Enseignement supérieur et formation professionnelle
Ciblage spécifique de cellules de la rétine à l’aide du système CRISPR Cas9 et évaluation d’une immunité dirigée contre la protéine Cas9 pour la maladie de Stargardt.
- Formation professionnelle
- Recherche appliquée
- Troubles sensoriels
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
142 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dont 132 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils reçoivent des injections sous la rétine ou dans le vitré des deux yeux sous anesthésie, une imagerie rétinienne répétée et des prélèvements sanguins, avant une ponction intracardiaque terminale, pour tester une édition génique CRISPR-Cas9 contre la maladie de Stargardt. Le porteur indique aussi que le projet sert à mettre au point des gestes techniques et à valider les compétences des personnels. Il affirme qu'il est impossible de reconstituer la rétine in vitro.
Objectifs
Parmi les vecteurs viraux, ceux qui dérivent du parvovirus humain Adéno-Associé (AAV) sont aujourd’hui considérés comme les plates-formes les plus performantes pour le traitement par thérapie génique des maladies génétiques. Parmi les différents sérotypes d’AAV connu, le sérotype AAV2/8 avec les ITRs d’AAV2 encapsidés dans la capside d’AAV8 montre une grande efficacité en termes de tropisme et de niveau d’expression dans les photorécepteurs de la rétine. Par ailleurs, les vecteurs AAV pouvant donner lieu à une réponse immunitaire suite à une pré-exposition au virus, nous souhaitons également tester les nanoparticules lipidiques (LNP) afin de délivrer la nucléase Cas9. L’objectif de ce projet repose sur le potentiel d’une stratégie d’édition génique en ciblant l’intégration d’un minigène correctif dans un site de coupure d’ADN double-brin induit par la nucléase Cas9. Ce minigène permet la correction des mutations du gène ABCA4 qui impactent le fonctionnement de la protéine ABCA4, transporteur essentiel pour le métabolisme des rétinoïdes dans les photorécepteurs, les cellules photosensibles de la rétine. Avec une preuve de concept déjà établie in vitro et avec des résultats préliminaires in vivo, la valeur thérapeutique de cette approche est réalisable. L’utilisation d’une stratégie d’édition génique est en essai clinique pour une autre dystrophie rétinienne et donne l’espoir pour le futur développement de thérapies basées sur CRISPR/Cas9 pour la cécité. Pour cela, les praticiens et concepteurs en recherche sur la cécité doivent acquérir les compétences nécessaires à la réalisation de leurs projets de recherche impliquant des animaux selon la Directive Européenne (arrêté du 1er février 2013 relatif à l’acquisition et à la validation des compétences des personnels des établissements utilisateurs, éleveurs et fournisseurs d’animaux utilisés à des fins scientifiques). C’est dans ce cadre que nous souhaitons mettre au point les techniques d’injections sous rétinienne et intravitréenne sur le modèle rat. Pour l’étude de certaines pathologies de la rétine et pour des études de recherches fondamentales nous serons amenés à travailler sur le modèle rat avant de pouvoir passer à une plus grosse espèce.
Bénéfices attendus
L’immunogénicité de la protéine Cas9 a été décrite dans quelques études. Il est cependant à noter qu’en transfert de gène, plusieurs facteurs peuvent influencer l’initiation d’une réponse immune ; parmi eux, la dose de vecteur, la nature du transgène ou encore la voie d’administration. Dans cette étude, le but est d’étudier la présence d’une réponse immune après transfert de gène dans l’œil qui est un site décrit comme immunoprivilégié et ce, à une dose cliniquement pertinente. Concernant la détection d’une réponse immune dirigée contre la protéine Cas9, les techniques d’analyse décrites dans la littérature ne sont pas standardisées et aucun kit n’est, à ce jour, commercialisé. Notre étude permettra d’établir un protocole adéquat pour la détection de la réponse immune anti-Cas9. De plus, l’utilisation d’une stratégie d’édition génique est en essai clinique pour une autre dystrophie rétinienne et donne l’espoir pour le futur développement de thérapies basées sur CRISPR/Cas9 pour la cécité. L’évaluation in vivo de notre stratégie d’édition génique nous permettra de statuer sur la faisabilité et les bénéfices d’une telle approche chez les patients. En effet, l’utilisation d’un minigène codant plusieurs exons à la fois, si efficace, permettra de corriger une large partie du gène, ce qui sera utile pour de nombreux patients, même avec des mutations différentes. Enfin si notre approche se révèle efficace, elle pourrait être utilisée pour soigner les pathologies liées à d’autres gènes de la famille ABCA.
