Enseignement supérieur et formation professionnelle

100 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal reçoit une fenêtre d'observation implantée dans le crâne sous anesthésie, puis jusqu'à neuf séances d'habituation à la contention et cinq à sept séances d'imagerie maintenues de une à trois heures, pour former une quinzaine d'étudiants par an à la technique. Le porteur revendique qu'il n'existe pas d'alternative non animale et qu'il est "essentiel" que la formation implique des animaux vivants. Les bénéfices évoqués contre les pertes sensorielles restent lointains, l'objet réel du projet étant l'apprentissage d'un outil d'imagerie.

Objectifs

Le but général du projet est d’entrainer annuellement une quinzaine d’étudiants, sous supervision d’un spécialiste, à mesurer de manière extensive et précise les représentations sensorielles de stimuli complexes dans le cerveau de souris vigiles. Ces mesures extensives sont rendues possibles par l’utilisation de techniques d’imagerie à haute densité permettant l’enregistrement simultané de plus de 1000 neurones par expérience. La formation d’étudiants dans ce domaine permettra la généralisation de cette méthodologie qui permet d’obtenir beaucoup plus de données cruciales pour la compréhension des circuits neuronaux du cerveau pour un nombre réduit d’animaux utilisées. Dans ce projet, nous mettons en place une procédure expérimentale permettant aux étudiants, sous la supervision d’un spécialiste de prendre en main les instruments nécessaires à la réalisation de l’expérience en situation réelle.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra l’acquisition par une quinzaine d’étudiant annuellement d’une méthode qui représente une nouveauté technologique pour l’observation de l’activité cérébrale à la résolution neuronale. Le développement de cette méthode permettra de progresser dans la compréhension des mécanismes de la perception sensorielle et ainsi de pouvoir développer de nouvelles approches thérapeutiques dans le domaine des pertes sensorielles.

Procédures

Les animaux sont soumis à 1 chirurgie d’implantation d’une fenêtre d’observation permanente sous anesthésie et analgésie puis à 9 séances maximum d’habituation à la contention (0.5 à 3h par séance). Enfin 5 à 7 séances d’imagerie en contention de 1 à 3 heures sont réalisés.

Impact sur les animaux

Ce projet inclut une préparation chirurgicale des souris occasionnant des douleurs et un inconfort modéré dans la période de récupération de 2 jours. Par la suite les souris sont habituées à la contention ce qui entraine un stress et un inconfort qui s’amenuisent après 3 jours d’habituation.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure car ils ne peuvent être ni réutilisés, ni replacés, ni adoptés.

Remplacement

Il n’existe pas d’alternative non animale pour accéder à l’activité de milliers de neurones opérant le traitement de l’information sensorielle. Dans ce projet l’utilisation d’animaux est nécessaire pour permettre aux étudiants d’apprendre la méthodologie d’imagerie et la manipulation de l’équipement en conditions réelles. Cela permet d’éviter par la suite de nombreuses erreurs qui peuvent se faire parfois au détriment du bien-être animal. Il est donc essentiel que la formation à cette méthode implique des animaux vivants.

Réduction

Grâce à l’utilisation des méthodes d’imagerie optiques modernes permettant d’enregistrer plus de 1000 neurones en parallèle, le nombre d’animaux utilisés est minimisé par la possibilité de répéter le protocole de mesure sur plusieurs jours voire plusieurs semaines avec le même animal pour maximiser la taille de l’échantillon de neurones collecté sur chaque animal, et ainsi atteindre des échantillons de plusieurs milliers de neurones, permettant une précision statistique jamais atteinte. Il est donc important de développer ces techniques pour améliorer la réduction des nombres d’animaux utilisés en neuroscience. 20 animaux sont nécessaires par ans pour obtenir les dix animaux nécessaires pour le cours (4 à 5 animaux utilisés par jours et repos de 2 jour) en comptant 50% d’animaux non utilisables du fait d’aléas expérimentaux, soit 100 animaux par an.

Raffinement

La procédure expérimentale de ce projet implique une antalgie et des temps de repos appropriés pour minimiser la souffrance, un suivi quotidien des animaux, et la définition de points limites précis basés sur des indicateurs de poids, (toute perte de poids >20% est un point limite), d’aspect général et de comportement, entrainant l’arrêt de l’expérience ou la mise à mort s’il n’est pas possible de pallier immédiatement la souffrance de l’animal.

