Enseignement supérieur et formation professionnelle

150 souris gestantes vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent une chirurgie de 30 minutes pour injecter de l'ADN dans le cerveau de leurs embryons par électroporation in utero, avant d'être tuées au CO2 et leurs embryons décapités pour analyse. Le porteur présente le projet comme une formation de chercheurs aux techniques d'étude de l'expression génétique embryonnaire. Il affirme qu'aucun modèle in vitro ne permet d'étudier ce développement, qui ne peut selon lui se faire que chez l'animal vivant.

Objectifs

Le système nerveux central est composé de différents types de neurones dont la morphologie et la physiologie varient considérablement. Cette diversité commence au cours du développement embryonnaire et elle est déjà observée dans les cellules immatures qui donneront naissance à des neurones. Il est proposé que la hétérogénéité neuronale dépende, en plus que d'autres facteurs, de l'expression spécifique d'un ensemble de protéines de ces cellules. Pour mieux comprendre les mécanismes moléculaires qui régissent la différenciation et la maturation des cellules pendant le développement, nous procèderons à transférer des gènes dans le cerveau embryonnaire grâce à la transfection par électroporation in utero menée chez la souris gestante. Nous proposons de former de nouveaux chercheurs sur les méthodes qui permettent d’étudier l’expression génétique pendant le développement embryonnaire. Une meilleure connaissance de nouvelles techniques leur permettra de réduire le nombre d’animaux utilisés lorsqu’ils voudront réaliser ce genre d'expérimentations techniques pour leurs besoins de recherche.

Bénéfices attendus

Ce projet a pour but de former les étudiants afin qu’ils soient en mesure de réaliser au mieux les procédures qu’ils auront apprises et transmettre ainsi ces techniques dans leur laboratoire d’origine. Une meilleure connaissance de nouvelles techniques leur permettra de réduire le nombre d’animaux utilisés lorsqu’ils voudront réaliser ce genre d'expérimentations techniques pour leurs besoins de recherche.

Procédures

Les souris arriveront à notre animalerie au cours de leur 8ème ou 9ème jour de gestion (E8/E9). Entre 4 et 5 jours plus tard, les souris suivront une intervention chirurgicale d’une durée de 30 minutes. Pendant cette procédure, une solution contenant de l’ADN sera injectée dans le cerveau des embryons. Deux jours après, les souris gestantes sont mises à mort par inhalation de CO2. Les cerveaux de tous les embryons seront prélevés pour effectuer des analyses post mortem.

Impact sur les animaux

Nuisances liées aux procédures chirurgicales : douleur abdominale post opératoire, risque mineur d’infection de la cicatrice. Dans de très rares cas, les souris enceintes pourraient avoir des problèmes de mobilité après la chirurgie.

Devenir

A l’issue de toutes les expériences, les souris gestantes seront mises à mort par inhalation de CO2. Tous les embryons seront mis à mort par decapitation et leur cerveau sera prélevé pour effectuer des analyses post mortem.

Remplacement

N'existant pas de modèle in vitro permettant d’étudier le développement embryonnaire de différents types de neurones, cette étude ne peut être réalisée que chez l'animal in vivo.

Réduction

L’expertise de nos instructeurs sur ces modèles garantit que le nombre d'animaux utilisés est minimisé par une pratique toujours de haute qualité dès le départ. De même il est extrêmement important pour nos objectifs éducatifs de pouvoir démontrer et mettre en pratique les actes de préparation chirurgicaux, le nombre d'animaux sera donc adapté en conséquence. Ce projet a aussi pour but de former les étudiants afin qu’ils soient en mesure de réaliser au mieux les procédures qu’ils auront apprises et transmettre ainsi ces techniques dans leur laboratoire d’origine. Une meilleure connaissance des nouvelles techniques de chirurgie et d'imagerie leur permettra de réduire le nombre d’animaux utilisés lorsqu’ils voudront réaliser ces techniques pour leurs besoins de recherche. Le nombre d'animaux est adapté́ a nos objectifs éducatifs. Nous devons démontrer et mettre en pratique les procédures pendant nos formations. Lors de la formation, les instructeurs réalisent une démonstration de la procédure puis les étudiants auront l’occasion de pratiquer la procédure sous-couvert des instructeurs.

Raffinement

Pour diminuer le stress lié au transport, les souris sont stabulées, habituées, et manipulées quotidiennement dans une animalerie aux paramètres environnementaux contrôlés où leur entretien sera pris en charge par le personnel zootechnique formé et compétent. Les souris seront placées en cage de 4-5 souris sur un rack ventilé, placé dans une salle d'hébergement. Un enrichissement de leur milieu (carrés de cellulose, maisons en papier mâché que les animaux peuvent utiliser pour se cacher et/ou ronger) permettra de favoriser les comportements d'exploration et d'empêcher le stress. Nos mesures mises en place pour réduire la douleur pendant les procédures expérimentales impliquent une induction et suivi de l'anesthésie, une mise en place d'analgésie, une installation tout au long des procédures chirurgicales de contrôle de la température par tapis chauffant. Les animaux opérés seront observés quotidiennement par le personnel responsable de notre animalerie pendant la période qui suit le réveil (2h) ainsi que pendant les 2 jours suivants. L'évaluation des points limites se fera selon une grille d'évaluation (Annexe 1). Si l’animal atteint un score >11 au cours de l’observation sur une journée ou si la perte de poids est > 20% l'animal sera mis à mort. Après la procédure chirurgicale nous rajouterons de la nourriture humidifiée au fond de la cage

Choix des espèces

La souris est une espèce de choix pour les études sur le système nerveux central des vertèbres. L'organisation du système central de cette espèce est assez proche de celle de l'homme, ce qui permet une extrapolation des résultats obtenus chez cette espèce à l'espèce humaine Nous devons cibler les cellules progénitrices en une période embryonnaire précise, nous utiliserons des gestantes à 13 jours de gestation. Il s’agit d’un stade où les embryons sont facilement accessibles pour l'électroporation (à des temps plus tardifs les embryons sont plus gros et difficiles à manipuler au sein de la corne utérine).