Procédures
Phases 1 et 2 : (i) Injection sous-rétinienne ou intravitréenne : Geste réalisé sous anesthésie générale, 1 à 3 µL injectés dans les 2 yeux des animaux, durée de la chirurgie 30 minutes maximum. (ii) Imagerie rétinienne (FO-OCT) : Geste réalisé sous anesthésie générale, 1 fois avant l’injection dans l’œil puis une fois par mois, soit au maximum 4 fois pour les animaux gardés 3 mois. Durée de l’examen 20 minutes maximum. (iii) Imagerie rétinienne (ERG) : Geste réalisé sous anesthésie générale, 1 fois avant l’injection dans l’œil puis avant l’euthanasie de l’animal, soit 2 fois au total. Durée de l’examen 30 minutes maximum. (iv) Prélèvements sanguins (Phase 2) : Geste réalisé sous anesthésie générale, un volume sanguin correspondant à 7,5% maximum du volume sanguin circulant de l'animal sera prélevé au niveau de la veine jugulaire ou de la veine caudale après anesthésie gazeuse de l'animal. En pré-injection puis toutes les deux semaines post-injection, soit au maximum 7 fois pour les animaux gardés 3 mois. Durée de l’anesthésie 10 minutes maximum. Phase 3 (v) Injection sous cutanée de 50μg de protéine et de l’adjuvant incomplet de Freund : Geste réalisé sous anesthésie générale, durée de l’anesthésie 15 minutes maximum. (vi) Injections en intramusculaire : 1 semaine après l’injection SC. Geste réalisé sous anesthésie générale, 200μL de vecteur en 4 sites d’injection, durée de l’anesthésie 15 minutes maximum. (vii) Prélèvements sanguins : Geste réalisé sous anesthésie générale, un volume sanguin correspondant à 7,5% maximum du volume sanguin circulant de l'animal sera prélevé au niveau de la veine jugulaire ou de la veine caudale après anesthésie gazeuse de l'animal. En pré-injection SC, soit une fois. Durée de l’anesthésie 10 minutes maximum. (viii) Ponction intracardiaque terminale : Geste réalisé sous anesthésie générale avec renforcement analgésique. Ce prélèvement précèdera l’euthanasie des animaux.
Impact sur les animaux
(i) Injection sous-rétinienne ou intravitréenne : A ce jour, l’administration sous rétinienne de vecteurs AAV chez le rat n’a pas d’effet délétère notable sur la morphologie et la fonction rétinienne ni sur l’état de santé général de l’animal. Nous nous attendons donc à une douleur minime liée à l’injection. Une pommade ophtalmique composée de dexaméthasone et d’oxytétracycline est appliquée à la suite de l’intervention pour minimiser l’irritation de la cornée. Cette douleur ne devrait pas dépasser les 12 heures post chirurgical. (ii) Imagerie rétinienne (FO-OCT et ERG) : Aucune douleur n’est attendue lors des examens d’imagerie (non invasifs). En effet, afin que l’animal soit immobilisé, cet examen est fait sous anesthésie générale n’entrainant pas de stress ou de douleur que pourrait entrainer une contention physique de l’animal et permettant ainsi d'assurer une qualité optimale d'acquisition des images. (iii) Prélèvements sanguins : un volume sanguin correspondant à 7,5% maximum du volume sanguin circulant de l'animal sera prélevé au niveau de la veine jugulaire ou de la veine caudale après anesthésie gazeuse de l'animal. (iv) Injection sous cutanée de protéine et de l’adjuvant incomplet de Freund et injections en intramusculaire : afin de limiter le stress de ces injections et que l’asepsie soit optimale, ces gestes seront réalisés sous anesthésie général de l’animal. Aucune douleur n’est attendue suite à ces injections. (v) Ponction intracardiaque terminale : Une ponction intracardiaque terminale sera réalisée sous anesthésie générale renforcée par une analgésie ce qui limitera une éventuelle douleur liée au geste invasif. Ce prélèvement précèdera l’euthanasie des animaux. De plus, les anesthésies répétées seront espacées d’au moins une semaine et les animaux seront surveillés au moins une heure après leur réveil par l’expérimentateur, la récupération devrait être rapide car les animaux seront soit sous anesthésie gazeuse ou recevront un réversif pour accélérer le réveil et la récupération de l’animal.
Devenir
L'euthanasie de tous les animaux est nécessaire pour obtenir les prélèvements (sang, yeux, foie, rate, nerf optique, cerveau) sur lesquels s'appuieront les analyses moléculaires, biochimiques, immunologiques et histologiques réalisées.
