Système cardiaque

150 cobayes vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils reçoivent six injections sous-cutanées d'antigène associé à un adjuvant et trois prélèvements sanguins sous anesthésie gazeuse, pour produire des anticorps polyclonaux vendus comme réactifs à des équipes de recherche. Le porteur indique que les immunisations peuvent provoquer des ulcérations aux points d'injection. Il affirme qu'aucune méthode substitutive n'est aussi efficace et que le recours à l'animal vivant reste "indispensable" pour obtenir des anticorps spécifiques.

Objectifs

Les anticorps sont produits par le système immunitaire d'un animal comme moyen de défense contre un immunogène spécifique. Ces immunoglobulines constituent des ressources largement utilisées dans des applications analytiques et thérapeutiques. Les AcP sont notamment utilisés pour l’évaluation, la détection et la purification de protéines d’intérêts. Ils trouvent des applications en biologie et en biochimie, en tant que ligand de colonne d’immunoaffinité. Ils possèdent également de nombreux emplois en recherche tel que la détection de molécules dans les essais du type enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), les révélations de Western Blot, les procédures immunohistochimiques et d'immunoprécipitation, en immunofluoromicroscopie et en immunoélectromicroscopie. Notre processus de production assure la production d’AcP pour le compte de différentes équipes de recherche publiques ou privées. Les antisérums sont produits par injection à un animal de l'immunogène (antigène) cible, souvent combiné à un adjuvant qui accroît la réponse immunitaire. La réponse immunitaire peut par la suite être amplifiée par des injections de rappel d'antigène. On prélève des échantillons de sang de l'animal pour évaluer le niveau de production d'anticorps ; lorsque le titre est suffisamment élevé, on prépare un antisérum en effectuant une prise de sang suivie de l'isolement du sérum puis, si nécessaire, de la purification des anticorps à partir du sérum

Bénéfices attendus

Les anticorps polyclonaux (AcP) seront des auxiliaires et des réactifs employés non seulement dans des procédés relatifs à la biochimie, à la biologie moléculaire et à l’immunohistochimie, mais aussi à des fins diagnostiques voir thérapeutiques. Les anticorps développés de cobaye dans le cadre de projets de recherche, permettront de localiser, d’identifier ou de purifier des protéines synthétisées au sein des cellules d’un tissu ou d’un organe. L’utilisation du cobaye interviendra dans des projets particuliers pour lesquels, cette espèce présente un avantage par rapport à d’autres. En effet, les cobayes présentent dans certaines situations des avantages vis-à-vis du lapin, qui est l’animal le plus communément utilisé pour l’obtention d’AcP. Le cobaye étant phylogénétiquement plus éloigné de la souris que le rat, il permet l’obtention d’anticorps anti-protéines de souris. Plusieurs exemples ont montré l’intérêt des cobayes en comparaison d’autres espèces, notamment pour la production d’anticorps dirigé contre l’insuline porcine, où les cobayes ont permis d’obtenir d’une meilleure réponse en comparaison des lapins.

Procédures

Six injections aux cobayes en sous-cutané de l’antigène associé à un adjuvant. Trois prélèvements sanguins seront réalisés, au niveau de la veine saphène sous anesthésie par inhalation de gaz anesthésiant (gaz halogéné). Injection sous-cutanée : 8 minutes dont 4 minutes pour prendre avec délicatesse l’animal, le rassurer et le préparer, 30 secondes par injection et 30 secondes pour masser la zone injectée (4 injections), c’est-à-dire 4 min. Prélèvement : l’endormissement sous anesthésie gazeuse prend 10 minutes pour être effective. Le prélèvement sous anesthésie au masque est réalisé pendant 3 à 4 minutes. Le réveil de l’animal prend 1 à 2 minutes.

Impact sur les animaux

Les immunisations peuvent notamment conduire à l'apparition d'ulcérations aux points d'injection. Il n’y a pas d’opération chirurgicale dans les protocoles. Les prélèvements seront réalisés sous anesthésie.

Devenir

Tous les animaux sont concernés. Les projets étant spécifiques d’un antigène, nous ne pouvons pas réutiliser les animaux pour d’autres protocoles, les animaux sont donc tous euthanasiés en fin de protocole.

Remplacement

La méthode usuelle pour produire des AcP reste l’immunisation de l’animal avec des préparations antigéniques pures ou partiellement purifiées, souvent combinées à un adjuvant qui accroît la réponse immunitaire. Les AcP sont produits chez les animaux vivants, puisqu’il n’existe pas de méthode substitutive aussi efficace pour cette production. L’immunité humorale correspond à un processus complexe impliquant différents acteurs du système immunitaire in vivo. Ce processus se traduit par la production d’un répertoire diversifié d’immunoglobulines répondant à un grand nombre d’antigènes. In vivo, l’adaptation accrue du système immunitaire vis à vis de l’antigène au fur et à mesure des immunisations est indispensable pour obtenir des anticorps notablement plus spécifiques et pertinents que ceux obtenus avec des systèmes de développement in vitro. En effet, les techniques partant de banque naïve ne permettent pas une obtention aisée (en termes de temps, budget et matériels) d’une large gamme d’anticorps de hautes affinités ciblant différents épitopes.

Réduction

Réduction : Le nombre d’animaux (3 cobayes par protocoles) pour l’obtention de réactifs intervenant dans l’obtention des protéines médicaments dans le domaine de l’immunologie, de l’hémostase et des soins intensifs. Ce nombre a été adapté au plus juste par rapport au besoin de sérum pour les investigations et les recherches au regard de notre recul sur ce protocole.

Raffinement

Raffiner : L’environnement des cobayes est enrichi pour améliorer leur bien-être (tunnel de jeu, friandises, foin, jouets,…). Les animaux seront particulièrement suivis pendant les 24h suivant les injections, puis quotidiennement pour examiner leur état de santé. L'observation quotidienne des animaux par le personnel compétent permet une détection précoce de tout signe d'inconfort ou de douleur et permet ainsi une intervention adaptée au plus tôt. Les prélèvements réalisés, sous anesthésie, concerneront de faibles volumes afin de ne pas induire de souffrance chez l’animal. Il s'agit d'un protocole de simple vaccinations avec adjuvants.

Choix des espèces

Les cobayes présentent dans certaines situations des avantages vis-à-vis du lapin, qui est l’animal le plus communément utilisé pour l’obtention d’AcP. Etant phylogénétiquement plus éloigné de la souris que le rat, ils permettent l’obtention d’anticorps anti-protéines de souris. Plusieurs exemples ont montré l’intérêt des cobayes en comparaison d’autres espèces, notamment pour la production d’anticorps dirigé contre l’insuline porcine, où ils ont permis d’obtenir d’une meilleure réponse en comparaison des lapins. Ils permettent également l’obtention d’anticorps ayant une forte capacité à fixer le système du complément. Ils permettent en comparaison des souris de Réduire le nombre d’animaux engagés dans chaque protocole à 3 individus. La production d’anticorps chez le cobaye nécessite de faibles doses d’antigène. La meilleure production d’anticorps est obtenue chez les jeunes adultes. Les cobayes entreront en protocole à l’âge de 3 mois. Auparavant ils auront subi une période de quarantaine d’une semaine, sans incident durant ce temps, ils seront aptes à rentrer en protocole.

