Protection de l’environnement

72 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles sont exposées à un champ magnétique statique intense vingt heures sur cinq semaines, puis soumises à des tests de coordination et d'équilibre, avant la mise à mort pour analyse du cerveau. Le porteur nomme les indicateurs surveillés, réduction de mobilité, dos voûté, perte de poids, et attend une possible atteinte du système vestibulaire. Il justifie le recours à l'animal par la nécessité de confirmer sur un organisme entier des effets observés en culture, dans le contexte des IRM à très haut champ.

Objectifs

Grâce à de nombreuses avancées scientifiques et technologiques, l'Imagerie par Résonance Magnétique (IRM) est devenue une modalité d’imagerie de diagnostic incontournable et utilisée en routine clinique. Bien que son utilisation ait montré clairement un intérêt dans diverses pathologies, cette technique induit notamment une exposition des patients à des champs magnétiques statiques intenses (quelques dizaines de milliers de fois l'amplitude du champ terrestre). Lors d’examens IRM, des effets aigus et réversibles ont été rapportés par des patients et des travailleurs, tels que des sensations de nausées et de vertiges, un goût métallique dans la bouche ainsi que des images lumineuses dans la rétine (phosphènes). De nombreuses études ont été menées sur des systèmes in vitro, des animaux ou sur l’Homme pour détecter des effets biologiques des champs magnétiques statiques, notamment sur la reproduction et le développement, le système nerveux et la cognition, ainsi que sur la génotoxicité. Cependant, les résultats de ces recherches cliniques et précliniques sont très divergents et/ou peu concluants et ne permettent pas de répondre clairement à ce jour sur la présence ou non d’éventuels risques pour la santé des champs magnétiques statiques. Face à ces interrogations, la Commission Internationale de Protection contre les Radiations non-ionisantes (ICNIRP) a publié des recommandations sur les limites d’exposition aux champs magnétiques statiques des patients et des travailleurs et une directive européenne (2013/35/UE) a été mise en place. Ces institutions insistent sur l’importance de mener de nouvelles études sur l’Homme et les animaux pour apporter des preuves scientifiques sur de potentiels impacts des champs magnétiques statiques sur la santé. Dans ce contexte, notre projet de recherche porte sur les effets sur le système nerveux central et les comportements qui en dépendent, de l’exposition aux champs magnétiques intenses. Il comporte des analyses in vivo chez la souris, pour caractériser les effets d’exposition de la tête sur certaines fonctions cognitives et sur le système vestibulaire situé dans l’oreille interne et qui contribue à la sensation de mouvement et d’orientation dans l’espace, ainsi qu’au maintien de l’équilibre.

Bénéfices attendus

Notre projet vise une première caractérisation des effets sur le système nerveux central de l’exposition chronique à des champs magnétiques intenses, en particulier sur certaines fonctions cognitives et sur le système vestibulaire qui intervient dans la coordination motrice et le maintien de l’équilibre. Les résultats de cette étude viendront compléter ceux déjà présentés dans une étude récente avec des expositions à 10,5 T et 16,4 T, et contribueront, à apporter de nouvelles preuves scientifiques sur les impacts potentiels des champs magnétiques statiques sur la santé. En effet, l’intensité du champ magnétique utilisé pour réaliser des études d’IRM sur le cerveau humain est un paramètre essentiel, car plus le champ magnétique est intense, plus le signal disponible pour acquérir une image est important, ce qui permet d’atteindre des résolutions spatiales et temporelles plus élevées. L’émergence de nouveaux scanners IRM cliniques à très hauts champs magnétiques nécessite de compléter les études sur les effets potentiels sur la santé humaine (aigus et à long terme) de l’exposition unique ou répétée à des champs magnétiques intenses.

Procédures

Les souris seront soumises : - À une exposition chronique à un champ magnétique statique intense (20h d’exposition réparties en 2 sessions de 2h par semaine pendant 5 semaines) - Des tests comportementaux pour quantifier les effets de cette exposition chronique sur la coordination motrice, l’équilibre et la locomotion volontaire (de 30mn à 1h selon le test allant de 4 à 7 sessions) Les tests comportementaux seront réalisés avant l’exposition (pour caractériser le comportement de base), à différents temps pendant les expositions (pour caractériser les effets de l’exposition chronique), puis 2 semaines après la dernière exposition (pour caractériser des effets persistants).

Impact sur les animaux

Les tests de comportement utilisés pourraient induire un stress chez l’animal. Une phase d’entraînement sera réalisée avant le début des expériences afin que les animaux s’habituent aux expérimentateurs et aux dispositifs de tests comportementaux. La présence d’effets indésirables chez les animaux liés à l’exposition chronique à un champ magnétique, et notamment la potentielle perturbation du système vestibulaire (perturbation de la coordination motrice et de l’équilibre), sera déterminée d’après une série d’indicateurs comportementaux : réduction de la mobilité, dos voûté, pilo-érection, tressautements du corps, perte de poids importante (plus de 20%).

Devenir

En fin de procédure, les animaux seront euthanasiés et leurs cerveaux prélevés afin de réaliser des analyses histologiques, qui permettront d’étudier au niveau cellulaire les potentielles modifications du système nerveux central induites par l’exposition chronique à des champs magnétiques intenses.

Remplacement

Quelques études in vitro menées sur des cultures de cellules souches neurales ou de neurones immatures ont mis en évidence des effets biologiques induits par l’exposition chronique à des champs magnétiques statiques. Néanmoins, il est indispensable de confirmer ces effets sur des organismes vivants car l’auto-renouvèlement, la migration et la différenciation des cellules souches neurales sont des processus finement régulés par leur microenvironnement. Notre projet nécessite d’avoir recours à des animaux à des fins scientifiques car l’objectif de cette étude est de déterminer clairement l’existence ou non d’effets du champ magnétique statique sur le système nerveux central dans son ensemble, mais surtout sur certaines fonctions cognitives et le système vestibulaire, en utilisant des tests comportementaux dédiés.

