Multisystémique

Deux mois d'hébergement à 30 °C pour douze d'entre elles, afin de dérégler leur graisse brune : 60 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue pour prélever leurs tissus, leurs organes et leur plasma. Toutes subissent deux prises de sang à la queue et un régime liquide chargé de glucose marqué, et vingt-quatre une échographie de trente minutes sous anesthésie. Le projet met au point une méthode de traçage par l'alimentation qui éviterait la pose chirurgicale d'un cathéter, et le porteur en attend moins de souris tuées "dans de futurs projets". Les plus jeunes entrent dans l'étude à cinq semaines, pour avoir environ trois mois à la sortie de la chaleur, âge où leur graisse brune est assez développée pour, selon le porteur, y "induire un dysfonctionnement".

Objectifs

Avec le fait que les gens vivent de plus en plus longtemps, il devient très important de garder les personnes âgées en bonne santé, autonomes et avec une bonne qualité de vie. En vieillissant, le corps devient moins efficace pour faire face aux stress et pour maintenir un bon équilibre énergétique. Cet équilibre correspond au fait que ce que l’on mange (apports) et ce que le corps dépense restent en balance. Normalement, plusieurs organes travaillent ensemble pour maintenir cet équilibre et s’adapter aux changements. Mais avec l’âge, cette coopération fonctionne moins bien, ce qui peut favoriser des problèmes métaboliques (comme le diabète ou l’obésité). Parmi les organes importants, il y a les tissus adipeux (les graisses du corps) avec la graisse blanche (stockage d’énergie) et la graisse brune et beige (qui brûle l’énergie sous forme de chaleur). Avec le vieillissement, ces tissus (surtout les graisses brunes et beiges) fonctionnent moins bien. Cela peut perturber la manière dont le corps utilise et distribue l’énergie, ce qui impacte le fonctionnement global de l’organisme. Pour étudier comment l’énergie circule dans le corps, les chercheurs utilisent des approches spéciales : ils donnent à des souris des molécules “marquées” (repérables) pour suivre leur transformation dans le corps. Ces approches nécessitent souvent une chirurgie pour réaliser une perfusion intraveineuse via un cathéter. De plus, elles sont très compliquées et ne sont pas toujours adaptées pour étudier certains types de molécules comme les lipides (graisses). Ce projet a donc pour objectif de développer une méthode plus simple et plus efficace (avec l’utilisation d’un régime liquide spécial au lieu d’une chirurgie) pour suivre ces molécules dans le corps et de valider une technique d’analyse qui va permettre d'étudier tous les types de molécules en même temps (au lieu de l'utilisation de deux techniques auparavant). Une fois ces méthodes validées, elles permettront de mieux comprendre comment le métabolisme change quand certaines graisses (brunes et beiges) ne fonctionnent plus correctement au cours de l’âge. Ce projet sera réalisé sur deux établissements utilisateurs.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de continuer d'étudier comment certaines graisses du corps (les tissus adipeux) en particulier brunes et beiges influencent le métabolisme, en particulier la gestion des lipides (les graisses), lorsqu'elles ne fonctionnent plus correctement. Si cette perte d’activité observée au cours de l'âge joue un rôle dans les problèmes du métabolisme, alors ces tissus pourraient devenir des cibles importantes pour maintenir un bon équilibre énergétique, favoriser un vieillissement en meilleure santé et diminuer la dépendance des personnes âgées. Par ailleurs, ce projet permettra grâce à l'utilisation d'un régime liquide de diminuer la souffrance des animaux en évitant une chirurgie. De plus grâce à la validation de cette technique d'analyse qui permettra d'étudier tous les types de molécules en même temps (au lieu de l'utilisation de deux techniques) nous pourrons réaliser l'analyse sur une seule et même souris au lieu de deux. Ceci pourra optimiser et réduire le nombre d’animaux utilisé dans de futurs projets.

Procédures

Pour la totalité des souris, une prise de sang à la queue sera réalisée juste avant le changement de régime puis juste avant la mise à mort. Vingt-quatre animaux subiront une seule échographie, qui durera 30 minutes environ, sous anesthésie gazeuse pour mesurer leur debit sanguin. Douze animaux seront hébergés pendant deux mois à une température de 30°C (température dite de thermoneutralité). Toutes ces interventions seront réalisées dans un service de zootechnie.

Impact sur les animaux

Certaines nuisances ou effets indésirables sont attendus au cours de ce projet : - le stress des animaux au moment de leur réception, - le stress lié à l’individualisation des animaux en cas d’agressivité, - le stress lié aux prélèvements sanguins en raison de la contention nécessaire à la prise de sang, - le stress possible lié à la température d’hébergement de 30°C (30°C étant la température de thermoneutralité pour la souris c'est à dire température à laquelle la souris ne met pas en jeu le frisson et/ou l'augmentation du métabolisme énergétique pour réguler sa température corporelle)(par expérience cette température de 30°C n'engendre généralement pas de stress particulier), - le stress possible liè au changement de régime (toutefois ce régime liquide à été décrit comme sans stress).

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort pour pouvoir prélever leurs tissus et organes ainsi que du plasma pour réaliser l'analyse des molécules du corps et étudier le devenir de ces molécules.

Remplacement

Notre projet consiste à mettre au point une méthode d'administration de molécules marqués et d'extraction de ces molécules afin d'étudier la distribution et le devenir de ces molécules dans l'organisme en entier dans un contexte d'inactivation des tissus adipeux. Il s'agit d'une étude intégrée à l'échelle de l'organisme impliquant des échanges de molécules entre différents tissus. Le recours à l’animal est donc indispensable pour ce projet de recherche. Les approches in vitro ne peuvant pas être envisagées car elles ne permettent pas d'avoir cet aspect intégré d'échanges de molécules. De même les approches in silico ne peuvent pas être utilisées car elles ne sont pas en capacité de modéliser la complexité du métabolisme de chacun des organes d'un idividu et les échanges de molécules qui ont lieu entre ces différents organes. Nous avons décidé de travailler sur la souris puisque cette espèce est un modèle bien établi pour l’analyse du métabolisme et dans lequel la biologie des tissus adipeux, en particulier les tissus adipeux bruns et beiges, a été bien étudiée.

Réduction

Compte tenu de la variabilité interindividuelle observée concernant le métabolisme, pour chacune des conditions, 8 souris seront utlisées (4 souris supplémentaires seront utilisées comme contrôles non marquées). Ce nombre d'animaux est necessaire pour avoir 90% de chance de voir une différence significative sur la quantité de molécules marquées. Pour déterminer ce nombre de souris le logiciel EDA a été utilisé (outil d'analyse permettant de déterminer le nombre d'animaux en se basant sur le plan expérimental et les statistiques). De plus grâce à la validation de cette technique d'analyse qui permettra d'étudier tous les types de molécules en même temps (au lieu de l'utilisation de deux techniques) nous pourrons réaliser l'analyse sur une seule et même souris au lieu de deux. Ceci pourra optimiser et réduire le nombre d’animaux utilisé dans de futurs projets.