Remplacement
La rétine est une structure complexe composée de multiples couches de neurones et de cellules nourricières. Il n’est pas possible de reconstituer parfaitement cet organe complexe in vitro. L’utilisation de modèles animaux est donc la seule option pour étudier la physiopathologie et le transfert de gènes dans la rétine avant de commencer des études cliniques chez l’homme.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés sera réduit au minimum nécessaire, nous utiliserons au maximum des animaux de réforme pour la phase 1. Nous avons calculé nos estimations sur les séances précédentes d’injections sous rétiniennes. D'après une revue des publications d'études similaires ainsi que l’expérience du laboratoire notamment sur la reproductibilité des ERG, 8 animaux par groupe seront suffisants pour réaliser des analyses statistiques pertinentes (comparaison des groupes à l’aide d’un test non paramétrique ‘one-way ANOVA’). Après l’expérience, nous nous attendons à obtenir des variables (liées à nos données) ordinales. Nous ne pouvons pas raisonnablement supposer que les données seront normalement distribuées, par conséquent, nous pensons essentiellement utiliser des tests statistiques de type Mann-Whitney U pour analyser les données générées par l’expérience. Pour réduire le nombre d’animaux au minimum nous avons mis en place des mesures pour limiter la variabilité des données, y compris l’effet de la lumière. La luminosité est normalisée entre toutes les cages (mesurée par luxmètre chaque semaine). La détermination du nombre d’animaux pour l’évaluation de l’immunogénicité de Cas9 a été réalisée par approche statistique et sur la base de l'expérience d'études similaires en thérapie génique des maladies de la vision. Une analyse de puissance été effectuée avec le logiciel R et le package pwr en utilisant l'écart-type que nous observons dans les mesures d’ERG chez nos rats WT. De là, nous avons sélectionné une taille d’échantillon n=8 animaux/lot comme maximum.
Raffinement
Les études antérieures de notre équipe ont été faites sur d’autres modèles pour des études précliniques. Pour l’étude de certaines pathologies de la rétine et pour des études de recherches fondamentales nous serons amenés à travailler sur le modèle rat avant de pouvoir passer à une plus grosse espèce. Toutes les interventions sur animaux se feront sous anesthésie générale et locale renforcée si nécessaire par des compléments analgésiques et anti-inflammatoires appropriés, pour réduire la contrainte imposée aux animaux. Les animaux sont observés quotidiennement et le vétérinaire de l’installation sera alerté dès l’apparition de signes cliniques afin d’adapter le suivi et les soins aux animaux. Pour leur bien-être, les animaux sont hébergés à plusieurs par cage (dans la limite réglementaire) dans un milieu enrichi comprenant des frisottis de papier, buchettes de bois et tunnels. L’enrichissement serait renforcé si un animal se retrouvait en hébergement seul. Les animaux auront accès à la nourriture et à l’eau ad libitum L'application de critères d'arrêts nous permettra d'intervenir immédiatement dès le moindre signe de souffrance en utilisant des traitements antalgiques appropriés ou de décider d'une euthanasie
Choix des espèces
Le modèle rat est un très bon modèle préclinique pour l’évaluation d’un traitement par thérapie génique. De plus, les modèles utilisés ici sont des rats transgéniques pour la maladie de Stargardt : la lignée, issue de rats Sprague Dawley, que nous utilisons ici, a été créée par la technologie de CRISPR/Cas9. Cette technologie nous a permis de produire, lors du même projet de transgénèse, des rats « knock-out » pour ABCR4 (ABCR-/-). Nous avons validé que ce modèle montre le phénotype attendu avec des défauts métaboliques des rétinoïdes dans la rétine. L'augmentation du niveau de bis-rétinoïdes est mis en évidence dès l'âge de 3 mois et augmente avec l'âge comme le montrent nos résultats préliminaires par HPLC et spectrométrie de masse. Il semble donc pertinent de commencer le traitement entre l'âge de 2 et 3 mois : à cet âge le risque de décollement de la rétine est faible et on se situe dans la fenêtre thérapeutique. Pour l’évaluation de la réponse immunitaire, nous souhaitons évaluer celle-ci sur des animaux ayant un système immunitaire mature, donc sur des rats adultes de 3 mois.
Travaux Pratiques d’introduction à l’expérimentation animale et de physiologie animale
- Enseignement supérieur
Rats : 140
70 souris et 140 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, les souris dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger et les rats dans des procédures menées sous anesthésie sans réveil. Les souris servent à des étudiants pour apprendre la contention et une injection de sérum physiologique, les rats sont opérés sous anesthésie avec pose d'une canule dans la trachée et de cathéters dans la jugulaire et la vessie, pour des mesures de ventilation et de diurèse. Le porteur indique que le règlement de l'animalerie interdit toute réintroduction et que les corps sont congelés pour des travaux pratiques de dissection. Il affirme qu'aucune méthode substitutive satisfaisante ne remplace ces séances.
