à six tests plantaires où l'équipe mesure leur temps de réaction à un stimulus de chaleur. Le but est de savoir si la mycolactone, toxine produite par la bactérie M. ulcerans, soulage la douleur postopératoire, et 60 rats incisés ne reçoivent aucun traitement, groupe chez qui le porteur attend une douleur modérée. Il écrit que "Le bien-être animal a été une des priorités dans la conception de cette étude".

Objectifs

Notre équipe travaille sur les propriétés analgésiques de la mycolactone, toxine produite par M. ulcerans. Nous avons démontré par des approches in vivo que la mycolactone induisait une hypoesthésie locale pendant plus de 24h après son inoculation en ciblant AT2R. Cette fixation permet l’activation d’une voie cellulaire permettant l’ouverture des canaux potassiques de la famille TRAAK. L’ouverture de ces canaux permet une fuite de potassium provoquant une hyperpolarisation cellulaire, empêchant la diffusion de l’influx nerveux par les cellules nerveuses. Jusqu’à maintenant, l’activité analgésique de la mycolactone n’avait été évaluée au laboratoire que sur des modèles de rats ne présentant pas de douleur. L’utilisation de ces modèles a d’ores et déjà permis de démontrer que la mycolactone présente des propriétés analgésiques supérieures à la morphine. De plus, nous avons pu augmenter son pouvoir analgésique en l’encapsulant dans des nanocapsules. Dans ce contexte, notre objectif est de déterminer si la mycolactone pourrait être utilisée comme analgésique local (en raison de sa faible diffusion après inoculation) dans des modèles de « douleur ». Compte tenu de son effet analgésique durable (entre 24 et 48 h après une injection unique en sous cutanée) et de sa faible diffusion dans l’organisme, la mycolactone pourrait présenter un intérêt pour traiter les douleurs post opératoires. Ainsi nous proposons d’évaluer l’effet analgésique de la mycolactone dans un modèle pertinent de douleur postopératoire

Bénéfices attendus

Nos résultats antérieurs ont montré que la mycolactone présentait des propriétés analgésiques lorsqu’elle était administrée par injection en sous cutanée chez des rats naïfs. Parallèlement, nos collaborateurs ont montré l’effet analgésique de la mycolactone dans le traitement de la douleur induite par des neuropathies (modèle de ligature du nerf sciatique). Compte tenu de l’ensemble des résultats positifs obtenus ces derniers mois, il nous semble judicieux d’évaluer les propriétés analgésiques de la mycolactone dans le traitement des douleurs post-opératoires. Ce projet se justifie puisque l’arsenal thérapeutique contre les douleurs reste limité.

Procédures

Les animaux seront répartis en 4 groupes de 60 animaux chacun (soit 240 animaux au total) : - sans incision - avec incision non traité - avec incision traité par un anesthésique de référence pour le traitement des douleurs post-opératoires (bupivacaïne). - avec incision traité par la mycolactone Incision plantaire, réalisée une seule fois. Geste réalisé sous anesthésie gazeuse. La durée de ce geste est d’environ 5 à 10 minutes. Les animaux concernés sont au nombre de 180 (Procédure 2 + 3 + 4). Les 60 animaux restants subiront tout le geste technique (anesthésie, désinfection de la patte) mais sans l’incision. Traitement : Injection à proximité du nerf sciatique, réalisée une seule fois. Geste réalisé sous anesthésie gazeuse 24 heures après l’incision. La durée de l’injection est rapide (

Impact sur les animaux

Suite à l’incision, il est attendu une douleur modérée, tout particulièrement chez les animaux non traités. Plusieurs indicateurs seront suivis : - L’induction d’une sensibilité excessive que nous détecterons lors des tests plantaires par un temps de réaction au stimulus chaleur réduit par rapport aux rats non incisés. - L’induction d’une modification de la démarche (telle qu’un boitement). - Un changement du comportement les 24 premières heures. De plus, malgré nos précautions, une surinfection (gonflement du coussinet, changement du comportement accentué de l’animal) de l’incision n’est pas à exclure. L’inoculation de la mycolactone ou de la bupivacaïne pourrait entraîner les effets suivants : -Surinfection au site d’inoculation (gonflement du coussinet, rougeur, changement de comportement marqué de l’animal) - Inflammation due aux propriétés pro-inflammatoires de la mycolactone - Altération de la démarche (boitement ou gêne locomotrice)

Devenir

A la suite du dernier test plantaire, tous les animaux seront mis à mort et les pattes seront récupérées pour des études histologiques.

Remplacement

Le bien-être animal a été une des priorités dans la conception de cette étude mais nous ne pouvons à ce stade nous passer d'utiliser des animaux. En effet, la phase réalisée chez les animaux permettra de valider l’effet de la mycolactone dans le traitement de douleurs post opératoires dans un système biologique complexe où de nombreux facteurs peuvent intervenir (disponibilité du composé, dégradation, capacité du composé à atteindre sa cible...). De plus, cette phase est obligatoire pour le développement d’analgésique destiné à la santé humaine et animale.

Réduction

Le nombre d’animaux prévu pour cette étude est suffisant pour que les résultats soient statistiquement significatifs sans pour autant exagérer ce nombre. Afin de valider des différences statistiques, les groupes seront composés de 6 rats et un test statistique 2-way ANOVA sera réalisé. Si l’analyse des résultats montre l’absence d’effet analgésique de la part de la dose de mycolactone utilisée, ou souligne des effets secondaires (non rapportés à ce jour dans nos travaux précédents), les expériences ne se poursuivront pas pour cette dose. Cependant, si les résultats montrent un effet analgésique sans effet indésirable, alors l’expérience sera répétée une seconde fois indépendamment pour accroître la qualité de nos résultats. Ce préalable est indispensable pour la poursuite de notre étude, qui vise à réaliser une étude dans un modèle animal plus complexe.