Raffinement

Les procédures seront réalisées dans le respect du bien-être animal pour diminuer la souffrance, la douleur ou l’angoisse des animaux, en respectant les points limites préalablement définis. Les animaux seront placés en zone d’acclimatation lors de leur arrivée à la zootechnie. Ils seront pris en charge par le personnel compétent de la zootechnie qui vérifie leur état et place de l’enrichissement dans les cages pour diminuer le stress du transport et permettre aux animaux de faire un nid. Les animaux mâles issus de différents cartons de transport ne seront jamais mélangés lors de la répartition dans les cages d’hébergement. Le caractère grégaire des souris sera respecté puisqu’elles ne seront jamais seules en cage (sauf si un isolement est nécessaire pour cause d’agressivité et de bagarres). Pour le transport entre les deux bâtiments, les animaux seront tranportés, à pieds, dans leur cages d'origines (pour diminuer le stress) placées dans un système de transport de type sac isotherme opaque fermé. Dix minutes plus tard à l'arrivée au second bâtiment, les animaux seront directement placés soit sur un portoir ventilé identique au premier bâtiment pour les souris hébergées à 21°C, soit dans une armoire à thermoneutralité similaire au premier bâtiment pour les souris hébérgées à 30°C afin de diminuer le stress. Les souris seront surveillées quotidiennement par le personnel de la zootechnie pour repérer des problèmes éventuels (comportement anormal, blessure, maigreur, problème de dentition, …). Elles seront également surveillées et pesées (par une personne impliquée dans le projet) tous les 15 jours pendant les deux mois d'hébergement à 30°C, en début et fin d'acclimatation au régime liquide puis toutes les 24h pendant l'exposition au régime liquide supplémenté avec le glucose marqué. La vétérinaire référente et/ou le zootechnicien expérimenté seront contactés pour avis lorsque une souris présentera une perte de poids supérieure à 10% par rapport au poids initial et/ou sera prostrée, aura le poil hirsute, le dos rond, des signes de diarrhée (postérieur sale, souillé). Toute souris sera mis à mort quand elle présentera une perte de poids supérieure à 20% par rapport au poids initial et/ou après avis de la vétérinaire référente et/ou le zootechnicien expérimenté.

Choix des espèces

Nous avons décidé de travailler sur la souris puisque cette espèce est un modèle bien établi pour l’analyse du métabolisme et dans lequel la biologie des tissus adipeux, en particulier les graisses brunes et beiges, a été bien étudiée. Nous utiliserons des souris âgées de 3 à 4 mois et des souris âgées de 5 semaines afin que ces dernières aient environ 3 mois après les deux mois d'hébergement à 30°C. A cet âge les souris sont de jeunes adultes avec une graisse brune bien développée sur lequel nous pouvons induire un dysfonctionnement suite à l'hébergement à thermoneutralité (30°C).

180 médakas vont être utilisés, tous tués à l'issue, chacun passant environ cinq heures par séance dans un dispositif qui mesure sa consommation d'oxygène puis le fait nager contre un courant dont la vitesse augmente progressivement. Chaque poisson reçoit d'abord un marquage sous la peau sous anesthésie, de dix à quinze minutes, puis vit à 20, 25 ou 30 degrés pendant une semaine ou environ deux mois selon le groupe. À chaque étape, deux poissons par aquarium sont anesthésiés profondément, saignés et mis à mort sans réveil, les autres subissant le même sort à la fin du protocole, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Le porteur justifie le choix du médaka par sa tolérance de 0 à 40 degrés, sa reproduction rapide, et par la plateforme d'élevage dont l'INRAE d'Aix-en-Provence dispose déjà.

Objectifs

Le réchauffement climatique entraîne une augmentation de la température des rivières, des lacs et des autres milieux aquatiques. Cette hausse peut avoir des conséquences importantes pour les poissons d’eau douce, car leur température corporelle dépend directement de celle de l’eau. Lorsque l’eau se réchauffe, leurs besoins en énergie et en oxygène augmentent. On ne comprend cependant pas encore complètement comment les poissons parviennent à s’adapter lorsqu'ils sont exposés à des températures élevées pendant une longue période. Le projet EPO a pour objectif de mieux comprendre les mécanismes qui permettent aux poissons de s’adapter à ces changements de température. Les chercheurs étudieront notamment la manière dont leur organisme utilise l’oxygène et produit l’énergie nécessaire à leur fonctionnement, afin de déterminer pourquoi certains poissons supportent mieux la chaleur que d’autres. Pour cela, l’étude sera réalisée sur une espèce de petit poisson appelée médaka (Oryzias latipes). Les poissons seront maintenus dans des aquariums à trois températures différentes (20, 25 et 30 °C). Une partie des animaux sera étudiée après une semaine d’exposition, et une autre après environ deux mois, afin de comparer les effets à court et à long terme. Les chercheurs mesureront leur consommation d’oxygène, leurs capacités physiques ainsi que certains paramètres de leur sang et du fonctionnement de leurs cellules. Les résultats de ce projet permettront de mieux comprendre la capacité des poissons à s’adapter au réchauffement des eaux. Ils contribueront à mieux prévoir les effets du changement climatique sur les espèces aquatiques et pourront aider à orienter les actions de protection de ces milieux.

Bénéfices attendus

L’étude des effets du changement climatique sur les poissons d’eau douce est essentielle pour mieux comprendre et protéger les milieux aquatiques. Lorsque la température de l’eau augmente, le fonctionnement de leur organisme peut être perturbé. Cette augmentation de température entraîne également une diminution de la solubilité de l’oxygène dans l’eau, réduisant ainsi sa disponibilité pour les organismes aquatiques. Les poissons sont donc confrontés à une double contrainte physiologique : une augmentation de leurs besoins en oxygène liée à l’accélération de leur métabolisme, alors même que la quantité d’oxygène disponible dans leur environnement diminue. Toutefois, la réponse des poissons au réchauffement ne dépend pas uniquement de la disponibilité en oxygène du milieu, mais également de leur capacité à transporter, diffuser et utiliser cet oxygène au niveau des tissus.. Le projet EPO a pour objectif de mieux comprendre comment les poissons réagissent lorsque l’eau se réchauffe. Les chercheurs étudieront la manière dont leur organisme transporte et utilise l’oxygène, depuis la respiration de l’animal jusqu’au fonctionnement de ses cellules. En mesurant leur consommation d’oxygène, en analysant certaines caractéristiques de leur sang et le fonctionnement de leurs cellules, ils chercheront à déterminer si les difficultés rencontrées à haute température sont dues à un transport insuffisant de l’oxygène, à une mauvaise utilisation de celui-ci par les cellules, ou à une combinaison de ces deux phénomènes. Les résultats de ce projet permettront de mieux comprendre pourquoi certaines espèces supportent mieux le réchauffement que d’autres. Ils aideront à mieux prévoir les conséquences du changement climatique sur les populations de poissons et apporteront des connaissances utiles pour la protection et la gestion des écosystèmes aquatiques.