Réduction

En se basant sur les résultats présentés dans une étude récente qui a montré certains changements comportementaux chez des souris exposées de façon chronique à haut champ magnétique, il apparaît qu’un nombre de 24 animaux par groupe est nécessaire pour mettre en évidence des effets significatifs lors de l’analyse statistique des résultats des tests comportementaux choisis. Cependant, l’ensemble du projet sera réalisé de manière séquentielle : les expériences seront réalisées avec des lots de 8 animaux et ainsi, si des effets significatifs sont observés sur la santé et le bien-être des animaux dès le premier lot ou après l’utilisation du deuxième lot, les expériences seront arrêtées.

Raffinement

Les animaux, une fois obtenus auprès d’élevages agréés, seront hébergés en groupe dans des cages munies de modules d’enrichissement (accessoires de jeu, fabrication de nids), avec un accès illimité à l’eau et la nourriture. Leur état de santé sera étroitement suivi tout au long de l’étude, afin d’intervenir immédiatement dès le moindre signe de souffrance et d’appliquer les critères d’arrêt en cas d’événement inattendu qui compromettrait le bien-être d’un animal. Les tests de comportement qui suivront les expositions au champ magnétique ne sont pas stressants et sont basés sur la curiosité naturelle des rongeurs pour la nouveauté. Une phase d’entraînement sera réalisée avant le début des expériences afin que les animaux s’habituent aux expérimentateurs et aux dispositifs de tests comportementaux

Choix des espèces

La souris est une espèce couramment utilisée dans le domaine des neurosciences car l’organisation anatomique et fonctionnelle des structures cérébrales est relativement proche de celles de l’Homme. De plus, l’espèce souris a été choisie pour cette étude car les tests comportementaux qui seront réalisés ont déjà été réalisés chez cette souche de souris dans de très nombreuses études comportementales, ce qui nous permettra de nous référer à des données connues de la littérature. Des souris de 8-9 semaines environ, mâles et femelles, seront utilisées car ce stade de développement correspond à l’âge adulte pour cette espèce. Pour les expériences de cette étude, le choix d’animaux adultes jeunes se justifie par la nécessite de limiter le risque d’apparition de pathologies liées à l’âge pouvant biaiser certains résultats comportementaux, et par la nécessité de pouvoir comparer les résultats obtenus avec ceux de la littérature.

15 sangliers vont être capturés et utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, tous abattus à l'issue. Chaque animal est piégé en cage, placé en sabot de contention, anesthésié par injection puis équipé d'un collier GPS et relâché pour neuf à douze mois, avant d'être tué par balle par des lieutenants de louveterie. Le porteur décrit une angoisse liée à la capture et à la contention et présente la mise à mort par balle comme une "euthanasie", ces sangliers relevant déjà d'un arrêté préfectoral de destruction administrative. Le projet vise à cartographier les déplacements de l'espèce autour de Toulouse pour orienter sa gestion en ville, des données destinées aussi à "convaincre les élus".

Objectifs

L'étude vise à localiser des habitats et des continuités écologiques favorisant la présence du sanglier (Sus scrofa) sur l’agglomération toulousaine, dans une optique de gestion écologique de ces espaces. Pour faire apparaître des habitats et des continuités écologiques récurrents, c'est-à-dire utilisés de manière constante par les animaux, il s’agira de capturer des sangliers et d’effectuer un suivi d’individus par collier GPS. Les données acquises seront traitées par Système d’Information Géographique (SIG) pour déterminer les secteurs les plus fréquentés par l’espèce et leur degré de connectivité écologique, afin d’orienter des préconisations de requalification écologique.

Bénéfices attendus

Le suivi réalisé permettra de répondre à la problématique que se posent les services de l’Etat et les collectivités en matière de gestion du sanglier en zone urbaine, qui posent aujourd’hui problème aux administrés et aux activités humaines, tout en permettant d’identifier des éléments favorables à la prise en compte et à la protection d’éléments essentiels à la biodiversité. Se faisant la procédure répond à une finalité de protection de l’environnement naturel dans l’intérêt de la santé ou du bien-être de l’homme ou de l’animal, conformément à l’article R214-105 du Code rural et de la pêche. Le protocole permettra ainsi d’identifier les éléments responsables de cette présence au plus près des habitations et des infrastructures de transport afin de les traiter. Les données générées permettront de convaincre les élus et les propriétaires les plus réticents de cette présence et des problèmes qu’elle peut poser, dans un contexte où les mesures à mettre en œuvre impliquent des positionnements politiques et financiers importants. De plus, ces données mettront en évidence les corridors biologiques à l’échelle de la métropole toulousaine, à l’heure où les collectivités réclament de plus en plus de données in situ et où les données générées in silico (modélisation des trames écologiques) convainquent modérément les élus. Ces données participeront ainsi au maintien d’éléments fondamentaux pour la conservation de la biodiversité sur le territoire métropolitain dans les stratégies de planification urbaine. Enfin, ces données permettront d’étalonner les modélisations des continuités écologiques de la faune sauvage développées par le réseau des Fédération des Chasseurs, afin que l’usage des animaux puisse être réduit, voire ne plus être nécessaire, à l’avenir. A ce titre, l’avantage de la mise en œuvre de ce protocole surpasse le coût pour l’animal.