Raffinement

Afin de raffiner les conditions de vie des rats, un suivi adapté des animaux a été instauré afin de réduire, supprimer ou soulager l'inconfort, mais aussi la détresse ou l'angoisse qu'elles pourraient éprouver. Les animaux sont hébergés en groupes sociaux et bénéficient d’un enrichissement adapté. Un suivi régulier sera effectué sur l'ensemble des animaux et des indicateurs comportementaux et physiques sont prédéfinis et constituent les points limites. Pour éviter toute souffrance ou stress lors du protocole expérimental, un anesthésique volatil (isoflurane) sera utilisé. La procédure d’incision sera d’abord pratiquée sur des cadavres pour s’entrainer à maitriser et calibrer l’incision avant de démarrer le protocole sur animaux vivants. Cet entrainement permettra de réaliser la procédure efficacement et rapidement pour éviter toute souffrance ou stress inutile aux animaux et diminuer le temps d’anesthésie générale. La dose de mycolactone maximale sera 4 μg car nos travaux précédents montrent qu’au-delà de cette dose il y a un risque de lésions tissulaires et d’inflammation. Lors de chaque expérience, les données des tests plantaires seront analysées au fur et à mesure et les tests seront arrêtés si à 6h aucun effet analgésique n’est observé de la part de la dose de mycolactone testée. Si un effet analgésique apparait, les tests se poursuivront jusqu’à ce que l’effet disparaisse, c’est-à-dire lorsque le temps de réaction au test plantaire des rats ayant reçu la mycolactone sera de nouveau identique à celui des rats du groupe témoin incisé non traité (arbre décisionnel en annexe). De plus, pour le groupe de rats ayant reçu la bupivacaïne(anti-douleur de référence pour le traitement des douleurs post-opératoires, un test sera réalisé 30 min après l’injection puis les animaux seront mis à mort (il a été montré par nos collaborateurs que l’effet est maximal jusqu’à 30 min après injection et disparait après 1 heure). Nous testerons les doses dans l’ordre décroissant, dès qu’une dose n’aura pas d’effet analgésique, nous arrêterons nos expérimentations et ne testerons pas les autres doses. Ce projet s’inscrit ainsi dans une gestion éthique de l’expérimentation animale et, est donc en accord avec les réglementations européennes et françaises de bonnes pratiques de laboratoire.

Choix des espèces

De nombreuses études visant à identifier de nouveaux analgésiques pour la prise en charge de la douleur postopératoire utilisent « l’espèce rat ». En effet, le modèle de Brennan est le modèle de référence pour évaluer des analgésiques sur la douleur postopératoire. Les animaux utilisés pour ce protocole devront, à l’initiation de l’expérimentation, être âgés de 6 semaines afin d’être homogène avec les autres partenaires du consortium.

Vouées à être mises à mort pour des études histologiques, biochimiques et génétiques, 8 160 souris mutantes et témoins vont être produites, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Chacune subit plusieurs contentions, une biopsie et trois à quatre injections, les souris porteuses de la mutation pouvant présenter une perte de poids et une posture anormale. Le bénéfice annoncé tient en une phrase, augmenter la connaissance sur les mécanismes moléculaires du développement de cellules que le résumé ne nomme pas. Rien n'appuie l'effectif de 8 160 souris au-delà de stratégies d'accouplement calculées d'après des expériences antérieures et d'un nombre déclaré "réduit à son minimum".

Objectifs

La quasi-totalité des cellules qui pigmentent la peau, des cellules du système nerveux sont issus d’une structure bien spécialisée dans l’embryon. Une anomalie de développement ou de maintien de cette structure conduisent à des maladies chez l’homme, dont les causes sont incomplètement caractérisées. Grace à la génération des modèles de souris génétiquement modifiées, le projet permettra de déterminer le rôle d’un nouveau mécanisme moléculaire à l'origine de ces maladies.

Bénéfices attendus

Le principal bénéfice attendu du projet est d’augmenter la connaissance scientifique sur les mécanismes moléculaires impliqués au cours du développement des cellules d’intérêt.

Procédures

Plusieurs contentions, une biopsie (quelques secondes), des injections (entre 3 et 4 ; environ 5 sec) seront réalisées.

Impact sur les animaux

La contention et la biopsie peuvent provoquer un stress chez l’animal. La biopsie peut provoquer une légère douleur. Les différentes injections entraineront un stress et une douleur légère au point d’injection (chaque injection dure environ 5 sec). Les souris mutantes pourront présenter une perte de poids et une posture anormale.

Devenir

L'ensemble des animaux mutants et contrôles générés sont voués à être mis à mort pour études histologiques biochimique et génétique.

Remplacement

Le recours à l’utilisation d’un modèle animal est indispensable afin de comprendre comment les mutations d’intérêts impactent le développement des cellules d’intérêt, en particulier les cellules qui pigmentent la peau et les cellules du système nerveux. L'étude des mécanismes impliqués ne peut pas être réalisée uniquement en culture car elle nécessite des interactions entre les différents types cellulaires et doivent être mesurés chez l'animal.

Réduction

Les stratégies d’accouplements ont été calculées selon des expériences antérieures pour générer un nombre suffisant d’animaux pour réaliser au mieux nos expériences. Le nombre de souris est réduit à son minimum. Des tissus seront collectés après mise à mort afin d’approfondir les études moléculaires, cellulaires et génétiques. Chaque souris génèrera donc de nombreuses informations.

Raffinement

Les points limites définis dans le projet seront strictement appliqués et la douleur sera limitée à son maximum. Une grille de score adaptée à la procédure a été mise en place. Pour limiter les nuisances/effets indésirables dues aux injections une aiguille fine sera utilisée.

Choix des espèces

Les mécanismes impliqués dans la formation des cellules qui pigmentent la peau, des neurones et des cellules gliales sont très conservés entre l'homme et la souris. En particulier, les phénotypes observés dans ces cellules après délétion d’un grand nombre de gènes sont très similaires dans les deux espèces. De plus, il existe un ensemble d’outils nécessaires à l’étude de ces cellules qui ont été développés quasiment exclusivement chez la souris. Les stades choisis (jour 18.5 de développement embryonnaire, naissance, jour 4, jour 30) pour l’étude correspondent à des phases précises de leur développement.