Choix des espèces

Nous avons choisi la souris comme modèle animal en raison de l’ensemble des outils génétiques (souris transgéniques, injections virales AAV) qui sont bien établies chez cet animal, et qui permettent d’une part de manipuler différents éléments du système nerveux de manière ciblée, d’autre part de garantir une expression large et stable de certaines protéines, comme des senseurs calciques fluorescents ou des opsines (par ex. channelrhodopsin). Dans ce projet nous utiliserons les lignées GAD2-Cre, AI14D-TDT et leur croisement qui permet le marquage spécifique des interneurones dans le cortex. Pour toutes les expériences, nous utiliserons des souris adultes (de 3 à 6 mois) afin d’étudier la perception sensorielle dans un système nerveux mature.

90 souris et rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, une partie réutilisée pour d'autres formations, le reste tué. Ils servent de support à une formation réglementaire pour concepteurs de projets, avec préhension, contention, injections intrapéritonéales et prélèvements sanguins, puis un travail pratique de mise à mort et d'autopsie sous anesthésie. Le porteur affirme que la formation pratique est "indispensable" à l'acquisition de bases solides et qu'une partie des travaux pratiques "doit" passer par des animaux non-humains, malgré le recours annoncé à des démonstrations filmées et des outils de substitution. Il privilégie des individus de réforme et enchaîne les enseignements pour réutiliser les mêmes animaux d'un exercice à l'autre.

Objectifs

L'utilisation d'animaux à des fins scientifiques en France est réglementée par le décret 2013-118 et cinq arrêtés datés du 1er février 2013, publiés le 7 février 2013, en application de la directive 2010/63/UE. Ainsi, des règles strictes, basées sur le principe des 3Rs, encadrent le fonctionnement de la recherche dans le domaine. De ce fait, les personnes utilisant des animaux se doivent d'être formées et qualifiées pour travailler dans ce domaine. Différents niveaux règlementaires permettent donc de définir les taches que les personnels seront à-même de réaliser ainsi que les niveaux de responsabilité par rapport au projet donné. De ce fait, afin d'assurer une formation complète à la direction d'études utilisant des animaux, l'université de Caen a mis en place un diplôme universitaire pour la formation reglemenatire obligatoire et spécifique à la conception de projets utilisant des animaux à des fins scientifiques, approbée par le CNEA. La formation est réservée aux personnes disposant d'une formation initiale bac +5 minimum (études scientifiques, médicales, pharmaceutiques, vétérinaires) ou bac +2 avec 5 ans d'expérience. Une capacité maximale de 15-20 stagiaires est prévue. La formation se déroulera sur deux semaines en 71 heures : 58 heures de cours théoriques et 13 heures d'aspects pratiques en une séance par an. Cette formation a pour but de former les étudiants à la conception de projets scientifiques nécessitant d'animaux à des fins de recherche tant sur le plan théorique (réglementation, méthodes alternatives, anatomie comparée, recours aux procédures expérimentales faiblement invasives) comme théorique et pratique (anesthésie, douleur et analgésie, stress et enrichissement du milieu, ...) Cette formation privilégie autant que possible le recours aux méthodes alternative par l'utilisation de démonstrations filmées, organisations en groupes de travail et/ou réutilisation quand il est possible. L'enchainement des enseignements a été réfléchi afin de pouvoir effectuer des formations sucessives sur les mêmes animaux. L'utilisation d'outils pédagogiques de substitution est prévue de façon qu'un minimum d'animaux est utilisé par séance et se limite à 9 rats et 9 souris par an pour tous les stagiaires. Les stagiaires auront une base solide théorique et pratique pour la conception de projets utilisants des rongeurs à des fins scientifiques.

Bénéfices attendus

Les stagiaires qui auront réussi l'examen écrit auront un diplome universitaire de l'université de Caen "Formation à Expérimentation animale appliquée à la Recherche Biomédicale : conception des projets utilisant des rongeurs à des fins scientifiques" Formation spéciale destinée aux personnes assurant la responsabilité scientifique directe d’expérimentations conformément à la directive 2010/63/UE relative à l’expérimentation animale.