Procédures

Après leur arrivée et une période d’adaptation dans l’animalerie, les médakas seront répartis dans des aquariums maintenus à trois températures différentes : 20, 25 ou 30 °C. Chaque poisson recevra un petit marquage sous la peau, réalisé sous anesthésie, afin de pouvoir le reconnaître et suivre son évolution tout au long de l’étude. Cette intervention durera environ 10 à 15 minutes par poisson. Les poissons seront ensuite étudiés dans un dispositif permettant de mesurer leur consommation d’oxygène et leurs capacités de nage. Ils seront placés dans ce dispositif environ une à deux heures avant les mesures afin de réduire le stress lié aux manipulations. Les chercheurs mesureront d'abord leur consommation d’oxygène au repos, puis leur demanderont de nager face à un courant dont la vitesse augmentera progressivement afin d'évaluer leurs capacités physiques. Chaque séance de mesure durera environ cinq heures par poisson. Au début de l'étude, puis après une semaine et après environ deux mois d'exposition aux différentes températures, les poissons seront pesés, mesurés et soumis à ces mesures de consommation d’oxygène. À chacun de ces moments, deux poissons par aquarium seront anesthésiés profondément afin de réaliser un prélèvement de sang. Ils seront ensuite mis à mort pour permettre l'analyse de certains organes et cellules, indispensable pour comprendre comment leur organisme produit et utilise l'énergie.

Impact sur les animaux

Les principales contraintes pour les poissons sont liées aux différentes manipulations nécessaires au suivi de l’étude. Ils recevront un petit marquage individuel sous anesthésie, seront régulièrement manipulés pour être pesés et mesurés, et participeront à des tests permettant de mesurer leur consommation d’oxygène et leurs capacités de nage. Ces manipulations peuvent provoquer un stress temporaire, une respiration plus rapide pendant un court moment, ainsi qu'une fatigue passagère après les tests de nage. Le marquage peut également entraîner une légère irritation au niveau de la zone d’injection. Après chaque anesthésie, les poissons seront surveillés jusqu’à leur récupération complète avant d’être replacés dans leur aquarium. Les poissons seront maintenus à trois températures différentes (20, 25 et 30 °C). Ces températures sont adaptées à cette espèce et correspondent à des conditions qu'elle peut rencontrer dans son environnement. Les changements de température seront réalisés progressivement afin de limiter le stress. La qualité de l’eau, notamment sa température, son oxygénation et ses autres paramètres, sera contrôlée régulièrement tout au long de l’étude pour garantir de bonnes conditions de vie. Les poissons seront observés chaque jour afin de vérifier leur état de santé. Les chercheurs surveilleront notamment leur comportement, leur alimentation, leur respiration et leur façon de nager. Si un poisson présente des signes de souffrance ou un problème de santé persistant, il sera retiré de l’étude et pris en charge selon les procédures prévues. Les prélèvements de sang et de tissus seront réalisés uniquement sur des poissons profondément anesthésiés. Ils seront ensuite mis à mort sans être réveillés. L'ensemble du projet a été conçu pour limiter autant que possible le nombre de manipulations, le stress et les effets sur les animaux, tout en permettant de répondre aux objectifs scientifiques de l'étude.

Devenir

À l’issue des différentes étapes expérimentales, certains poissons seront mis à mort afin de réaliser les prélèvements sanguins et tissulaires indispensables aux objectifs scientifiques du projet. Ces prélèvements doivent être effectués immédiatement après la mise à mort afin de préserver l’intégrité fonctionnelle des tissus et des cellules utilisés pour les analyses, notamment celles portant sur la respiration mitochondriale. Les autres poissons seront maintenus dans leurs conditions expérimentales jusqu’à la fin du protocole. Ils seront ensuite également mis à mort afin de permettre la réalisation des analyses terminales prévues dans le projet. Le nombre d’animaux utilisés et mis à mort a été limité au strict minimum nécessaire pour atteindre les objectifs scientifiques tout en garantissant la robustesse des analyses, conformément au principe de Réduction.

Remplacement

À ce jour, il n’existe pas de méthode permettant de remplacer l’utilisation de poissons vivants pour cette étude. Les chercheurs doivent observer le fonctionnement de l’animal dans son ensemble afin de comprendre comment il réagit lorsque la température de l’eau augmente. Les expériences réalisées sur des cellules ou les modèles informatiques ne permettent pas de reproduire fidèlement le fonctionnement d’un organisme vivant. L’utilisation de poissons est donc indispensable pour comprendre comment ils s’adaptent au réchauffement de leur environnement.

Réduction

Le nombre de poissons a été limité au minimum nécessaire pour répondre aux objectifs du projet tout en obtenant des résultats fiables. Les poissons seront répartis dans plusieurs aquariums et exposés à trois températures différentes (20, 25 et 30 °C). Les mêmes poissons seront suivis tout au long de l’étude afin de réaliser plusieurs mesures sur les mêmes individus, ce qui permet de recueillir davantage d’informations sans utiliser plus d’animaux. Seul un petit nombre de poissons sera mis à mort à chaque étape de l’étude pour réaliser les analyses qui nécessitent des prélèvements de sang et de tissus. Enfin, le marquage individuel des poissons permettra de suivre chaque animal au cours de l’étude et de limiter le nombre total d’animaux utilisés.

Raffinement

Les poissons sont maintenus dans des conditions adaptées à leurs besoins afin de préserver leur bien-être tout au long de l’étude. Ils sont élevés en groupes dans des aquariums aménagés avec des refuges et des plantes pour limiter le stress et favoriser leurs comportements naturels. Ils sont nourris quotidiennement et la qualité de l’eau est contrôlée régulièrement. Les animaux sont observés chaque jour et, en cas de problème, des mesures sont prises immédiatement. Si nécessaire, le vétérinaire est consulté et un poisson peut être isolé en aquarium de quarantaine. Toutes les manipulations sont réalisées par du personnel formé. Les procédures susceptibles d’être stressantes sont effectuées sous anesthésie afin de limiter la douleur et le stress. Les poissons sont manipulés avec précaution, dans un environnement calme, puis replacés dans leur aquarium après une période de récupération. Leur état est surveillé tout au long de l’étude et tout animal présentant des signes persistants de souffrance est retiré de l’expérimentation conformément aux points limites définis dans le projet.