15 lapins vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils subissent plusieurs chirurgies sous anesthésie générale pour l'implantation puis le contrôle de stents utilisés chez l'humain contre les anévrismes intracrâniens, la dernière intervention n'étant pas suivie d'un réveil. Le porteur indique une anxiété, un stress et des douleurs postopératoires possibles, ainsi qu'un rare risque de paralysie de la patte. Il affirme que l'utilisation d'animaux est "indispensable" car aucune méthode in vitro ne reconstitue ces conditions.

Objectifs

Le projet consiste en l’étude chez le lapin de dispositifs implantables de neuroradiologie interventionnelle utilisés chez l’humain dans le traitement des anévrismes intracrâniens. L'objectif est de comparer quatre types de stents à diversion de flux (des dispositifs médicaux implantables utilisés dans le traitement des anévrismes intracrâniens par voie endovasculaire) sous des régimes différents d’anti-agrégation plaquettaire, et d’analyser l’endothélialisation et le risque thromboembolique de chacun des dispositifs. Une étude clinique rétrospective a suggéré que des stents à diversion de flux « actifs » pouvaient être mis en place sous simple anti-agrégation plaquettaire en phase de rupture d’un anévrisme, avec une occlusion satisfaisante de ces derniers, sans complication ischémique surajoutée. Le but de ce projet sera d'étudier l’endothélialisation des stents par des analyses radiologiques et histologiques, et nécessitera donc l'utilisation de l'animal pour être mené à bien.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra d’effectuer des analyses qui ne sont pas réalisables chez l’être humain afin évaluer la réponse biologique à l’implantation de stents à diversion de flux, ce qui n’a encore jamais été fait de façon indépendante in vivo. L’analyse de la prolifération tissulaire sur le dispositif et sa thrombogénicité, apportera des connaissances supplémentaires et une meilleure compréhension sur les principes du traitement des anévrysmes cérébraux par stents à diversion de flux, permettant d’opter pour les dispositifs les plus fiables pour l’Homme et de les développer.

Procédures

Les animaux seront soumis à un prélèvement de sang 5 jours avant l’implantation du stent, sous anesthésie locale (15 min environ). Un second prélèvement sera fait pendant la première chirurgie, sous anesthésie générale (1 h environ). Une deuxième chirurgie sous anesthésie générale sera effectuée 15 jours plus tard pour le contrôle (45 min environ). Le dernier contrôle à 1 mois demandera également une chirurgie sous anesthésie générale, pour laquelle l’animal ne sera pas réveillé à son terme (1 h environ).

Impact sur les animaux

L’anxiété et le stress sont des effets indésirables attendus avant, et après chaque procédure/prélèvement. Des douleurs peuvent également survenir en contexte post-opératoire, de même qu’une paralysie de la jambe du lapin en cas d’atteinte du nerf (très rare).

Devenir

Les animaux mis à mort à la fin de la procédure afin de prélever les pièces anatomiques à des fins d’analyse en histologie.

Remplacement

Ce projet vise à étudier la prolifération cellulaire et la thrombogénicité sur des stents à diversion de flux dans des conditions proches de ce qui est trouvé chez l'Homme. Aucune méthode alternative in vitro ou ex vivo ne permet de reconstruire un modèle proche de ces conditions. L'utilisation d'animaux dans le cadre de ce projet est indispensable.

Réduction

Une analyse intermédiaire effectuée en OCT (tomographie par cohérence optique, technique d’imagerie permettant d’obtenir des images en coupe du vaisseau) et angiographie à 15 jours après l’implantation des stents permettra d’étudier partiellement le processus d’endothélialisation du stent, et évite d’avoir recours à une analyse histologique intermédiaire qui nécessiterait un sacrifice. Par ailleurs, l’implantation de différents stents chez le même lapin permet de diminuer le nombre de lapins utilisés).

Raffinement

Les animaux seront hébergés dans le respect du bien-être animal. Les animaux seront gardés pendant une période d'acclimatation de 5 jours minimum entre leur entrée dans l’animalerie expérimentale, et leur première entrée en procédure. Leur environnement comportera un enrichissement (bûchettes à ronger...). Les animaux seront suivis quotidiennement et leur état de santé et de bien-être sera évalué tout au long du protocole expérimental. Les animaux seront anesthésiés et analgésiés pendant les procédures chirurgicales et seront suivis au cours de la procédure. Un suivi renforcé sera effectué durant les premiers jours après chaque procédure opératoire. Si un animal présente un signe de douleur ou de souffrance, des analgésiques pourront lui être administrés . Si une infection se présente, un traitement antibiotique adapté au lapin pourra être mis en place. Dans le cas où l'animal présenterait une souffrance, une maladie ou une altération physique sans qu'il soit possible de le soulager efficacement (atteinte d'un point limite), l'animal sera sorti d'expérimentation et mis à mort.

Choix des espèces

Le lapin est un animal dont l’élevage est aisé, et un modèle animal reconnu pour l’étude des anévrismes intracrâniens. La biologie de la néo-endothélialisation des stents est ainsi bien étudiée chez le lapin et similaire aux mécanismes humains. Par ailleurs, la taille des vaisseaux du lapin est similaire à celle des vaisseaux humains, où sont implantés les stents flow-diverter étudiés. Les animaux utilisés seront des adultes de plus de 3 kg pour la taille des artères et la taille des dispositifs du commerce utilisés.

218 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Diabétiques ou non, elles reçoivent des injections de peptides puis subissent des prélèvements sanguins répétés et des tests métaboliques par incision de la queue, pour évaluer la toxicité et les effets de ces molécules sur le diabète et la stéatose hépatique. Le porteur anticipe une possible perte de poids et une atteinte neurologique liées à l'action des peptides sur le cerveau. Il juge "erronée" la corrélation entre viabilité cellulaire in vitro et humain, et affirme qu'un "système animal entier" est "nécessaire".

Objectifs

La prévalence de l'obésite, du diabète de type 2 (DT2) et de la stéatose hépatique non alcoolique (NAFLD) a doublé au cours des 20 dernières années et représente dans la région Grand-Est, environ 1/4 de la population. La prise en charge de ces pathologies, appelées syndrome métabolique, est une priorité en santé publique et mérite un intérêt marqué pour la recherche clinique expérimentale. Il convient de noter le succès relativement limité des médicaments biologiques et chimiques disponibles pour traiter l'obésité pathologique et les maladies associées. Dans ce contexte, nous avons identifié des petites molécules appelées peptides dérivés de l'élastine (PDE) qui sont notamment impliquées dans le développement du diabète de type 2. Ces mêmes peptides activent une molécule présente à la surface des cellules que l'on appelle la neuraminidase-1, NEU-1. Le regroupement de deux NEU-1 (processus de dimérisation) permet l'élimination d'acides sialiques (appelée désialylation) présents sur certaines molécules. Par exemple, la désialylation du récepteur de l'insuline (RI) provoque le développement du diabète de type 2 mais également de la stéatose hépatique. Afin de réduire l'impact de la désialylation induite par NEU-1 sur le développement de ces pathologies, nous avons élaboré une stratégie innovante par l'utilisation de peptides interférents (PI). Ils ont été mis au point et testés sur différents types de cellules. En effet, ils diminuent la dimérisation de NEU-1 et le phénomène de désialylation associé. De ce fait, ces PI pourraient empêcher le développement du diabète de type 2 et de la stéatose hépatique. Il nous semble donc crucial de tester ces molécules sur un modèle animal (souris). Une première approche animale a été menée sur un modèle de souris développant des tumeurs de façon importante et spontanée. Une injection unique de ces molécules a été testée lors de cette première étude et une détection de ces dernières 7 jours après injection a été observée au sein des tumeurs. Cependant aucune donnée sur les effets indésirables de ces molécules et de leur temps d'action n'a été évoquée sur modèle animal. C'est pourquoi nous proposons une étude sur le temps d'action, la dose, la fréquence d'injection ainsi que sur la potentielle toxicité de nos molécules (procédure 1 à 3) avant toute investigation thérapeutique comme l'impact de ces molécules sur le développement du syndrome métabolique induit par l'activation de NEU-1 (procédure 4).