Procédures

Angoisse et inconfort liés à la restriction de liberté en cage de capture et de reveil (angoisse et inconfort modérés de durée moyenne 1h à 12h) - Angoisse liée à la présence de personnel (angoisse modérée de courte durée 15min) - Angoisse liée au placement en sabot de contention (angoisse forte de très courte durée

Impact sur les animaux

Stress lié à la capture et au placement en sabot de contention Douleur liée à l'introduction d'une aiguille au cours de la sédation Stress lors de la mise à mort

Devenir

L’ensemble des animaux utilisés dans ce protocole sont des animaux concernés par une procédure réglementaire de destruction administrative et ne pourront quoi qu’il arrive pas être relâchés ou placés. La mise à mort sera effectuée par une équipe de Lieutenants de Louvèterie, dument habilitée par la Préfecture à prélever des animaux sauvages dans leur habitat naturel dans les conditions prévues par l’annexe 4 de l’arrêté du 1er février 2013.

Remplacement

D’autres méthodes ne faisant pas intervenir l’utilisation d’animaux ont été envisagées et testées pour répondre à la problématique. Une étude de photographies aériennes et d’images satellites a été réalisée pour identifier les structures végétales favorisant la présence de ces animaux. Cette méthode nécessite l’utilisation d’images bénéficiant à la fois d’une très haute résolution spatiale (THRS) et d’une mise à jour annuelle (dynamique végétale des friches et landes arbustives). Par ailleurs, cette méthode ne permet de se prononcer ni sur la présence effective de sangliers dans ces habitats (présence d’éléments d’entraves non détectables par l’imagerie aérienne) ni sur la structure de végétation sous les boisements mâtures. Une telle méthode nécessiterait de nombreuses prospections de terrain à la recherche d’indices de présence, techniquement inenvisageables à l’échelle de l’agglomération toulousaine. La seconde méthode consiste en la modélisation informatique des continuités écologiques de cette espèce, sur la base de carte d’occupation du sol enrichie d’autres bases de données pour préciser les occupations du sol à enjeu. Si cette méthode permet d’identifier certaines continuités écologiques et certains habitats, il a été montré que de nombreux habitats vérifiés de l’espèce échappent à la modélisation, notamment parce que les données d’occupation du sol se basent principalement sur l’imagerie aérienne et de ses biais mentionnés précédemment. Par ailleurs, l’acquisition de données GPS in situ représenterait une opportunité de calibrer les modélisations pour les rendre plus performantes à l'avenir afin de se passer des animaux.

Réduction

La littérature et les contacts pris avec des laboratoires de recherche recommandent généralement l'équipement de 30 animaux pour obtenir des résultats statistiquement robustes. Le projet s'inscrivant dans un cadre plus opérationnel que statistique, l'adaptation du matériel (colliers GPS permettant de multiplier le nombre de localisations par individu (>1 localisation par heure) afin de limiter le nombre N d’individus suivis tout en conservant un grand nombre de données collectées >8760 loc. attendues / an / individu) et la localisation des captures permettra d'adapter le nombre d’individus aux stricts besoins de l’étude et au territoire d’étude. Ainsi, seuls 15 animaux seront suffisants, au regard de la zone d'étude (30 000 ha) et des domaines vitaux de l'espèce (2000 ha).

Raffinement

Faire intervenir des personnels formés et compétents : La capture effectuée par une personne disposant des compétences nécessaires en matière de capture et autorisée par arrêté Préfectoral - Limiter la manipulation de l’animal à des personnels ayant bénéficié de manipulations pilotes sur animaux d’élevage. Limiter l’inconfort du port du collier et les risques de blessures pour l’animal : Adaptation du ratio poids du collier / poids animal pour ne pas dépasser 3% - Procédure réservée à des individus de plus de 45 kg pendant 1 an maximum - Engagement d’une procédure de mise à mort à t=9 mois en tenant compte des réalités techniques d’une telle opération. Réactivité des équipes post-capture pour réduire au maximum le temps passé en cage de capture : Mise en place de pièges photographiques GSM permettant d’être alerté de la capture en temps réel -Mise en place d’une coordination d’équipe préalable et renforcée et d’une astreinte fédérale lors des périodes de capture. Limiter le stress de l’animal : Aucun personnel à moins de 50 mètres avant examen initial -Dans la mesure du possible, examen initial à plus de 50 mètres à la jumelle binoculaire – si impossible, un unique personnel autorisé à réaliser l’examen initial à moins de 50 mètres de la cage -Choix du recours à l’anesthésie pour limiter un stress dommageable pour l’animal lors de l’équipement du collier GPS -Limiter le nombre de personnels sur site, le volume sonore et l’agitation jusqu’à l’anesthésie complète de l’animal. Adapter la manipulation pour limiter le risque d’effets indésirables de l’anesthésie pour l’animal : Préparation de la dose d'hypnotique adaptée par le vétérinaire ou le concepteur sur site et avant placement en contention - Mise en contention par 4 personnels maximum compétents pour la manipulation de la grande faune sauvage - Injection rapide de l’agent hypnotique et retrait de l’équipe pour permettre à l’anesthésie d’opérer sans stress -Limiter les risques de détresses peranesthésiques par l'usage d'une couverture de survie et de manipulations adaptées - Adapter la fixation du collier dans la recherche du confort de l'animal. Limiter le stress et accroître le confort de l’animal en phase de réveil : abreuvoir dans la cage de reveil et si possible branchages autour. S’assurer de la bonne santé de l’animal suivi au cours de la procédure. Mettre à mort l’animal de manière à engendrer le moins de stress possible et sans douleur pour l’animal.

