Oncologie

1 404 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, tous tués à la fin de chaque procédure pour des analyses post mortem. Chacun subit une chirurgie du cerveau d'une heure trente à deux heures trente, garde parfois un dispositif fixé sur la tête, puis passe des tests de mémoire : un environnement associé à jusqu'à cinq stimulations "désagréablement ressentie", de nature non précisée, un apprentissage spatial en six à huit sessions, des tests d'interactions sociales et d'odeurs alimentaires, avec un rationnement pour les tests à récompense. Le but est de comprendre comment une région profonde du cerveau relaie les souvenirs entre deux autres zones. Le porteur écrit que "toute souffrance sera évitée", au motif que le "bien-être animal" est "essentiel pour garantir des données comportementales fiables".

Objectifs

Les recherches actuelles suggèrent que les souvenirs durables sont progressivement stockés dans différentes zones du cerveau. Cependant, on comprend encore mal comment un souvenir est attribué à des groupes précis de cellules nerveuses lors de son enregistrement. Des travaux récents montrent qu’une région profonde du cerveau sert de relais entre une zone impliquée dans la mémorisation des expériences récentes et une autre région participant au stockage des souvenirs à long terme. Dans ce projet, nous souhaitons mieux comprendre comment ces différentes régions cérébrales communiquent entre elles pendant la création des souvenirs chez le rat. Dans un premier temps, nous étudierons les connexions entre cette région relais et plusieurs zones du cerveau impliquées dans la mémoire. Ensuite, nous analyserons leur rôle en enregistrant leur activité ou en modifiant temporairement certaines communications entre ces régions. L’objectif est de déterminer plus précisément leur fonction chez le rat adulte soumis à différents tests de mémoire faisant appel à des odeurs, à l’environnement ou à l’orientation dans l’espace. Ces tests permettront d’étudier la formation des souvenirs à différents moments après l’apprentissage.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra, à court terme, de mieux caractériser les connexions entre certaines régions du cerveau ainsi que leur rôle dans différents aspects de la formation des souvenirs. À moyen terme, ces résultats contribueront à mieux comprendre les mécanismes cérébraux impliqués dans les troubles de la mémoire. À long terme, ce projet fondamental présente une perspective translationnelle en pouvant aider à identifier l’origine des amnésies et de l’oubli accéléré observés dans certaines maladies psychiatriques et neurodégénératives, et ainsi orienter de futures stratégies diagnostiques ou thérapeutiques.

Procédures

Dans le cadre de ce projet, les animaux pourront être soumis à différentes interventions expérimentales. Intervention chirurgicale réalisée sous anesthésie générale : 1 intervention par animal, durée de 1 h 30 à 2 h 30. Administration de substances nécessaires au protocole expérimental : une seule injection intrapéritonéale sera administrée par animal. Test de mémoire lié à l’environnement : 1 session de 8 minutes pouvant inclure jusqu’à 5 stimulations désagréablement ressentie ; puis 1 session de rappel d’environ 10 minutes. Test de mémoire spatiale : plusieurs sessions d’apprentissage (6 – 8 sessions) et de rappel (1 session), de 5 à 60 minutes selon les étapes. Test de mémoire lié aux interactions sociales et aux odeurs alimentaires : 1 à 2 sessions de 5 à 30 minutes. Mesure ou modulation temporaire de l’activité cérébrale pendant les tests comportementaux : 1 à 8, d’une durée identique à celle du test concerné (5 à 60 minutes).

Impact sur les animaux

Les opérations réalisées sous anesthésie générale, impliquant une intervention au niveau du cerveau et la pose de petits dispositifs, peuvent entraîner un impact négatif temporaire sur le bien-être des animaux pendant les heures ou les jours suivant l’intervention. Après certaines opérations, les animaux porteront un petit dispositif fixé sur la tête pour maintenir le matériel en place ; malgré sa petite taille, il peut occasionner une légère gêne. Certains tests comportementaux peuvent entraîner un inconfort ou un stress passager chez les animaux, sans conséquence durable sur leur bien-être. Pour certains tests fondés sur une récompense alimentaire, un rationnement alimentaire sera mis en place afin de maintenir la motivation des animaux, avec un impact limité sur leur bien-être. Certaines procédures nécessitent des injections de substances. Celles-ci peuvent entraîner un risque de douleur transitoire au site d’injection, bien que les produits utilisés ne soient pas considérés comme douloureux. La manipulation nécessaire pour maintenir l’animal peut également provoquer un stress modéré et une gêne passagère.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure afin de procéder aux études post mortem.

Remplacement

Elucider les bases neuronales de fonctions cognitives ne peut, par définition, s’étudier que chez des organismes entiers. L’approche cognitive chez l’homme n’autorise pas la manipulation fine des circuits neuronaux qui est nécessaire à la compréhension de leur fonctionnement. De même, les approches basées sur la modélisation du fonctionnement du cerveau sont utiles, mais restent complémentaires des approches expérimentales in vivo, qui permettent de tester et de valider les prédictions des modèles.

Réduction

Nous cherchons à utiliser le nombre minimal d’animaux permettant d’obtenir des données fiables et exploitables. Le nombre d’animaux par groupe correspond au minimum nécessaire pour comparer rigoureusement les résultats, tout en tenant compte des pertes éventuelles au cours de l’étude. Le recours à des méthodes temporaires permettant d’activer ou d’inhiber certaines zones du cerveau de manière réversible permet également de diminuer le nombre d’animaux nécessaires. De plus, les différentes procédures seront réalisées dans un ordre logique afin de ne poursuivre les expérimentations que sur les voies présentant un intérêt confirmé par les étapes précédentes, ce qui contribuera à réduire encore le nombre d’animaux utilisés.

Raffinement

Le bien-être animal étant essentiel pour garantir des données comportementales fiables, toute souffrance sera évitée. Les protocoles chirurgicaux ont été optimisés afin de limiter au maximum l’inconfort et la douleur. Les animaux seront observés quotidiennement ; dès qu’un problème est détecté, l’expérimentateur interviendra pour prodiguer les soins nécessaires ou, si besoin, mettre fin à la procédure. Des critères d’arrêt et des mesures de prise en charge adaptés ont été définis afin de garantir une gestion optimale de la douleur et de l’inconfort. Les tests comportementaux susceptibles de provoquer un inconfort temporaire seront réalisés selon des conditions strictement encadrées et limitées au minimum nécessaire pour obtenir les observations attendues. L’objectif recherché est une réaction passagère, sans effet durable sur l’animal.

Choix des espèces

De manière générale, les rongeurs constituent un modèle pertinent pour l’étude du système nerveux. Les grands principes d’organisation et de fonctionnement des circuits neuronaux sont largement conservés au cours de l’évolution. De plus, de nombreuses épreuves comportementales validées permettent d’évaluer chez le rat des fonctions cognitives complexes. Enfin, les processus de développement cérébral et les mécanismes neurobiologiques sous-jacents présentent de fortes similitudes avec ceux des autres mammifères, ce qui permet d’extrapoler les résultats obtenus à la compréhension du fonctionnement cérébral humain. Les animaux utilisés pour ce projet seront des rats jeunes adultes âgés d’environ 8-9 semaines (250-275 g) au début des expériences afin de limiter la variabilité de taille et garantir une bonne reproductibilité des positions utilisées lors des chirurgies cérébrales.