30 souris et 30 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, puis proposés à l'adoption. Ils servent à entraîner le personnel d'animalerie aux injections, aux prélèvements sanguins et à la pose de cathéter, chaque animal étant réutilisé jusqu'à six fois sur trois mois. Le porteur indique que ces manipulations répétées peuvent provoquer un stress, et que les gestes sont réalisés sous anesthésie à l'isoflurane. L'objet déclaré du projet n'est pas de produire des connaissances mais de maintenir les compétences techniques des soigneurs.

Objectifs

Au cours des différentes procédures, le personnel qualifié de l’animalerie pourra maitriser et s’entrainer régulièrement aux injections, prélèvements de sang et pose de cathéter sur animaux vigiles et/ou anesthésiés couramment pratiquées au sein de l’établissement utilisateur. Cela inclu la préparation de l’animal, l’analgésie, l’anesthésie, l’asepsie, la maîtrise et le contrôle des paramètres physiologique pendant toute la durée de l’intervention et le réveil de l’animal.

Bénéfices attendus

Grâce a cet entrainement, le personnel qualifié de l’animalerie aura les compétences adéquates pour réaliser des administrations et prélèvements de sang principalement demandés par les utilisateurs de l’établissement utilisateur. Le temps d’anesthésie générale sera raccourci avec l’entrainement ce qui limitera le stress chez l’animal.

Procédures

Liste des interventions effectuées sur tous les animaux (rats et souris) à une fréquence de 1 fois toute les 2 semaines sur 3 mois maximum : - Anesthésie par injection intrapéritonéale (IP) d’un cocktail anesthésique et analgésique de Ketamine et de Xylazine (64.5/5.4 mg/kg ; 0.15-0.2 ml/100 g de poids vif). - Injection en intra-musculaire et en sous-cutanée de sérum physiologique - Prélèvements de sang dans la veine mandibulaire, la veine sublinguale et la veine caudale (pose de cathéter).

Impact sur les animaux

Les animaux d’entrainement seront utilisés à plusieurs reprises (maximum 6 fois sur une durée de 3 mois) afin de limiter le nombre d’animaux, donc un stress chez l’animal peut être observé.

Devenir

Proposé à l’adoption

Remplacement

Le personnel concerné s’entraine dans un premier temps sur des animaux euthanasiés. Lorsque la technique est acquise sur animal euthanasié, il est nécessaire de travailler sur des animaux anesthésiés afin d’appréhender les éventuelles complications que l’animal vivant peut présenter au cours d’une anesthésie et d’une chirurgie (ex : arrêt respiratoire, hémorragie).

Réduction

Le nombre d’animaux prévu pour toute la durée du projet est le nombre minimum nécessaire permettant l’entrainement de 3 personnes : nous prévoyons au maximum 30 rats et 30 souris sur les 5 ans du projet : 60 animaux au maximum sur la totalité du projet.

Raffinement

Les injections via les différentes voies décrites dans ce projet (IP, SC etIM) seront réalisées sous anesthésie générale par inhalation d’isoflurane à 4%, administrée dans une boite en plexiglas prévue à cet effet. Après l’induction de l’anésthésie, le personnel s’entrainera aux injections dans les minutes qui suivent afin de limiter le stress de l’anesthésie (si l’animal se réveil, il sera replacé dans la boite en plexiglas). Les prélèvements de sang et pose de cathéter seront réalisés sous anesthésie générale par inhalation d’isoflurane à 4%, administrée dans une boite en plexiglas prévue à cet effet. Pour la pose de cathéter en veine caudale, l’anesthésie sera maintenue sous masque à isoflurane à 2-3%. Pour le prélèvement de sang via la veine mandibulaire et la veine sublinguale, l’anesthésie sera maintenue par injection intrapéritonéal (IP) d’un cocktail anesthésique et analgésique de Ketamine et de Xylazine. Les différentes voies d’injections et les différentes voies de prélèvement ne seront pas toutes effectuées sur le même animal. Entrainement à une seule voie de prélèvement de sang par animal. L’animal sera réutilisé que 2 semaines après avoir été manipulé et au maximum 6 fois sur une durée de 3 mois si son état général le permet afin de laisser le temps à l’animal de récupérer et d’éviter un stress trop récurrent. Tout au long de l’expérimentation, les rats/souris seront observés et les paramètres physiologiques contrôlés (température, respiration). Des points limites sont définis dans la partie procédure expérimentale afin de préserver le bien-être des animaux Une phase d’acclimatation de 5 jours minimum est appliquée après réception et les rats/souris sont hébergés en groupes sociaux harmonieux, dans un environnement enrichi afin de limiter les angoisses qui pourraient être induites par l’environnement : tunnels en carton, sizzle pads et bûchettes de peuplier. La taille des aiguilles et des cathéters est adaptée à la taille de l’animal afin d’éviter toute douleur inutile.