Choix des espèces

L'étude vise à localiser les habitats et les continuités écologiques du sanglier (Sus scrofa). Parallèlement à une augmentation des dégâts aux productions agricoles, les sollicitations croissantes des collectivités locales et de leurs administrés auprès des Services de l’Etat pour des actes de destruction administrative révèlent les problèmes que pose la présence croissante du sanglier en ville. Le Préfet de la Haute-Garonne a souhaité engager des travaux pour identifier les habitats et les continuités écologiques du sanglier sur les communes de l’agglomération toulousaine, avec l'objectif d'empêcher, ou du moins de limiter, l'accès du sanglier aux secteurs les plus urbanisés et de prévenir les dégâts et les risques associés à la présence de ces animaux auprès des populations. Les sangliers utilisés seront concernés par un arrêté préfectoral de destruction administrative qui prévoira notamment que ces animaux puissent être équipés de colliers GPS et relâchés dans l’environnement, à la condition que ces animaux présentent les caractéristiques adéquates et soient abattus en fin de procédure. Les animaux utilisés seront des adultes ou des sub-adultes de plus de 45 kg pour limiter le risque de prise de poids trop importante et les inconforts associés.

1 200 poissons, 900 goujons et carassins et 300 truites, vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, la plupart tués à l'issue et les individus de taille extrême relâchés. Ils sont capturés par pêche électrique, exposés deux à trois semaines à des cocktails de polluants en rivière ou en laboratoire, marqués et parfois injectés d'un antigène mimant une attaque parasitaire, puis euthanasiés par surdose d'anesthésique pour mesurer la contamination de leurs tissus. Le porteur indique choisir des doses faibles et des durées courtes pour observer des effets non létaux tout en limitant la mortalité. Les bénéfices se limitent à "mieux comprendre" les effets des pollutions humaines sur la faune sauvage, et le porteur juge le remplacement par culture cellulaire inapplicable à l'étude de stress multiples.

Objectifs

Les écosystèmes aquatiques sont lourdement impactés par les pollutions organiques (pesticides) et inorganiques (métaux) issues des activités agricoles et industrielles, mais leurs effets à long terme sur la santé et les capacités d’adaptation des organismes aquatiques et notamment des poissons sont encore peu évalués, notamment en conditions réalistes de stress multiples (parasites, température…). Le projet vise à évaluer les impacts potentiels des stress environnementaux multiples (notamment chimiques) en combinant des approches en laboratoire et sur le terrain, au plus près du réalisme environnemental.

Bénéfices attendus

A terme les résultats de ce projet permettront de caractériser les effets des pollutions environnementales sur la santé des poissons, et de mieux comprendre les réponses comportementales et physiologiques des animaux soumis aux stress chimiques. Ils permettront donc de mieux comprendre et anticiper les effets des pollutions d'origine humaine sur la santé de la faune sauvage.

Procédures

Pour tester leur réponse aux stress chimiques, des poissons seront exposés à des polluants en dose et cocktails réalistes au plus proche des concentrations trouvées en rivière, et ce pendant une durée maximale de 21 jours pour éviter tout effet mortel, mais observer des effets physiologiques et comportementaux. Dans un premier temps, des approches en laboratoire seront utilisées afin de tester les effets des polluants en conditions contrôlées sur carassins et goujons, notamment des cocktails de contaminants représentatifs du milieu naturel en se basant sur des bases de données existantes. Pour tester la variabilité de réponse entre populations sauvages hétérogènes, plusieurs populations sauvages de goujons ayant évolué dans des rivières plus ou moins polluées seront comparées. Dans un deuxième temps, des expérimentations d’encagement en rivière seront mises en place afin de tester les réponses des poissons en conditions réalistes de multistress sur le terrain. Des goujons issus de populations plus ou moins exposées aux pesticides, et des truites également issues de zones plus ou moins polluées par des métaux, seront transplantés en cage dans des rivières contaminées ou peu contaminées. Les cages seront de dimensions suffisante avec un grillage fin de 5 mm qui laisse passer les invertébrés pour la nourriture. Les poissons seront exposés pendant 14 à 21 jours à des rivières plus ou moins polluées que leur rivière d’origine. Après toutes les expositions en laboratoire ou rivière, les poissons seront anesthésiés, marqués avec des colorants non toxiques par injection sous-cutanée, mesurés (poids et longueur totale), une unique injection sous-cutanée d’antigène mimant une attaque parasitaire pourra être effectuée au niveau de la queue afin de tester l’immunité des poissons. Au total ces interventions sont réalisées en moins de 2 minutes. Enfin les poissons seront euthanasiés par surdose d’anesthésique, et les taux de contamination de leurs tissus seront mesurés, ainsi que leur état de santé à partir de diverses mesures dans les tissus (nageoires, foie, rein, muscles, sang).

Impact sur les animaux

Pour l’ensemble des démarches expérimentales, excepté celles impliquant le carassin domestique et les goujons d’élevage (animaux d’élevage), la capture des individus sauvages sera réalisée par pêche électrique. Cette procédure de pêche peut causer un stress mais elle sera effectuée par des personnels formés et après demande d’autorisation auprès des autorités compétentes via l’utilisation de matériel spécifique respectant la législation en vigueur. Le voltage utilisé sera adapté pour causer une sédation légère et rapide des poissons qui seront ensuite transportés dans des conteneurs isothermes oxygénés puis acclimatés en laboratoire ou dans les cages en rivière pendant 7 jours minimum pour limiter le stress de capture, de transport et de captivité. Les démarches expérimentales (en laboratoire et en rivière) impliquent des expositions à des polluants qui peuvent causer des dommages mais les cocktails et doses seront relativement faibles car représentatives du milieu naturel. De plus, les durées d’exposition seront relativement courtes (21 jours maximum) pour observer des réponses physiologiques mesurables tout en limitant les dommages pathologiques potentiels infligés aux organismes d’étude et la mortalité. En effet l’objectif étant de mimer des niveaux de stress réalistes et des effets non létaux. Le reste des procédures (mesures, prises de sang, injections) aura lieu sous anesthésie de quelques minutes et devrait causer un stress limité.