45 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Éveillées et maintenues dans un système de contention, elles reçoivent une injection de cellules tumorales dans la veine de la queue, puis développent des nodules dans les poumons, que le porteur dit susceptibles de provoquer difficultés respiratoires, amaigrissement et "une douleur modérée". Le projet sert à vérifier si cette méthode d'induction fait apparaître des structures immunitaires dans les tumeurs, et le porteur prévoit qu'en cas d'échec les recherches s'orienteront vers d'autres méthodes. Il affirme qu'un "modèle animal immunocompétent est indispensable", les organoïdes et cultures en 3D ne reproduisant pas selon lui le tissu tumoral.

Objectifs

Le projet vise à étudier la formation et les caractéristiques de structures fonctionnelles induites dans les tumeurs pulmonaires, appelées les structures lymphoïdes tertiaires (TLS). Ces structures permettent de mettre en place localement une réponse immunitaire antitumorale. Pour cela, un modèle murin d’adénocarcinome pulmonaire sera établi par injection intraveineuse de cellules tumorales pulmonaires. Ce modèle permettra d’induire le développement de nodules tumoraux pulmonaires reproduisant certains aspects du cancer pulmonaire humain. Les tumeurs seront ensuite analysées afin d’identifier la présence, l’organisation et la composition cellulaire des TLS, ainsi que leur association avec la progression tumorale et les réponses immunitaires locales. Les objectifs sont les suivants: - Établir et valider un modèle murin d’adénocarcinome pulmonaire par injection intraveineuse de cellules tumorales. - Déterminer si ce modèle induit la formation de structures lymphoïdes tertiaires dans la tumeur. - Caractériser la composition cellulaire et l’organisation des TLS (cellules immunitaires). Explorer le rôle potentiel des TLS dans la réponse immunitaire antitumorale.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de mieux comprendre la formation des structures lymphoïdes tertiaires (TLS) dans le cancer du poumon. Ces structures immunitaires sont associées à une meilleure réponse aux immunothérapies dans plusieurs cancers, mais leurs mécanismes de formation restent encore mal connus. Ce travail permettra d’établir et de valider un modèle murin pertinent pour étudier les TLS dans le microenvironnement tumoral pulmonaire. Les résultats obtenus permettront de déterminer si ce modèle reproduit la formation de TLS observée chez l’Homme. Si ce modèle est validé, il pourra être utilisé dans de futurs projets visant à mieux comprendre le rôle des cellules immunitaires dans la formation et la fonction des TLS. À l’inverse, si aucune formation de TLS n’est observée, ces résultats permettront d’orienter les recherches vers d’autres modèles expérimentaux plus adaptés. À plus long terme, ce projet pourrait contribuer à l’identification de nouveaux biomarqueurs et au développement de nouvelles stratégies d’immunothérapie dans le cancer du poumon.

Procédures

Les animaux vigiles dans un système de contention adapté recevront une administration unique de cellules tumorales (durée de l’acte technique : 2 minutes). À la fin de l’expérimentation, une procédure chirurgicale sans réveil sera réalisée sous analgésie et anesthésie générale (durée de l’acte : environ 5 minutes).

Impact sur les animaux

Les animaux pourront présenter une gêne transitoire liée à l’injection intraveineuse, incluant un stress léger lors de la contention ainsi qu’une douleur légère ou un petit hématome localisé au niveau de la queue en cas d’irritation liée à l’injection. Le développement des tumeurs pulmonaires pourra entraîner une perte de poids progressive, des signes respiratoires tels qu’une augmentation de la fréquence respiratoire (polypnée), une difficulté respiratoire (dyspnée) ou une respiration abdominale, ainsi qu’une diminution de l’activité générale. Les animaux pourront présenter une douleur modérée liée au développement tumoral pulmonaire, pouvant s’accompagner d’une altération de l’état général, incluant hypoactivité, posture anormale, poil hérissé, diminution de la prise alimentaire ou isolement. Les nuisances potentielles liées à l’anesthésie comprennent notamment une hypothermie et une dépression respiratoire.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés afin de permettre le prélèvement des poumons et la réalisation des analyses histologiques et immunologiques nécessaires à l’atteinte des objectifs du projet, notamment l’identification, la quantification et la caractérisation des structures lymphoïdes tertiaires (TLS) au sein du microenvironnement tumoral. Le maintien en vie des animaux n’est pas envisageable, car les données expérimentales reposent sur l’analyse ex vivo des tissus tumoraux pulmonaires. Par ailleurs, cette stratégie permet d’obtenir un maximum d’informations à partir de chaque animal grâce à la réalisation d’analyses multiples (histologie, immunohistochimie, analyses cellulaires), contribuant ainsi à limiter le nombre total d’animaux utilisés dans le cadre du projet et des études futures.

Remplacement

À l’heure actuelle, il n’existe pas de méthodes alternatives non animales permettant de reproduire de manière satisfaisante la complexité du microenvironnement tumoral pulmonaire et la formation des structures lymphoïdes tertiaires (TLS). Ces structures résultent d’interactions dynamiques entre cellules tumorales, cellules immunitaires et stroma, au sein d’un tissu organisé et vascularisé, ce qui ne peut être modélisé de façon adéquate par des approches in vitro (cultures cellulaires 2D/3D, organoïdes) ou in silico. Bien que certaines approches ex vivo ou de modélisation puissent apporter des informations partielles, elles ne permettent pas d’étudier l’initiation, l’organisation spatiale et la maturation des TLS dans un contexte physiologique intégré, ni les interactions systémiques impliquées dans la réponse immunitaire antitumorale. Ainsi, l’utilisation d’un modèle animal immunocompétent est indispensable pour atteindre les objectifs du projet. Ce projet constitue par ailleurs une étape préalable visant à valider la pertinence du modèle, permettant d’éviter le recours à des animaux dans des études ultérieures si celui-ci s’avérait inadapté.

Réduction

Le nombre d’animaux (45), a été déterminé de manière à obtenir des résultats scientifiquement robustes tout en respectant le principe de réduction. Chaque expérience comportera 15 animaux recevant une injection intraveineuse de cellules tumorales. Ce nombre a été choisi comme le minimum nécessaire pour permettre l’observation fiable du développement tumoral et de la formation éventuelle de structures lymphoïdes tertiaires, en tenant compte de la variabilité biologique interindividuelle. Afin de garantir la reproductibilité des résultats et de permettre une analyse statistique appropriée, l’expérience sera répétée trois fois de manière indépendante, portant le nombre total d’animaux à 45. La taille des effectifs a été établie grâce à un calcul de puissance, et sur la base de nos conncaissances en terme d'hétérogénité du système immunitaire chez la souris. Aucun groupe contrôle supplémentaire n’est nécessaire, l’objectif étant de valider l’établissement du modèle tumoral et la présence ou l’absence de TLS. Les effectifs ont été déterminés sur la base des données de la littérature, afin d'obtenir une puissance statistique suffisante. La stratégie expérimentale repose sur une étude pilote visant à valider la pertinence du modèle, ce qui permet d’éviter l’utilisation d’un nombre plus important d’animaux dans des projets ultérieurs si le modèle s’avérait non adapté. De plus, les analyses seront optimisées afin de maximiser les données obtenues à partir de chaque animal (analyses histologiques et immunologiques multiples sur les mêmes tissus), limitant ainsi le recours à des animaux supplémentaires. Enfin, les données obtenues seront exploitées de manière rigoureuse à l’aide de tests statistiques adaptés.