Procédures

5 rats et 5 souris suivront des procédures non invasives pendant 4 heures maximum (gestes zootechniques pour la préhension et contention; administration de produits; prélèvements sanguins). Ces gestes sans anesthésie étant réalisés par des personnes non habituées, nous ne considérons pas la possibilité de réutiliser ces animaux pour le reste de la formation, privilégiant une récupération du stress subi. 4 autres rats et 4 autres souris suivront également le TP de physiologie pendant 2h : techniques de surveillance de la physiologie normale sous anesthésie générale. Ces 4 rats suivront le TP d'anesthésie et analgésie avec les méthodologies exérimentales pendant 3h maximum. Ils suivront sans réveil le TP de mise à mort et autopsie. Les 4 souris suivront également le TP de mise à mort et autopsie. Un rat et une souris sont prévus en plus pour anticiper au cas ou un problème subviendrai rapidement après anesthésie par exemple pour ne pas handicaper un groupe de stagiaires si ce cas apparaissait. Si non utilisés, ces animaux pourront être réutilisés dans des formations du laboratoire en comportement.

Impact sur les animaux

Nuisances du TP 1 : Les animaux seront manipulés et contenus par du personnel non formé : du stress est à prévoir. Il y aura également des douleurs légères et de courte durée (injections de liquide physiologique) dues aux injections intrapéritonéales et aux prélèvements sanguins. Nuisances du TP 2 : Les animaux seront anesthésiés et ne souffriront pas de gestes invasifs, nous ne nous attendons pas à des nuisances. Nuisances du TP 3 : les animaux seront seront anesthésiés et auront une couverture analgésique nous ne nous attendons pas à des nuisances.

Devenir

La première procédure est légère mais réalisée par du personnel non habitué. Nous préférons laisser ces animaux récupérer et les inclure dans des apprentissages de tests comportementaux au lieu de les réutiliser cinq jours après pour une autre procédure (5 rats et 5 souris par année). La deuxième procédure inclut des démonstrations pour l'observation de la physiologie cardiaque et respiratoire sous anesthésie générale. Les animaux sont prévus d'être reutilisés le lendemain pour une démonstration procédure (4 rats et 4 souris par année). La troixième démobstration consiste au TP sur l'anesthésie et analgésie avec l'utilisation de méthodologies expérimentales fréquentes en recherche préclinique chez le rongeur (4 rats par année). A la suite de cette procédure et sans réveil entre deux, le TP de mise à mort et autopsie utilisera les 4 rats et les 4 souris de la procédure 2 qui seront anesthésiés profondément comme décrit dans la procédure avant mise à mort.

Remplacement

La formation pratique est indispensable à l'acquisition de bases solides pour les concepteurs de projets utilisant des rongeurs à des fins scientifiques. Bien que le maximum d'approches seront réalisées sur des systèmes de substitution et l'utilisation d'outils pédagogiques qui ne nécessitent pas l'utilisation d'animaux, une partie des travaux pratiques doit être pratiquée sur des animaux. De ce fait les procédures seront réalisées sous anesthésie et analgésie par du personnel formé et expérimenté et sous la supervision dans chaque atelier d'enseignants experts dans les domaines abordés. Une partie des démonstrations est réalisés sur des techniques non invasives (comportement, techniques de préhension) et ne nécessitent donc pas de méthodes d'anesthésie.

Réduction

Les stagiares sont regroupés en groupes de travail afin de réduire le nombre d'animaux nécessaire. Les thématiques de formation sont enchainées permettant la réutilisation des animaux d'un TP à l'autre. Néanmoins, un minimum de 9 rats et 9 souris par an est prévu pour la totalité des enseignements pour 20 stagiaires.

Raffinement

Les animaux sont anesthésiés par anesthésie gazeuse à l’isoflurane. L’induction est effectuée à 5% isoflurane dans un mélange gazeux 30%O2 / 70%N2O pendant 3minutes. Ils sont ensuite maintenus sous anesthésie par inhalation d’isoflurane (2% dans 30%O2 / 70%N2O) en respiration spontanée ou en ventilation mécanique (TP correspondant). Une vaporisation de Lidocaïne sera faite au larynx pour soulager tout incorfort. Une couverture analgésique est assurée par injection sous cutanée de buprénorphine (0.1mg/kg, 200μL) avant la manipulation et pose de cathéter (TP correspondant). La thermorégulation (37.5 ± 0.5°C) est assurée par une couverture chauffante (groupes anesthésiés) rétrocontrôlées par une sonde de température rectale.

Choix des espèces

La formation est destinée specifiquement aux concepteurs de projets nécessitant l'utisation de rongeurs. Cette formation est donc basée sur l'utilisation de rats et des souris. Nous privilégions de préférence l'utilisation d'animaux de réforme. Les animaux seront des adultes, aucune incidence d'age ou de sexe. Nous privilégions si possible l'utilisation d'animaux de réforme.