Bénéfices attendus

Ce projet nous permettra, à court terme et à long terme, d’obtenir des données cruciales pour la suite des expérimentations et permettra une avancée importante dans la recherche translationnelle tant en clinique humaine qu’en clinique vétérinaire. En effet, la procédure 1 nous permettra de déterminer la dose optimale et sous-optimale des peptides interférents fluorescents à injecter. Par la suite, nous connaîtrons, via la procédure 2, la fréquence d’injection optimale afin d’éviter un potentiel effet cytotoxique des peptides fluorescents injectés de façon chronique. Enfin, grâce à la procédure 3, nous pourrons vérifier si une potentielle intolérance pourrait être observée chez des animaux insulino-résistants et qui seront utiles pour la suite des expérimentations. Enfin la procédure 4 nous permettra d’évaluer les effets biologiques des peptides interférents sur l’insulino-résistance et la NASH développée par l’accumulation de PDE observées chez les sujets vieillissants ou diabétiques. Ces PDE et le CRE qui y est associé, ont été décrits comme des inducteurs de maladies cardio-vasculaires (thromboses, athérosclérose, hypertension artérielle…), métaboliques (NASH, insulino-résistance, fibrose adipeuses…), cancer (sein, mélanome, …), … Si les peptides interférents ont un réel effet sur l’insulino-résistance, alors ces peptides pourraient avoir un impact thérapeutique important sur diverses pathologies dont les traitements sont peu convaincants.

Procédures

Procédure 1 : Une semaine après l’arrivée des souris au laboraroire, 100 µL de sang maximum sera prélevé au niveau de la veine caudale à l’aide d’une aiguille 27G sous anesthésie générale. Puis au moins 7 jours plus tard, 100 µL seront de nouveau prélevés. La fréquence de prélèvement ne dépassera pas deux fois par semaine et le volume n'excèdera pas 100 µL de sang par prélèvement. Ainsi le volume prélevé ne dépassera pas le seuil reglémentaire autorisé (20% du volume sanguin total soit environ 280 µL de sang). Procédures 2 et 3 : Une semaine après l’arrivée des souris au laboraroire, 100 µL de sang maximum sera prélevé au niveau de la veine caudale à l’aide d’une aiguille 27G sous anesthésie générale. Puis au moins 7 jours plus tard, 100 µL seront de nouveau prélevés. La fréquence de prélèvement ne dépassera pas une fois par semaine et le volume n'excèdera pas 100 µL de sang par prélèvement durant toute la durée du traitement. Ainsi le volume prélevé ne dépassera pas le seuil reglémentaire autorisé (20% du volume sanguin total soit environ 280 µL de sang). Procédure 4 : Etape 1 : Aucun prélèvement n’est effectué. Etape 2 : Une incision de 1 mm au niveau de la queue est réalisée afin de recueillir une goutte de sang (

Impact sur les animaux

Nos données préliminaires (COS-7, SKBR-3, MCF-7, HepG2) sur cellules, n’ont pas montré de modifications sur la prolifération, la viabilité ou la sénescence cellulaire. De ce fait, l’injection de doses raisonnables de peptides interférents (ne dépassant pas 1 mg/kg) ne devrait pas induire d’effets indésirables. Cependant, dans notre cas, il serait possible que ces injections induisent une perte de poids par manque d’appétit. En effet, NEU-1 a été décrit dans le système nerveux central (hippocampe) mais pourrait aussi être exprimé dans d’autres régions comme l’hypothalamus renfermant notamment le centre de la faim. La présence de NEU-1 dans le système nerveux central et l’inhibition de son activité par les peptides interférents pourraient entraîner une atteinte neurologique associée à une modification du comportement.

Devenir

Les animaux de chaque procédure (procédures 1 à 4) seront mis à mort afin de réaliser des études de biodistribution de la fluorescence et de cytotoxicité organe par organe (procédures 1 à 3), ou des études biochimiques/histologiques (procédures 1 à 4).

Remplacement

Le recours aux modèles in vitro a été réalisé en amont de la demande d’autorisation de projet. En effet, des résultats in vitro ont été obtenus concernant l’étude de la viabilité cellulaire de différentes lignées cellulaires (COS-7, SKBR-3, MCF-7, HepG2) après incubation avec le peptide transmembranaire interférent ou le véhicule seul (micelles de Lithium Dodécyl Sulfate ou LDS qui est un détergent utilisé en biologie). Bien que nous n’ayons observé aucune cytotoxicité de ces peptides et des micelles à 1 µM et 0,1 µM après différents temps d’incubation (10), la corrélation de cette étude de viabilité sur des modèles cellulaires isolés avec l’Homme est erronée d’un point de vue scientifique. Il est donc nécessaire d’étudier la posologie et la potentielle cytotoxicité de ces peptides dans un système animal entier afin d’obtenir des informations clés pour la suite des expérimentations (procédure 1 à 3). En ce qui concerne la procédure 4, à notre connaissance, aucun modèle in silico et in vitro ne peut remplacer un modèle in vivo pour cette application et cette thématique (développement d’un syndrome métabolique, à savoir, l’insulino-résistance et la NASH).

Réduction

Les procédures 1 à 3 ont été réalisées afin de se limiter aux expérimentations jugées absolument indispensables pour la procédure 4. Une réflexion biostastistique (G-Power) a été intégrée à la création de ce projet afin d’éviter qu’une réduction trop drastique ne nuise à la fiabilité des résultats du projet. Ainsi la procédure 1 nous permettra de déterminer la dose optimale à injecter tandis que les procédures 2 et 3 nous permettront de déterminer la fréquence d’injection afin d’atteindre les objectifs fixés dans la procédure 4, tout en garantissant le bien-être animal. L’avantage d'avoir mis au point ces procédures liées est qu'il sera possible et nécessaire d’arrêter le projet si les conditions fixées ne sont pas respectées pour l’ensemble ou l’un des deux sexes, réduisant ainsi le nombre d’animaux. De plus, pour les procédures 1 et 2, nous avons envisagé une prise de sang avant l’injection de peptides interférents afin que chaque individu soit son propre contrôle. En effet, une semaine avant le début des injections, un prélèvement de sang de 100 µL sera effectué pour chaque individu. Ceci permet de réduire le nombre d’individus nécessaire en éliminant un groupe contrôle ne subissant aucune injection. Pour les études de tomographie, un suivi dans le temps est réalisé par individu permettant d’éviter les sacrifices d’animaux aux temps intermédiaires de mesures (1h, 6h, 24h, 3 jours). Pour la procédure 4, comme les informations nécessaires à sa réalisation seront connues (posologie et biodistribution des peptides interférents), le nombre d’animaux sera le nombre minimum nécessaire. De plus, les étapes expérimentales dans cette procédure 4 impliquent de nombreuses méthodologies non invasives, permettant là encore une réduction du nombre d’animaux. Enfin des analyses statistiques seront réalisées à l’aide d’un test Mann-Whitney (test non paramétrique) ou de test de rang de type Wilcoxon qui sont adaptés pour l’étude sur un faible nombre d’individus.