Raffinement

Les procédures expérimentales ont été conçues afin de minimiser la douleur, la souffrance et le stress des animaux à chaque étape du projet. Les animaux bénéficieront d’un temps d'acclimatation de 8 jours avant le début des procédures. Ils seront hébergés en groupes de 5 animaux par cage dans des conditions conformes à la réglementation en vigueur, avec un environnement enrichi favorisant leur bien-être et offrant un espace adapté à leurs déplacements. Les injections seront réalisées par du personnel expérimenté afin de limiter les échecs et les manipulations répétées. Une attention particulière sera portée à l’accès à l’alimentation, avec la mise à disposition, si nécessaire (en cas d’amaigrissement ou de difficulté d’alimentation), de nourriture enrichie sous forme de gelée et l’ajout de croquettes. Les animaux feront l’objet d’une surveillance clinique régulière, comprenant une surveillance quotidienne par le personnel animalier ainsi qu’un suivi régulier par les expérimentateurs (2 à 3 fois par semaine). Ce suivi inclura le contrôle du poids, du comportement et des signes respiratoires, permettant une détection précoce de toute altération de l’état général. Dès l’apparition des tumeurs, la fréquence de surveillance sera renforcée, avec notamment des pesées régulières (2 à 3 pesées hebdomadaires) et une évaluation attentive des signes cliniques (amaigrissement, posture anormale, difficultés respiratoires) pour rechercher des signes d’altération de l’état général. Des points limites stricts et précoces seront appliqués afin d’éviter toute souffrance prolongée. Les conditions d’hébergement respecteront les standards en vigueur, avec enrichissement du milieu pour favoriser le bien-être des animaux. L’ensemble du personnel impliqué est formé aux bonnes pratiques en expérimentation animale, garantissant une prise en charge adaptée et respectueuse des animaux tout au long de l’étude.

Choix des espèces

La souris (Mus musculus) a été choisie comme modèle expérimental en raison de sa large utilisation et de sa pertinence pour l’étude du cancer du poumon et du système immunitaire. Elle permet le développement de modèles syngéniques immunocompétents indispensables à l’étude des interactions entre cellules tumorales et système immunitaire, notamment dans le cadre de la formation des structures lymphoïdes tertiaires (TLS), structures formées dans les tumeurs et permettant la génération d'une réponse antitumorale locale. De plus, la souris offre un large éventail d’outils génétiques permettant, dans des projets ultérieurs, d’étudier de manière ciblée le rôle de gènes d’intérêt dans des cellules telles que les lymphocytes B. Enfin, aucune autre espèce ou méthode alternative ne permet actuellement d’étudier de manière intégrée la tumorigenèse pulmonaire et la formation des TLS dans un organisme entier, justifiant le recours à ce modèle animal. Les animaux utilisés dans ce projet seront des souris adultes jeunes, âgées de 7 à 9 semaines au moment du début des procédures expérimentales. A ce stade de développement, les souris sont sevrées, ont atteint leur taille adulte et ont un système immunitaire mature, indispensable pour l’étude des interactions entre les cellules tumorales et les cellules immunitaires, notamment dans le cadre de la formation des TLS.

Les souris reçoivent jusqu'à onze injections dans l'abdomen, ou une injection dans la veine située derrière le globe oculaire sous anesthésie gazeuse, et subissent jusqu'à douze prises de sang à la mâchoire. 600 souris vont être utilisées ainsi, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue pour que leurs organes, dont la rate, soient prélevés. Le porteur indique que la réaction immunitaire déclenchée entraîne une altération de leur état général, pour produire des lignées de cellules sécrétant des anticorps monoclonaux. Le résumé ne nomme aucune cible ni aucune application, et le porteur présente l'effectif comme "une estimation des projets à venir".

Objectifs

Depuis les années 1980, les anticorps ont profondément modifié la thérapeutique dans un grand nombre de pathologies, comme le cancer et les maladies inflammatoires chroniques. Bien que le développement des anticorps soit un processus complexe, et que certains d'entre eux peuvent entraîner des effets indésirables préoccupants, leur apport dans l'arsenal thérapeutique est majeur. Aujourd'hui, plus d'une cinquantaine d'anticorps sont disponibles dans des indications de plus en plus larges. Un grand nombre de nouveaux anticorps est actuellement en développement. Après injection d'un élèment déchenchant une réaction immunitaire (c'est-à-dire une réaction de défense de l'organisme), l’objectif est de récupérer les cellules productrices d’anticorps (spécifiques de cet élèment) pour générer des lignées de cellules sécrétant les anticorps d’intérêt. Ces dernières seront amplifiées à très petite échelle en plaques de culture. Les cellules seront ensuite éclatées pour développer les anticorps. L’utilisation des rongeurs reste indispensable pour créer de nouveaux anticorps contre des cibles car c’est uniquement la stimulation du système immunitaire qui va permettre d’atteindre l’objectif.

Bénéfices attendus

Les anticorps et leurs dérivés constituent la classe des principes actifs qui connaît le plus fort taux de développement actuel dans les domaines biotechnologique et pharmaceutique. En effet, ces anticorps sont des outils de recherche, des réactifs pour les tests d'analyses biologiques et des candidats potentiels à une utilisation thérapeutique. Ils offrent de nouvelles perspectives pour générer une réponse immunitaire protectrice et durable. Ainsi, ils sont aujourd’hui utilisés dans les traitements de cancers, de maladies inflammatoires, de migraine et plus récemment dans la lutte des formes graves de la Covid 19. Aujourd'hui, plus d'une cinquantaine d'anticorps sont disponibles dans des indications de plus en plus larges. Un grand nombre de nouveaux anticorps est actuellement en développement. Ce présent projet a pour but d’engendrer une réponse immunitaire spécifique chez l'animal. L’objectif principal est de récupérer les cellules productrices d’anticorps pour générer des lignées de cellules sécrétant les anticorps d’intérêt.

Procédures

[MODIFICATION] Les souris seront soumises à des injections et des prélèvements de sang. En effet, la réaction immunitaire sera réalisée par une injection dans l'abdomen puis par une autre injection dans l'abdomen (durée: 1 minute par injection, 11 INJECTIONS MAXIMUM SUR L'ENSEMBLE DU PROTOCOLE) ou dans une veine localisée derrière le globe oculaire (durée: 5min). Le volume administré sera choisi en respectant les volumes maximaux d’administration chez la souris. Des prélèvements de sang (12 AU MAXIMUM) pourront être réalisés à la veine de la mandibule afin de suivre le niveau de production d'anticorps des souris (durée: 2 min).