Choix des espèces

Le rat a été choisi car cette espèce est la plus couramment utilisée dans les différentes procédures pratiquées au sein de l’établissement utilisateur. Adulte : 8-12 semaines, 160-300 g, ce qui permettra de travailler sur des poumons entièrement développé et fonctionnel pour la procédure 1 et sur un système cérébral stable, mature pour la procédure 2.

400 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour prélèvement du cerveau, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent une chirurgie du crâne d'environ une heure pour poser une fenêtre ou un implant d'imagerie, puis des séances d'imagerie cérébrale sous contention, non pour produire des connaissances mais pour former des chercheurs à ces techniques. Le porteur signale des douleurs postopératoires et le stress lié au maintien sous le microscope. Il avance que cette formation réduira le nombre d'animaux utilisés plus tard par les stagiaires dans leurs laboratoires.

Objectifs

Nous proposons de former de nouveaux chercheurs sur les méthodes modernes de mesure d’activités neuronales impliquées dans la codification des informations sensorielles. L’imagerie biphotonique ainsi que l’imagerie calcique sont deux techniques qui permettent d’observer et mesurer l’activité de neurones en temps réel. Grâce à ces techniques nous pouvons étudier le rôle que jouent différentes populations de neurones dans l’apprentissage et l'exécution d’une tâche comportementale. Ce projet a pour but de former les étudiants afin qu’ils soient en mesure de réaliser au mieux les procédures qu’ils auront apprises et transmettre ainsi ces techniques dans leur laboratoire d’origine. Une meilleure connaissance des nouvelles techniques de chirurgie et d'imagerie leur permettra de réduire le nombre d’animaux utilisés lorsqu’ils voudront réaliser ces techniques pour leurs besoins de recherche

Bénéfices attendus

Ce projet a pour but de former les étudiants afin qu’ils soient en mesure de réaliser au mieux les procédures qu’ils auront apprises et transmettre ainsi ces techniques dans leur laboratoire d’origine. Une meilleure connaissance des nouvelles techniques de chirurgie et d'imagerie leur permettra de réduire le nombre d’animaux utilisés lorsqu’ils voudront réaliser ces techniques pour leurs besoins de recherche.

Procédures

- Le groupe A suivra: une chirurgie stéréotaxique (1 heure) pour implanter une fenêtre crânienne qui permet de mettre en place un couvercle transparent au-dessus d’une région corticale d’intérêt. Grâce à cette fenêtre certains types de neurones du cerveau sont visibles en microcopie. Deux semaines plus tard, les animaux seront habitués à rester sur le microscope bi photonique ensuite l’activité neuronale sera imagée chez les animaux éveillés. Les séances d’imagerie auront une durée de 30 minutes et elles seront faites 1 fois par jour pendant 5 jours. A la fin de la dernière séance, les animaux seront euthanasiés et leur cerveau sera prélevé pour effectuer des analyses post mortem. - Le groupe B suivra: Une chirurgie stéréotaxique (1 heure) qui permet de rapporter dans certains types de neurones une molécule fluorescente visible en microcopie et d’installer un implant. Deux semaines plus tard, les souris seront connectées au niveau de la fibre optique vers un système d’enregistrement de l’activité neuronale et leur comportement spontané sera évalué. Chaque séance aura une durée de 20 minutes et chaque souris suivra 3 séances. Pendant une des séances, les souris recevront une injection intrapéritonéal (1minute) contenant, soit une molécule qui permet d’activer les neurones dopaminergiques soit de la saline. A la fin de la dernière séance - Le groupe C suivra : Une chirurgie stéréotaxique (1 heure) qui permet d’implanter un système d’imagerie. Deux semaines plus tard, les séances d’imagerie seront réalisées pendant la procédure comportementale. Chaque séance aura une durée de 20 minutes et chaque souris suivra 3 séances ( une séance par jour). A la fin de la dernière séance , les animaux seront euthanasiés et leur cerveau sera prélevé pour effectuer des analyses post mortem.

Impact sur les animaux

- Nuisances liées aux procédures chirurgicales : douleur post opératoires, risque mineur d’infection de la cicatrice, risque mineur de détérioration des implants crâniens - Nuisances liées à la connexion des animaux aux niveau du système de fixation, fibre optique ou appareillage d’imagerie calcique : stress de la contrainte du maintien sous l’objectif du microscope auquel l’animal doit s’habituer - Douleur légère liée aux différents injections intrapéritonéales

Devenir

A l’issue de toutes les expériences, les animaux seront euthanasiés et leur cerveau sera prélevé pour effectuer des analyses immuno-histologiques.

Remplacement

Pour comprendre l'activité des circuits neuronaux dans le cerveau, il est nécessaire de générer des données biologiques pertinentes. L'utilisation d'animaux est donc inévitable. Les souris sont les modèles animaux de prédilection pour les recherches dans ce domaine en raison de la structure anatomique et de la fonction bien définies de différents cortex corticaux. La souris est aussi l’espèce de rongeurs qui permet d’obtenir aisément des animaux modifiés génétiquement.