Choix des espèces

Le médaka est un petit poisson particulièrement adapté à cette étude, car il peut vivre dans une large gamme de températures (de 0 à 40 °C). Il permet ainsi de mieux comprendre comment les poissons s’adaptent au réchauffement de leur environnement. Cette espèce se reproduit rapidement, est facile à élever et supporte bien les manipulations nécessaires à l’étude. L’INRAE d’Aix-en-Provence dispose déjà d’une plateforme d’élevage dédiée à cette espèce, avec des installations adaptées et du personnel expérimenté, garantissant de bonnes conditions d’hébergement et le bien-être des animaux.

Testées en comportement et en cognition, puis en motricité, en force et en coordination, 1 288 souris courent jusqu'à soixante minutes sur tapis roulant, subissent six heures puis quatre heures de jeûne, une injection et une incision de la queue pour cinq prises de sang étalées sur deux heures. Ces procédures impliquent un niveau de souffrance modéré et concernent des souris de 3 mois et des souris de 18, 21 et 24 mois, ce dernier âge étant associé selon le porteur à une survie d'environ 60 %. Aucun des tests comportementaux et cognitifs employés n'est nommé, et le résumé annonce parmi les effets du test de tolérance à l'insuline une hypoglycémie avec léthargie, tremblements et perte de réactivité, ainsi qu'une fatigue liée à l'exercice forcé. Toutes sont tuées et leurs organes collectés pour identifier les mécanismes cellulaires en cause.

Objectifs

Le vieillissement s’accompagne d’une diminution progressive des capacités physiques et cognitives, ainsi que d’une augmentation du risque de maladies liées à l’âge. Un des mécanismes biologiques impliqués dans ce processus est un système naturel de nettoyage et recyclage cellulaire qui permet aux cellules d’éliminer et de renouveler leurs composants endommagés. Ce mécanisme joue un rôle essentiel dans le maintien de l’équilibre cellulaire et la protection des tissus face au stress. Cependant, l’efficacité du recyclage cellulaire diminue avec l’âge, ce qui contribue au déclin des fonctions physiologiques. L’objectif de ce projet est d’étudier l’impact du recyclage cellulaire sur les capacités cognitives, motrices et physiques au cours du vieillissement. Pour cela, des souris génétiquement modifiées seront utilisées afin de mieux comprende les effets bénéfiques du recyclage cellulaire. Les études seront réalisées chez des souris jeunes adultes ainsi que chez des souris âgées à différents stades du vieillissement. Cette approche permettra d’analyser l’évolution des effets du recyclage cellulaire au fil du temps et d’identifier les périodes du vieillissement au cours desquelles son augmentation est la plus bénéfique. À terme, ces travaux contribueront à une meilleure compréhension des mécanismes biologiques du vieillissement et pourraient ouvrir de nouvelles pistes pour prévenir le déclin fonctionnel lié à l’âge.

Bénéfices attendus

Ce projet de recherche vise à mieux comprendre le rôle d’un mécanisme naturel de recyclage des cellules, dans le vieillissement de l’organisme. Ce processus permet aux cellules d’éliminer leurs composants endommagés et de maintenir le fonctionnement des tissus. Avec l’âge, cette capacité de recyclage diminue, ce qui est associé à l’apparition progressive de limitations physiques, cognitives et métaboliques. Les résultats de ce projet permettront d’identifier des mécanismes biologiques impliqués dans le déclin des fonctions observé au cours du vieillissement. En étudiant ces mécanismes à différentes étapes de la vie, ce travail apportera des éléments concrets sur les liens entre l’activité de ce processus cellulaire et l’évolution des capacités fonctionnelles avec l’âge. Ce projet permettra également de caractériser des modifications observées à l’échelle de l’organisme lorsque le recyclage cellulaire est modulé, en lien avec les interactions entre différents tissus. Ces données permettront d’identifier comment les échanges biologiques entre organes évoluent au cours du vieillissement et impactent l’état fonctionnel global. Les connaissances générées par ce projet pourront aussi servir de base scientifique pour orienter le développement de stratégies visant à préserver les fonctions physiologiques au cours du vieillissement. Elles pourront soutenir l’identification de cibles biologiques pertinentes dans l’objectif de retarder l’apparition de déficits fonctionnels liés à l’âge et de favoriser un vieillissement en bonne santé.

Procédures

Au cours de cette étude, le comportement et l’état de santé des souris seront évalués sur animaux vigiles, organisées au sein d’une procédure expérimentale unique et progressive, du moins au plus contraignant. Les interventions sur animaux vigiles comprennent des tests comportementaux et cognitifs réalisés une seule fois par animal. Chaque test a une durée comprise entre 1 et 15 minutes. Un temps de repos d’au moins 24 heures est respecté entre chaque test afin de limiter le stress et la fatigue. L’activité motrice des animaux sera ensuite évaluée par des tests de motricité, de force et de coordination, également réalisés sur animaux vigiles d’une durée de 1 à 10 minutes et un test d’endurance sur tapis roulant d’une durée maximale d’environ 60 minutes, avec arrêt immédiat en cas de signes de fatigue excessive et pour lequel une phase d’acclimatation sur 2 jours est réalisé. Un temps de repos d’au moins 24 heures est respecté entre chaque test afin de limiter le stress et la fatigue. Des interventions métaboliques sont également réalisées sur animaux vigiles, comprenant un test de tolérance au glucose et un test de tolérance à l’insuline réalisé à un intervalle de 8 jours. Ces tests impliquent une mise à jeun préalable de respectivement 6 et 4 heures, une injection unique et l’analyse d’une goutte de sang à 5 temps donné depuis une unique incision de la queue sur une durée totale d’environ 2 heures par test.

Impact sur les animaux

Les principaux effets indésirables attendus seront transitoires pour les tests comportementaux et moteurs. Un stress modéré peut être induit par les mesures métabolique au niveau du site d’injection. Possible fatigue cumulée en fin de protocole comportemental (minimisée par des jours de repos entre divers tests) ainsi qu’une fatigue liée à l’exercice forcée sont attendus. Le test métabolique de tolérance à l’insuline peut potentiellement entrainer une hypoglycémie (léthargie, tremblements, perte de réactivité). Les nuisances liées au vieillissement peuvent être une altération de l’état général et une détérioration de leur santé.

Devenir

Mise à mort et collecte des organes pour identifier les mécanismes cellulaires et moléculaires impliqués.