Objectifs
Dans le cadre de notre formation universitaire, régi par un programme pédagogique national, nos étudiants sont amenés à "mettre en oeuvre les techniques d'expérimentation animale pour mieux comprendre le fonctionnement, la physiologie des systèmes/appareils des organismes animaux. Ils doivent ainsi acquérir les compétences suivantes: 1) Manipuler les animaux de laboratoire; 2) Respecter la réglementation, les règles de la bioéthique; 3) Maîtriser les techniques liées à l’expérimentation animale utilisées en physiologie animale. Ces compétences de base doivent leur permettre ensuite de mettre en œuvre les techniques d'expérimentation animale pour des études de toxicologie, de pharmaco-cinétique, ou encore des études du métabolisme.
Bénéfices attendus
Ces TP sont extrêmement importants dans le cursus de ces étudiants. La formation doit les amener à être directement opérationnels en laboratoire de recherche. Cette première approche permet ainsi de les confronter à la réalité de l’expérimentation animale, et de les sensibiliser au respect absolu de la réglementation, en particulier aux procédures de raffinement. Ils permettent de lever l’appréhension d’un certain nombre d’étudiants et de les conforter ou non dans leur désir de travailler sur l’animal et de s’engager dans cette démarche. Le 1er TP d'introduction au semestre 1 (sur la souris) leur permet d’aborder plus sereinement les TP de physiologie (sur le rat) qui ont lieu au semestre 2. Le résultat pédagogique est extrêmement satisfaisant, car les étudiants sont extrêmement impliqués et se montrent transformés (positivement) entre le début et la fin des TP. Les TP du semestre 2 représentent une réelle "plus value" pour nos étudiants qui peuvent être amenés à manipuler des animaux dans leurs fonctions ultérieures. Le retour des étudiants est unanime.
Procédures
Dans le cadre du TP d'introduction à l'expérimentation animale, les souris seront manipulées par les étudiants dans un premier temps pour se familiariser avec l'animal de laboratoire (30 minutes à 1 heure), puis pour apprendre la contention de base (1 heure à 1h30), mais également pour réaliser une injection sous cutannée ou intrapéritonéale de sérum physiologique (30 minutes). Dans le cadre des TP de physiologie animale, les rats seront manipulés selon une procédure d'anesthésie sans réveil. Différentes procédures seront menées sur ces animaux : pose d'une canule dans la trachée (30 minutes), pose d'un cathéter dans la veine jugulaire (1 heure), et pose d'un cathéter dans la vessie (30 minutes). Concernant le TP sur la ventilation, le protocole de mesure de la ventilation est ensuite estimé à environ 20 minutes maximum. Concernant le TP sur la diurèse et la pression artérielle, le protocole de mesure est ensuite estimé à environ 1 heure maximum. Dans tous les cas, aucun prélèvement ne sera effectué.
Impact sur les animaux
Concernant le TP d'introduction, hormis un stress lié à la manipulation des souris pour l'apprentissage de la contention, aucune nuisance ou effet indésirable n'est attendu. Concernant les TP de physiologie, la buprénorphine peut entrainer une faible dépression cardio-vasculaire.
Devenir
Le règlement de l’animalerie interdisant la ré-introduction d’animaux après expérimentation, tous les animaux sont euthanasiés (dose létale de pentobarbital) à l'issue des TP. Une fois euthanasiés, les animaux sont congelés et utilisés ultérieurement pour des TP d’anatomie/dissection.
Remplacement
Il n’existe actuellement aucune méthode substitutive satisfaisante qui permettrait le remplacement de ces séances telles qu’elles ont été conçues pour préparer les étudiants à la réalité des procédures en laboratoire de recherche et au respect de la règle des 3R.
Réduction
Le nombre total d’animaux concernés pour l’ensemble des cinq années et 28 étudiants pas promotion (partagés en 2 groupes de 14 étudiants) est de 210, dont 70 souris et 140 rats. En effet, dans le cadre du TP d’introduction, chaque année, 14 souris seront utilisées (une souris par étudiant), les souris du groupe du matin étant ré-utilisées pour le groupe de l’après-midi. Afin de réduire le nombre de rats (28/an contre 42/an précédemment), nous avons décidé de supprimer une séance de TP par rapport aux années précédentes. La saisine actuelle ne comprend par conséquent que 2 protocoles expérimentaux sur les rats, contre 3 les années précédentes. Ainsi, sur 5 ans, 70 rats de moins seront utilisés dans le cadre de cette formation. Par ailleurs, les animaux euthanasiés seront congelés et utilisés pour des TP d’anatomie/dissection.