Raffinement

Une période de stabulation sera réalisée à l’arrivée des souris, leur permettant de s’acclimater à leur nouvel environnement. La température et l'hygrométrie du local sont relevés quotidiennement. La nourriture et l’eau seront vérifiées tous les jours et disponibles ad libitum. Les cycles jour/nuit de 12h seront respectés. La litière sera changée deux fois par semaine, voire trois fois en cas de diurèse excessive des souris diabétiques. Les cages aux dimensions réglementaires (30x40cm) présenteront un enrichissement adapté et plusieurs animaux du même sexe y seront hébergées. Lors des phases d’expérimentation, les animaux seront isolés (une souris / boîte) afin de limiter la transmission du stress inter-individu. La manipulation se fera en dehors du champ de vision des animaux en attente d’expérimentation. Pour le bien-être de l’animal, les souris seront anesthésiées (isoflurane 4% pour l’induction et 1,5% pour le maintien) lors de certaines méthodologies (échographie/ tomographie) ou habituées au moins une semaine à l’avance à la contention. Cela devrait réduire le stress au minimum. Une vigilance d’autant plus accrue sera déployée à la suite des injections de peptides fluorescents ou de véhicule seul. En effet, un suivi régulier des animaux (au moins deux fois par jour) sera effectué notamment en déterminant, à l’aide d’une grille de score préalablement définie, le bien-être animal (voir document associé). Toute modification du comportement de l’animal (prostration, anxiété, isolement, troubles de l’équilibre), d’une variation significative du poids (environ 20% de perte ou de gain de la masse corporelle) ou d’une hyperglycémie (supérieur à 600 mg/dl de glucose) seront des points limites clés afin de juger de la nécessité ou non de mise à mort de l’animal. Au cours de l’expérimentation et notamment juste avant les phases de tomographies, de prélèvements de sang, des anesthésiques généraux ou locaux seront administrés. De plus, les ponctions de sang seront réalisées sous anesthésie générale à la suite de la mesure au FMT afin de réduire le temps de manipulation, le stress et la souffrance des souris. Une grille de score définie (voir en annexe) nous permettra de définir l’état dans lequel se trouvent les individus. Des tests neurocomportementaux (Labyrinthe à 8 branches, Labyrinthe en Croix Surélevé, Open Field) pourront être envisagés pour s'assurer qu'il n'y ait pas d'atteintes neurologiques suite aux traitements.

Choix des espèces

Les maladies métaboliques touchent principalement les adultes. Ainsi, afin de se placer dans les conditions les plus représentatives de ce que l'on peut retrouver chez l'Homme, les souris seront âgées de 8 semaines lors de la réception.

819 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal subit une cryolésion, une brûlure par le froid de degré 4 détruisant le muscle, réalisée sous anesthésie et provoquant une boiterie transitoire, pour étudier le rôle d'une chimiokine dans la réparation musculaire. Le porteur soutient, références à l'appui, que la destruction des terminaisons nerveuses rend la zone insensible, et prévoit un antalgique péri-opératoire. Il affirme qu'aucun système de culture ne pourrait reproduire la complexité des interactions cellulaires impliquées.

Objectifs

L’objectif du projet est de détailler le rôle des isoformes de CXCL12 dans la stabilité de la microvasculature musculaire à l’homéostasie et dans la réparation musculaire après lésion. La microvasculature à l’homéostasie et les étapes de réparation tissulaire seront étudiées dans des souris de phénotype sauvage, dans des souris dont CXCL12 est dépourvu de tous ses sites de fixation à la matrice extracellulaire (souris CXCL12gatm) et dans des souris n’exprimant pas CXCL12γ qui est l’isoforme ayant de loin la plus forte affinité à la matrice extracellulaire (souris CXCL12gamma). Nous avons des souris portant également la mutation Flk1-GFP qui permet de visualiser directement les vaisseaux sanguins en microscopie confocale. Les lésions musculaires seront créées en suivant le protocole de cryolésion décrit dans le projet dont celui-ci prend la suite. A différents temps post-lésions, les muscles seront prélevés après mise à mort des animaux et étudiés par des méthodes standard d’histologie impliquant des colorations de coupes et des immunomarquages des populations cellulaires impliquées. Ces analyses seront complétées par des quantification d’expression, par qPCR, des isoformes de CXCL12.

Bénéfices attendus

Ces expériences devraient permettre de comprendre de façon plus fine l’implication de CXCL12 dans les processus de réparation musculaire et devraient à plus long terme ouvrir à une meilleure compréhension des mécanismes de régulation de cette chimiokine multifonctionnelle, exprimée dans de nombreux organes et tissus depuis les premières étapes du développement et tout au long de la vie. La très grande similarité entre CXCL12 de souris et CXCL12 humaine (CXCL12 est extrêmement conservée dans l’évolution) est évidemment un atout important dans une perspective translationnelle. Des interventions thérapeutiques ciblées sur un isoforme, dans le cas de processus pathologiques impliquant CXCL12, pourraient permettre de moduler l’action de cette cytokine qu’il est difficile de cibler dans sa totalité du fait de son caractère essentiel.

Procédures

Cryolésion une fois dans leur vie (une intervention réalisée sous anesthésie). L’intervention dure quelques minutes.

Impact sur les animaux

Les mutations sur CXCL12 ou sur flk1 n’entraînent aucun phénotype particulier, en particulier aucune altération visible du comportement ou de la fertilité. Chez l’humain les brûlures par le froid (gelures) de degré 3 (atteinte de toute l’épaisseur du derme) et 4 (destruction musculaire) détruisent les terminaisons nerveuses et s’accompagnent d’une perte de sensibilité. Cf les deux sites web ci-dessous : https://www.mayoclinic.org/diseases-conditions/frostbite/symptoms-causes/syc-20372656 (“Deep (severe) frostbite … [that] affects all layers of the skin as well as the tissues that lie below [makes] the skin turns white or blue-gray and you lose all sensation of cold, pain or discomfort in the area.”) http://www.brulures.be/index.php/degres-de-gravite/fr/ (« les atteintes du 3e degré sont indolores du fait de la destruction des terminaisons nerveuses ») La brûlure que nous appliquons aux souris est de degré 4 et donc après cryolésion les terminaisons nerveuses du tissu sont détruites. Nous pouvons en déduire que, par les mêmes mécanismes que chez l’Homme, il y a une perte de sensibilité au niveau de la cryolésion. Les souris seront protégées de la douleur de l’incision cutanée par une anesthésie générale à l’isoflurane, complétée d’un traitement antalgique péri-opératoire. Il est possible que des douleurs apparaissent à la ré-innervation ou du fait de la réaction inflammatoire. Le risque d’infection secondaire qui accompagne les brûlures graves chez l’Homme est ici très faible parce que la brûlure sera protégée par la peau qui, elle, sera intacte (quoique suturée). Du côté lésé, les souris auront une perte transitoire de la fonction musculaire engendrant une boiterie, qui n’empêchera pas les animaux d’accéder à la nourriture dans la grille.