18 360 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures d'un niveau de souffrance léger à modéré. Les interventions prévues vont du gavage quotidien pendant quatorze jours à l'irradiation aux rayons X suivie d'une greffe de moelle osseuse, en passant par l'inoculation intranasale du virus de la grippe, l'injection de cellules cancéreuses et jusqu'à vingt-quatre séances d'imagerie par animal. Les tumeurs pulmonaires ou sous-cutanées qui en résultent provoquent une perte de poids, une baisse d'activité et une gêne respiratoire croissante, et toute souris perdant plus de 20 % de son poids est mise à mort. L'objectif reste la connaissance fondamentale du rôle de séquences virales anciennes intégrées au génome, et le porteur présente l'effectif de 18 360 comme minimal au terme d'analyses de puissance dont aucun résultat n'apparaît.

Objectifs

L’objectif de ce projet est de mieux comprendre comment certaines molécules (rétroéléments endogènes, séquences génétiques issues d’anciens virus, intégrées naturellement dans notre génome lors d’infections passées, et généralement inactives) modulent les réponses immunitaires. Ces séquences peuvent être réactivées dans des cellules infectées ou cancéreuses et produire des signaux capables d’alerter le système immunitaire et d’activer les défenses naturelles du corps.L’ampleur avec laquelle ces signaux influencent le fonctionnement du système immunitaire et les mécanismes biologiques impliqués restent encore mal compris. Ce projet utilisera un modèle d’infection respiratoire par le virus de la grippe chez la souris. Ce modèle bien caractérisé permet d’étudier l’impact des rétroéléments endogènes sur le système immunitaire dans un contexte où les mécanismes immunitaires impliquées dans la défense contre les virus sont fortement activés. Ce projet poursuivra 3 objectifs principaux : 1. Définir si une infection respiratoire par le virus de la grippe favorise la réactivation des rétroéléments endogènes et étudier les mécanismes par lesquels le système immunitaire détecte cette réactivation. 2. Identifier et caractériser les populations de cellules immunitaires impliquées dans la reconnaissance des rétroéléments endogènes réactivés et dans les réponses immunitaires qui en découlent. 3. Évaluer dans quelle mesure les réponses immunitaires déclenchées par la détection de ces rétroéléments endogènes sont susceptibles d’influence la capacité de l’organisme à limiter l’apparition ou la progression du cancer. En intégrant des modèles d’infection, des approches génétiques et des modèles de cancer chez la souris, ce projet établira un cadre mécanistique reliant infection virale, activation des rétroéléments endogènes et protection immunitaire. Les résultats attendus permettront de faire progresser les connaissances fondamentales sur la manière dont le système immunitaire détecte des signaux de danger internes et sur la façon dont les réponses contre les virus peuvent influencer la protection contre le cancer. Ces découvertes pourraient contribuer au développement d’immunothérapies améliorées ou de stratégies vaccinales exploitant les voies de détection par le système immunitaire des rétroéléments endogènes afin de renforcer la protection contre les infections et le cancer.

Bénéfices attendus

Ce projet générera des connaissances fondamentales sur la manière dont certaines molécules (rétroéléments endogènes) façonnent la fonction immunitaire lors d’infections virales et dans le contexte du cancer. Les rétroéléments endogènes sont des séquences génétiques issues d’anciens virus, intégrées naturellement dans notre génome lors d’infections passées, et généralement inactives. Ces séquences peuvent toutefois être réactivées dans des cellules infectées ou cancéreuses. Comprendre comment ces éléments sont détectés par le système immunitaire et comment ils modulent les défenses naturelles du corps est essentiel pour mieux comprendre les mécanismes qui relient infection et réponse immunitaire contre les virus et contre les tumeurs. En identifiant les cellules et les mécanismes impliqués dans la détection des rétroéléments endogènes, ce projet permettra de mieux connaître comment le système immunitaire intègre des signaux de danger provenant à la fois de microbes pathogènes et du génome de l’organisme hôte. Il permettra également de déterminer si les réponses immunitaires induites lors de l’infection par un virus peuvent influencer la reconnaissance et le contrôle des cellules cancéreuses. Les bénéfices scientifiques attendus sont multiples : - identifier les mécanismes par lesquels la réactivation des rétroéléments endogènes conduit et contribue à l’activation du système immunitaire ; - améliorer les connaissances sur les cellules à l’origine des signaux immunitaires induits par les rétroéléments endogènes ; - mieux comprendre l’impact de la réactivation des rétroéléments endogènes lors d’une infection virale sur la surveillance immunitaire contre les tumeurs et le développement du cancer. Ce projet aura également des retombées biomédicales importantes en améliorant la compréhension du rôle des éléments étudiés dans plusieurs pathologies humaines, notamment les infections virales, les maladies inflammatoires et les cancers. Les connaissances acquises fourniront des bases scientifiques pour le développement de nouvelles stratégies thérapeutiques ou vaccinales exploitant les mécanismes naturels de détection par le système immunitaire pour renforcer les réponses protectrices contre les virus ou pour le contrôle du cancer.