Réduction

L’expertise de nos instructeurs sur ces modèles garantit que le nombre d'animaux utilisés est minimisé par une pratique toujours de haute qualité dès le départ. De même il est extrêmement important pour nos objectifs éducatifs de pouvoir démontrer et mettre en pratique les actes de préparation chirurgicaux, le nombre d'animaux sera donc adapté en conséquence. Ce projet a aussi pour but de former les étudiants afin qu’ils soient en mesure de réaliser au mieux les procédures qu’ils auront apprises et transmettre ainsi ces techniques dans leur laboratoire d’origine. Une meilleure connaissance des nouvelles techniques de chirurgie et d'imagerie leur permettra de réduire le nombre d’animaux utilisés lorsqu’ils voudront réaliser ces techniques pour leurs besoins de recherche. Par an, 20 étudiants et 10 instructeurs suivront les projets décrits dans cette DAP. Dans ce context, lors de la formation, les instructeurs réalisent une démonstration de la procédure puis les étudiants auront l’occasion de pratiquer la procédure sous-couvert des instructeurs. Nous utiliserons un animal (C57BL6) par étudiant et par instructeur soit 30 souris/an. Avant le début de la formation, toutes les souris transgéniques suivront les chirurgies stéréotaxiques. Les séances de comportement, d’imagerie et d’électrophysiologie seront réalisées pendant la formation. - Souris DAT-Cre: Le taux de réussite de la chirurgie ( expression correcte du virus et fibre optique fonctionnelle ) est de 60%. Pour pouvoir évaluer l'effet de l’agoniste dopaminergique nous avons besoin d'au minimum 3 souris par groupe. Nous avons besoin donc de 10 souris DAT-Cre par formation/an. - Souris C57BL/6J-Tg(Thy1-GCaMP6f)GP5.17Dkim: a. Imagerie 2-photon sur animal éveillé: Le taux de réussite de la chirurgie ( fenêtre crânienne de bonne qualité pour la microscopie) est de 25%. Une souris sur 5 ne s’habitue pas au système de fixation. Pour pouvoir analyser les images provenant d'au minimum 4 souris, nous devons utiliser 20 souris par formation/an. b. imagerie calcique avec des miniscopes : Le taux de réussite de la chirurgie est de 25-30%. Une souris sur 5 ne s’habitue nt pas à la connexion au niveau de la miniature au crâne. Pour pouvoir analyser les images provenant d'au minimum 4 souris, nous devons utiliser 20 souris par formation/an.

Raffinement

Nos mesures mises en place pour réduire la douleur pendant les procédures expérimentales impliquent une induction et suivi de l'anesthésie, une mise en place d'analgésie, une installation tout au long des procédures chirugicales de contrôle de la température par tapis chauffant. Les souris seront placées en cage de 4-5 souris sur un rack ventilé, placé dans une salle d'hébergement. Un enrichissement de leur milieu (carrés de cellulose, maisons en papier mâché que les animaux peuvent utiliser pour se cacher et/ou ronger) permettra de favoriser les comportements d'exploration et d'empêcher le stress. Les animaux opérés seront observés quotidiennement par l’expérimentateur pendant la période qui suit le réveil (2h) ainsi que pendant les 4 jours suivant. L'évaluation des points limites se fera selon une grille d'évaluation incluant le poids de l'animal, l'état de la plaie, l'état du pelage, la mobilité de l'animal et les signes de douleur. Si l'animal présente un score qui le justifie, une seconde injection d'un médicament anti-inflammatoire sera effectuée et reconduite toutes les 24h si les signes persistent lors des observations suivantes. Si l’animal n’a pas repris de poids au bout de 4 jours, ou si des signes de souffrance sont observés, le traitement sera étendu de 2 jours supplémentaires. Si la récupération ne s’effectue pas bien et si le score des critères de la grille d’évaluation dépasse un certain stade de gravité l’animal sera euthanasié par l'expérimentateur par dislocation cervicale. Dans des cas très rares, les implants (fibre optique, appareillage d'imagerie calcique, un système de fixation) peuvent se détacher du crâne. Dans cette situation, les animaux seront euthanasiés.

Choix des espèces

La souris est une espèce de choix pour les études sur le système nerveux central des vertèbres. L'organisation du système central de cette espèce est assez proche de celle de l'homme, ce qui permet une extrapolation des résultats obtenus chez cette espèce à l'espèce humaine pour mieux comprendre les mécanismes synaptiques à une échelle cellulaire et aussi au niveau des circuits neuronaux. Nous utilisons le modelé souris qui est l'espèce de rongeur permettant d'obtenir aisément des animaux modifies génétiquement. Le projet sera réalisé sur des animaux agés de plus de 6 semaines, ce qui correspond à l’âge adulte pour ces espèces. Leur poids et leur taille sont stabilisés, et la taille du cerveau homogène pour une bonne reproductibilité des procédures chirurgicaux.

3000 souris et rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, la plupart tués à l'issue, environ 200 réutilisés et 20 placés en adoption. Les animaux, souvent porteurs de tumeurs greffées et issus d'un projet précédent, servent à entraîner le personnel aux gestes techniques, jusqu'à quinze journées et deux gestes par jour, dont les administrations, les prélèvements, la chirurgie et l'euthanasie. Le porteur indique que la mise à mort peut être elle-même le geste appris. Il justifie l'usage d'animaux vivants par l'échec d'un rat synthétique jugé insuffisamment réaliste.