Devenir

Les animaux pêchés par pêche électrique seront euthanasiés pour être disséqués post-mortem. Les animaux pêchés mais jugés de taille extrême (trop petit ou trop grand) seront immédiatement remis à l'eau après vérification de leur état après passage dans un seau de réveil.

Remplacement

L’objectif de l’étude étant de caractériser l’effet des stress multiples sur la variation des réponses physiologiques des poissons d’eau douce, l’utilisation de méthodes de remplacement (par exemple test sur cultures cellulaires) en vue de limiter le nombre d’animaux vivants utilisés dans le projet ne peut être appliquée. Néanmoins, afin de limiter le prélèvement d’individus dans le milieu naturel, des carassins seront utilisés ainsi que des goujons d’élevages pour remplacer une population sauvage (population de référence non polluée) afin d’affiner la caractérisation des processus physiologiques impliqués dans la réponse à une exposition à des stress multiples.

Réduction

Pour limiter le nombre d’animaux utilisés, un maximum d’information sera tiré de chaque individu en utilisant un maximum de mesures sur les organes pertinents. Nous avons préalablement réalisé une étude statistique pour déterminer le nombre minimal d’animaux à utiliser dans chaque procédure et dans chaque lot pour obtenir un résultat statistiquement probant. A posteriori, des traitements statistiques seront également effectués pour mettre en évidence des différences significatives entre les lots et les modalités d’exposition.

Raffinement

Afin de limiter le stress induit par la captivité des animaux (aquariums et cages), les individus seront maintenus en groupe de 5 à 10 individus maximum avec une densité d’environ 1 cm de poisson pour 1 L d’eau. En laboratoire, la photopériode sera fixée à 12h de jour/12h d’obscurité (lors des phases expérimentales) et la qualité de l’eau sera assurée quotidiennement via la mise en place d’un système de filtration propre à chaque aquarium et la mesure régulière des paramètres physico-chimiques. Dans le cas où certains de ces paramètres (en particulier les produits azotés) dépasseraient les optimums de chaque espèce, des renouvellements d’eau partiels seront effectués. Les aquariums d’exposition seront alimentés avec de l’eau du réseau, filtrée et stérilisée. Pour les phases de stabulation, les bacs seront alimentés par de l’eau du réseau. Des refuges seront introduits dans tous les bacs de stabulation et cages afin de limiter le stress et enrichir le milieu. Il n’est pas possible de placer des refuges dans les aquariums d’exposition en raison de l’adsorption des polluants sur les surfaces des refuges. Un suivi régulier des aquariums et des cages sera effectué quotidiennement pour surveiller l’état des animaux notamment pendant les phases d’exposition.

Choix des espèces

La pertinence de l’utilisation des poissons et plus particulièrement des 3 espèces sélectionnées se justifie par le fait que : - Le carassin domestique Carassius auratus est un animal utilisé depuis plusieurs décennies en recherche. Sa physiologie, son mode de vie et ses besoins sont connus et bien documentés. - Concernant les 2 espèces sauvages, le goujon Gobio occitaniae et la truite fario sauvage Salmo trutta trutta, ces dernières ont été sélectionnées car elles sont bien implantées dans notre zone d'étude. Comme pour le carassin, leur physiologie est connue et bien documentée. - Ces espèces ayant des exigences différentes (en termes d'habitat, de régime alimentaire, de déplacement…), elles sont exposées aux polluants de manière différente. Ainsi, les goujons seront soumis à des contaminations liées aux polluants utilisés en agriculture, alors que les truites seront soumises à des contaminations métalliques minières. Tous les poissons utilisés seront des adultes ou jeunes adultes d’une taille d’environ 10 cm (carassins et goujon adultes, truitelles jeunes adultes). Nous utilisons des adultes pour deux raisons essentielles : - la pêche d'adultes dans le milieu naturel permet de ne pas compromettre la régénération des populations sauvages - les adultes sont sexés et donc sexables. Par conséquent le sexe dans animaux étant connu, il est possible d'intégrer ce facteur de variation à notre étude statistique, pour mettre en évidence un éventuel impact du sexe dans le comportement et/ou la physiologie des animaux exposés aux contaminants.

4 vaches laitières vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, puis réintégrées à un troupeau laitier et susceptibles de repasser dans d'autres protocoles après deux mois. Pendant quatorze semaines, dont quatre périodes de dix-huit jours à l'attache, elles subissent une vingtaine de prélèvements de contenu digestif et des prises de sang par période, des collectes d'urine et de fèces, et le port de harnais que le porteur reconnaît susceptibles de provoquer des irritations. L'objectif est de comparer la valeur nutritionnelle de tourteaux extraits avec un composé bio-sourcé plutôt qu'à l'hexane, un solvant neurotoxique, et d'estimer le rôle du rumen dans l'absorption du phosphore. Le porteur affirme qu'une mesure de référence est une "nécessité" faute de données suffisantes pour des modèles mathématiques ou des tests in vitro.