Procédures

- Administration orale par gavage d’un traitement : souris vigiles, quelques secondes, quotidienne pendant 14 jours maximum. - Injection intrapéritonéale (dans la cavité abdominale) d’un produit permettant d’étudier le renouvellement des cellules : souris vigiles, quelques secondes, jusqu’à 4 injections espacées de 24 heures. - Administration intranasale unique d’un virus respiratoire ou de bactérie : souris anesthésiées, quelques secondes. - Administration intranasale unique de molécules mimant une infection virale : souris anesthésiées, quelques secondes. - Injection intrapéritonéale d’un produit bloquant la migration des cellules immunitaires : souris vigiles, quelques secondes, quotidienne pendant 16 jours maximum. - Injection intrapéritonéale d’un produit permettant la déplétion spécifique d’une population de cellules immunitaires : souris vigiles, quelques secondes, jusqu’à 3 injections espacées de 24 heures. - Administration intranasale de ce même produit : souris anesthésiées, quelques secondes, jusqu’à 3 injections espacées de 24 heures. - Exposition à des rayons X : souris vigiles, jusqu’à 2 doses de rayons X espacées de 3-4 heures. - Injection intraveineuse unique de cellules de moelle osseuse : souris anesthésiées, quelques secondes. - Injection intraveineuse unique de cellules cancéreuses : souris anesthésiées, quelques secondes. - Injection intrapéritonéale unique d’anticorps: souris vigiles, quelques secondes. - Injection intranasale unique d’anticorps: souris anesthésiées, quelques secondes. - Injection intrapéritonéale d’anticorps: souris vigiles, quelques secondes, 2 fois par semaine pendant 4 semaines maximum. - Imagerie in vivo : souris anesthésiées, environ 15 min, au maximum 3 fois par semaines pour un nombre maximum de 24 sessions. - Injection sous-cutanée unique de cellules cancéreuses : souris vigiles, 1 min. - Injection intraveineuse unique de cellules immunitaires : souris anesthésiées, quelques secondes. - Prélèvement sanguin: souris vigiles, 1 min, fréquence variable (au maximum 2 fois par semaine pendant 3 semaines maximum ou une fois toutes les 2 semaines pendant 14 semaines maximum). - Injection sous-cutanée préopératoire d’un médicament anti-douleur : souris vigiles, quelques secondes. - Injection sous-cutanée d’un anesthésique local avant incision : souris anesthésiées, quelques secondes. - Prélèvement sanguin terminal par ponction cardiaque : souris anesthésiées.

Impact sur les animaux

Ce projet sera attentif aux 5 libertés individuelles de l’animal. Cependant, certaines procédures décrites dans ce projet peuvent induire divers effets indésirables, dont l’intensité et la durée dépendent de la nature de l’intervention. De manière générale, les effets les plus fréquemment observés sont une douleur et/ou un inconfort de courte durée (quelques secondes) liée à la manipulation et la contention et aux différentes administrations (gavage, injections), ainsi qu’aux prélèvements sanguins. L’administration par la voie nasale du virus de la grippe, du virus respiratoire syncytial ou de la bactérie Streptococcus pneumoniae ne provoque pas de douleur au moment du geste mais peut entraîner, dans les jours suivants, une infection pulmonaire transitoire chez l’animal. Celle-ci peut se manifester par un pelage ébouriffé, une posture voûtée, une diminution de l’appétit, une perte de poids, une baisse d’activité et, dans certains cas, une respiration plus difficile. Ces signes apparaissent généralement entre 2 et 7 jours après l’administration. Une récupération de l’animal est ensuite observée, avec une reprise progressive du poids et de l’activité. Plus rarement, une aggravation de l’état clinique peut être observée. L’administration de cellules cancéreuses, qu’elle soit réalisée sous la peau ou dans la circulation sanguine, conduira au développement de tumeurs au niveau du poumon ou sous la peau, respectivement. Le développement des tumeurs entraînera une altération progressive de l’état général, associée notamment à une perte de poids et une diminution de l’activité. Dans le cas de tumeurs pulmonaires, elles peuvent provoquer à terme une gêne respiratoire croissante. Dans le cas des tumeurs sous la peau, elles peuvent devenir visibles et palpables, entraîner une gêne locale liée à leur volume, une sensibilité de la zone concernée, et parfois une limitation des mouvements selon leur localisation. L’irradiation des souris suivie de la transplantation de moelle osseuse peut provoquer une faiblesse générale, une diminution de l’activité et une perte de poids pendant quelques jours après cette procédure. Une amélioration progressive de l’état des animaux est ensuite attendue.

Devenir

Toutes les procédures expérimentales nécessitent l’analyse des cellules immunitaires présentes dans différents organes, dont les poumons. La seule façon d’effectuer ces analyses est de mettre les animaux à mort à la fin de chaque expérience.

Remplacement

Les objectifs scientifiques de ce projet nécessitent l’étude du système immunitaire dans son environnement physiologique complet, incluant les interactions entre différents types de cellules, plusieurs organes et différents tissus dans le contexte d’une infection ou d’un cancer. À l’heure actuelle, ces interactions ne peuvent être intégralement reproduites ni in vitro ni in silico. Des méthodes substitutives seront néanmoins mises en œuvre chaque fois que possible. Des cultures cellulaires, des organoïdes et des approches fondées sur des simulations informatiques seront utilisés en complément afin d’explorer certains mécanismes moléculaires et de limiter le recours aux animaux. Toutefois, ces modèles ne permettront pas d’étudier de façon intégrée les interactions complexes entre plusieurs populations de cellules au sein de différents organes dans le contexte d’un organisme tout entier au cours d’une infection par virus ou d’un cancer. En l’état actuel des technologies disponibles, l’utilisation d’animaux vivants demeure donc indispensable pour atteindre les objectifs scientifiques décrits dans ce projet.

Réduction

Le nombre d’animaux a été soigneusement déterminé à partir d’analyses de puissance statistiques basées sur des jeux de données antérieures, afin de garantir l’utilisation du nombre minimal d’animaux nécessaire pour obtenir des résultats valides et fiables. Des groupes témoins seront partagés entre différentes procédures chaque fois que possible. Les lignées de souris génétiquement modifiées seront élevées de manière à limiter les surplus, et des animaux contrôles issus de la même portée seront utilisés afin d’optimiser les données recueillis pour chaque groupe. Toutes les expériences seront réalisées avec un nombre suffisant de réplicas biologiques pour tenir compte de la variabilité, tout en évitant toute répétition inutile.