Objectifs

Ce projet, dédié à la formation et au maintien des compétences du personnel interne, répond aux exigences réglementaires (arrêté du 1er février 2013 relatif à l’acquisition et à la validation des compétences des personnels des établissements utilisateurs, éleveurs et fournisseurs d’animaux utilisés à des fins scientifiques) et éthiques. Il permet de répondre aux besoins d’acquisition de compétences sous tutorat ou de perfectionnement de gestes techniques nécessaires à l’activité de recherche spécifique. Les gestes qui pourront être travaillés sur souris ou rats sont les suivants : 1)Identification des animaux 2)Techniques d’administrations 3)Procédures non invasives réalisées sous anesthésie gazeuse (ex. imagerie) 4)Prélèvements sanguins 5)Techniques de chirurgie sous analgésie et anesthésie 6)Techniques d’euthanasie 7)Autopsies : apprentissage de l’anatomie avec reconnaissance et prélèvements d’organes en post-mortem. Les animaux utilisés dans le cadre de ce projet sont essentiellement issus d’un premier projet autorisé. Du fait du design des études en oncologie nécessitant de greffer des animaux qui ne sont ensuite pas tous inclus dans les études de pharmacologie, une grande proportion d’animaux formation sera porteur de tumeur greffée en sous cutanée dont le volume sera de petite taille et contrôlé (de type « petit nodule »). Cette réutilisation des animaux permet de valoriser les animaux non inclus dans les études et contribue à la règle des 3R par la réduction du nombre d’animaux. A défaut de disponibilités compatibles avec les besoins en formation, les animaux nécessaires seront commandés spécifiquement auprès des fournisseurs.

Bénéfices attendus

L’entrainement et la compétence du personnel, au-delà de l’aspect réglementaire, contribuent à la bonne réalisation des études, à la fiabilité des résultats, ainsi qu’au respect du bien-être animal par la réalisation de gestes maitrisés. A l’inverse, un geste technique mal réalisé au cours d’une étude peut avoir pour conséquence : - Un stress de l’animal - Une souffrance de l’animal allant jusqu’à la mort en cas de fausse route lors d’un gavage par exemple. - Une plus forte variabilité des résultats de l’étude ou des résultats ininterprétables amenant à devoir reproduire l’étude en utilisant plus d’animaux.

Procédures

Pour les gestes techniques, une limite de 15 journées d’utilisation (consécutives ou non) est fixée par animal à raison d’un nombre maximal de 2 gestes par jour. En fonction du type de technique à acquérir et de l’objectif de formation visés, différentes combinaisons de techniques d’administration et/ou de prélèvements peuvent être réalisées sur un même animal. Les gestes qui pourront être réalisés sont : - identification, administrations et prélèvements sur animaux vigiles (quelques secondes) ou anesthésiés (

Impact sur les animaux

Un maximum de 15 journées d’utilisation seront possibles avec un nombre maximal de 2 gestes techniques simples réalisés par jour. Un seul geste chirurgical sera possible. Aucun animal présentant des signes de douleur ou de souffrance suite à un geste technique ou une chirurgie ne sera gardé en vie.

Devenir

La plupart des animaux seront porteurs de tumeurs, ils devront donc être euthanasiés à la suite de la formation. La mise à mort peut être elle-même la technique pour laquelle la personne sera formée. Dans de rares cas, des animaux qui ne proviennent pas d’une utilisation précédente et en bonne santé pourront être ré-utilisés pour de la mise au point de modèle chirurgical dans le cadre d'un autre projet. L’utilisation de ces animaux se fera uniquement dans le cadre d'un projet autorisé et de gravité de sévérité prospective modéré. Enfin, des cas ponctuels d’adoptions pourraient être organisés sur des animaux immunocompétents, ne présentant pas de phénotype dommageable, en bonne santé, n’ayant jamais été porteurs de tumeurs et dans un contexte où il n’y a pas de besoin de formations à l’euthanasie. L’avis vétérinaire et l’autorisation des autorités compétentes seraient un préalable à ces adoptions.

Remplacement

Par le passé, des sessions d’entrainement sur la contention et l’administration de composés ont été effectuées sur des rats synthétiques (rat Koken) mais n’ont malheureusement pas été concluantes suite au manque de tonicité et de mouvement de l’animal et à la mauvaise reproduction de l’enveloppe corporelle et du système veineux. De plus, certains gestes techniques, comme les prélèvements sanguins à la veine saphène, par exemple, ne pouvaient pas être effectués sur ce moyen de substitution. Il n’y a donc pas d’autres choix, actuellement, que d’exercer ces entrainements sur des rongeurs anesthésiés ou vigiles avant de les mettre en pratique dans des expériences d’un projet de recherche.

Réduction

Les animaux utilisés dans le cadre de ce projet sont essentiellement issus d’un premier projet autorisé. Cette réutilisation des animaux permet de valoriser les animaux non inclus dans les études et contribue à la règle des 3R par la réduction in fine du nombre d’animaux. A défaut de disponibilités compatibles avec les besoins en formation les animaux nécessaires seront commandés spécifiquement auprès des fournisseurs. Un même animal pourra faire l’objet de plusieurs gestes techniques à raison d’un maximum de 2 gestes par jour. En effet, nous pourrons associer un geste dédié à l’administration avec un geste dédié aux prélèvements sanguins. Par exemple, on pourra cumuler des administrations Intra-veineuses avec des prélèvements de sang à la veine jugulaire sous anesthésie gazeuse. Ainsi, en combinant ces 2 types d’entrainement sur un maximum de 15 journées sur 6 mois (30 gestes maximum) on valorisera au maximum les animaux.

Raffinement

Une attention particulière sera portée sur les volumes des prélèvements sanguins et volumes d’administration, qui seront basés sur des guidelines reconnues. Si un animal présente un signe clinique altérant son bien-être ou nécessitant un soin il sera euthanasié. Pour les animaux porteurs de tumeur, le point limite lié au volume tumoral est inferieur aux normes habituelles afin de s’assurer que l’impact lié à la précédente utilisation de l’animal reste léger. Les animaux seront hébergés en groupes sociaux tout au long des entrainements, dans des cages enrichies leur permettant de fouiller. Des éléments de nidification sont apportés ainsi que des éléments d’enrichissement en polypropylène permettant une complexification de l’environnement. L’observation de l’utilisation de l’enrichissement sera un paramètre complémentaire permettant de s’assurer du bien-être des animaux.