Remplacement

Le projet visant à étudier comment le recyclage cellulaire impacte le vieillissement de l’organisme entier, il n’est pas possible de remplacer les animaux par des lignées cellulaires ou des organoïdes. L’utilisation d’animaux est un pré-requis indispensable à l’établissement du projet.

Réduction

Nous utiliserons des animaux des deux sexes. Afin de limiter le nombre d’animaux utilisés tout en maximisant l’information recueillie, l’ensemble des évaluations fonctionnelles est réalisé chez les mêmes animaux. Pour les calculs du nombre d’animal nécessaire, nous nous sommes basés sur un logiciel statistique. Nous réaliserons ces expériences sur 31 souris/sexe/génotypes pour les animaux jeunes.

Raffinement

Les mesures de raffinement mises en place comprennent : • hébergement en groupes sociaux stables • enrichissement du milieu : matériel de nidification et abris supplémentaire si besoin • période d’acclimatation avant expérimentation ; • habituation préalable aux tests comportementaux et moteurs ; • réalisation des manipulations et injections par du personnel expérimenté ; • respect de temps de repos entre les différents tests ; • surveillance renforcée après les injections et les tests métaboliques ; • recours à des points limites; L’objectif est de limiter au maximum le stress, la fatigue et l’inconfort associés aux procédures expérimentales en particulier sur nos animaux âgés.

Choix des espèces

Les souris génétiquement modifiées permettent d’étudier in vivo chez un mammifère les conséquences de la mutation ponctuelle d’un gène dans un type cellulaire spécifique et d’explorer l’impact du gène étudié dans un contexte physiologique similaire à l’homme. Les animaux seront utilisés à différents stades de vies : animaux jeunes adultes à 3 mois et animaux vieux à trois âges différents : 18, 21 et 24 mois. L’âge de 18 mois correspond à un stade de vieillissement avec apparition progressive de déficits fonctionnels mais avec des capacités d’adaptation encore préservées. L’âge de 21 mois représente une phase de transition avec un déclin fonctionnel et une diminution des réserves physiologiques ; enfin, l’âge de 24 mois est associé à une fragilité accrue, à des altérations fonctionnelles plus prononcées et à une survie d’environ 60%. Cette approche nous permettra d’analyser la dynamique temporelle des effets du recyclage cellulaire et d’identifier quand ses effets sont les plus marqués ou, au contraire, s’atténuent.

Nourries pendant trente-huit semaines avec un régime riche en graisses et en cholestérol pour les rendre obèses, 30 souris sur les 40 du projet subissent en plus un jeûne nocturne pouvant atteindre quinze heures, une injection de glucose sur souris consciente et six prélèvements de sang à la queue en deux heures. Toutes sont tuées après ces trente-huit semaines pour prélever le foie, le sang et d'autres tissus, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. L'obésité ainsi provoquée est décrite comme les rendant "un peu moins actives", et l'objet est de tester un composé contre la fibrose du foie, pour laquelle le porteur indique qu'aucun traitement efficace n'existe. L'effectif de 40 souris est présenté comme calculé pour obtenir un effet statistique significatif, sans que ce calcul soit rapporté.

Objectifs

Les maladies chroniques du foie représentent un enjeu majeur de santé publique à l’échelle mondiale. Parmi ces maladies, la stéatose hépatique non alcoolique, qui correspond à une cirrhose du foie sans consommation d’alcool, est en forte progression à cause de l’augmentation de l’obésité ou encore du diabète de type 2. Dans cette maladie, il y a une accumulation importante de graisses dans les cellules du foie ,ce qui entraine une cicatrisation du foie appelée fibrose hépatique. Cette fibrose va rigidifier des parties du foie conduisant progressivement à une perte de fonction du foie et pouvant évoluer vers une insuffisance hépatique terminale. De plus, la fibrose hépatique chronique peut être responsable du développement de cancer du foie, ce qui accentue la gravité de cette pathologie. La stéatose hépatique non alcoolique est souvent diagnostiquée à un stade avancé, lorsque les lésions dans le foie sont déjà présentes. A l’heure actuelle il n’existe aucun traitement efficace pour inverser ou ralentir cette fibrose. Le développement de traitements efficaces contre la fibrose étant un enjeu majeur en santé, l’objectif principal de ce projet est de tester chez la souris un nouveau composé pour traiter la stéatose hépatique non alcoolique.

Bénéfices attendus

Le principal bénéfice attendu du projet est le développement d’un traitement efficace pour lutter contre la progression de la fibrose hépatique. De plus ce projet permettra de mieux connaitre les mécanismes biologiques encore mal connus responsables du développement de la maladie.

Procédures

Pendant 38 semaines, 30 souris seront nourries avec un régime riche en graisses et cholestérol pour les rendre obèses et 10 souris recevront un régime standard. Pour tester la glycémie au cours du régime, 20 souris parmi les 40 souris du projet seront mis à jeun sur la nuit (maximum 15h) APRES 16 SEMAINES DE REGIME. Le lendemain, une injection de glucose (moins de 20 secondes) sera réalisée sur l'animal conscient et des prélèvements de sang se feront au niveau de la queue. Les prélèvements seront réalisés sur un temps court (durée inférieure à 2 minute) et de façon répétée en 6 fois sur une période de 2h dans la même journée. APRES 37 SEMAINES DE REGIME, UN AUTRE TEST DE LE GLYCEMIE APRES UNE PERIODE DE JEUNE MAXIMALE DE 6H SERA REALISE SUR LES 30 SOURIS NOURRIES AVEC LE REGIME GRAS DONT 10 SOURIS AURONT DEJA SUBI CE TEST A LA SEMAINE 16. Un autre prélèvement sanguin au niveau de la queue (une seule prise) sur la totalité des 40 souris sera réalisé 11 semaines plus tard.

Impact sur les animaux

Les souris qui recevront sur 38 semaines le régime riche en graisses et cholestérol vont prendre du poids et devenir un peu moins actives à cause de l'obésité. Durant la période de jeûne de 14-15h sur la nuit, les souris privées de nourriture pourront ressentir une sensation de faim. Lors de l’injection de glucose, le passage de l’aiguille de petite taille au travers de la peau sera de très courte durée (moins de 20 secondes) et entrainera un inconfort chez les souris. Des prélèvements sanguins à la queue seront pratiqués sur animaux conscients après 16, 27 ET 37 semaines de régime. Ces prélèvements bien que rapides (durée < 2 minutes) sont susceptibles d’induire un stress et une légère douleur.

Devenir

Après les 38 semaines de régime, tous les animaux seront mis à mort par une méthode d'euthanasie réglementaire pour prélever les tissus et le sang. L'analyse de ces prélèvements nous permettra de mieux comprendre les mécanismes de développement dans le foie de la fibrose et d'identifier les cibles thérapeutiques de notre composé.