Impact sur les animaux

Les souris subiront des injections répétées dans l'abdomen ou une injection par voie intraveineuse. Ces administrations peuvent entraîner du stress chez l’animal lié à la contention, des douleurs, inflammations ou risques d'infections aux sites d'injection. Les injections réalisées dans la veine derrière le globe occulaire, peuvent produire des effets indésirables sur l’œil. Elles nécessitent une anesthésie par voie gazeuse des animaux pouvant générer une irritation des voies respiratoires. Les prélèvements de sang peuvent entraîner des risques de déshydratation ou de chute du volume sanguin et des hématomes aux sites de prélèvements. Le déclenchement d'une réaction immunitaire entraîne une altération de l'état général des animaux.

Devenir

Les animaux sont mis à mort à la fin de la procédure car il est nécessaire de prélever les organes pour extraire les anticorps.

Remplacement

L’utilisation des rongeurs reste indispensable pour créer de nouveaux anticorps contre des cibles car c’est uniquement la stimulation du système immunitaire qui va permettre d’atteindre l’objectif. Ces développements nécessitent l’utilisation d’animaux. En effet, ces tests doivent être réalisés sur un organisme entier afin de prélever les organes tels que la rate où sont retrouvés les cellules produisant les anticorps.

Réduction

Le nombre d’animaux inclus dans ce projet est une estimation des projets à venir et a été fixé à N = 10 animaux maximum par série expérimentale. Cela constitut le nombre maximal pour générer des anticorps. Le nombre d’animaux nécessaires par expérience sera calculé en se basant sur les données de la littérature de la cible d’intérêt afin d’évaluer la difficulté à obtenir les anticorps. Afin de limiter le nombre d’animaux utilisés, des prélèvements sanguins répétés seront effectués sur les mêmes individus au cours du temps, permettant de suivre précisément l’évolution de la réponse immunitaire sans avoir recours à différents animaux pour chaque point temporel. De plus, dès que le nombre d’individus présentant une réponse supérieure au seuil minimal requis pour les analyses statistiques sera atteint, la série expérimentale pourra être arrêtée avant d’atteindre les 10 individus initialement prévus.

Raffinement

A l’arrivée des animaux, une période d'acclimatation d’au moins 5 jours est respectée. Une importance particulière est portée au suivi des animaux pour prévenir et remédier à l’apparition de douleur ou de mal-être. Les points limites sont fixés avant le début des expérimentations. Les animaux sont observés quotidiennement et tout signe de douleur ou de détresse entraîne l’établissement d’un score grâce à une grille d’évaluation clinique. En fonction du score obtenu, un protocole d’analgésie approprié est mis en place si besoin. Les injections au niveau du sinus retro-orbitaire sont réalisées après anesthésie gazeuse de l'animal et analgésie locale de l’œil.

Choix des espèces

L’utilisation d’animaux pour créer et produire des anticorps reste nécessaire car aucun modèle bio-informatique ne permet à l’heure actuelle de recréer la réponse du système immunitaire de l’animal en présence d'un organisme étranger. La maturité sexuelle des souris se situant aux alentours des 6 à 8 semaines selon le sexe, il convient d’utiliser des animaux jeunes âgés d’au moins 8 semaines pour les programmes de stimulation de système immunitaire. Généralement, les jeunes animaux sont de meilleurs producteurs d’anticorps que les animaux plus âgés parce que la fonction immunitaire atteint son apogée à la puberté et diminue lentement par la suite.

Pour savoir si un élément issu d'anciens virus intégrés au génome freine la croissance des tumeurs, 540 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. Chacune reçoit une implantation de cellules tumorales, puis, pendant six semaines au plus, deux mesures de la tumeur et deux séances d'imagerie sous anesthésie par semaine, avec épilation de la zone. Le porteur indique que la tumeur peut provoquer une tension de la peau, une baisse de mobilité et une dissémination à d'autres tissus. Les souris sont mises à mort plus tôt en cas de tumeur trop volumineuse, d'ulcération, de perte de poids ou de douleur.

Objectifs

Certains éléments présents dans notre génome proviennent d’anciens virus intégrés au cours de l’évolution. Ces éléments sont généralement inactifs, mais certains peuvent encore produire des molécules capables d’influencer le comportement des cellules. Nos travaux suggèrent que l’un de ces éléments pourrait jouer un rôle protecteur en limitant certaines propriétés des cellules tumorales. L’objectif de ce projet est de déterminer si la restauration de cet élément dans des cellules tumorales modifie leur capacité à former une tumeur et à progresser dans un organisme vivant. Pour cela, des cellules tumorales de souris seront modifiées en laboratoire, puis implantées chez des souris. La croissance des tumeurs sera suivie au cours du temps par des mesures externes et par une méthode d’imagerie permettant de suivre les mêmes animaux de manière répétée. Ce projet permettra de mieux comprendre comment certains éléments anciens d’origine virale présents dans le génome peuvent influencer la progression tumorale et les interactions entre les cellules tumorales et leur environnement.

Bénéfices attendus

Ce projet pourrait permettre de mieux comprendre certains mécanismes biologiques qui influencent la croissance et la progression des tumeurs. En particulier, il vise à déterminer si certains éléments anciens d’origine virale présents dans le génome peuvent contribuer à limiter le développement tumoral. Les résultats attendus pourraient apporter de nouvelles connaissances sur les interactions entre les cellules tumorales et leur environnement dans l’organisme. À plus long terme, ces connaissances pourraient contribuer à identifier de nouvelles pistes de recherche pour mieux comprendre les mécanismes qui freinent ou favorisent la progression des cancers.

Procédures

Tous les animaux recevront une seule implantation de cellules tumorales, réalisée sous anesthésie brève. Cet acte durera environ 5 à 10 minutes par animal, incluant l’anesthésie, l’implantation des cellules et la surveillance immédiate du réveil. La croissance des tumeurs sera ensuite suivie deux fois par semaine pendant 6 semaines maximum. Ce suivi comprendra une mesure externe de la tumeur, d’une durée d’environ 1 à 2 minutes par animal. Les animaux seront également suivis par imagerie deux fois par semaine. Pour cette imagerie, ils recevront un agent permettant de visualiser les cellules tumorales, puis seront placés sous anesthésie brève pendant l’acquisition des images. La durée totale d’une session d’imagerie sera d’environ 30 minutes par animal, incluant l’administration de l’agent d’imagerie, l’anesthésie, l’acquisition des images et la surveillance du réveil. Une épilation locale pourra être réalisée afin d’améliorer la qualité de l’imagerie. Elle sera limitée à la zone nécessaire et ne sera renouvelée qu’en cas de repousse gênant l’acquisition du signal.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables attendus sont liés à l’implantation des cellules tumorales, aux manipulations répétées nécessaires au suivi, aux anesthésies brèves réalisées pour l’imagerie, ainsi qu’au développement de la tumeur. Les animaux pourront présenter une gêne transitoire au moment de l’implantation des cellules ou lors des manipulations. Le suivi par imagerie pourra entraîner un stress modéré lié à la contention, à l’anesthésie et aux manipulations répétées. Une irritation locale de la peau pourra également survenir après l’épilation limitée à la zone à imager. La croissance de la tumeur pourra provoquer une gêne locale, une tension de la peau, une masse palpable, une diminution de la mobilité selon la taille et la localisation de la tumeur, ou plus rarement une altération de l’état général. En cas de progression tumorale importante, une dissémination à d’autres tissus pourrait également contribuer à une dégradation de l’état général. Des critères d’arrêt précoces seront appliqués afin d’éviter toute souffrance excessive.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de l’expérimentation. Cette mise à mort est nécessaire car le projet repose soit sur le suivi complet de la croissance tumorale, soit sur le prélèvement des tumeurs et de certains tissus pour réaliser des analyses biologiques. Ces prélèvements permettront d’étudier les caractéristiques des tumeurs, leur organisation, leur activité moléculaire et leurs interactions avec leur environnement dans l’organisme. Les animaux ne pourront donc pas être réutilisés dans un autre projet. Les animaux seront mis à mort au plus tard 6 semaines après l’implantation des cellules tumorales, ou plus tôt pour les groupes destinés à des prélèvements à des temps définis. Ils seront également mis à mort avant la fin prévue de l’étude si des critères d’arrêt sont atteints, notamment en cas de tumeur trop volumineuse, d’ulcération, de perte de poids, de douleur, de gêne locomotrice ou d’altération importante de l’état général.