Choix des espèces

Les projets de l’équipe in vivo se faisant avec des modèles souris ou rat, il convient de s’entrainer sur ces espèces en adéquation avec les activités. Des animaux sevrés seront utilisés majoritairement (jeunes adultes et adultes). Cependant, pour des besoins spécifiques de formation, des animaux non-sevrés pourront être également utilisés.

15 cochons vont être utilisés, gardés vivants à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal est anesthésié pour un prélèvement sanguin à la jugulaire et une biopsie musculaire à la cuisse, dans le cadre de travaux pratiques de formation à l'expérimentation animale. Le porteur indique que les cochons rejoignent ensuite un autre protocole de l'installation. Il déclare l'usage d'animaux vivants "indispensable" à la formation exigée par la directive européenne, les méthodes alternatives n'étant selon lui pas toutes adaptées à l'enseignement.

Objectifs

Afin de former les personnes aux techniques et expérimentations in vivo, le recours à l'animal vivant est indispensable. Les méthodes alternatives existantes ne sont pas toutes adaptées aux problématiques qui peuvent se poser dans l'enseignement. Les personnels impliqués directement dans l'expérimentation animal in vivo doivent, sinon être opérationnels, maitriser les techniques de base de l'expérimentation animale in vivo. Ce projet fait partie intégrante de la formation agrée que nous délivrons et qui est requise par la directive européenne 2010/63/UE.

Bénéfices attendus

Afin de former les personnes aux techniques et expérimentations in vivo, le recours à l'animal vivant est indispensable. Les méthodes alternatives existantes ne sont pas toutes adaptées aux problématiques qui peuvent se poser dans l'enseignement. Les personnels impliqués directement dans l'expérimentation animal in vivo doivent, sinon être opérationnels, maitriser les techniques de base de l'expérimentation animale in vivo. Ce projet fait partie intégrante de la formation agrée que nous délivrons et qui est requise par la directive européenne 2010/63/UE.

Procédures

Chaque animal sera anesthésié. Suite à cette anesthésie, un prélèvement sanguin en jugulaire et une biopsie musculaire à la cuisse seront réalisés.

Impact sur les animaux

Les animaux sont par ailleurs hébergés individuellement tout en ayant en permanence un contact visuel avec leurs congénères dans des cages respectant la directive. Les animaux sont surveillés quotidiennement par du personnel habilité et habitué à travailler sur ce modèle.

Devenir

Les animaux seont gardés en vie suite à ce TP et seront intégrés à un protocole se déroulant à l'installation.

Remplacement

Afin de former les personnes aux techniques et expérimentations in vivo, le recours à l'animal vivant est indispensable. Les méthodes alternatives existantes ne sont pas toutes adaptées aux problématiques qui peuvent se poser dans l'enseignement. Les personnels impliqués directement dans l'expérimentation animal in vivo doivent, sinon être opérationnels, maitriser les techniques de base de l'expérimentation animale in vivo. Ce projet fait partie intégrante de la formation agrée que nous délivrons et qui est requise par la directive européenne 2010/63/UE. L’étude est réalisée sur des animaux en fin de croissance (âge>10 mois).

Réduction

Le nombre d'animaux est réduit au minimun tout en restant dans des limites pédagogies efficaces pour la fomation et l'acquisition des compétences.

Raffinement

La douleur ou la souffrance sont limitées à de brèves manipulations. En effet, la totalité de la procédure se fait sous anesthésie générale et une injection sous cutanée de Lidocaine (Lurocaine 2 ml 20mg /ml) est réalisée au point de biopsie.

Choix des espèces

Afin de former les personnes aux techniques et expérimentations in vivo, le recours à l'animal vivant est indispensable. Les méthodes alternatives existantes ne sont pas toutes adaptées aux problématiques qui peuvent se poser dans l'enseignement. Les personnels impliqués directement dans l'expérimentation animal in vivo doivent, sinon être opérationnels, maitriser les techniques de base de l'expérimentation animale in vivo. Ce projet fait partie intégrante de la formation agrée que nous délivrons et qui est requise par la directive européenne 2010/63/UE. L’étude est réalisée sur des animaux en fin de croissance (âge>10 mois).

5 000 rongeurs, 4 500 souris et 500 rats, vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils servent à entraîner le personnel d'un prestataire de recherche préclinique à des gestes techniques, chaque animal recevant jusqu'à quinze administrations par injection ou gavage et cinq prélèvements sanguins avant d'être tué. Le porteur présente le projet comme un moyen de réduire à terme la souffrance des animaux en fiabilisant les gestes, et indique employer en priorité des animaux surnuméraires. Sur le remplacement, il affirme utiliser d'abord une formation théorique et des supports non vivants pour limiter le recours aux animaux vivants.