Remplacement

ll n’existe pas de modèle in vitro permettant de reproduire de manière fiable l’environnement in vivo que l'on retrouve dans un organisme vivant et dans lequel plusieurs types de cellules interagissent entre elles et participent au développement de la fibrose . De plus, cette maladie se développe lorsqu’il y a des problèmes métaboliques (ex hausse de la glycémie) dans l’organisme entier suralimenté, ce qui justifie l’utilisation d’animaux. Enfin il n’existe pas de méthode alternative n’utilisant pas l’animal de laboratoire pour tester l’efficacité d’un composé sur la fibrose hépatique.

Réduction

Le nombre total de souris a été calculé pour avoir un effet statistique significatif sur les paramètres étudiés. A la fin de l’étude, des tissus autres que le foie pourront être prélevés chez les animaux et utilisés dans le cadre de différents projets dans notre équipe en lien avec d’autres maladies étudiées dans notre laboratoire (obésité, pré-diabète, atteintes cardiaques, rénales). Pour l’analyse des données recueillies lors des différentes expériences nous appliquerons les tests statistiques appropriés en utilisant un logiciel d'analyse.

Raffinement

Les souris seront surveillées quotidiennement et la litière des cages sera plus fréquemment changée. Les procédures expérimentales seront réalisées par du personnel expérimenté. Pour diminuer le stress lors des prélèvements de sang, les animaux seront habitués au mesure de contention quelques semaines avant la prise de sang. Pour éviter d’avoir recours au gavage source de stress, le traitement sera administré quotidiennement (5 jours sur 7) dans de la nourriture constituée de beurre de cacahuète pour l’appétence. Le traitement avec le composé a déjà été administré chez le rongeur (rat et souris) dans de précédents travaux sans entrainer d’effets indésirables

Choix des espèces

Les souris utilisées dans ce projet sont très sensibles au régime riche en graisses et développe une obésité et une stéatose hépatique non alcoolique similaire à la maladie humaine. Les souris utilisées seront de jeunes mâles âgés de 5 à 6 semaines car la plupart des études sur le modèle murin pour étudier cette maladie sur une longue période utilisent de jeunes souris adultes. Ainsi, grâce aux nombreuses études scientifiques publiées, de nombreuses informations sur la souris sont disponibles et permettront de mieux comparer les résultats obtenus dans ce projet.

Six tests comportementaux par souris sur trois semaines, dont un labyrinthe en Y et une piscine équipée d'une plateforme de sortie, plus quatre prélèvements sanguins isolés et trois séries de prélèvements étalées sur deux heures : 288 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Des souriceaux de dix-huit jours reçoivent de l'ovalbumine par voie intrarectale sous anesthésie, puis sont tués par dislocation cervicale une heure après leur réveil. L'objet est de mesurer les effets des additifs des laits infantiles sur l'intestin et le cerveau, avec des résultats destinés à éclairer l'Efsa et l'Anses. Le porteur qualifie ces tests comportementaux de "non invasifs et n'induisant pas de stress", tout en annonçant que certaines souris pourraient développer une inflammation intestinale chronique et un comportement anxieux.

Objectifs

Le lait maternel joue un rôle essentiel dans la croissance des nouveau-nés. Il module entre autres le microbiote intestinal, qui lui-même participe au bon développement du cerveau et de la santé. De nombreux nourrissons sont alimentés avec des laits de substitution en poudre. Ces préparations contiennent des additifs, utilisés notamment pour améliorer leur texture ou leur conservation. Il a déjà été montré que certains de ces additifs peuvent perturber l’équilibre du microbiote intestinal, entraînant une dysbiose et une inflammation intestinale chez l’adulte. En revanche, leurs rôles et leurs conséquences sur le développement du cerveau durant la période néonatale sont peu explorées et leurs effets à plus long terme sur le comportement restent inconnus. Ce projet a pour objectif d'étudier chez l'animal les effets de la consommation durant la période néonatale de laits contenant ces additifs sur l’axe intestin-cerveau à différentes périodes de la vie.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus sont multiples. Sur le plan fondamental, ce projet apportera des connaissances nouvelles sur les mécanismes par lesquels l'alimentation agit sur la santé intestinale et le développement cérébral durant la période néonatale, et sur la façon dont les perturbations précoces du microbiote peuvent influencer l’apparition d’inflammation intestinale et le comportement à long terme. Sur le plan appliqué, les résultats viendront éclairer les évaluations des risques sanitaires liés à ces additifs chez les nourrissons. Ils pourront orienter l'optimisation des formulations des laits infantiles et fournir des éléments scientifiques utiles aux instances de réglementation (Autorité européenne de sécurité des aliments (Efsa), agence nationale de sécurité sanitaire (Anses)), dans une perspective de meilleure protection de la santé des nouveau-nés. Enfin, ces travaux contribueront à enrichir les recommandations nutritionnelles destinées aux familles et aux professionnels de santé.

Procédures

Les animaux subiront 4 prélèvements uniques de sang pour une durée inférieure à 1 minute afin de mesurer la gly-cémie. Les animaux subiront 3 prélèvements multiples de sang sur une durée de 2h, chacun de ces prélèvements mul-tiples seront séparés d’au moins une semaine afin de mesure la glycémie lors d’un test de tolérance au glucose. Les animaux adultes seront impliqués dans des tests de comportement non invasifs et n'induisant pas de stress chez l'animal. Les animaux adultes seront au préalable soumis à une phase d’habituation d’une semaine qui n'induira que peu ou pas de stress chez: chaque jour, ils seront exposés à l’expérimentateur et à la salle de comportement pendant une durée de 30 minutes à 1 heure, afin de réduire le stress lié à la manipulation et à l’environnement expérimental. À l’issue de cette période, une série de tests comportementaux sera réalisée pour évaluer différents aspects tels que l’anxiété, la sociabilité, la mémoire et l’hyperactivité. Ces évaluations reposeront sur les paradigmes suivants : • tes de l’anxiété : Les dispositifs expérimentaux combineront des zones ouvertes/éclairées et des zones fermées/protégées. Le temps de présence dans chaque type de zone sera quantifié sur une période de 10 minutes • évaluation de la mémoire : phase d’habituation de 10 minutes durant laquelle l’animal est placé dans une arène contenant des objets, dans un labyrinthe en Y ou dans une piscine équipée d'une plateforme pour permettre à l'animal de sortir de l'eau. Suite à une modification de la configuration (changement d’objets ou d’accessibilité des zones), une phase de test de 10 minutes permettra de mesurer la capacité de reconnaissance ou de spatialisation de l’animal. • évaluation de la sociabilité : mesureront la préférence naturelle de l’animal à interagir ou à passer du temps à proximité d’un congénère plutôt que d’un objet inanimé, sur une durée de 10 minutes Chaque test comprendra une phase d’habituation de 10 minutes à l’arène, suivie d’une phase de test de 10 minutes par animal. La fréquence des tests est limitée à un seul test par jour et par animal au maximum, pour un total d’environ 6 tests par animal répartis sur une période de trois semaines. • animaux jeunes adultes agés de 18 jours subiront une administration intrarectale d’ovalbumine après anesthésie à l’isoflurane. Après 1h de phase de réveil, ils seront mis à mort par dislocation cervicale.