100 souris vont être utilisées sur cinq ans, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, non pour la recherche mais pour former des étudiants. Chaque étudiant explore l'équilibre et l'audition d'une souris d'un modèle du syndrome de Usher, avec des tests comportementaux puis des tests auditifs sous anesthésie profonde. Le porteur indique qu'aucun effet indésirable n'est attendu et que les souris retournent ensuite dans les cages de reproducteurs de la colonie. Il affirme que l'oreille interne ne peut s'étudier in vitro et que le modèle animal reste le "seul outil disponible".

Objectifs

L’objectif de ce projet est de former les étudiants sélectionnés dans le cadre de notre cours sur l’Audition à la réalisation de tests d’équilibres et de tests auditifs sur des souris adultes.

Bénéfices attendus

Ce projet vise à former nos étudiants aux bonnes pratiques de laboratoire dans le domaine de l’exploration des fonctions audio-vestibulaires.

Procédures

Les souris seront utilisées pour des tests comportementaux non invasifs (50 minutes) et pour des tests audiologiques réalisés sous anesthésie profonde (40 minutes). Chaque étudiant étudiera l’équilibre et les capacités auditives d’une souris. Un maximum de 20 étudiants sera sélectionné chaque année. Vingt souris seront de fait utilisées chaque année, soit 100 souris sur 5 ans. D’un point de vue pratique, les étudiants seront divisés en 2 groupes. Pour le groupe 1 (10 souris), les tests auditifs auront lieu le 1er jour et les tests d’équilibre le 2ème jour. Pour le groupe 2 (10 souris), les tests d’équilibre auront lieu le 1er jour et les tests auditifs le 2ème jour.

Impact sur les animaux

Les souris seront utilisées pour des tests comportementaux non invasifs (50 minutes) et pour des tests audiologiques réalisés sous anesthésie profonde (40 minutes). Aucun effet indésirable n’est attendu.

Devenir

A la fin de la procédure, toutes les souris retourneront dans les cages de reproducteurs utilisés pour l’entretien de la colonie.

Remplacement

Nous ne disposons pas à ce jour de système in vitro capable d’intégrer les mécanismes complexes impliqués dans le fonctionnement de l‘oreille interne que sont : 1) la perception du stimulus mécanique par les cellules ciliées sensorielles ; 2) la transduction de ce stimulus en un signal électrique ; 3) la transmission de ce signal électrique aux neurones spiraux ; 4) le transfert via ces neurones et leurs relais de l’information jusqu’au cerveau. Le modèle animal demeure donc le seul outil disponible pour étudier les cascades physiopathologiques impliquées dans la surdité et les troubles de l’équilibre.

Réduction

Chaque étudiant du cours se verra confier une souris sur laquelle il réalisera ses tests comportementaux et auditifs. A la fin des tests, toutes les souris retourneront dans les cages de reproducteurs utilisés pour l’entretien de la colonie. Les données générées pendant ce cours viendront compléter d’autres produites dans le cadre d’un projet de notre laboratoire, ce qui permettra de diminuer le nombre d’animaux utilisés dans ce projet.

Raffinement

Un igloo et des copeaux de carton seront ajoutés dans les cages d’hébergement. Nous renforcerons l’enrichissement des cages hébergeant des souris présentant un trouble de l’équilibre, par l’ajout de deux tubes creux en carton et de bâtonnets en bois. Une roue sera disposée dans les cages de souris mâles pour limiter les risques de bagarres. L’emploi d’analgésiques sera systématique tout comme l’application d’un gel ophtalmique lors des anesthésies. Les animaux anesthésiés seront placés sur un tapis chauffant jusqu’à leur réveil complet. L’état général des animaux sera surveillé de façon régulière.

Choix des espèces

Les cellules et les molécules impliquées dans le fonctionnement de l’oreille interne sont comparables chez l’homme et la souris. Les pathologies qui nous intéressent ont déjà des modèles murins bien établis. Mâles et femelles seront utilisés, les déficiences auditives et vestibulaires étant similaires dans les deux sexes.

150 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles sont maintenues dans l'obscurité totale pendant sept jours, exposées à la lumière une à quatre heures, puis euthanasiées par perfusion intracardiaque pour analyser l'activité des interneurones du cortex visuel. Le porteur indique que ce projet sert d'abord à former des étudiants aux techniques, en plus de l'objectif de connaissance. Il affirme que les alternatives non animales ne sont pas encore disponibles et retient la souris pour la modification génétique aisée.