Objectifs

La bonne pratique d’expérimentation nécessite une bonne connaissance de la biologie des espèces utilisées et aussi les connaissances théorique et pratique des méthodes expérimentales sur le modèle animal. Ce projet de formation vise à réutiliser les animaux surnuméraires non-utilisés ou non -randomisés dans des études dans un souci de réduction. L’objectif de ce projet est de fournir les connaissances indispensables et d’enseigner les bonnes pratiques d’expérimentation animale. Cette formation s’adresse aux personnes réalisant les procédures expérimentales dans le cadre des expériences précliniques réalisées par notre société – prestataire de services en recherche préclinique. Le vétérinaire ou son délégué assure la formation théorique en anesthésie, analgésie, euthanasie et sur le suivi clinique et notamment sur la reconnaissance des signes de souffrance. Les responsables formation qui ont la délégation du responsable de l’établissement assurent la validation des compétences en anesthésie, analgésie et euthanasie. Chaque technicien de recherche suivra un programme de formation, dont une partie nécessite l’utilisation d’animaux vivants. Dans le cadre de ce programme, chaque technicien doit prendre connaissance et maitriser les techniques d’administration des produits, les techniques de prélèvement sur rongeurs (souris et rats) et les techniques d’imagerie. La formation de chaque technicien sera encadrée par le personnel formé (tuteur) avec les compétences reconnues. Pour chaque geste technique enseigné, une session de validation devra confirmer que le tutoré est apte à réaliser le geste technique en autonomie. La bonne maitrise des procédures expérimentales non-invasives et invasives appliquées sur les rongeurs permettra d’améliorer le bien-être des animaux et d’obtenir des résultats scientifiques fiables et reproductibles.

Bénéfices attendus

Le tutorat pour chaque compétence et la validation du tutorat sont indispensables pour la bonne réalisation de procédures expérimentales. Ils permettent de diminuer le temps de manipulation des animaux, de diminuer le stress/souffrance de l’animal, d’éviter les dérives techniques dans le temps, de prendre connaissance des évolutions techniques, d’améliorer la fiabilité des résultats, d’éviter de recommencer des études suite à un biais initié par une mauvaise manipulation technique, ... Ce projet permet à notre établissement utilisateur de se conformer à la réglementation et de valider les compétences de son personnel impliqué en expérimentation animale. De plus, la formation continue des techniciens nous permet de maintenir un niveau de qualité des gestes techniques et également la mise en place de nouvelle procédure/technique dans le but d’un raffinement.

Procédures

Les animaux seront soumis à des injections intrapéritonéales, intraveineuses, sous-cutanées, des gavages et des prélèvements sanguins. Le nombre d’actions est limité : • 2 gestes différents maximum par jour • 15 Administrations ou utilisations autres (tonte, imagerie, tatouages) • 5 Prélèvements Les animaux engagés dans le projet de formation seront euthanasiés après les limites d’utilisation ci-dessus et en l’absence de points limites atteints. Les gestes d’administrations ou de prélèvements pourront durer jusqu’à une dizaine de minutes, induction de l’anesthésie exclue, chez une personne non expérimentée en début de tutorat. L’objectif est de pouvoir réaliser ces gestes en moins de 30 secondes. Les procédures non-invasives et faiblement invasives comme le gavage, les injections intrapéritonéales et sous cutanées sont réalisées sur les animaux vigiles. Si la technique le permet, le tutoré commencera sa formation sur les animaux anesthésiés avant de passer sur animaux vigiles à l’appréciation de son tuteur. Certaines procédures (injections intra-veineuse, intra-musculaire, intra-rectale, prélèvements de sang), nécessitent l’anesthésie gazeuse (isoflurane) pour la contention des animaux.

Impact sur les animaux

La réalisation de procédures expérimentales non maitrisées peut induire une augmentation du stress, une angoisse ou une douleur.

Devenir

A l’issue de cette procédure les animaux seront euthanasiés.

Remplacement

Application du principe de Remplacement : Avant toute manipulation d’animaux, une formation théorique avec des modes opératoires et des vidéos permettra de limiter l’utilisation des animaux. Pour certaines, des supports non vivants pourront être utilisés afin de mimer un animal. L’utilisation de support non vivant dans les premières étapes d’apprentissage d’un geste technique permet d’étendre la période d’apprentissage tout en limitant le nombre d’animaux vivant utilisés et une éventuelle souffrance liée à l’application d’un geste encore mal maitrisé.

Réduction

Application du principe de Réduction : Pour former le personnel, nous utiliserons principalement et en priorité les animaux de réforme des études de gravité légère ou modérée, ou des animaux surnuméraires. Plusieurs procédures faiblement invasives, telles que injections et prélèvements, seront réalisées sur les mêmes animaux dans les limites éthiques prédéfinies (Voir 5.6.1 et les documents de référence validés par le comité éthique)

Raffinement

Application du principe de Raffinement : Pour cette formation seront utilisés exclusivement les animaux en bon état général. L’état des animaux sera régulièrement évalué, si besoin par le vétérinaire ou par la personne chargée du bien- être des animaux. Toutes les procédures réalisées sur chaque animal seront enregistrées et les délais de repos définis seront respectés. Le nombre de gestes techniques est limité à 15 injections et 5 prélèvements au total pour chaque animal. Dans les heures qui suivent la formation, les animaux seront observés par le tutoré et/ou le tuteur préalablement formés à reconnaître les signes de souffrance d’un animal. En cas de procédure entraînant des effets indésirables inattendus et une souffrance qui peut perdurer, le tuteur ou la SBEA pourra prendre la décision d’euthanasier l’animal. Les administrations seront avec du sérum physiologique parfois supplémentés par un colorant compatible avec les injections pour les validations de la bonne administration. Les prélèvements sanguins respecteront les recommandations du comité d’éthique. Pour les gestes réalisables sur animaux vigiles, l’anesthésie sera privilégiée lors de la réalisation des premiers gestes. Pour les procédures à réaliser sous anesthésie et analgésie, les documents de référence du comité d’éthique seront appliqués.