Raffinement

Les procédures expérimentales nécessitant une anesthésie seront réalisées sous anesthésie générale appropriée dont la durée aura été optimisée pour faciliter une récupération rapide des animaux. Pour les manipulations répétées (prélèvements sanguins, injections), des méthodes peu invasives seront privilégiées et les sites d’injection ou de prélèvement seront alternés lorsque cela est possible, afin de limiter les irritations locales. Les animaux feront l’objet d’un suivi clinique régulier tout au long des procédures expérimentales avec une surveillance renforcée après infection ou injection de cellules cancéreuses. Leur état général, leur activité, leur comportement et leur poids seront suivis afin de repérer rapidement tout signe de souffrance ou d’altération de leur état de santé. La taille et l’aspect des tumeurs sous-cutanées feront également l’objet d’un suivi attentif. En cas de besoin, des mesures de raffinement supplémentaires seront systématiquement mises en œuvre afin d’optimiser le bien-être des animaux. Celles-ci incluront notamment la mise à disposition d’une litière douce, le renforcement de l’enrichissement du milieu, le maintien de conditions thermiques appropriées (avec apport de chaleur si nécessaire, en particulier pour les animaux fragilisés), ainsi que l’administration de supports nutritionnels adaptés (gel nutritif). Des points limites précis, spécifiques et précoces pour chaque protocole expérimental seront établis : tout animal présentant des signes de détresse ou de douleur persistante (léthargie, piloérection, perte de poids supérieure à 20%, difficultés respiratoires) sera mis à mort immédiatement selon les procédures appropriées.

Choix des espèces

La souris est un modèle particulièrement pertinent pour étudier les interactions entre infection virale, immunité et développement tumoral, en raison de son utilisation largement répandue dans les domaines de la virologie, de l’immunologie et de la cancérologie. Son système immunitaire, bien caractérisé, présente de nombreuses similitudes fonctionnelles avec celui de l’être humain. Des modèles murins d’infection par le virus de la grippe A et de tumeurs pulmonaires transplantables sont déjà bien établis, facilitant l’étude des interactions entre infection virale, immunité et développement tumoral. De plus, la disponibilité de nombreuses lignées de souris génétiquement modifiées permet d’explorer précisément le rôle de gènes ou d’éléments génomiques, comme les rétroéléments endogènes, dans la régulation immunitaire. Enfin, la petite taille des souris facilite également la constitution de cohortes expérimentales de taille appropriée tout en limitant l’impact sur le bien-être animal, comparativement à des espèces de plus grande taille. Les souris seront utilisées à l’âge adulte (6-12 semaines), car il correspond à une période où le système immunitaire est mature et pleinement fonctionnel. Ce choix permet d’obtenir des résultats plus reproductibles, en limitant les variations liées à la croissance, au développement ou à l’immaturité de certains systèmes biologiques observés chez les animaux plus jeunes. Ce stade est également le plus adapté pour étudier les interactions entre infection virale, activation des rétroéléments endogènes et développement tumoral, ainsi que leurs conséquences sur l’immunité dans des conditions proches d’un fonctionnement physiologique stable. Par ailleurs, les animaux adultes tolèrent généralement mieux les différentes interventions prévues au cours de ce projet, ce qui contribue à limiter les contraintes et à préserver leur bien-être. L’utilisation de souris adultes permet ainsi de répondre aux objectifs scientifiques du projet tout en assurant des conditions expérimentales appropriées et compatibles avec le respect de l’animal.

Tuées en cours ou en fin de procédure pour prélever les tissus de leur oreille interne, 694 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Une partie d'entre elles est génétiquement sourde. Elles subissent des mesures de l'audition, une chirurgie de quinze minutes et l'administration d'un traitement génique dans l'oreille interne, soit par la voie chirurgicale classique, soit par un dépôt assisté par laser dont le porteur annonce qu'il ne génère "aucune douleur ou traumatisme", des douleurs étant en revanche attendues durant les deux jours qui suivent la chirurgie. Le porteur appuie le choix de l'espèce sur l'affirmation que le patrimoine génétique de la souris est "identique à 99% à celui de l'espèce humaine", et opère les souriceaux à treize jours, âge auquel leur audition commence à être évaluable.

Objectifs

La surdité profonde héréditaire humaine liée à la mutation du gène de l’Otoferline est actuellement l’objet des premiers tests de thérapie génique de l’oreille interne chez l’homme. Mais, cette thérapie ne restaure que la forme principale de l’Otoferline et repose sur une chirurgie invasive et traumatisante pour l’oreille interne, réduisant le taux de réussite. Notre laboratoire a montré qu’une seconde forme de l’Otoferline est également exprimée. Nous proposons de mesurer les bénéfices qu’apporterait une double thérapie génique réparant les deux formes de l’Otoferline dans la restauration de la fonction auditive. En parallèle, nous développerons une méthode de délivrance de thérapie génique dans l’oreille interne, innovante et non traumatisante. En adaptant la technique de bioimpression assistée par laser, il est possible de faire de l’administration de thérapie génique permettant la correction de surdité d’origine génétique. Nous souhaitons valider un nouveau dispositif laser conduit à l’aide d’une fibre optique et permettant le dépôt ciblé de thérapie génique sur l’oreille interne humaine, sans chirurgie invasive. L’objectif est de valider la récupération de l’audition chez un modèle de souris génétiquement sourdes avec cette technique révolutionnaire. A l’issue de ce projet, nous disposerons des arguments pour introduire la seconde forme de l’Otoferline dans les protocoles de thérapies géniques chez l’homme et transposer la méthode de délivrance assistée par laser dans tous les futurs traitements ciblant l’oreille interne avec un laser conduit par fibre optique.