Objectifs

Les tourteaux sont le résidu solide obtenu lors du traitement des graines oléagineuses en vue de l’extraction d’huile. Du fait de leur forte teneur en protéines, ils constituent une matière première clé pour équilibrer les rations des animaux d’élevage. Aujourd’hui, la majorité des tourteaux résultent d’une extraction des huiles à l’hexane qui est une substance neurotoxique, ainsi qu’un perturbateur endocrinien. Une alternative à l’hexane pourrait être un composé bio-sourcé, issus de coproduit alimentaire. Une question est de déterminer si la valeur nutritionnelle pour les vaches laitières des tourteaux issus de l’extraction par ce composé bio-sourcé reste suffisamment similaire aux tourteaux extraits à l’hexane pour permettre leur usage généralisé en élevage. Par ailleurs, un autre enjeu autour de l’usage des tourteaux est l’impact de l’usage du tourteau de soja dans les émissions de gaz à effet de serre, via notamment la déforestation que sa culture provoque. Le tourteau de colza produit plus localement semble une bonne alternative à la seule limite qu’il est plus riche en phosphore. Son usage dans des rations de vaches laitières entraine ainsi une excrétion accrue de phosphore, susceptible de provoquer des phénomènes d’eutrophisation. Une partie significative du phosphore contenu dans les tourteaux est sous forme de phytates, non absorbable au niveau intestinal. Chez les animaux monogastriques, l’addition de phytases dans les rations a permis de réduire significativement les apports de phosphore en permettant une meilleure absorption intestinale de ce dernier. Chez les ruminants, la flore microbienne ruminale produirait des phytases mais on ne sait pas si leur quantité est suffisante pour que le phosphore soit bien absorbé dans les rations à base de colza. Du fait du développement de l’usage du tourteau de colza, il est donc aujourd’hui nécessaire d’évaluer le rôle des phytases ruminales sur des rations à base de tourteau de colza afin de juger de la pertinence d’ajouter aux rations des ruminants des phytases de synthèse comme chez les monogastriques.

Bénéfices attendus

Si les résultats de ce projet sont concluants, c’est-à-dire si la valeur nutritionnelle des tourteaux résultant d’une extraction au composé bio-sourcé est comparable à celle des tourteaux extraits à l’hexane, l’adoption de ce nouveau procédé d’extraction permettra de réduire les risques de maladies professionnelles des ouvriers des usines d’extraction liés à la manipulation de l’hexane et à limiter la diffusion de résidus d’hexane dans les produits animaux destinés à la consommation humaine. Des tests urinaires réalisés en Europe ont montré que la moyenne de la population présente des teneurs urinaires en 2,5-haxanedione résultant du métabolisme de l’hexane supérieurs au niveau d’exposition jugé comme acceptable pour la santé. A contrario, l’EFSA (European Food Safety Authority) a tranché que le composé bio-sourcé testé dans ce projet ne présentait pas un risque de résidus problématiques dans les produits animaux. D’autre part, l’estimation du rôle du rumen dans le devenir des phytates sur des rations à base de tourteau de colza chez les vaches laitières permettra d’objectiver les bénéfices d’une supplémentation en phytases de synthèse. Ceci pourra constituer une piste pour ajuster au mieux les supplémentations en phosphore des vaches sur ce type de ration, afin de répondre à leur besoin physiologique tout en limitant les rejets de phosphore dans l’environnement et les risques d’eutrophisation.

Procédures

Cet essai concerne des animaux vigiles qui seront mobilisés durant 14 semaines (2 semaines de mesures de référence, puis 4 périodes de 3 semaines). Cette durée inclura 4 périodes de 18 jours pendant lesquelles les vaches seront à l'attache. Des prélèvements de contenus digestifs et de sang dans la veine caudale seront réalisés sur la dernière semaine de chaque période. Les prélèvements de contenu digestifs seront au nombre de 20 par vache et par période et chaque prélèvement durera moins de 5 minutes. Les prises de sang en veine caudale seront au nombre de 4 par vache et par période et chaque prélèvement durera moins de 2 minutes. Des collectes totales d’urine et de fèces seront aussi réalisées pendant 5 jours consécutifs par période, en continu. Des mesures de l’activité fermentaire du rumen seront aussi réalisées.

Impact sur les animaux

Pour ce projet les vaches devront être maintenues à l’attache pendant une période de deux semaines et quatre périodes de 18 jours. Pour limiter les effets d’une telle pratique sur les articulations, chacune de ces périodes sera espacée de trois jours pendant lesquels les vaches seront laissées en liberté dans la stabulation afin qu’elles puissent marcher librement. Pour limiter le stress lié à l’isolement social, les vaches attachées seront logées dans la même pièce et séparées par des pare-bottes, ce qui leur permettra de se sentir et de s’entendre. Pour limiter les stress sociaux liés aux séquences de 3 jours pendant lesquels les vaches seront en liberté ensembles, elles seront regroupées en liberté dans une case de la stabulation qui leur sera dédiée et isolée du reste du troupeau. Pour la collecte séparée de l’urine et des fèces, des harnais de collecte d’urine seront posés sur les vaches à la fin de chaque période expérimentale, soit pendant 5 jours à 4 reprises espacées de 16 jours. Ces derniers peuvent induire un risque d’irritations. Ces périodes avec harnais sont limitées en nombre et en durée au maximum pour limiter ce risque, et espacées pour permettre aux vaches d’avoir totalement cicatrisé entre les périodes le cas échéant. Par ailleurs, les dispositifs de prélèvement digestif entrainent peu de nuisances avérées chez les vaches équipées par rapport aux autres vaches. Ceci est garanti par un suivi journalier afin de vérifier que les dispositifs sont bien bouchés en dehors des périodes de prélèvements.

Devenir

A l’issue de la procédure les animaux seront réintégrés dans un troupeau de vaches laitières soumis à une conduite classique d’élevage laitier. Après un délai d’au moins 2 mois, certaines de ces vaches pourront réintégrer de nouveaux projets expérimentaux.