Devenir

Tous les animaux inclus dans le projet seront euthanasiés.

Remplacement

Nous nous intéressons à la régulation complexe par CXCL12 et ses isoformes d’interactions entre des populations cellulaires différentes (résidentes du tissu et recrutées à partir du sang) permettant la régénération d’un tissu lésé. CXCL12 lui-même peut avoir différentes cibles cellulaires. Aucun système de culture ne pourrait reproduire fidèlement la complexité de l’environnement cellulaire impliqué.

Réduction

Le nombre de souris a été déterminé en comptant 7 animaux par groupe, et en multipliant par le nombre de points d’observation prévus. Le nombre de souris pour chaque groupe a été déterminé sur la base de précédentes expériences. Un effectif de 7 animaux par groupe a été retenu pour permettre de détecter les différences de moyenne attendues entre les deux lignées mutantes, avec une puissance statistique suffisante. Chaque animal fournit un muscle lésé et son contrôle controlatéral, non lésé, et un groupe contrôle présentant le phénotype sauvage est également inclus.

Raffinement

La cryolésion sera réalisée dans le cadre d’une anesthésie gazeuse et d’un traitement antalgique complémentaire. Les animaux seront sur plaque chauffante le temps de l’intervention et des chaufferettes seront utilisées jusqu’au réveil complet. De l’aliment appétent facilement absorbable sera rajouté dans les cages qui seront également enrichies d’un igloo. Les souris seront surveillées quotidiennement par le responsable du protocole à la recherche de signes de complications locales, de douleur ou d’altération de l’état général. Si certains de ces signes apparaissent, des actions adaptées seront mises en oeuvre.

Choix des espèces

Nous travaillons chez la souris car il s’agit d’un petit Mammifère, étudié par de nombreuses unités de recherche (important pour les confrontations avec les résultats antérieurs), pour lequel de nombreux outils existent (anticorps, biologie moléculaire, etc…), génétiquement manipulable, aux temps de génération courts et aux portées nombreuses, permettant d’obtenir rapidement le nombre d’animaux nécessaire pour nos expérimentations. De plus, le CXCL12 murin est homologue à 99% au CXCL12 humain. Les animaux utilisés seront de jeunes adultes âgés de 6 et 10 semaines. Le choix de cette tranche d’âge résulte des éléments suivants : 1) L’importance de garder les mêmes conditions expérimentales que celles qui ont été utilisées dans une étude antérieure dont celle-ci prendra la suite ; 2) Pour ces deux études, le but est d’étudier des processus de réparation tissulaire et vasculaire à l’âge adulte, sans interférence avec la croissance et la maturation du système immunitaire des premières semaines de vie, ni avec les processus de vieillissement qui surviennent au-delà de quelques mois.

30 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour prélèvement d'organes, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal reçoit sous anesthésie une irradiation localisée à forte dose au colorectum, à l'abdomen ou au thorax, jusqu'à 27 Gy, puis est maintenu sept jours avant euthanasie. Le porteur indique que l'irradiation entraîne des douleurs et une perte de poids, la mise à mort survenant si l'animal perd plus de 20 % de son poids. Cette phase vise à mettre au point l'isolement des cellules endothéliales et le choix du modèle d'irradiation.

Objectifs

Le projet que nous présentons ici s’inscrit dans le cadre de ce projet de développement des outils de prédiction des lésions tissulaires radio-induites, basé sur la réponse moléculaire des cellules endothéliales à l’irradiation in vitro en raison de leur rôle dans l’initiation et le développement des toxicités liées aux fortes doses d’irradiation localisée (Annexe 2). Pour évaluer les effets des nouvelles modalités d’irradiation en radiothérapie, notre programme de recherche s’appuie sur les mesures d’un ensemble de paramètres biologiques dans les cellules endothéliales cultivées in vitro comme l’expression de gènes, la sénescence ou le cycle cellulaire, pour comparer des rayonnements ionisants de différentes qualités. Des premières séries expérimentales sur des souris ont permis de confirmer ces différences de réponse pour des débits de dose différents in vivo (12). Pour rendre notre modèle plus robuste, nous souhaitons maintenant collecter et utiliser des données provenant de cellules endothéliales irradiées in vivo. La phase 1 des expériences in vivo est proposée dans ce protocole : il s’agira de mettre au point l’isolement des cellules endothéliales d’organes de souris contrôles et irradiées, condition nécessaire à l’étude de l’expression des gènes et des protéines de ces cellules, afin de comparer les rendements et qualités (notamment la viabilité) des cellules obtenues à partir de trois organes d’intérêt : colorectum, intestin et poumon. En effet, il se peut que certains organes soient mieux adaptés à l’obtention de quantités et de viabilités des cellules suffisantes pour la suite des expériences (cytométrie en flux et séquençage de l’ARN sur cellules uniques). Ce protocole permettra de faire le choix de l’organe pour la suite du projet. Dans la phase 2 du projet, il s’agira d’irradier l’organe choisi lors de la première étape à différentes énergies et différents débits de doses. Cette phase du projet sera proposée dans une future DAP. L’objectif du projet présenté ici (cf. Annexe 3) sera de réaliser des expériences pour choisir, parmi les modèles d’irradiation localisée au niveau du, de l’abdomen (intestin) ou du thorax (poumon), le modèle qui permettra de collecter le plus grand nombre de cellules endothéliales et dans le meilleur état possible (proportion de cellules vivantes supérieur à 80%).

Bénéfices attendus

L’objectif global de notre projet est l’étude de la réponse moléculaire des cellules endothéliales issues d’organes irradiés in vivo chez la souris. Le projet a pour but de contribuer à une meilleure prédiction des risques de séquelles à long terme liées aux traitements par la radiothérapie. Le bénéfice scientifique attendu de ce projet est la validation et le renforcement de notre modèle d’évaluation des risques de séquelles utilisant des cellules en culture (in vitro) en établissant des liens entre les jeux de données obtenus in vitro et ceux obtenus chez la souris par des analyses mathématiques et bio-informatiques. Une fois établi, notre modèle pourra permettre d’évaluer in vitro les risques sans recourir à l’expérimentation animale. Pour ce qui concerne le projet présenté ici, le bénéfice scientifique attendu est de pouvoir choisir l’organe optimal pour ces études. A plus long terme, le bénéfice attendu de ce projet sera principalement pour l’être humain : par l’établissement d’un modèle de prédiction in vitro du risque de séquelles lié aux nouvelles pratiques de la radiothérapie, nous comptons contribuer à l’amélioration de la qualité de vie des patients après traitement anti-cancéreux, un objectif inscrit dans la stratégie décennale de lutte contre les cancers 2021-2030.