Raffinement
La formation ne dispose pas d’animalerie. Nous utilisons donc l’animalerie de l’UFR dédiée à la recherche qui existe sur le site. Les animaux sont réceptionnés au minimum 5 jours avant chaque TP. Les animaux sont stabulés dans des cages ayant une surface de 410 cm2 et une hauteur de 12cm (souris) ou ayant une surface de 820 cm2 et une hauteur de 15cm (rats) contenant de la litière mélangée à du coton. Des "maisons dômes" en carton et des tunnels en plexiglass rouge sont ajoutés aux cages des souris et des rats, respectivement. Une surveillance quotidienne est effectuée par le personnel de l'animalerie. Il y a 4 souris ou 2 rats par cage, la température de l'animalerie est de 21°C +/- 2, la nourriture et l’eau sont fournies ad libitum. Une alternance jour/nuit de 12h est respectée. Dans le cadre des TP d’introduction/contention, chaque étudiant est invité à faire une démonstration de contention à l’enseignant. Si l’enseignant estime la contention réalisée correctement, il invite ensuite l'étudiant (uniquement dans le cadre du volontariat) à pratiquer une injection de sérum physiologique par voie sous-cutanée ou par voie intrapéritonéale sous le contrôle exclusif de l’enseignant habilité et formé aux gestes garantissant le bien-être des animaux. Dans le cadre des TP de physiologie animale, les rats seront anesthésiés avant l'arrivée des étudiants selon un protocole mis au point avec l'aide d'un vétérinaire. Une prémédication permet de réduire la dose du mélange anesthésique administré, mais aussi de rendre l’anesthésie plus facile et surtout permet une analgésie plus efficace, plus profonde, et plus longue. Au cours de la séance, si le rat montre des signes de réveil, l'injection d'une dose supplémentaire d'anesthésiant sera pratiquée par les enseignants.
Choix des espèces
Le rat et la souris seront utilisés lors des séances de travaux pratiques. Ces deux espèces mammifères ont une physiologie assez proche de l’homme. La souris sera utilisée pour les travaux pratiques sur l’apprentissage de la contention car c’est un petit animal facile à appréhender pour des étudiants n’ayant pas l’habitude de manipuler les animaux. Par ailleurs, nous avons choisi de réaliser ce TP avec des souris de souche OF1 ou Swiss réputées calmes et non agressives. Pour les autres TP le rat sera utilisé car il y aura nécessité de réaliser des procédures au niveau des abords veineux et la taille du rat est mieux adaptée. Les animaux ne sont pas identifiés. Ils seront utilisés à maturité sexuelle afin de ne pas avoir des animaux trop petits et faciliter les expériences. Les rats utilisés ne proviennent pas de notre animalerie qui n'est pas une animalerie d'élevage. Il s'agit d'anciens mâles reproducteurs (animaux de réforme). Concernant les souris, nous ne sommes pas en mesure d'utiliser des souris de réforme de notre animalerie pour plusieurs raisons. En premier lieu, l'animalerie n'est pas une animalerie d'élevage et n'est donc pas en mesure de fournir 14 souris de réforme à une date précise. Le responsable de l'animalerie pourra le confirmer. Par ailleurs, la quasi totalité des souris de l'animalerie sont de la souche B6, connue pour être nerveuse et agressive, ce qui n'est pas idéal pour un TP d'initiation à l'expérimentation animale, à la contention.
Etude de l’impact d’un régime riche en gras et en sucre sur des rats à des fins d’enseignement en travaux pratiques.
- Enseignement supérieur
24 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Ils reçoivent pendant huit semaines un régime riche en gras et en sucre pour induire un surpoids, sont mis à jeun, anesthésiés puis tués afin de prélever sang et organes pour des travaux pratiques d'étudiants. Le porteur qualifie l'expérience de peu douloureuse et affirme que la simulation n'est pas une alternative efficace pour la formation. Il revendique la "nécessité" de l'expérimentation animale en recherche.
Objectifs
Le projet consiste à faire prendre du poids à des rats en leur donnant plus de sucre et de gras qu'ils n'en ont besoin pour vivre, afin de mimer ce qu'on observe dans l'obésité chez l'homme. Le poids des rats est suivi chaque semaine le temps de l'expérimentation. Les effets du surpoids sur le métabolisme de ces rats seront étudiés par des étudiants grâce à des analyses biochimiques lors de leurs travaux pratiques.