Objectifs

L'exposition soudaine à la lumière, après une période d’obscurité, induit une modification très importante de l’activité de tous les types des neurones du cortex visuel. Cependant, parmi toute la population neuronale de cette région, les interneurones sont les cellules les plus affectées. L’objectif de ce projet est de mieux comprendre les processus cellulaires et moléculaires qui se déroulent lors de l’activation de ce groupe cellulaire. Dans ce but, les souris seront hébergées dans le noir 24 heures/24 pendant 7 jours et seront ensuite exposées à la lumière entre 1 et 4 heures. Après cette exposition, elles seront mises à mort et leur cerveau sera prélevé pour faire des analyses moléculaires post-mortem.

Bénéfices attendus

Ce projet a pour but de former les étudiants afin qu’ils soient en mesure de réaliser au mieux les procédures qu’ils auront apprises et transmettre ainsi ces techniques dans leur laboratoire d’origine. Une meilleure connaissance de ces techniques leur permettra aussi de réduire le nombre d’animaux utilisés lorsqu’ils voudront réaliser ces techniques pour leurs besoins de recherche. Ce projet permettra de mieux comprendre les processus cellulaires et moléculaires qui se déroulent lors de l’activation des interneurones du cortex visuel.

Procédures

Les animaux seront hébergés dans le noir 24 heures/24 pendant 7 jours. A la fin de cette période, les souris seront exposées entre 1 et 4 heures à la lumière avant d’être euthanasiées par perfusion intracardiaque.

Impact sur les animaux

Nuisances liées à l'hébergement dans le noir: stress

Devenir

A l’issue de toutes les expériences, les animaux seront mis à mort et leur cerveau sera prélevé pour effectuer des analyses moléculaires post-mortem

Remplacement

Pour comprendre l'activité des circuits neuronaux dans le cerveau, il est nécessaire de générer des données biologiques pertinentes. L'utilisation d'animaux est donc inévitable. Les souris sont les modèles animaux de prédilection pour les recherches dans ce domaine en raison de la structure anatomique et de la fonction bien définies de différents cortex cérébraux. La souris est aussi l’espèce de rongeurs qui permet d’obtenir aisément des animaux modifiés génétiquement. Il est important de noter que des alternatives non animales ne sont pas encore disponibles .

Réduction

L’expertise de nos instructeurs sur ces modèles garantit que le nombre d'animaux utilisés est minimisé par une pratique toujours de haute qualité dès le départ. De même il est extrêmement important pour nos objectifs éducatifs de pouvoir démontrer et mettre en pratique les procédures, le nombre d'animaux sera donc adapté en conséquence. Ce projet a aussi pour but de former les étudiants afin qu’ils soient en mesure de réaliser au mieux les procédures qu’ils auront apprises et transmettre ainsi ces techniques dans leur laboratoire d’origine. Une meilleure connaissance des nouveles techniques leur permettra de réduire le nombre d’animaux utilisés lorsqu’ils voudront réaliser ces techniques pour leurs besoins de recherche.

Raffinement

Les souris seront placées en cage de 4-5 souris sur un rack ventilé, placé dans une salle d'hébergement. Un enrichissement de leur milieu (carrés de cellulose, maisons en papier mâché que les animaux peuvent utiliser pour se cacher et/ou ronger) permettra de favoriser les comportements d'exploration et d'empêcher le stress. Les animaux seront observés quotidiennement par le personnel zootechnique formé et compétent. Leur bien-être sera contrôlé par la cellule de bien-être del’animalerie.

Choix des espèces

La souris est une espèce de choix pour les études sur le système nerveux central des vertèbres. L'organisation du système central de cette espèce est assez proche de celle de l'homme, ce qui permet une extrapolation des résultats obtenus chez cette espèce à l'espèce humaine pour mieux comprendre les mécanismes synaptiques à une échelle cellulaire et aussi au niveau des circuits neuronaux. Nous utilisons le modelé souris qui est l'espèce de rongeur permettant d'obtenir aisément des animaux modifies génétiquement. Le projet sera réalisé sur des animaux agés de plus de 6 semaines, ce qui correspond à l’âge adulte pour ces espèces. Leur poids et leur taille sont stabilisés, et la taille du cerveau homogène. Les expériences doivent être réalisées sur animauix adultes lorsque les réseaux neuronaux sont mis en place et le système nerveux est mature.