Procédures

Les animaux seront anesthésiés, irradiés localement sous anesthésie, maintenus 7 jours en cage d’hébergement dans les conditions classiques de l’animalerie, puis euthanasiés avant le prélèvement des différents organes (colorectum, intestin ou poumon – les animaux étant irradiés à 2.5 Gy/min, les durées d’irradiation des doses 17, 18 et 27 Gy seront respectivement de 6.8 min, 7.2 min et 13.5 min). Aucune autre manipulation ne sera réalisée.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables prévus seront occasionnés par l’exposition aux rayonnements ionisants. Les 3 modèles d’irradiation localisée que nous utiliserons sont bien caractérisés dans notre laboratoire : irradiation au niveau du colorectum, irradiation au niveau de l’abdomen, irradiation du thorax. Le recul acquis par le laboratoire sur ces modèles n’a pas montré de dommage clinique nécessitant l’euthanasie anticipée des animaux. Pour les 3 modèles, l’irradiation entraîne des douleurs et une perte de poids. En revanche, le temps final de l’étude étant assez court (7 jours après l’irradiation), ces protocoles n’entrainent pas la mort des animaux.

Devenir

Euthanasie pour prélèvements sous anesthésie terminale

Remplacement

Il n’existe pas d’alternative non animale à ce jour concernant l’étude de la réponse moléculaire des cellules endothéliales dans leur environnement tissulaire. L’utilisation d’animaux vivants est indispensable à cette étude.

Réduction

Cette étude est une mise au point. Pour les souris contrôles (non irradiées), nous prélèverons 3 organes différents sur le même animal (colorectum, intestin et poumon), ce qui limitera le nombre d’animaux. Dans l’étape 1, il s’agira de comparer les rendements en cellules endothéliales sur ces 3 organes, en condition non irradiée. Dans l’étape 2, le protocole de purification des cellules irradiées sera appliqué à des souris irradiées, en comparaison à des souris non irradiées.

Raffinement

Tous les animaux du projet seront surveillés quotidiennement avec une mesure de poids afin de vérifier que la perte de poids ne dépasse pas 20 % du poids du groupe témoin. Des observations de signes comportementaux et cliniques (absence de mobilité, prostration, diarrhée/constipation, signes de détresse respiratoire) seront effectuées. L’observation des signes comportementaux ou cliniques anormaux pendant plus de 3 jours entraînera une euthanasie anticipée. La connaissance du laboratoire dans les 3 modèles nous indique que les premiers signes apparaissent à J8-J10 post-irradiation, or les animaux seront euthanasiés à J7. Il n’est donc pas attendu de signes cliniques majeurs dans ce projet.

Choix des espèces

Nous avons choisi d’utiliser des souris âgées de 10 à 12 semaines. Ceci correspondant au stade adulte, ce qui permet d’éviter l’hétérogénéité éventuelle liée à l’âge (il s’agit également de la gamme d’âge classiquement utilisée pour ces modèles d’irradiation localisée). La souris est un modèle bien caractérisé et qui est le plus utilisé dans les études précliniques. De plus, c’est un modèle très utilisé au sein du laboratoire dans des protocoles d’irradiation colorectale, intestinale et thoracique pour comprendre le rôle de l’endothélium vasculaire dans les lésions radio-induites. Nous possédons donc un recul important sur les conséquences de l’irradiation pour chacun de ces trois modèles.

720 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des injections intrapéritonéales quotidiennes, l'implantation chirurgicale d'une mini-pompe et des séjours en cage métabolique, avant un prélèvement sanguin terminal, pour reproduire une hypertension artérielle maligne. Le porteur reconnaît de possibles atteintes du cœur, des reins et de la rétine, ainsi que des douleurs post-opératoires. Les bénéfices, identifier les patients à risque et de nouvelles cibles, sont formulés au conditionnel.

Objectifs

L’intérêt de ce projet est de comprendre pourquoi certains patients avec hypertension artérielle vont développer une forme grave de cette hypertension, appelée hypertension artérielle maligne, avec une atteinte sévère du coeur, des reins et de la rétine et du cerveau pouvant conduire à la mort des patients. Notre équipe a identifié des mécanismes pouvant expliquer cette aggravation sévère de l'hypertension artérielle et cherche à valider ces mécanismes complexes dans un modèle d'hypertension artérielle chez la souris.

Bénéfices attendus

Si notre projet confirme nos hypothèses, cela pourrait permettre d'identifier les patients hypertendus susceptibles de développer une forme grave d'hypertension artérielle maligne. Nous pourrions également identifier des marqueurs prédictifs et/ou diagnostic de l'hypertension artérielle maligne. De plus, la démonstration qu’une altération des petts vaisseaux est en cause dans certains troubles graves du rythme cardiaque pourrait ouvrir de nouvelles perspectives thérapeutiques.

Procédures

Injection intrapéritonéale quotidienne pendant 5 jours. Une procédure chirurgicale: implantation d'une mini-pompe osmotique sous-cutanée. Prélèvement urinaire en cage métabolique sur animal vigile. Prélèvement sanguin terminal sur animal anesthésié.

Impact sur les animaux

Effets indésirables liés au traitements: inconfort lié à la préhension des animaux, douleur au point d'injection, inconfort lié aux cages métaboliques. Effets de la chirurgie: douleurs post-opératoire. Effets du modèle pathologique d'HTA: potentiellemnt atteinte des organes cibles, coeur, reins et rétines

Devenir

Tous les animaux du projet seront mis à mort afin de prélever les organes et analyser les atteintes microvasculaires des organes cibles de l'hypertension artérielle.

Remplacement

Nous utilisons différentes approches pour analyser les mécanismes de l'atteinte microvasculaire liés à l'hypertension artérielle, incluant les cultures cellulaires (in vitro). En général, les expériences de remplacement ne peuvent pas reproduire la complexité des mécanismes mis en jeu au cours de l'HTA comme les interactions entre les vaisseaux et le système immunitaire. C'est pourquoi nous aurons aussi recours au modèle animal, en choisissant la souris comme modèle classique de mammifère, et comme modèle expérimental établi, avec de nombreux outils génétiques disponibles, un temps de génération court et des portées de grande taille.

Réduction

Réduction : le nombre d'animaux est calculé sur la base d’un plan expérimental stéréotypé permettant d’obtenir la puissance statistique nécessaire à l’obtention de conclusions biologiquement pertinentes. Un calcul d'effectif a été réalisé au préalable permettant d'évaluer le nombre d'animaux requis. Nous prélevons un maximum d'organes d'intérêt par animal afin de réduire le nombre d'animaux utilisés.

Raffinement

Raffinement : les animaux seront élévés en cages enrichies en coton et surveillés au cours des procédures pour repérer l’éventuelle apparition de signes cliniques pouvant indiquer une souffrance ou un mal-être. Les souris hypertendus urinent beaucoup. Pour cette raison, le nombre d'animaux par cage est limité à 3 et les cages sont changés plus fréquemment et dès que nécessaire. En cas d’apparition de signes cliniques, ou à la fin de la procédure, les animaux sont mis à mort. Les procédures chirurgicales sont réalisées sous anesthésie générale avec une analgésie péri-opératoire. Les échographies cardiaques qui sont non invasive sont réalisées sous anesthésie gazeuse.

Choix des espèces

La souris est le seul modèle permettant à la fois de réaliser des expériences de physiopathologie de mammifère et d’utiliser la recombinaison homologue ou l’excision allélique dirigée afin de connaître la fonction des produits des gènes in situ et in vivo. Souris adultes agées de 10 à 20 semaines car il faut de jeunes adultes. En effet, l'age est un facteur de risque de fibrose rénale et utiliser des souris trop agées induirait une plus grande variabilité de nos résultats expérimentaux.