Impact sur les animaux

Certaines procédures pourraient induire une inflammation intestinale chronique de bas bruit sans ulcération majeure et qui n’a pas de conséquences visibles sur le phénotype. De plus, certains animaux pourraient développer des dérégulations métaboliques, caractérisées notamment par une augmentation de la masse grasse ainsi que présenter un comportement anxieux. Les tests comportementaux réalisés sur animaux adultes entraineront peu ou pas de stress.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure car l’analyse de leurs organes est nécessaire pour répondre à notre hypothèse de travail.

Remplacement

Des modèles in vitro de culture de microbiote intestinal ainsi que des modèles cellulaires permettant de mimer la barrière intestinale existent. Cependant, le recours au modèle murin est indispensable dans le cadre de ce projet afin de comprendre les interactions hôte / microbiote et notamment cerveau/intestin/microbiote en lien avec le développement d’inflammation chronique de bas bruit et de troubles du comportement. Des animaux plus simples tels que la drosophile, C. elegans ou le poisson zèbre ne peuvent pas non plus être utilisés car la physiologie du développement cérébral et du comportement de ces animaux est très différente de celle des mammifères.

Réduction

Un nombre minimum d'animaux suffisant pour assurer la reproductibilité de l’expérience et appliquer des tests statistiques entre les différentes conditions sera inclus dans chaque groupe. Des études précédentes ont montré que dans le même type de procédure, l’utilisation de 12 souris par condition et par sexe était nécessaire afin d’atteindre des résultats interprétables et garantir l’utilisation de tests statistiques appropriés. Les tests statistiques envisagés dans le cadre de ce projet l’ont été après avis recueilli auprès de biostatisticiens pour des projets similaires. De plus, il s’agit d’une expérience au design longitudinal, ce qui nous permet d’observer le phénotype des souris aux différents stades de développement et donc limiter le nombre de souris nécessaires.

Raffinement

Les procédures décrites visent à réduire autant que possible le mal-être animal. Dans un souci de raffinement, un suivi étroit des animaux et des points limites précoces et adaptés seront mis en place tout au long des expérimentations. Des points limites spécifiques et précoces sont définis pour chaque protocole. Dès l’apparition d’un signe clinique, différentes méthodes de raffinement seront appliquées pour éviter ou minimiser l’inconfort ou la douleur : utilisation de gel de réhydratation, réhydratation sous-cutanée, renforcement de l’enrichissement.

Choix des espèces

Cette étude privilégie la souris comme modèle de référence pour analyser l'impact des additifs alimentaires sur le microbiote intestinal et le développement cérébral néonatal. Ce choix se justifie par la capacité à suivre précisément les interactions microbiote-système immunitaire dès la naissance grâce à des outils d'analyse avancés. Bien que simplifiée, la physiologie mu-rine offre une pertinence conceptuelle et souvent directe pour comprendre les mécanismes chez le nouveau-né humain. En pratique, la souris est indispensable : sa reproduction rapide permet d'obtenir de grandes portées pour suivre les effets à long terme d'une exposition nutritionnelle précoce, de la nais-sance à l'âge adulte. De plus, c'est l'espèce la mieux maîtrisée pour évaluer les fonctions co-gnitives et comportementales en milieu contrôlé. Ces avantages combinés garantissent une efficacité optimale dans la recherche tout en assurant une représentation physiologique fiable des processus biologiques humains. Le premier groupe sera suivi jusqu’à l’âge du sevrage, soit environ trois semaines. Cette période constitue la phase d’exposition aux additifs ; c’est également une fenêtre de développement où le microbiote intestinal et le cerveau sont particulièrement sensibles à l’environnement nutritionnel. Le second groupe sera suivi jusqu’au 18ème jour de vie. Cette période constitue la phase d’exposition aux additifs ; c’est également une fenêtre de développement où le microbiote intestinal et le système immunitaire sont modulés par l’environnement nutritionnel. Le troisième groupe sera maintenu dans les mêmes conditions jusqu’à l’âge adulte, l’exposition aux additifs étant limitée à la seule période néonatale. Ce suivi longitudinal permettra de vérifier si les éventuelles perturbations observées chez le jeune animal perdurent et influencent le comportement et l’état général à long terme. L’utilisation de ces deux stades est indispensable à la démarche scientifique : la période néonatale représente le moment critique de l’exposition alimentaire, tandis que l’évaluation à l’âge adulte est nécessaire pour mesurer l’existence d’effets différés.

Mesurer la concentration sanguine de quatre-vingts candidats-médicaments par an, pour affiner leur posologie avant les études d'activité : 1 200 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune reçoit de une à vingt et une administrations espacées d'au moins huit heures, subit la section de la pointe de la queue, puis jusqu'à dix micro-prélèvements sanguins sur quarante-huit heures au minimum, et une partie une chirurgie d'implantation d'un implant médicamenteux sous anesthésie. Le porteur écarte toute grille de score, au motif qu'elle "nécessite de maintenir la souffrance de l'animal pour en évaluer l'évolution", et annonce la mise à mort dès qu'apparaît une différence de poids de 2 à 5 %. L'effectif déclaré se déduit d'un calcul simple, trois souris par condition testée et quatre-vingts composés par an sur cinq ans, le porteur précisant qu'aucune comparaison statistique n'est requise.

Objectifs

Pour le développement de nouveaux médicaments, il est nécessaire d'étudier le devenir de la substance active dans l'organisme, dans le but de déterminer : l’absorption, la distribution, le métabolisme et l’élimination du composé (ADME), des propriétés qui vont influencer la posologie du candidat-médicament (dose administrée et fréquence d'administration). L’objectif scientifique est de suivre la concentration sanguine de produits pharmacologiques en cours de développement chez la souris. Les produits pourront être de différentes natures (chimique, peptidique, oligo-nucléotidique) et/ou pour diverses applications : analgésie, anti-inflammatoire, antibiotique, immunodépresseur, anticancéreux, cardio-protecteur, anti-arthrosique, antidépresseurs, neuro-protecteur…

Bénéfices attendus

La mesure de la concentration sanguine au court du temps des candidats-médicaments permettra de sélectionner les plus adaptés et d’en affiner la posologie (dose et fréquence d’administration) selon les résultats de l’ADME. Ce projet s'inscrit pleinement dans les étapes indispensables au développement des candidats-médicaments. Il permet de réduire drastiquement le nombre de candidat-médicament à tester dans les études d’activité et le nombre d'études nécessaires pour mesurer ensuite l’activité des candidats-médicaments sélectionnés, tout en augmentant les probabilités d'obtenir un médicament.