Choix des espèces

Les rats et les souris sont des espèces couramment utilisées dans la recherche et pour la réalisation d’expérience précliniques. L’apprentissage des bonnes pratiques permettra aux utilisateurs de réduire la souffrance et les dommages subis par les animaux au cours de la réalisation de ces expériences. Animaux adultes. L’objectif de formation est d’apprendre la réalisation de ces procédures sur des animaux adultes, les mêmes que ceux utilisés dans le cadre des expériences précliniques réalisées par notre société

900 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour prélèvement d'organes, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Génétiquement modifiées pour développer un lupus, elles subissent pendant vingt semaines des administrations répétées de molécules, un gavage quotidien possible, des passages en cage à métabolisme et des mesures de filtration rénale sous anesthésie, pour tester les candidats médicaments d'un client. Le porteur indique ne connaître ni la nature ni les effets des molécules testées, et signale des effets possibles comme des infections, des lésions de l'œsophage ou des hématomes aux points d'injection. Il affirme qu'aucun modèle in vitro ne reproduit la maladie et conclut que le recours à l'animal est "incontournable".

Objectifs

L’objectif de ce projet est d’évaluer l’effet de nouveaux candidats médicaments sur l’atteinte rénale dans un modèle de lupus érythémateux disséminé.

Bénéfices attendus

Le projet permettra de tester de nouveaux candidats médicaments pour trouver de nouvelles molécules plus efficaces et avec moins d’effets secondaires que les molécules utilisées actuellement pour traiter les patients atteints de lupus érythémateux disséminé.

Procédures

Dans ce projet, les animaux ne subiront aucune procédure chirurgicale. Les animaux pourront subir toutes les procédures expérimentales pendant 20 semaines. Ils pourront avoir des administrations de candidats médicaments ou réactifs de traitement de façon quotidienne pour les voies per os et sous-cutanées, 1 fois par semaine pour les voies intra-péritonéales, intraveineuse et 2 fois par semaine pour la voie intramusculaire. Les animaux pourront être placés en cage à métabolisme par groupe de souris ou de façon individuelle pendant 24H 1 fois par semaine. Les animaux pourront avoir une mesure de filtration glomérulaire qui consiste à une anesthésie légère pour scotcher le capteur d’enregistrement et une administration intra-veineuse. Selon la demande du client, un prélèvement sanguin pourra être réalisé au cours ou à la fin de la procédure expérimentale. La fréquence et le volume dépendront des demandes. Cependant, les prélèvements seront effectués en concertation avec le responsable éthique de l’entreprise et en total respect de la réglementation internationale et européenne. Un prélèvement sanguin plus important terminal pourra être réalisé sous anesthésie avant l’euthanasie de l’animal.

Impact sur les animaux

Les animaux utilisés sont génétiquement modifiés pour qu’ils développent spontanément une néphropathie lupique. Nous testons des molécules clients dont nous ne connaissons ni la nature ni les effets secondaires possibles, il nous est, pour cette raison, difficile d’anticiper les nuisances pour les animaux. La procédure expérimentale est longue (20 semaines) et les animaux peuvent avoir des traitements répétitifs pouvant engendrer des effets indésirables comme des infections, des lésions de l’œsophage par exemple, des hématomes aux points d’injection… Une attention particulière sera apportée lors des administrations.

Devenir

Les animaux sont euthanasiés en fin de procédure pour prélèvement d’organes.

Remplacement

Actuellement, aucun modèle in vitro ne peut mimer la pathologie lupique dans son ensemble et dans sa complexité. Ces limitations rendent incontournables le recours à l’expérimentation animale pour tester l’efficacité de nouveaux candidats médicaments.

Réduction

L’évaluation de l’effet de candidats médicaments sur le lupus érythémateux disséminé et sur la néphropathie lupique se fera au cours du temps (jusqu’à 20 semaines) par des techniques non-invasives : évolution dans le temps du phénotype (scores des lésions cutanées de 0 à 6), mesure de la protéinurie par bandelette urinaire et récolte urinaire par cage à métabolisme, ce qui réduit fortement le stress de l'animal. De plus, une évaluation en basal (avant traitement) ainsi que des évaluations à différents temps pendant le traitement permettront pour chaque animal d'être son propre contrôle et donc de limiter le nombre d'animaux utilisés.

Raffinement

L’état général des animaux sera observé tous les jours par du personnel qualifié. . Afin de suivre la directive européenne 2010/63/UE, différents types d’enrichissement pourront être ajoutés aux animaux (coton, aspen brick (bout de bois) ou igloo en polycarbonate). Les procédures nécessitant une anesthésie seront réalisées avec des plaques chauffantes thermorégulées afin d'éviter une hypothermie à l'animal.

Choix des espèces

Le modèle choisi pour cette étude est un modèle murin génétiquement modifié (souris MRL/MpJ-Faslpr/J, communément appelées souris MRL-lpr). Ces souris développent une maladie auto-immune ressemblant au lupus érythémateux disséminé en raison d'une mutation (Faslpr) qui favorise la survie des lymphocytes auto-réactifs, et d'un fond de souche (MRL/MpJ) prédisposé à l'auto-immunité. Elles vont développer de manière spontanée une néphropathie cliniquement similaire à ce qui est observé dans la pathologie humaine. Les animaux utilisés seront au moins âgés de 8 semaines afin d’avoir des animaux sexuellement matures permettant de mimer au mieux les conditions cliniques humaines.