600 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une bactériémie à staphylocoque doré résistant à la méticilline leur est provoquée par injection dans la veine de la queue, avec prélèvements sanguins quotidiens pendant dix jours, pour étudier le rôle protecteur de la protéine cavéoline-1. Le porteur indique que l'aggravation de l'infection conduit à prostration, cyanose et perte de poids, la mise à mort étant alors anticipée. Il reconnaît qu'une étude sur cellules a déjà établi le rôle de la cavéoline-1, mais affirme que la confirmation "doit" passer par un modèle in vivo.

Objectifs

La famille des exotoxines EDIN (A, B et C) de S. aureus compromet la perméabilité vasculaire par induction de tunnels transcellulaires. Des résultats non publiés montrent que cavéoline-1, une protéine fortement exprimée dans les cellules endothéliales, limite la formation et l’élargissement de ces tunnels transencellulaires. La perte d’expression de la cavéoline-1 entraine i) un doublement du nombre des tunnels transcellulaires provoqués par l’EDIN et ii) l’élargissement de ces tunnels. Des études antérieures sur modèle souris ont montré que l’EDIN est responsable d’une plus grande capacité des bactéries à induire une augmentation de la perméabilité vasculaire, associée à une plus forte dissémination de S. aureus dans les tissus par voie hématogène. Basé sur des résultats obtenus in vitro, l’objectif de notre étude est de démontrer que la perte d’expression de la cavéoline-1 chez l’animal est responsable d’une hyper-susceptibilité des animaux à la bactériémie induite par la souche LUG1799 du clone ST80-SARM-IV PVL+ et que ceci est directement lié à l’activité de la toxine EDIN-B. La souche LUG1799 est représentative des souches de S. aureus résistantes à la méticilline, problème majeur en Europe et en France. Nous nous baserons sur des études précédentes pour limiter le nombre d’animaux engagés dans cette étude et par une approche d’analyse statistique pour définir le nombre d’animaux par groupe.

Bénéfices attendus

Des travaux antérieurs ont permis de montrer un lien causal entre la formation des tunnels transendothéliaux induits par l’exotoxine EDIN de S. aureus et la survenue de dysfonctions vasculaires : œdème et hémorragie. De plus un exemple de formation transitoire de tunnels transcellulaires en physiologie est décrit lors de la transmigration des leucocytes à travers l’endothélium. Bien qu'elle ait été longtemps controversée, la première preuve de transcytose de leucocytes au travers des cellules endothéliales a été démontrée in vivo et/ou in vitro pour les monocytes, les neutrophiles, les lymphocytes, grâce à l’imagerie confocale à haute résolution. L'intégrité de la barrière endothéliale est maintenue lors de la diapédèse des leucocytes au travers des cellules endothéliales grâce à la formation d'un anneau d’actine-myosine qui est étroitement ajusté à la taille des leucocytes. Cet anneau stabilise le pore pendant le passage des leucocytes empêchant la fuite de plasma et la formation associée d'œdème. La formation de tunnels transcellulaires de taille régulée est aussi essentielle pour permettre l'écoulement de l'humeur aqueuse. Le dysfonctionnement de ces tunnels transcellulaires affecte la résistance à l'écoulement avec augmentation de la pression intraoculaire, provoquant le glaucome. Les protéines responsables de la régulation de ces tunnels transcellulaires sont largement inconnues. Nous avons identifié le rôle inhibiteur de la cavéoline-1 sur la formation et l’élargissement des tunnels transcellulaires induits par l’EDIN. Cette étude permettra de démontrer le rôle protecteur de la cavéoline-1 lors de la bactériémie induite par une souche clinique de S. aureus ST80-SARM-IV edinB+ et ouvrira à une meilleure compréhension de la régulation des tunnels transcelluaires dans les processus physiologiques et pathophysiologiques.

Procédures

Cette procédure consiste en l’administration de S. aureus par injection intravasculaire dans la veine de la queue avec suivi de la bactériémie par prélèvement sanguin quotidien de 20 microlitres (3 minutes par intervention) durant 10 jours. Cette procédure est néanmoins modérée car conduit à une mise à mort anticipée des animaux lors de l’apparition d’un phénotype caractéristique d’aggravation de la bactériémie.

Impact sur les animaux

Des expériences antérieures ont montré que des souris transgéniques invalidées pour le gène de la cavéoline-1 du même fond génétique que celle que nous élevons (C57BL/6, 12-14 semaines) une fois infectées par voie intravasculaire (veine de la queue) par 103 CFU de Salmonella typhimurium souche SB300 meurent en 7 jours (temps ½) alors que les souris sauvages meurent en 13 jours. Cet effet de susceptibilité à l’infection est à mettre en parallèle avec une translocation accrue des bactéries vers le foie avec formation de larges granulomes et translocation dans la rate, une forte augmentation de marqueurs de la réponse immunitaire (IFN-gamma, IL-6, TNF-alpha) dans le sang et la production de taux élevés de NO dans le sérum. Cette réponse péjorative de marqueurs immunitaires est récapitulée par l’injection de LPS de S. typhimurium. Les souris lors de l’infection meurent plus rapidement du fait d’une réaction immunitaire élevée et translocation de Salmonella plus forte dans les organes essentiels. Aucune étude à ce jour n’a permis de définir si des souris invalidées dans le gène de la cavéoline-1 sont plus susceptibles à des bactériémies induites par des bactéries à Gram-positif, S. aureus étant la plus fréquemment isolée dans la bactériémie à Gram-positif chez l’homme que l’infection soit d’origine nosocomiale ou communautaire. Un ensemble de résultats obtenus in vitro sur cellules primaires endothéliales humaines concordent pour indiquer que la perte d’expression de la cavéoline-1 entraine une augmentation du nombre et du diamètre des tunnels transendothéliaux provoqués par les exotoxines EDIN (A, B et C). Nous chercherons à prouver chez l’animal invalidé pour la cavéoline-1 que lors de la bactériémie à S. aureus produisant l’EDIN-B les animaux montrent des signes d’hyper-susceptibilité à l’infection du fait d’induction de fuites vasculaires. Nous suivrons l’évolution de la bactériémie provoquant un phénotype caractéristique de bactériémie aggravée conduisant à la prostration, immobilité, apathie, des animaux avec hérissement des poils, le tremblement, la cyanose, et perte de poids significative de plus de 20%. Ce suivi des animaux permettra une mise à mort anticipée des souris présentant un phénotype de bactériémie aggravée.

Devenir

Les animaux sont mis à mort à l’issue de chaque procédure.

Remplacement

Une étude de biologie cellulaire conduite sur cellules endothéliale en remplacement d’expériences sur l’animal nous permet d’affirmer que la cavéoline-1 est un gène de susceptibilité à la formation de tunnels transendothéliaux qu’induit l’EDIN. La formation de ces tunnels transendothéliaux corrèle avec l’apparition de fuites vasculaires. Cette approche de remplacement de type biologie cellulaire nous a permis de limiter le nombre de gènes de susceptibilité à l’EDIN à étudier pour ne sélectionner que la cavéoline-1. Le rôle protecteur de la cavéoline-1 dans l’infection bactériémique par une souche de S. aureus produisant l’exotoxine EDIN-B doit être confirmée par une approche in vivo.