Bénéfices attendus

Les premiers traitements par thérapie génique des surdités profondes chez des patients déficients pour le gène de l’Otoferline sont prometteurs mais restent à améliorer. La caractérisation fonctionnelle d’une autre forme de cette protéine dans la fonction auditive démontrera le bénéfice médical d’une thérapie génique incluant sa restauration. Cette prise en compte dans les thérapies des patients traités devrait suivre rapidement après la publication des travaux. De plus, ce projet permettra d’améliorer le dispositif d’administration de thérapie génique ciblée vers le système auditif sans risque d’endommager des structures auditives, contrairement aux stratégies développées à ce jour. D’un point de vue technique, ce projet est une étape-clé pour optimiser la technologie de délivrance ciblée de médicaments assistée par laser. Le développement d’un prototype avec un partenaire industriel se fera durant le projet. Les études cliniques de ce système interviendraient à l’issue du projet.

Procédures

Selon la procédure, les animaux seront soumis à des mesures de l’audition, n’excédant pas 15 minutes. Cette mesure est similaire aux mesures réalisées sur l’homme éveillé. Les animaux seront soumis à une chirurgie (durée de 15 minutes) et à une administration de médicaments ciblant l’oreille, soit par une méthode classique (durée de 5 minutes), soit par délivrance assistée par laser (durée de 10 à 12 minutes au total pour installer la souris, paramétrer le laser puis administrer le médicament). L’administration de médicaments assistée par laser ne génèrent aucune douleur ou traumatisme chez l’animal, et est réalisée sous anesthésie générale car cela nécessite une immobilisation complète de l’animal. Dans leur globalité, les procédures préopératoires et opératoires n’excèdent pas 40 minutes maximum afin de limiter la durée de l’anesthésie. Toutes ces interventions seront faites sous anesthésie.

Impact sur les animaux

Les animaux pourront subir du stress avant et lors des anesthésie (entre 2 et 5 minutes). Un délai de 24h minimum sera respecté entre les anesthésies pour le limiter. Des douleurs pourront être ressenties après la chirurgie durant les 2 jours post-opératoires. Les protocoles de dépôt assisté par laser et de mesure de l’audition n'engendreront aucune douleur.

Devenir

En cours ou à la fin de chaque procédure, les animaux seront mis à mort par une méthode garantissant l’absence de nuisances, de stress et de douleur. Sur l’ensemble des animaux du projet, les tissus de l’oreille interne seront prélevés pour des analyses quantitatives et qualitatives.

Remplacement

L’application de thérapie génique assistée par laser s’insérant dans un projet d’application clinique future, il est nécessaire de valider son efficacité (diffusion et transfert) et son innocuité (sans impact auditif) sur un modèle animal. La caractérisation de ces surdités est également nécessaire pour mieux comprendre l’effet de la thérapie génique. Seules les conditions in vivo chez l’animal permettent d’évaluer l’effet de la procédure sur l’audition. Ces mesures doivent être effectuées sur des animaux mammifères qui possèdent un système auditif suffisamment proche de l’homme, et un défaut auditif génétique similaire. Aucun environnement multifactoriel ne permet de reproduire ce modèle in vitro. Néanmoins, des études in vitro et ex vivo seront réalisées pour valider le transfert de la thérapie génique au niveau cellulaire, et sélectionner les paramètres laser du dépôt ciblé, de la perméabilisation, et du gel contenant la thérapie génique.

Réduction

Avant de procéder aux expérimentations animales, des tests préliminaires seront effectués afin de fixer l’entièreté des paramètres de bioimpression (paramètres laser et composition de l’hydrogel) et afin de valider la méthode de perméabilisation. Chaque souris sera utilisée pour l’entièreté de la procédure correspondante afin d’en limiter le nombre. Nous utiliserons le plus petit nombre possible de souris par procédure. Le nombre total de 694 souris sur l’ensemble du projet permet de s’assurer de la répétabilité des manipulations avec une marge de manœuvre en cas d’échec, compte tenu du degré de variabilité inter-individuelle, mais un nombre plus faible d’animaux pourrait être suffisant pour obtenir un traitement statistique significatif des données obtenues.

Raffinement

Nous utiliserons des analgésiques en injection ou en gouttes dans toutes les procédures pour réduire la douleur. Les signes d’anesthésies seront monitorés visuellement pour assurer le meilleur confort possible à l’animal durant la procédure. Lors des procédures chirurgicales, selon une grille d’évaluation, l’expérimentateur pourra augmenter la force de l’anesthésie, administrer un bonus d’analgésiques ou bien interrompre l’intervention pour épargner une nuisance trop importante à l’animal. En amont, les gestes opératoires seront mis au point et répétés sur des animaux morts. Dans les jours suivant la chirurgie, la surveillance des animaux sera régie par une grille d’évaluation pour détecter toute forme de nuisances et y remédier : des soins adéquats seront apportés, soit par médication, soit par désinfection de la plaie. Un niveau maximum de score de nuisances est établi à partir duquel on considère que la souffrance de l’animal ne peut plus être jugulée. Le porteur de projet prend alors la décision de la mise à mort de l’animal. Une communication soutenue avec les zootechniciens garantit un suivi qualitatif des animaux. Le stress sera réduit en manipulant régulièrement les animaux dès leur naissance et avant l'anesthésie pour qu'ils s'habituent aux expérimentateurs.

Choix des espèces

La souris constitue un modèle idéal pour explorer les surdités génétiques humaines. Son patrimoine génétique est identique à 99% à celui de l’espèce humaine. De nombreuses lignées de souris portant des mutations sur des gènes responsables de pathologies chez l’humain existent. L’évaluation de l’impact de la bioimpression assistée par laser sur la fonction auditive et l’efficacité de la thérapie génique dans l’oreille interne nécessite de réaliser des expérimentations sur l’animal. La caractérisation des surdités d’origine génétique et les mesures de l'audition associées ne peuvent se faire sur des animaux non-mammifères car leur système auditif est trop éloigné de celui de l'homme. Chez la souris, l’anatomie cochléaire est également similaire, et la fenêtre ronde est bien accessible par voie chirurgicale. Des études présentent les voies d’accès à la membrane de la fenêtre ronde chez la souris, afin d’avoir une chirurgie reproductible et le moins traumatique possible. Les chirurgies pour la bio-impression concernent des souris âgées de 13 jours, stade qui correspond à l'entrée en fonction du système auditif chez la souris et où l’audition commence à être évaluable. De plus, les souris plus âgées présentent une structure anatomique limitant l’accès à la fenêtre ronde. Les chirurgies de thérapies géniques sont efficaces dès 3 jours, permettant l’apparition de l’effet souhaité dès le 6éme jour et le maintien de cet effet pendant plusieurs mois. Les stades 1 mois et 2 mois correspondent au début des pertes auditives dans certaines souris étudiées. Les stades 3 mois, 6 mois et 1 an nous permettront de caractériser l'évolution des pertes auditives durant le vieillissement naturel des souris.