Remplacement

Avant d’envisager cette étude chez l’animal, les cellules tumorales sont étudiées en laboratoire afin de caractériser leurs propriétés et de sélectionner les conditions les plus pertinentes. Cependant, les cultures cellulaires ne permettent pas de reproduire toute la complexité d’un organisme vivant. En particulier, elles ne permettent pas d’étudier correctement la croissance d’une tumeur dans un tissu, ses échanges avec les cellules environnantes, son accès aux nutriments, ni ses interactions avec le système immunitaire. Ces éléments sont pourtant essentiels pour comprendre comment une tumeur se développe et progresse dans l’organisme. Il n’existe donc pas, pour cette question, de méthode alternative permettant de remplacer complètement l’utilisation d’animaux. Le recours à la souris est nécessaire pour valider les observations obtenues en laboratoire dans un contexte biologique complet.

Réduction

Le nombre d’animaux a été limité au minimum nécessaire pour obtenir des résultats interprétables, tout en évitant l’utilisation d’effectifs excessifs. Les groupes ont été dimensionnés afin de comparer plusieurs types de cellules tumorales et de tenir compte de la variabilité naturelle de la croissance des tumeurs. La croissance tumorale sera suivie plusieurs fois chez les mêmes animaux, grâce à des mesures externes et à une méthode d’imagerie répétée au cours du temps. Cette approche permet de réduire le nombre d’animaux, car elle évite de constituer de nouveaux groupes uniquement pour suivre l’évolution des tumeurs à chaque étape. Une première série d’animaux permettra de définir les moments les plus pertinents pour les prélèvements biologiques. Cette stratégie évite de multiplier inutilement les temps d’analyse dans la seconde série et limite ainsi le nombre total d’animaux utilisés.

Raffinement

Les animaux seront habitués à la manipulation avant le début de l’expérience afin de réduire leur stress. Les actes susceptibles d’être inconfortables seront réalisés sous anesthésie brève, avec protection systématique des yeux pendant l’anesthésie. Après chaque anesthésie, les animaux seront surveillés jusqu’à récupération d’un comportement normal, puis replacés dans leur cage d’origine. La croissance tumorale sera suivie régulièrement pendant 6 semaines maximum, ou jusqu’à l’atteinte d’un critère d’arrêt. L’état général des animaux, leur poids, leur mobilité, leur alimentation, l’aspect de leur pelage et l’aspect de la tumeur seront contrôlés tout au long de l’étude. Des critères d’arrêt précoces seront appliqués afin d’éviter toute souffrance excessive. En cas de perte de poids modérée ou de diminution de l’alimentation, une aide alimentaire sera mise en place. Si l’état de l’animal se dégrade ou si un critère d’arrêt est atteint, l’animal sera mis à mort.

Choix des espèces

La souris a été choisie car elle permet d’étudier le développement d’une tumeur dans un organisme vivant complet. Ce modèle permet de prendre en compte des éléments qui ne peuvent pas être correctement reproduits en culture cellulaire, comme l’organisation des tissus, les interactions entre la tumeur et les cellules environnantes, l’accès aux nutriments et les interactions avec le système immunitaire. Les cellules utilisées dans ce projet sont des cellules de souris. Les implanter chez des souris permet donc d’étudier leur comportement dans un environnement biologique adapté, sans introduire de différence d’espèce qui pourrait fausser l’interprétation des résultats. Les animaux seront utilisés à l’âge adulte jeune, à partir de 6 semaines. À cet âge, les souris sont sevrées, suffisamment développées pour permettre des manipulations reproductibles et disposent d’un système immunitaire fonctionnel. L’utilisation d’animaux plus jeunes serait moins adaptée en raison de leur développement encore en cours, de leur plus petite taille et de la difficulté accrue des manipulations répétées. Les animaux seront suivis pendant 6 semaines maximum après l’implantation des cellules tumorales, ou jusqu’à l’atteinte d’un critère d’arrêt.

196 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, et toutes celles opérées sont tuées pour prélever leur cerveau. Avant quatre jours de vie, les souriceaux reçoivent une injection de virus dans le cerveau, séparés de leur mère jusqu'à deux heures, puis une seconde injection cérébrale de trente à quarante-cinq minutes entre 24 et 28 jours. Le projet vise à démontrer chez un mammifère un mode de transport des vésicules dans les neurones, surnommé "Sushi-go-round", et ses retombées sur les maladies du système nerveux restent au conditionnel. Le porteur désigne le "cannibalisme maternel" comme le "plus gros problème" de ses procédures, et le résumé ne dit pas ce que deviennent les mères.

Objectifs

Comment les cellules du cerveau (les neurones) peuvent-elles réagir si rapidement aux signaux, alors qu'il faut parfois des minutes, voire des heures, pour que les molécules voyagent d’une cellule à l’autre? Grâce à l’utilisation de techniques in vitro et à la modélisation mathématique, nous avons découvert un nouveau mode de transport cellulaire expliquant comment le signal se transmet de façon rapide et efficace le long des connections cérébrales. Ces résultats, obtenus in vitro sur culture cellulaire de neurones, nécessitent maintenant d’être validés in vivo afin de démontrer la pertinence physiologique de ce nouveau mécanisme dans le cerveau de mammifère. Pour cela, nous proposons d’exprimer une molécule fluorescente dans le cerveau de souris adultes qui sera transportée le long des connections cérébrales. Nous bloquerons ensuite le mécanisme de transport en injectant un inhibiteur que nous avons identifié. Nous analyserons ensuite la localisation de la molécule fluorescente après fixation des tranches de cerveau. Si le nouveau mode de transport que nous avons découvert existe in vivo, nous devrions observer une accumulation de la molécule fluorescente au niveau des points de contact avec les neurones cibles. Ces travaux permettront ainsi de démontrer comment les neurones gèrent leur communication pour la transmission rapide et efficace du signal à travers le cerveau.