Réduction

Pour limiter le nombre d’animaux engagés dans cette étude nous procèderons en étapes successives avec une seule procédure de « suivi d’aggravation de la bactériémie » et nous définirons le nombre d’animaux par groupe grâce à un calcul statistique de puissance. Pour l'étape 1 (établissement de la CFU50) les effectifs ont été calculés sur la base d'expériences précédentes sur d'autres modèles animaux. Pour les étapes 2, 3 et 4 les effectifs ont été calculés sur la base d'une analyse de puissance. Pour approximation, une analyse de puissance d'un test de comparaison de proportions a été réalisée, pour un risque 5%, une puissance de 80%, donnant des effectifs de 30 animaux par groupe. Ceci correspond à une différence entre les groupes variant de 0.13 à 0.35, suffisante pour répondre à la question biologique.

Raffinement

Une surveillance quotidienne des animaux selon la grille d’évaluation de la douleur du stress et inconfort du SBEA, nous permettra de détecter au plus tôt les points limites de souffrance de l’animal. Les points limites seront : des changements de comportement, tels que l'isolement dans le groupe, ainsi que prostration, immobilité, apathie, hérissement des poils, le tremblement, la cyanose, et une perte de poids significative (plus de 20%) seront mis à mort. Dans ces conditions, la mise à mort sera anticipée par dilacération cervicale pour abréger les souffrances de l’animal (technique validée 1A). Des cotons imbibés d’eau et de la nourriture « Dietgel » seront placés dans la cage dans le cas ou certaines souris auraient du mal à se déplacer.

Choix des espèces

Etude comparative de souris transgéniques invalidées dans le gène codant la cavéoline-1 de fond génétique C57BL/6 (B6.Cg-Cav1tm1Mls/J, Jackson via Charles River) versus souris sauvage « littermate ». Les souris C57BL/6 sont sensibles à l’infection intraveineuse par S. aureus (geste technique validé 18A). Nous savons d’expériences précédentes (n° dap160118) que l’injection de doses comprises entre 5x 106 et 5x 108 CFU suivant les souches de S. aureus conduit à un état de prostration, immobilité, apathie avec hérissement des poils, le tremblement, la cyanose, et une perte de poids significative de plus de 20% conduisant à une mise à mort anticipée de 50 % des animaux sur 10 jours. La valeur de CFU50 des souris C57BL/6 à l bactériémie LUG1799 sera déterminée dans l’étape n°1. La souris est l'espèce de choix pour l'étude de l'infection par S. aureus : espèce naturellement colonisée par S. aureus comme l'homme, pathogenèse infectieuse proche de celle de l'homme, espèce permissive à l'infection par S. aureus, littérature abondante. Notre étude portant sur l’infection de type bactériémie sera conduite sur des animaux de 8-16 semaines selon un protocole publié portant sur un modèle de souris invalidées dans le gène codant la cavéoline-1.

720 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent des injections intrapéritonéales quotidiennes pendant cinq jours, l'implantation chirurgicale d'une mini-pompe sous-cutanée et des séjours en cage métabolique, pour reproduire une hypertension artérielle maligne pouvant atteindre le coeur, les reins et la rétine. Le porteur indique que tous les organes seront prélevés après mise à mort pour analyser les atteintes microvasculaires. Il affirme que les cultures cellulaires ne reproduisent pas la complexité de la maladie et retient la souris comme "modèle classique de mammifère".

Objectifs

L’intérêt de ce projet est de comprendre pourquoi certains patients avec hypertension artérielle vont développer une forme grave de cette hypertension, appelée hypertension artérielle maligne, avec une atteinte sévère du coeur, des reins et de la rétine et du cerveau pouvant conduire à la mort des patients. Notre équipe a identifié des mécanismes pouvant expliquer cette aggravation sévère de l'hypertension artérielle et cherche à valider ces mécanismes complexes dans un modèle d'hypertension artérielle chez la souris.

Bénéfices attendus

Si notre projet confirme nos hypothèses, cela pourrait permettre d'identifier les patients hypertendus susceptibles de développer une forme grave d'hypertension artérielle maligne. Nous pourrions également identifier des marqueurs prédictifs et/ou diagnostic de l'hypertension artérielle maligne. De plus, la démonstration qu’une altération des petts vaisseaux est en cause dans certains troubles graves du rythme cardiaque pourrait ouvrir de nouvelles perspectives thérapeutiques.

Procédures

Injection intrapéritonéale quotidienne pendant 5 jours. Une procédure chirurgicale: implantation d'une mini-pompe osmotique sous-cutanée. Prélèvement urinaire en cage métabolique sur animal vigile. Prélèvement sanguin terminal sur animal anesthésié.

Impact sur les animaux

Effets indésirables liés au traitements: inconfort lié à la préhension des animaux, douleur au point d'injection, inconfort lié aux cages métaboliques. Effets de la chirurgie: douleurs post-opératoire. Effets du modèle pathologique d'HTA: potentiellemnt atteinte des organes cibles, coeur, reins et rétines

Devenir

Tous les animaux du projet seront mis à mort afin de prélever les organes et analyser les atteintes microvasculaires des organes cibles de l'hypertension artérielle.

Remplacement

Nous utilisons différentes approches pour analyser les mécanismes de l'atteinte microvasculaire liés à l'hypertension artérielle, incluant les cultures cellulaires (in vitro). En général, les expériences de remplacement ne peuvent pas reproduire la complexité des mécanismes mis en jeu au cours de l'HTA comme les interactions entre les vaisseaux et le système immunitaire. C'est pourquoi nous aurons aussi recours au modèle animal, en choisissant la souris comme modèle classique de mammifère, et comme modèle expérimental établi, avec de nombreux outils génétiques disponibles, un temps de génération court et des portées de grande taille.

Réduction

Réduction : le nombre d'animaux est calculé sur la base d’un plan expérimental stéréotypé permettant d’obtenir la puissance statistique nécessaire à l’obtention de conclusions biologiquement pertinentes. Un calcul d'effectif a été réalisé au préalable permettant d'évaluer le nombre d'animaux requis. Nous prélevons un maximum d'organes d'intérêt par animal afin de réduire le nombre d'animaux utilisés.

Raffinement

Raffinement : les animaux seront élévés en cages enrichies en coton et surveillés au cours des procédures pour repérer l’éventuelle apparition de signes cliniques pouvant indiquer une souffrance ou un mal-être. Les souris hypertendus urinent beaucoup. Pour cette raison, le nombre d'animaux par cage est limité à 3 et les cages sont changés plus fréquemment et dès que nécessaire. En cas d’apparition de signes cliniques, ou à la fin de la procédure, les animaux sont mis à mort. Les procédures chirurgicales sont réalisées sous anesthésie générale avec une analgésie péri-opératoire. Les échographies cardiaques qui sont non invasive sont réalisées sous anesthésie gazeuse.

Choix des espèces

La souris est le seul modèle permettant à la fois de réaliser des expériences de physiopathologie de mammifère et d’utiliser la recombinaison homologue ou l’excision allélique dirigée afin de connaître la fonction des produits des gènes in situ et in vivo. Souris adultes agées de 10 à 20 semaines car il faut de jeunes adultes. En effet, l'age est un facteur de risque de fibrose rénale et utiliser des souris trop agées induirait une plus grande variabilité de nos résultats expérimentaux.