L'application d'imiquimod sur la peau provoque rougeurs, desquamation, épaississement et parfois excoriations, avec des démangeaisons, pendant environ huit jours : c'est ainsi qu'un psoriasis est déclenché chez 2 350 souris, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Toutes seront tuées en fin de procédure pour prélever le sang total et des tissus. S'y ajoutent une application de microbiote cutané humain, des séances d'imagerie sous anesthésie gazeuse et une prise de sang, l'ensemble servant à tester des molécules candidates contre le psoriasis, y compris chez des souris porteuses d'une protéine humaine impliquée dans l'inflammation. Le porteur affirme conduire chaque geste de façon à "garantir à la fois le bien-être animal et la qualité des données produites", et vante un "excellent modèle de psoriasis" sans jamais nommer l'espèce dans le passage qui justifie ce choix, où il parle au pluriel de "ces espèces".

Objectifs

Le psoriasis est une maladie auto-immune de la peau qui touche 1 à 3 % de la population mondiale. Chez l’homme, le psoriasis se caractérise par des lésions cutanée du cuir chevelu, des genoux et des coudes, associée à une atteinte des ongles. Dans les cas graves, l'atteinte cutanée peut être généralisée (érythrodermie) et il peut exister des atteintes des articulations. Cette dermatose évolue de façon chronique avec des poussées entrecoupées de périodes de rémissions de durée variable au cours desquelles les lésions sont minimes. Aucun traitement curatif n’est connu actuellement, mais des traitements symptomatiques existent. Il est donc important d’avoir un modèle préclinique prédictif du psoriasis et afin d’évaluer l’efficacité de nouvelles molécules thérapeutiques, il est indispensable de tester ces molécules dans ce modèle. Le projet sera conduit chez des souris sauvages et chez des souris transgéniques exprimant une protéine humaine impliquée dans les processus inflammatoires et dont le rôle dans la physiopathologie du psoriasis suscite un intérêt croissant. L’utilisation conjointe de ces deux types d'animaux vise à mieux comprendre l’impact de l’expression de cette protéine sur l’intensité de la réponse inflammatoire cutanée et sur la réponse aux traitements testés.

Bénéfices attendus

Ce projet a pour objectif de faire progresser les connaissances scientifiques et appliquées dans le domaine du psoriasis en évaluant l’efficacité de nouvelles molécules thérapeutiques dans un modèle préclinique pertinent. Il permettra d’identifier des composés innovants (ou repositionnés) présentant un potentiel anti-psoriasique, ainsi que d’évaluer différentes formulations et voies d’administration, en particulier topiques, adaptées à cette pathologie cutanée. De plus, il permettra de mieux comprendre l’impact de l’expression d'une protéine spécifique sur l’intensité de la réponse inflammatoire cutanée et sur la réponse aux traitements testés. Pendant la durée du projet, les études conduites permettront de sélectionner les molécules les plus prometteuses sur la base de critères objectifs d’efficacité et de tolérance. L’évaluation de différentes doses et schémas d’administration contribuera à l’optimisation des fenêtres thérapeutiques. Le projet permettra également d’explorer des effets de synergie entre plusieurs molécules ou entre une molécule et une formulation spécifique. Les données cliniques, biologiques, histologiques et d’imagerie générées amélioreront la compréhension des mécanismes inflammatoires impliqués dans le psoriasis et de leur modulation pharmacologique. À plus long terme, ce projet apportera des preuves d’efficacité précliniques indispensables au développement clinique de nouvelles stratégies thérapeutiques pour le psoriasis. L’identification de molécules plus efficaces, de formulations optimisées et de doses mieux adaptées pourrait conduire à des traitements plus ciblés, mieux tolérés et plus efficaces pour les patients. Les connaissances acquises sur l’optimisation des associations thérapeutiques pourront également être transposées à d’autres maladies inflammatoires chroniques, avec un bénéfice potentiel élargi pour la santé humaine.

Procédures

Dans le cadre de ce projet, les animaux seront soumis à un ensemble d’interventions techniques brèves, non chirurgicales , nécessaires à l’induction et au suivi de la pathologie. Les interventions réalisées lors de l’induction et du suivi du modèle sont les suivantes : manipulation quotidienne des animaux (1 à 2 minutes maximum), contention pour administrations de molécules à visée thérapeutique (durée d’intervention de 30 à 60 secondes en fonction de la voie d’administration), examens d’imagerie non invasive par Tomographie Optique de Cohérence ou OCT / par imagerie de fluorescence / par imagerie de bioluminescence sous anesthésie gazeuse (une à deux fois par animal ; durée de la session d’imagerie : 5 minutes maximum), un prélèvement sanguin sous anesthésie gazeuse (une fois au cours de la procédure d’induction, durée d’environ 3 minutes). Chaque intervention est conduite par un personnel qualifié, en conditions contrôlées, afin de garantir à la fois le bien-être animal et la qualité des données produites.