Remplacement

Une difficulté pour prédire la valeur nutritionnelle des rations chez les ruminants résulte du fait que les bactéries du rumen transforment largement les aliments, dont certains nutriments peuvent être dégradés par le métabolisme microbien et d’autres synthétisés de novo. Cependant, du fait du faible nombre de données engrangées actuellement, il est difficile d’estimer la proportion de phytates dégradés dans le rumen par des modèles mathématiques et/ou des tests in vitro. L’acquisition de mesure de référence est une nécessité. De même, très peu de données ont été produites à ce jour pour connaitre les dégradations et les synthèses des vitamines dans le rumen et d’acides aminés intestinaux. Cette expérimentation sera doublée de tests in vitro pour valider leur pertinence pour estimer la digestion des protéines.

Réduction

Le schéma expérimental utilisé dans ce projet (4X4) fait qu’on peut obtenir une puissance statistique satisfaisante avec un faible nombre d’animaux. Ce type de schéma est possible ici car les traitements qui sont à comparer n'ont pas d’effet induit sur la période suivante (pas d’effet rémanent). En effet, les rations alimentaires ne varieront que par le type de tourteau utilisé, et les teneurs des régimes en protéines restent dans une gamme de variation qui n'induit pas de régulation physiologique interne très marquée. De plus, une autre condition à ce type de schéma est une certaine stabilité du stade physiologique des vaches sur la durée de l’essai, ce qui est le cas ici avec des vaches suivies en milieu de lactation.

Raffinement

La conduite des animaux dans ce projet sera aussi respectueuse que possible du bien-être des animaux. Un suivi régulier du comportement et des paramètres indicateurs de la souffrance des animaux sera mis en place pour détecter le plus rapidement possible tout signe de perturbations et de traiter si besoin les animaux malades. Les pratiques dans ce projet les plus susceptibles d’entraîner un mal-être chez les animaux seront le fait de les maintenir attachés et la pose de harnais de collecte des urines. Pour limiter les risques de mal-être, voire de stress lié à l’attache, les vaches seront logées dans une même salle pour se sentir et s’entendre, et les périodes d’attaches seront ponctuées de périodes de remises en liberté. La durée des périodes à l’attache est limitée au maximum pour permettre aux animaux d’être complétement habitués au fait d’être attachés avant les mesures. Les périodes en liberté auront aussi pour objectif de permettre de limiter les risques articulaires et de mieux les détecter et les traiter le cas échéant. Pour limiter les risques d’irritation chronique de la peau pendant les collectes d’urine, ces dernières seront les plus courtes possibles si on intègre le fait que l’on a toujours une variabilité journalière du volume et de la composition de l’urine. Des crèmes cicatrisantes/apaisantes seront appliquées dès la fin des collectes, qui seront par ailleurs suffisamment espacées pour permettre des périodes de récupération importante entre les périodes de pause des harnais.

Choix des espèces

La problématique de l’étude est assez spécifique aux vaches laitières, puisqu'elle concerne des apports protéiques sous forme de tourteaux dans les rations hivernales. Les vaches seront de race Prim’Holstein. Il s’agit de la race de vache laitière la plus répandue dans le monde. Les résultats de ce projet ont vocation à être diffusés au niveau international. Les vaches seront en milieu de lactation qui est le stade physiologique le plus courant des vaches laitières en production en fermes.

240 crapauds communs vont être capturés dans la nature, prélevés puis relâchés sur place, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque individu subit sous anesthésie locale une ponction de sang directement dans le cœur, avec deux tentatives au maximum, avant d'être surveillé au réveil puis relâché en moins d'une heure. Le porteur étudie l'effet de la pollution lumineuse nocturne sur leurs défenses immunitaires le long d'un gradient d'éclairage, et présente les retombées pour la conservation des amphibiens. Il affirme que ces traits immunitaires ne sont "pas modélisables" et qu'aucune expérience in vitro ou in silico ne peut y donner accès.

Objectifs

Dans les dernières décennies, la lumière artificielle nocturne a considérablement augmenté et est maintenant considérée comme une source de pollution. Le halo lumineux généré par les villes s’étend jusqu’à des zones naturelles pourtant éloignées de plusieurs dizaines de kilomètres des centres urbains. Du fait de l’urbanisation croissante, les zones humides, qui concentrent une part considérable de la biodiversité, se retrouvent fréquemment dans des aires urbaines et péri-urbaines exposées à la pollution lumineuse. Les amphibiens, qui sont le groupe de vertébrés le plus menacé à l’échelle mondiale, dépendent de ces zones humides en raison de leur cycle de vie complexe à l’interface entre les milieux aquatiques et terrestres. Leur rythme d’activité, principalement nocturne, les exposent particulièrement à la pollution lumineuse. Nous avons montré, à l’aide d’une approche transcriptomique, que des têtards de crapaud commun Bufo bufo soumis à de la lumière nocturne durant leur développement présentent une sous-expression de nombreux gènes liés à l’immunité innée, et une sur-expression de gènes impliqués dans l’inflammation par rapport aux animaux témoins. Or, en milieu naturel, la capacité du système immunitaire à lutter contre les agents pathogènes est une fonction cruciale pour ces espèces très sensibles aux infections virales et fongiques. Il est donc nécessaire de déterminer si les modifications transcriptomiques observées chez les têtards exposés à cette pollution se traduisent bien par des capacités immunitaires altérées à l’échelle de l’organisme. Afin de répondre à cette question, le projet proposé a pour but de caractériser fonctionnellement l’impact de la pollution lumineuse nocturne sur le phénotype immunitaire du crapaud commun. Pour cela, nous allons mesurer les capacités immunitaires et l’état de santé de différentes populations de crapauds en fonction d’un gradient de pollution lumineuse. Cela permettra de tester si la modification de l’expression des gènes liés à l’immunité a bien des conséquences fonctionnelles au niveau des capacités immunitaires des adultes, leur permettant de lutter contre les agents pathogènes. Ce type d’étude, bien que primordiale en biologie de la conservation et en éco-immunologie, est très rarement menée dans la nature compte tenu de la complexité des variables immunitaires mise en jeu. Les résultats attendus seront directement utilisables en biologie de la conservation par les gestionnaires des territoires.