Bénéfices attendus

Le transport des vésicules dans les neurones est un processus essentiel qui permet de déplacer des protéines importantes du corps cellulaire vers les zones de communication entre les neurones, appelées synapses. Dans une étude précédente, nous avons découvert un nouveau mode de transport que nous avons surnommé "Sushi-go-round", qui joue un rôle dans la régulation de ces communications. Ce projet va nous permettre de prouver l'exitence de ce mode de transport chez les mammifères, ce qui nous aidera à mieux comprendre comment les neurones communiquent et s'adaptent. Ces découvertes pourraient avoir des implications majeures en neurosciences, en nous aidant à mieux saisir le fonctionnement du cerveau et en ouvrant de nouvelles voies pour comprendre les maladies qui affectent le système nerveux.

Procédures

Dans cette étude, des souris, qui n'ont même pas encore quatre jours de vie, vont recevoir une injection de virus dans une zone du cerveau. Cette opération dure entre 10 et 20 minutes. Pendant ce temps, les souriceaux seront séparés de leur mère pour un maximum de deux heures. Ensuite, quand ils seront âgés entre 24 et 28 jours (après sevrage), ils subiront une autre injection dans une autre partie précise de leur cerveau. Cette deuxième opération prendra un peu plus de temps, entre 30 et 45 minutes. Après un temps défini dans l’étape 0 du projet, les animaux seront mis à mort pour récupérer les cerveaux pour analyse.

Impact sur les animaux

- stress : Les souris nouveau-nés (P0-P4) et leurs mères seront séparés momentanément (120min maximum) donc cela engendrera du stress. -anesthésie : risque de déshydratation, dépression cardio-vasculaire et respiratoire, hypothermie. Après l’injection des nouveaux nés, un suivi de l’animal sera mis en place tous les jours pendant une semaine pour vérifier l’apparition de signes de souffrance (peau de couleur bleutée, vocalisation, changement de la respiration abdominale). Concernant les animaux sous chirurgie, un suivi postopératoire sera également mis en place pendant les 4h de traitement (Agité ou très immobile, vocalisation ou automutilation, Augmentation de la fréquence et de la respiration abdominale), jusqu’à leur mise à mort. Un traitement analgésique en sous cutané sera utilisé en présence de signes de souffrance.

Devenir

Tous les animaux ayant subis une chirurgie seront mis à mort pour les prélèvements.

Remplacement

Ce projet s'inscrit dans la continuité d'une recherche précédente qui a été réalisée dans notre laboratoire, où nous avons découvert un nouveau moyen par lequel les cellules nerveuses peuvent communiquer rapidement entre elles. . Ces résultats proviennent d’analyse à partir de culture de cellules de souris. Maintenant, nous devons vérifier si ce même processus se produit dans un organisme vivant, la souris. C'est pourquoi nous ne pouvons pas nous passer de ce modèle animal pour nos prochaines étapes de recherche.

Réduction

Pour réaliser nos expériences, nous devons déterminer combien de souris nous avons besoin. Cette décision est basée sur des études précédentes, ce qui nous aide à garantir que nos résultats seront fiables et reproductibles. Nous avons prévu d'utiliser 15 souris par groupe pour certaines analyses, en incluant à la fois des mâles et des femelles. Pour une autre partie de notre étude, qui concerne l'activité électrique des neurones, nous utiliserons 10 souris par groupe. De plus, afin de réduire le nombre de souris nécessaires tout en assurant que nos résultats soient cohérents, nous allons d'abord tester les paramètres d'injection des virus. Cela nous permettra d'optimiser nos méthodes avant de commencer les expériences principales.

Raffinement

Lors de la chirurgie, les souriceaux sont anesthésiés et ils reçoivent une injection d'analgésique. Nous veillons à ce que les animaux soient en contact avec de la litière provenant de leur cage d'origine afin qu'ils soient en présence d'odeurs familières. Le plus gros problème rencontré dans nos procédures est le cannibalisme maternel. Afin de diminuer au maximum ce phénomène, nous mettons en place plusieurs actions : 1- seules les femelles qui ne présentent pas de signes de stress sont utilisées 2- nous favorisons l'utilisation de femelles non primipares 3- une grande quantité de matériel de nidification est fournie 4- les femelles ne sont manipulées qu'avec des tunnels 5- deux à trois fois par semaine pendant la gestation, nous fournissons quelques friandises ou du gel nourrissant aux femelles afin qu'elles associent notre intervention à quelque chose de positif. La croissance pondérale est le principal marqueur de bonne santé chez les nouveau-nés puisqu'elle indique que l'individu arrive à se nourrir et que la mère s'occupe bien de lui. Ainsi tout individu qui présente une croissance pondérale altérée est, selon le degré, suivi de plus près (point limite) ou euthanasié (point d'arrêt).

Choix des espèces

Compte tenu du degré de similarité anatomique et cellulaire important entre le cerveau de souris et le cerveau humain, la souris est un modèle de choix pour étudier le rôle du transport axonal. Nous utiliserons des souris C57/BL6J. Les injections seront réalisées à deux stades de développements : 1/ Cerveau immature : injection de virus avant les 4 jours de vie du souriceaux 2/ Cerveau mature : injection après 21 à 24 jours de latence (après expression du virus) d'un inhibiteur du transport, pour visualiser l'accumulation de vésicules ( petites sacs) au niveau des prolongements des cellules nerveuses qui se trouve dans la zone du cerveau qui relie les deux hémisphères.

Après deux injections, dont celle de cellules de lymphome qui envahissent la rate et les ganglions, des souris sont pesées trois fois par semaine et prélevées de sang chaque semaine pendant cent jours au plus, certaines recevant en plus une injection quotidienne pendant quatorze jours. Au total, 6 660 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue pour prélever leurs organes, et la maladie peut réduire leur activité et leur mobilité pendant une à deux semaines. Le projet cherche à savoir si la façon dont les cellules cancéreuses produisent leur énergie influe sur la réponse aux cellules CAR-T, avec des retombées pour les patients au conditionnel. Les lots décrits totalisent 5 580 souris, et le résumé ne dit rien des 1 080 autres.

Objectifs

Le lymphome est un cancer du sang agressif et fréquent dans les pays industrialisés. Cette maladie est très hétérogène, ce qui explique qu’environ 40 % des patients ne répondent pas durablement au traitement de référence. Pour certains de ces patients, une thérapie innovante peut être proposée : la thérapie par cellules CAR-T. Cette thérapie est un traitement révolutionnaire contre le cancer qui consiste à modifier génétiquement les propres cellules immunitaires du patient pour les transformer en « super-soldats » capables de repérer et de détruire les cellules cancéreuses. Malgré l’efficacité remarquable de cette thérapie chez certains patients atteints de lymphome, environ la moitié d’entre eux ne répondent pas ou rechutent rapidement, notamment au cours de la première année. Il est donc essentiel de mieux comprendre les mécanismes qui déterminent l’efficacité de cette thérapie afin d’identifier de nouvelles stratégies permettant d’améliorer la réponse au traitement. Les cellules de lymphome peuvent utiliser différentes sources d’énergie pour se multiplier. L’objectif de ce projet est de déterminer si la manière dont les cellules cancéreuses produisent leur énergie influence leur sensibilité au traitement.