Bénéfices attendus
Les bénéfices de ce projet d'expérimentation animale sont multiples tant sur le plan de l'enseignement que de l'expérimentation en elle-même. Tout d'abord c'est le seul et unique projet impliquant ce type d'expérimentations lors des trois années de formationdes étudiants (80% des leurs autres TP ne font pas appel aux animaux/expérimentation animale). Les modèles animaux sont utilisés en recherche et sont pertinents pour étudier l'impact de l'alimentation sur la santé. On leur enseigne cet aspect là de la recherche et les analyses associées lors ce TP . De plus ils approfondissent et mettent en pratique des notions vues en cours. Les étudiants s'intéressent aux projets qui ont un sens et pour lesquels une problématique claire est annoncée (lien direct avec la santé humaine). Ils ne vont donc pas seulement faire des dosages mais verront les marqueurs dosés être modifiés et devront analyser cette variation et faire des recherches pour comprendre pourquoi ils évoluent. Nous avons choisi ce régime riche en graisses et en sucre (High fat High Sugar HFHS) car la thématique est abordée en cours (métabolisme des glucides, des lipides, stress oxydant, physiologie de la digestion, phyiologie cardiaque, physiologie hépatique...), et cette pratique n'est pas douloureuse pour les animaux. Ce projet d'expérimentation animale permettra de générer des tissus pour plusieurs années de travaux pratiques (réduction du nombre d'animaux utilisés). Pour résumer les étudiants bénéficieront d'une initiation à l’utilisation de modèle animaux pour tester les effets de l’alimentation sur la santé, à l'étude du métabolisme glucidique et lipidique (analyses associées), à la mise en place d’analyses à partir d’un protocole, à l'acquisition de compétences techniques (pipetage, préparation de tampons, de solutions à pH contrôlé ou non, mise pratique d’expériences à partir d’un protocole), à la mise en forme des résultats, à l'analyse des résultats, au traitement statistique, à la discussion critique des résultats et à la recherche bibliographique associée. Et grâce à une seule expérimentation peu douloureuse/invasive pour les animaux nous pourrons mettre en place ce TP pendant 4 années universitaire. Cette expérience animale ayant déjà été réalisée auparavant, nous savons que la prise de poids (bien que limitée) est significative chez les rats HFHS, et que les marqueurs proposés sont significativement modifiés grâce au régime HFHS.
Procédures
Les animaux seront alimentés avec une nourriture riche en gras et en sucres pendant 8 semaines. A la fin du protocole ils seront anesthésiés avant mise à mort pour prélèvement de sang et organes à la fin de l'étude.
Impact sur les animaux
Le régime riche en sucre et gras fera prendre du poids aux animaux et pourrait les rendre diabétiques (raremant sur une durée de 2 mois). La mise à jeun des animaux la veille du prélèvement pourrait être inconfortable pour les animaux. L'injection de l'anesthésique peut créer un stress pour les animaux.
Devenir
La veille de la fin de l'étude les animaux ne recoivent plus de nourriture. Le lendemain ils sont anesthésiés et mis à mort pour prélèvement de sang et des organes pour faire les travaux pratiques.
Remplacement
Les travaux pratiques ont été modifiés depuis quelques années. La plupart des TP nécessitant des animaux ont été remplacée soit par des modèles in vitro (exemple modélisation de la digestion in vitro, modèles cellulaires, analyse de données et bibliographie, enquêtes diététiques sur les étudiants eux-mêmes...). Les modèles animaux sont utilisés en recherche car nous connaissons leurs caractéristiques physiologiques et leur fonctionnement bien connu permet de mimer ce qui se passe chez l'homme. L'utilisation de l'expérimentation animale que nous pensons nécessaire en recherche, et qui donc doit être vue lors de la formation d'étudiants appliquée à la nutrition, a été réduit à une part minime. La modélisation quand elle est possible et concrète (impliquant des dosages biologiques) est intéressante; Par contre l'utilisation de la virtualisation et la simulation n'est pas une alternative efficace pour la formation des étudiants.
Réduction
Le nombre d'animaux utilisés pour l'étude permet de faire l'étude seulement une fois tous les 3-4 ans et d'optimiser l'analyse des résultats obtenus par les étudiants. Le nombre d'animaux est donc relativement important (24 rats au total) pour une expérimentation mais cette expérimentation au lieu de se dérouler chaque année, se déroule une fois tous les 3-4 ans. Ce qui diminue de ce fait le nombre d'animaux et engendre une optimisation d'utilisation des tissus récoltés.
Raffinement
les animaux traités par le régime HFHS ont un suivi pondéral régulier et un changement de litière adapté en fonction de leurs besoins Les animaux sont anesthésiés pour éviter toute douleur à la fin de l'étude avant la mise à mort.