Bénéfices attendus

Les résultats attendus de cette expérimentation seront valorisables à la fois au niveau fondamental en Eco-immunologie et à un niveau plus appliqué en Biologie de la Conservation. En effet, dans le cadre du concept de Santé Unique, comprendre les dynamiques d’interactions entre les sources de pollutions anthropiques et les espèces en milieu naturel est indispensable au contrôle des épidémies futures. Ce projet va permettre, pour la première fois, de caractériser de manière précise les réponses immunitaires chez un amphibien dans des conditions de lumière nocturne réalistes présentes sur le terrain. Nous allons utiliser une combinaison de mesure de traits immunitaires qui permettent de mieux appréhender la complexité des effecteurs (innés, acquis, cellulaires et humoraux) caractérisant la fonction immunitaire. Cette étude pionnière donnera des indications sur la pertinence et la

Procédures

Pour les 240 crapauds prélevés (nombre maximum), nous prévoyons un prélèvement sanguin par cardiocentèse après anesthésie des individus par application cutanée de la crème EMLA 5% lidocaïne + prilocaïne (voie percutanée). Le prélèvement sera réalisé en quelques minutes. Pas plus de deux tentatives ne seront réalisées chez le même individu. En comptant l’induction de l’anesthésie (environ 10 min) et le temps de réveil monitoré par un opérateur (de 5 à 30 min selon les individus), nous évaluons le temps total de la procédure à partir de la capture à un maximum de 1 heure. Après la procédure, les individus seront relâchés et ne seront donc échantillonné qu’une seule fois au cours de ce projet.

Impact sur les animaux

La manipulation et la contention peut induire un stress chez les crapauds, qui sera minimisé par une limitation de la durée de la contention entre 3 et 5 minutes. La prise de sang par cardiocentèse représente un effet traumatique mais modéré car se fera sous anesthésie (application locale crème EMLA, dosage standardisé).

Devenir

Après la capture et la prise de sang effectué sous narcose, suivie de la surveillance des individus lors de la période de réveil, tous les individus vigiles présentant un comportement actif normal seront relâchés en milieu naturel sur le lieu exact de leur capture dans un délai évalué à 1 heure. Une seule session de capture sera organisée sur chacun des sites, les individus ne seront donc capturés qu’une seule fois pour ce projet.

Remplacement

La réponse immunitaire est une fonction physiologique complexe, composée de multiples effecteurs (innés et adaptatifs, cellulaires et humoraux) qui est modulée en miroir des conditions environnementales locales. Les traits immunitaires des individus, notamment en milieu naturel, ne sont pas modélisables et leur mesure nécessite le prélèvement sanguin sur organisme vivant et sain. Aucune expérience in vitro ou in silico ne peut permettre d’accéder à ce type de données.

Réduction

La capture et l’échantillonnage réalisés sur les individus adultes ont été optimisés statistiquement, de façon à réduire au maximum le nombre d’animaux utilisés et prélevés dans la nature tout en obtenant des résultats significatifs. Quinze individus par site seront capturés. Cela représente le nombre minimal d’individus nous permettant d’avoir une information réaliste et exploitable sur l’état de santé des crapauds du site. Une autorisation préfectorale a été obtenue pour les sites concernés, le nombre d’individus et les prélèvements réalisés. Enfin, la quantité de sang prélevée sera utilisée dans son entièreté. Les culots de globules rouges restants des prélèvements sanguins seront conservés à -80° pour des mesures ultérieures de longueur de télomères, mesure possible chez les amphibiens qui présentent la particularité d’avoir des globules rouges nucléés. Cette mesure permettra une évaluation du stress environnemental.

Raffinement

Le bien-être et la minimisation du stress infligé aux animaux est une condition sine qua non de cet échantillonnage en milieu naturel et fera l’objet de toute notre vigilance et notre adaptation à chaque individu échantillonné. Les crapauds seront délicatement prélevés sur le terrain à la main avec port de gants à usage unique. Chaque individu sera essuyé délicatement avant pesée nous permettant

Choix des espèces

Les amphibiens sont un taxa très menacé mondialement. En dehors des chiroptères, les amphibiens contiennent la plus grande proportion d’espèces nocturnes (93%) susceptibles d’être affectés par la pollution lumineuse. Le crapaud commun, espèce sentinelle, est présent dans les zones péri-urbaines et urbaines régulièrement soumise à la pollution nocturne. Ainsi, dans son environnement naturel, cette espèce est soumise à des éclairements bien supérieurs aux éclairements de la photopériode naturelle, pouvant affecter sa physiologie et son comportement. Le choix de cette espèce est donc particulièrement adapté à l’étude des effets de la pollution lumineuse. De plus, la pollution lumineuse semble avoir d’importants effets sur le système immunitaire de cette espèce, la fonction physiologique de défense des individus en milieu naturel. Ce taxa étant particulièrement sensible aux épidémies bactériennes et fongiques, les résultats obtenus seront susceptibles d’avoir une grande portée de conservation et pour la gestion des territoires. Nous avons choisi de travailler sur les adultes car ce stade est particulièrement impacté par la pollution lumineuse nocturne, notamment au moment de la reproduction (sortie de l’hiver – début du printemps) où ils doivent se déplacer pour rejoindre les sites de ponte. De plus, des perturbations physiologiques à ce stade auraient directement des impacts sur le succès reproducteur des individus, et donc sur les dynamiques des populations. Enfin, le système immunitaire des individus adultes étant complètement développé, les résultats obtenus seront plus généralisables qu’à des stades plus juvéniles.