Bénéfices attendus

À terme, ces travaux pourraient contribuer à mieux identifier les patients susceptibles de répondre aux traitements et à développer de nouvelles stratégies permettant d’améliorer l’efficacité de cette thérapie chez les patients résistants.

Procédures

Les interventions suivantes seront réalisées sur des animaux vigiles : Lots 1 à 3 : 2 340 souris : deux injections (1 minute chacune), trois pesées par semaine pendant une durée maximale de 100 jours (1 minute par pesée) et un prélèvement sanguin par semaine (1 minute). Lot 4 : 360 souris : mise à disposition ad libitum d’un régime alimentaire pendant une durée maximale de 100 jours, associée à deux injections (1 minute chacune), trois pesées par semaine pendant une durée maximale de 100 jours (1 minute par pesée) et un prélèvement sanguin par semaine (1 minute). Lot 5 : 2 880 souris : : deux injections (1 minute chacune), trois pesées par semaine pendant une durée maximale de 100 jours (1 minute par pesée) et un prélèvement sanguin par semaine (1 minute). Une injection par jour pendant 14 jours et l’administration d’un traitement dans l’eau de boisson à volonté pendant 5 semaines.

Impact sur les animaux

Les nuisances attendues sont les suivantes : 1/ un stress transitoire et un inconfort léger liés aux contentions, auxquels peuvent s’ajouter, selon les procédures, les manipulations nécessaires à l’administration des traitements ; 2/ les effets liés au développement de la tumeur : après leur injection, les cellules tumorales se multiplient principalement dans la rate et les ganglions lymphatiques, qui jouent un rôle important dans le fonctionnement du système immunitaire. La progression tumorale va entraîner une gêne légère à modérée et, à un stade plus avancé de la maladie, une diminution de l’activité ainsi qu’une mobilité réduite. Ces effets sont attendus environ 3 à 4 semaines après l’injection des cellules tumorales et peuvent persister pendant 1 à 2 semaines.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin des procédures afin de prélever les organes et de réaliser les analyses in vitro nécessaires à l’obtention des résultats scientifiques.

Remplacement

Notre projet évalue l’importance de la source de production de l’énergie par la cellule tumorale sur la réponse au traitement. Des études in vitro ont été menées en amont afin d’identifier et de sélectionner les mécanismes métaboliques les plus pertinents à étudier. Le métabolisme tumoral au sein de son environnement est profondément différent de celui observé in vitro et il n’existe pas à ce jour d’autre alternative à l’utilisation des souris pour l’étude in vivo des mécanismes métaboliques impliqués dans l’échappement des cellules tumorales aux thérapies proposées.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés a été réduit au strict minimum, tout en restant suffisant pour obtenir des résultats fiables. Nous avons utilisé un outil informatique, basé sur nos premières données, pour calculer le nombre d’animaux réellement nécessaires. Après la fin des expériences, nous recueillerons également plusieurs organes et tissus afin de réaliser un maximum d’analyses complémentaires avec les mêmes animaux. Enfin, le projet est organisé par étapes. En fonction des résultats obtenus au laboratoire et chez l’animal, certaines expériences pourront ne pas être réalisées si elles ne sont plus nécessaires.

Raffinement

Nous avons établi des critères d’arrêt précis, précoces et adaptés pour détecter le lymphome suffisamment tôt afin de limiter toute souffrance animale, tout en conservant une exploitation optimale des résultats scientifiques. Nous serons particulièrement attentifs à toute modification du comportement et de l’aspect physique des animaux.

Choix des espèces

La souris est une espèce animale relativement proche de l’homme, et est le modèle de choix utilisé par la communauté scientifique pour étudier les acteurs moléculaires et cellulaires impliqués dans le cancer. De plus, la souris présente plusieurs avantages comme un cycle de vie relativement court, une natalité importante et un modèle facile à élever. En absence de système pouvant reproduire in vitro la réaction immunitaire et le dialogue entre les différents médiateurs cellulaires, il n’existe pas de méthode alternative à l’expérimentation animale pour mener à bien ce projet. Les souris auront entre 5 et 20 semaines car c’est durant cette période qu’il y a la meilleure prise de tumeur.

Deux mois d'hébergement à 30 °C pour douze d'entre elles, afin de dérégler leur graisse brune : 60 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue pour prélever leurs tissus, leurs organes et leur plasma. Toutes subissent deux prises de sang à la queue et un régime liquide chargé de glucose marqué, et vingt-quatre une échographie de trente minutes sous anesthésie. Le projet met au point une méthode de traçage par l'alimentation qui éviterait la pose chirurgicale d'un cathéter, et le porteur en attend moins de souris tuées "dans de futurs projets". Les plus jeunes entrent dans l'étude à cinq semaines, pour avoir environ trois mois à la sortie de la chaleur, âge où leur graisse brune est assez développée pour, selon le porteur, y "induire un dysfonctionnement".

Objectifs

Avec le fait que les gens vivent de plus en plus longtemps, il devient très important de garder les personnes âgées en bonne santé, autonomes et avec une bonne qualité de vie. En vieillissant, le corps devient moins efficace pour faire face aux stress et pour maintenir un bon équilibre énergétique. Cet équilibre correspond au fait que ce que l’on mange (apports) et ce que le corps dépense restent en balance. Normalement, plusieurs organes travaillent ensemble pour maintenir cet équilibre et s’adapter aux changements. Mais avec l’âge, cette coopération fonctionne moins bien, ce qui peut favoriser des problèmes métaboliques (comme le diabète ou l’obésité). Parmi les organes importants, il y a les tissus adipeux (les graisses du corps) avec la graisse blanche (stockage d’énergie) et la graisse brune et beige (qui brûle l’énergie sous forme de chaleur). Avec le vieillissement, ces tissus (surtout les graisses brunes et beiges) fonctionnent moins bien. Cela peut perturber la manière dont le corps utilise et distribue l’énergie, ce qui impacte le fonctionnement global de l’organisme. Pour étudier comment l’énergie circule dans le corps, les chercheurs utilisent des approches spéciales : ils donnent à des souris des molécules “marquées” (repérables) pour suivre leur transformation dans le corps. Ces approches nécessitent souvent une chirurgie pour réaliser une perfusion intraveineuse via un cathéter. De plus, elles sont très compliquées et ne sont pas toujours adaptées pour étudier certains types de molécules comme les lipides (graisses). Ce projet a donc pour objectif de développer une méthode plus simple et plus efficace (avec l’utilisation d’un régime liquide spécial au lieu d’une chirurgie) pour suivre ces molécules dans le corps et de valider une technique d’analyse qui va permettre d'étudier tous les types de molécules en même temps (au lieu de l'utilisation de deux techniques auparavant). Une fois ces méthodes validées, elles permettront de mieux comprendre comment le métabolisme change quand certaines graisses (brunes et beiges) ne fonctionnent plus correctement au cours de l’âge. Ce projet sera réalisé sur deux établissements utilisateurs.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de continuer d'étudier comment certaines graisses du corps (les tissus adipeux) en particulier brunes et beiges influencent le métabolisme, en particulier la gestion des lipides (les graisses), lorsqu'elles ne fonctionnent plus correctement. Si cette perte d’activité observée au cours de l'âge joue un rôle dans les problèmes du métabolisme, alors ces tissus pourraient devenir des cibles importantes pour maintenir un bon équilibre énergétique, favoriser un vieillissement en meilleure santé et diminuer la dépendance des personnes âgées. Par ailleurs, ce projet permettra grâce à l'utilisation d'un régime liquide de diminuer la souffrance des animaux en évitant une chirurgie. De plus grâce à la validation de cette technique d'analyse qui permettra d'étudier tous les types de molécules en même temps (au lieu de l'utilisation de deux techniques) nous pourrons réaliser l'analyse sur une seule et même souris au lieu de deux. Ceci pourra optimiser et réduire le nombre d’animaux utilisé dans de futurs projets.