Procédures

Les animaux seront soumis à des injections pour l'administrer les candidat-médicaments étudiés. Les candidat-médicaments et médicaments étudiés seront administrés 1 à 21 fois avec un minimum de 8h entre chaque administration. Une anesthésie de quelques minutes est nécessaire pour le rasage des animaux et pour les administrations ID, IN, IT. Afin de suivre la concentration sanguine du candidat médicament au cours du temps, un maximum de 10 micro-prélèvements de sang (environ 1min) seront réalisés à l’extrémité de la queue et sur une durée minimum de 48h. Une partie des animaux pourront être soumis à une chirurgie sous anesthésie (environ 15 min) et analgésie pour l’implantation d’un implant médicamenteux.

Impact sur les animaux

Les injections entraînent une douleur légère de courte durée, de même que la section de la pointe de la queue (moins d’un demi millimètre) utilisée pour permettre les prélèvements sanguins. [Modification] L’implantation chirurgicale d’un implant médicamenteux peut potentiellement induire une douleur modérée et une altération de l'état de santé général des animaux durant les 48h premières heures suivant l’implantation (sensibilité de la zone d’implantation, gène dans les déplacements, une activité moindre, une appétence modérée pour la nourriture pouvant entrainer une très légère et transitoire perte de poids…)

Devenir

Les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure expérimentale afin de recueillir les échantillons nécessaires aux analyses

Remplacement

Les candidats-médicaments auront été sélectionnés préalablement pour leur activité et leur innocuité sur les modèles cellulaires, ainsi que pour leur caractéristiques pharmacochimiques (solubilité, stabilité plasmatique et microsomale…). Cependant, tous les essais réalisés ne peuvent prédire avec exactitude l’ADME d’un composé car aucun modèle alternatif (bio-informatique, moléculaire et/ou cellulaire) n’est suffisamment intégré et complexe pour reproduire l’ensemble des phénomènes biologiques impliqués dans l’absorption, la distribution, la dégradation et l’élimination des médicaments. Ces phénomènes biologiques sont liés à la circulation sanguine, aux barrières biologiques et aux voies d'élimination (dégradation par le foie, élimination biliaire et rénale...) et régulent l’activité des médicaments. Pour ces raisons, une approche chez l’animale reste indispensable pour sélectionner les candidats-médicaments les plus prometteurs avant de poursuivre leur développement. La mesure de la pharmacocinétique sera réalisée chez le souris, car cette espèce est la plus utilisée pour cette approche dans le cadre du développement des candidats-médicaments.

Réduction

La réalisation des procédures par un technicien rompu à ces manipulations garantit une bonne reproductibilité et permet de limiter le nombre d’animaux à engager dans les protocoles. La procédure expérimentale parfaitement maîtrisée permet une mesure efficace à l’aide de 3 souris par condition testée. La mise en place de micro-prélèvements répétés chez un même animal permet de réduire drastiquement le nombre d’animaux utilisés pour suivre la concentration sanguine des candidats médicaments. Les résultats sont exploités sous la forme de courbes cinétiques et aucune comparaison statistique n’est requise. Il est prévu de mesurer la pharmacocinétique de 80 composés chaque année sur une période de 5 ans soit un maximum de 1200 souris.

Raffinement

La procédure expérimentale est conçue pour garantir le bien-être de l’animal et réduire au maximum l’inconfort, le stress et la souffrance. La souris étant un animal social, les souris seront maintenues en groupes sociaux, dans des cages enrichies d’un tube de change et de matériaux de « nidification ». Une période d'acclimatation et d'habituation de 2 semaines sera respectée mais pourra exceptionnellement être ramenée à une semaine minimum en cas de contraintes temporelles. Le bien-être des animaux sera pris en compte tout au long de l’étude, avec un suivi journalier de l’état des animaux par l’expérimentateur. [Modification] La douleur liée aux injections est une douleur ponctuelle réversible qui fera l’objet d’une surveillance de l’animal. Lorsque les caractéristiques du composé le permettront (solubilité et stabilité), l'usage d'un implant médicamenteux pourra être mis en place pour éviter le recourt à des administrations répétées génératrices de stress et de douleur. Les souris seront anesthésiées pour permettre certaines administrations (intranasale, intratrachéale, intradermique, intramusculaire) ou l’implantation d’un implant médicamenteux qui fera aussi l’objet d’une couverture analgésique pré et post opératoire. L’implantation chirurgicale sera réalisée dans des conditions d’asepsie strictes et sous un poste de sécurité microbiologique dédié. Les souris anesthésiées seront placées sur un tapis chauffant afin de prévenir une hypothermie. Une alimentation hydratée sera mise à disposition des animaux pour assurer une récupération postopératoire rapide. Les animaux seront particulièrement surveillés après l’administration des candidats-médicaments ou des sondes, pour mettre en évidence tous signes de toxicité imprévue qui nécessiterait la mise à mort de l’animal. Aucun animal ne sera maintenu en vie s’il présente des signes de douleur ou d’inconfort. Pour cette même raison, aucun « scoring » n’est envisagé, car il nécessite de maintenir la souffrance de l’animal pour en évaluer l’évolution. Il arrive cependant qu’aucun signe extérieur de douleur ne puisse être observé, et que seule une perte ou absence de prise de poids soit mise en évidence. Dans ce cas, les animaux seront mis à mort dès la mise en évidence d’une différence significative (généralement dès 2 à 5% d’écart). Les micro-prélèvements de sang sont réalisés sur les animaux vigiles et non contraints (sans boite ou tube de contention), à même de signifier librement tout manquement

Choix des espèces

La mesure de la pharmacocinétique est réalisée chez la souris, car cette espèce est la plus utilisée pour cette approche dans le cadre du développement des candidats-médicaments. Certain candidat-médicament sont très difficile à synthétiser et la petite taille de la souris nécessite beaucoup moins de composé. Enfin, ce choix permet aussi de mesurer l’ADME d’un composé chez la même espèce que pour les futures études d’activités, elles-mêmes nécessitant le plus souvent le recourt à des animaux génétiquement modifiés, plus facile à trouver ou générer chez la souris. L’âge des souris sera déterminé en fonction de l’objectif scientifique et de la pathologie visée. Les souris seront âgées d’au minimum 4 semaines afin que la procédure puisse être réalisée sans remettre en cause le bien-être de l’animal.