Choix des espèces
Les rats sont couramment utilisés pour développer des modèles d'obésité/maladies métaboliques grâce aux régimes riches en en graisses et en sucres, sujets développés en cours et lors du TP en question. Les mâles sont utilisés car le statut hormonal peut faire varier la réponse au régime HFHS. La même chose aurait pu être faite sur des femelles. Les mâles sont souvent retrouvés dans les études publiées . Tous les marqueurs qui seront étudiés en travaux pratiques sont fréquemment dosés et étudiés lors de divers travaux publiés sur l'impact d'une alimentation trop grasse et sucrés en santé humaine. En tant qu'enseignants nous avons donc des sources fiables auxquelles nous référer pour construire nos TP et les étudiants eux pourront après formation faire une bibliographie pertinente pour analyser les données lors des TP. Le rat est une espèce utilisée en laboratoire pour la recherche fondamentale et aussi appliquée en industrie. La formation aux techniques utilisées en laboratoire de recherche (publique/privé) fait partie intégrante du cursus des étudiants.
- Enseignement supérieur
- Formation professionnelle
Rats : 80
780 rongeurs, 700 souris et 80 rats, vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, la plupart tués à l'issue et dix-huit réutilisés pour d'autres entraînements. Des stagiaires s'exercent à la contention, aux injections et aux prélèvements sur animaux vigiles, puis à la mise à mort par dislocation cervicale sur animaux anesthésiés. Le porteur indique qu'aucune limite n'est fixée au nombre de tentatives de gestes techniques par stagiaire, l'animal n'étant remplacé qu'en cas d'agitation. Il décrit cette mise à mort comme un apprentissage à "but pédagogique" et juge le recours aux animaux vivants "indispensable".
Objectifs
● Répondre à des besoins de formation sur l’expérimentation animale. De nombreuses entreprises privées ou institutions publiques nécessitent que leurs personnels soient formés à l’application ou à la conception de procédures/projets pour l’expérimentation animale pour être conforme à la réglementation en vigueur. Cette formation permet de répondre en partie à la demande locale e peut être réalisée dans le cadre de formation initiale ou continue. ● Pédagogique : de nombreux étudiants /doctorants de science, pharmacie ou médecine – de notre université - étudient dans le cadre de leur formation initiale les bases de l’expérimentation animale. Cette formation complémentaire s’inscrit dans la continuité de leur formation initiale et leur permet d’approfondir et valider leurs connaissances théoriques vis-à-vis de l’expérimentation animale. ● Scientifique : Proposer une formation qui permettra aux stagiaires de saisir les enjeux de l’expérimentation animale et de ces limites. Les travaux pratiques répondent à l'ensemble de ces trois points. Ils permettent d’apporter une réelle plus-value à la formation ainsi qu'aux stagiaires. Le stagiaire peut ainsi se familiariser avec les animaux tout en étant encadrer par des intervenants « experts » en expérimentation animale.
Bénéfices attendus
Les stagiaires à la suite de cette formation réglementaire, scientifique et pratique possèdent l’ensemble des pré-requis indispensables à l’application et/ou à la conception des procédures/projets en expérimentation animale. Cela se traduit in fine par des connaissances robustes sur la réglementation française liée à l’expérimentation animale ainsi que les aspects éthiques et scientifiques. La simulation APAFIS permet aux stagiaires d’acquérir des connaissances et expériences suffisantes afin de procéder à l’élaboration et écriture de leur propre formulaire. Les travaux pratiques quant à eux s’inscrivent dans la lignée de ces cours théoriques. La mise en situation est indispensable pour appliquer les aspects théoriques enseignés. Ces TPs sont suffisamment étoffés pour enseigner les techniques d’administration, de prélèvement et de mise à mort les plus couramment utilisés et sont parfaitement adaptés pour rappeler les notions théoriques (réglementation – 3R – points limites…). Ces TPs sont basés sur une démonstration puis l’application des gestes les plus fréquemment rencontrés lors de la manipulation des rongeurs. Sur les précédentes sessions, l’évaluation par les stagiaires nous a confortés sur les bénéfices de notre formation et notamment sur l'importance de préserver des séances de mise en pratiques.