Impact sur les animaux

Les procédures expérimentales prévues dans ce projet sont susceptibles d’entraîner des effets indésirables transitoires chez les animaux, principalement liés à l’induction du psoriasis, aux manipulations répétées et aux administrations de traitements. L’application topique de microbiote cutanée humain peut provoquer un stress ponctuel lié à la contention de l’animal ainsi qu’un inconfort, sans entraîner de lésions cutanées et/ ou d’infections chez les animaux. L’induction du psoriasis par application topique d’imiquimod entraîne l’apparition de lésions cutanées inflammatoires localisées (érythème, desquamation, un épaississement de la peau et parfois des excoriations). Ces lésions peuvent être associées à un inconfort local et à des démangeaisons. Leur intensité est variable et elles persistent pendant la phase d’induction, d’une durée d’environ 8 jours, puis régressent progressivement lors de la phase de traitement ou après l’arrêt de l’induction. Les manipulations répétées (applications topiques, évaluations cliniques, imagerie non invasive) ainsi que les anesthésies gazeuses répétées peuvent induire un stress modéré et transitoire, pouvant se traduire par une diminution temporaire de l’activité ou une modification passagère du comportement. Un retour à un comportement normal est attendu rapidement après chaque intervention. Les administrations de traitements par voie orale, parentérale ou topique, ainsi que les prélèvements sanguins de faible volume, peuvent provoquer un inconfort ponctuel et un stress léger, sans douleur prolongée attendue. Une perte de poids modérée et transitoire peut être observée chez ces animaux au cours de l’étude. L’ensemble de ces effets est réversible et fait l’objet d’un suivi quotidien (poids, hydratation et comportement), avec application de points limites prédéfinis afin de prévenir toute souffrance excessive.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort en fin de procédure car des prélèvements de sang total seront réalisés. Des prélèvements tissulaires post-mortem pourront également être réalisés.

Remplacement

Afin d’évaluer l’efficacité de nouvelles molécules thérapeutiques, il est indispensable de tester ces molécules dans ce modèle pour plusieurs raisons : - Il n’existe pas de modèle in vitro de psoriasis pouvant remplacer complètement le micro-environnement cutané en tant que tissu biologique vivant. Il existe cependant des modèles in vitro qui permettent d’effectuer un premier criblage d’efficacité de molécules, mais cette efficacité doit ensuite être confirmée chez l’animal. - Ces modèles in vitro ne permettent pas de tester des produits thérapeutiques ou des dispositifs médicaux appliqués directement sur la peau en application externe (topique) - L’efficacité ne pouvant être testée in vitro, des premières preuves d’efficacité in vivo doivent être apportées avant de passer au stade clinique de développement de ces molécules (tests cliniques chez l’homme).

Réduction

La stratégie d’expérimentation consiste à suivre les mêmes animaux dans le temps (étude longitudinale) par observation répétée avec ou sans procédure d’imagerie. Chaque animal devient son propre contrôle car il est observé une première fois avant de commencer les traitements (observation à T=0) puis à différents temps. Cette approche expérimentale permet d’obtenir des résultats plus fiables avec moins d’animaux. Le nombre d’animaux sera de 10 animaux maximums par groupe de traitement (groupe d’animaux devant recevoir la molécule à tester ou le traitement thérapeutique). Ce nombre est le minimum statistiquement nécessaire pour avoir des résultats robustes. Des analyses seront réalisées à la fin de(s) la procédure(s) sur les tissus provenant des animaux afin d’obtenir le plus d’informations possibles relatives à l’efficacité des molécules administrées ou des traitements thérapeutiques effectués sur les animaux et d’éviter l'utilisation d'animaux supplémentaires.

Raffinement

Conformément à la réglementation en vigueur, ce projet est conçu afin de réduire au minimum la douleur, la souffrance, l’angoisse et toute nuisance durable infligées aux animaux, tout en garantissant la validité scientifique des résultats. Le recours à l’imagerie non invasive (par exemple l'imagerie par bioluminescence ou fluorescence) permet un suivi longitudinal des lésions chez les mêmes animaux, limitant ainsi le nombre de manipulations terminales et la répétition de procédures invasives. Une surveillance clinique quotidienne est mise en place pendant toute la durée des procédures, incluant l’évaluation du poids, de l’état d’hydratation, du comportement, de l’activité et de l’état des lésions cutanées. Des points limites précoces et prédictifs ont été définis afin de permettre une interruption rapide de la procédure ou une mise à mort anticipée en cas de dégradation de l’état général de l’animal. En cas de signes de déshydratation ou de perte de poids, des mesures correctrices immédiates seront mises en œuvre (apport alimentaire humidifié, gels nutritionnels, réhydratation par sérum physiologique). Les conditions d’hébergement sont enrichies (igloos, tunnels, matériaux de nidification) afin de réduire le stress. Les manipulations potentiellement stressantes (imagerie, prélèvements, administrations) seront réalisées sous anesthésie gazeuse, permettant une induction et un réveil rapides, avec un inconfort limité. Les volumes et fréquences de prélèvements sanguins sont strictement limités. Tout au long de la durée de vie du projet, une veille scientifique et réglementaire sera assurée. Les animaux seront manipulés par du personnel formé et expérimenté, afin de limiter la durée et l’impact des interventions.

Choix des espèces

L’espèce animale utilisée dans ce projet représente un excellent modèle de psoriasis. Il existe de nombreuses références bibliographiques scientifiques relatives à l'évaluation du psoriasis induit dans ces espèces. Ces animaux développent des symptômes de psoriasis très semblables à ceux observés chez l'humain. De plus, ces modèles présentent certains intérêts pratiques indéniables : faibles coûts, cycles de reproduction courts, croissance rapide, facilité de transport, facilité de manipulation et une très bonne adaptation aux conditions expérimentales. Les animaux seront utilisés au stade de jeunes adultes (8-12 semaines) car il s'agit du stade auquel ils sont les plus susceptibles de fournir des résultats satisfaisants. Ce stade de développement correspond à l’âge de maturité sexuelle, hormonale et immunitaire. Tous les animaux auront le même âge. Les résultats publiés avec ce modèle utilisent des animaux de cet âge.