Procédures

Pour la totalité des souris, une prise de sang à la queue sera réalisée juste avant le changement de régime puis juste avant la mise à mort. Vingt-quatre animaux subiront une seule échographie, qui durera 30 minutes environ, sous anesthésie gazeuse pour mesurer leur debit sanguin. Douze animaux seront hébergés pendant deux mois à une température de 30°C (température dite de thermoneutralité). Toutes ces interventions seront réalisées dans un service de zootechnie.

Impact sur les animaux

Certaines nuisances ou effets indésirables sont attendus au cours de ce projet : - le stress des animaux au moment de leur réception, - le stress lié à l’individualisation des animaux en cas d’agressivité, - le stress lié aux prélèvements sanguins en raison de la contention nécessaire à la prise de sang, - le stress possible lié à la température d’hébergement de 30°C (30°C étant la température de thermoneutralité pour la souris c'est à dire température à laquelle la souris ne met pas en jeu le frisson et/ou l'augmentation du métabolisme énergétique pour réguler sa température corporelle)(par expérience cette température de 30°C n'engendre généralement pas de stress particulier), - le stress possible liè au changement de régime (toutefois ce régime liquide à été décrit comme sans stress).

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort pour pouvoir prélever leurs tissus et organes ainsi que du plasma pour réaliser l'analyse des molécules du corps et étudier le devenir de ces molécules.

Remplacement

Notre projet consiste à mettre au point une méthode d'administration de molécules marqués et d'extraction de ces molécules afin d'étudier la distribution et le devenir de ces molécules dans l'organisme en entier dans un contexte d'inactivation des tissus adipeux. Il s'agit d'une étude intégrée à l'échelle de l'organisme impliquant des échanges de molécules entre différents tissus. Le recours à l’animal est donc indispensable pour ce projet de recherche. Les approches in vitro ne peuvant pas être envisagées car elles ne permettent pas d'avoir cet aspect intégré d'échanges de molécules. De même les approches in silico ne peuvent pas être utilisées car elles ne sont pas en capacité de modéliser la complexité du métabolisme de chacun des organes d'un idividu et les échanges de molécules qui ont lieu entre ces différents organes. Nous avons décidé de travailler sur la souris puisque cette espèce est un modèle bien établi pour l’analyse du métabolisme et dans lequel la biologie des tissus adipeux, en particulier les tissus adipeux bruns et beiges, a été bien étudiée.

Réduction

Compte tenu de la variabilité interindividuelle observée concernant le métabolisme, pour chacune des conditions, 8 souris seront utlisées (4 souris supplémentaires seront utilisées comme contrôles non marquées). Ce nombre d'animaux est necessaire pour avoir 90% de chance de voir une différence significative sur la quantité de molécules marquées. Pour déterminer ce nombre de souris le logiciel EDA a été utilisé (outil d'analyse permettant de déterminer le nombre d'animaux en se basant sur le plan expérimental et les statistiques). De plus grâce à la validation de cette technique d'analyse qui permettra d'étudier tous les types de molécules en même temps (au lieu de l'utilisation de deux techniques) nous pourrons réaliser l'analyse sur une seule et même souris au lieu de deux. Ceci pourra optimiser et réduire le nombre d’animaux utilisé dans de futurs projets.

Raffinement

Les procédures seront réalisées dans le respect du bien-être animal pour diminuer la souffrance, la douleur ou l’angoisse des animaux, en respectant les points limites préalablement définis. Les animaux seront placés en zone d’acclimatation lors de leur arrivée à la zootechnie. Ils seront pris en charge par le personnel compétent de la zootechnie qui vérifie leur état et place de l’enrichissement dans les cages pour diminuer le stress du transport et permettre aux animaux de faire un nid. Les animaux mâles issus de différents cartons de transport ne seront jamais mélangés lors de la répartition dans les cages d’hébergement. Le caractère grégaire des souris sera respecté puisqu’elles ne seront jamais seules en cage (sauf si un isolement est nécessaire pour cause d’agressivité et de bagarres). Pour le transport entre les deux bâtiments, les animaux seront tranportés, à pieds, dans leur cages d'origines (pour diminuer le stress) placées dans un système de transport de type sac isotherme opaque fermé. Dix minutes plus tard à l'arrivée au second bâtiment, les animaux seront directement placés soit sur un portoir ventilé identique au premier bâtiment pour les souris hébergées à 21°C, soit dans une armoire à thermoneutralité similaire au premier bâtiment pour les souris hébérgées à 30°C afin de diminuer le stress. Les souris seront surveillées quotidiennement par le personnel de la zootechnie pour repérer des problèmes éventuels (comportement anormal, blessure, maigreur, problème de dentition, …). Elles seront également surveillées et pesées (par une personne impliquée dans le projet) tous les 15 jours pendant les deux mois d'hébergement à 30°C, en début et fin d'acclimatation au régime liquide puis toutes les 24h pendant l'exposition au régime liquide supplémenté avec le glucose marqué. La vétérinaire référente et/ou le zootechnicien expérimenté seront contactés pour avis lorsque une souris présentera une perte de poids supérieure à 10% par rapport au poids initial et/ou sera prostrée, aura le poil hirsute, le dos rond, des signes de diarrhée (postérieur sale, souillé). Toute souris sera mis à mort quand elle présentera une perte de poids supérieure à 20% par rapport au poids initial et/ou après avis de la vétérinaire référente et/ou le zootechnicien expérimenté.

Choix des espèces

Nous avons décidé de travailler sur la souris puisque cette espèce est un modèle bien établi pour l’analyse du métabolisme et dans lequel la biologie des tissus adipeux, en particulier les graisses brunes et beiges, a été bien étudiée. Nous utiliserons des souris âgées de 3 à 4 mois et des souris âgées de 5 semaines afin que ces dernières aient environ 3 mois après les deux mois d'hébergement à 30°C. A cet âge les souris sont de jeunes adultes avec une graisse brune bien développée sur lequel nous pouvons induire un dysfonctionnement suite à l'hébergement à thermoneutralité (30°C).