Procédures
Lors des enseignements, les animaux (souris et rats) seront soumis à de la manipulation et contention par les encadrants et stagiaire (30 minutes). Cela n'engendre pas de douleurs physiques aux animaux. Aucune limite n'est fixée sur ces gestes. Cependant, en cas de stress des animaux (agressivité ou prostration), ils seront remplacés. Des injections et prélèvements sur animaux vigiles (30 minutes-1 heure) sont également prévues dans le cadre de ces enseignements. Lors de la démonstration, deux injections et un prélèvement peuvent être réalisés au maximum chez la souris. Les voies d'administration étudiées chez la souris vigile sont : la voie orale - gavage, l'injection intraveineuse caudale, l'injection intrapéritonéale et l'injection sous-cutanée. Les voies de prélèvement enseignées sont : la voie caudale et la voie mandibulaire. Seule la voie intrapéritonéale est enseignée sur le rat. Aucune limite de tentatives de geste technique est fixée pour le stagiaire sur souris vigile. Cependant, les volumes injectés et prélevés resteront en adéquation avec les limites d'usage. En cas d'agitation, l'animal sera remplacé. A noter, que les souris utilisées par les stagiaires pour la pratique en condition vigile seront automatiquement anesthésiées puis mises à mort. À la suite de cette anesthésie (
Impact sur les animaux
La première partie de l'enseignement pratique a pour but d'enseigner la contention et la manipulation et n'engendre pas de douleurs ou effets secondaires aux animaux. Les animaux sont utilisés avec parcimonie. Cependant, la manipulation par des stagiaires inexpérimentés peut induire un stress chez l'animal (agressivité - prostration). Dans ce cas, l’animal expérimenté est substitué. La deuxième partie des travaux pratiques est basée sur l'injection et le prélèvement sur animaux vigiles. La manipulation par les stagiaires sur souris vigile sera supervisée étroitement par un des encadrants (4 encadrants minimum pour 10 étudiants) qui pourra le cas-échéant accompagner le stagiaire dans le bon geste de contention puis d’injection et/ou de prélèvement. Dans le cas d'une mauvaise manipulation par le stagiaire, l’encadrant jugera du besoin de remplacer l’animal, de la mise en place de stratégie antalgique ou de la mise à mort de l'animal en fonction des critères définis. L’administration sera réalisée avec du sérum physiologique au volume adapté au poids de l’animal. Aucun effet pharmacologique n’est attendu. Un maximum de deux procédures d'administration et une procédure de prélèvement sera mis en œuvre par animal. La dernière partie de l'enseignement cible l’injection, le prélèvement et la mise à mort sur animaux anesthésiés. Une souris par étudiant et une souris par encadrant ; pour la démonstration de la mise à mort; seront utilisées pendant cette partie du TP. L'ensemble des animaux utilisé ayant reçu les anesthésiques ne seront pas gardés en vie. La mise à mort sera réalisée par dislocation cervicale par le stagiaire sous supervision d’un encadrant. Dans le cas d'une séance normale, aucun point limite ne sera atteint pendant lors des deux premières parties des enseignements. Les animaux seront alors replacés dans l'animalerie. Un suivi longitudinal des animaux est réalisé quotidiennement pour s'assurer de la récupération des animaux par du personnel qualifié. Cette évaluation est basée sur les grilles d'évaluation de la douleur et de points limites décrits dans l'annexe 1. En fonction des scores de douleurs, des stratégies analgésiques peuvent être mises en place. Si un point limite est atteint, l'animal sera mis à mort par dislocation cervicale.
Devenir
La mise à mort des animaux à la fin de la séance de TP est à but pédagogique afin d’inculquer aux stagiaires les bons gestes. Les souris et rats, non mis à mort seront réutilisés à des buts de formation et d’entrainement de la mise en pratique de ces gestes par le personnels et chercheurs du laboratoire en dehors de la formation de CESU. Dans le cadre du roulement de personnel actif, de nombreux étudiants et post-doc de notre laboratoire s'inscrivent au CESU de niveau A ou de niveau B. À la suite de la formation, ce personnel nécessite de continuer la formation pratique à l'expérimentation à l'aide d'un tuteur diplômé. Les animaux restants sont mis à profit afin qu'ils puissent s'exercer avant de débuter tout projet scientifique. Cet entrainement consiste à la répétition des gestes enseignés sur animaux vigiles. A l'issue, de cet entrainement, l'évaluation des scores de douleurs et points limites sont évalués par le tuteur basée sur l'annexe 1. Le suivi longitudinal quotidien des animaux est poursuivi (basée sur l'annexe 1 également). Les animaux sont mis à mort à la fin de l'apprentissage de ce personnel.
Remplacement
Cet enseignement/apprentissage est indispensable pour la mise en œuvre de futures expérimentations précliniques dans les meilleures conditions possibles. L’emploi d’animaux vis-à-vis des procédures enseignées ne peut être substitué par l’usage de mannequin notamment sur la pratique de gestes complexes tels que la réalisation d'injections ou prélèvement par voie rétro-orbitaire. Les stagiaires sont cependant sensibilisés pendant la formation théorique : 7h00 d’enseignement destiné aux méthodes in silico (ex : modèle pharmacocinétique), in vitro (modèle de tumoroides) ou in vivo chez des espèces alternatives (Drosophiles – Nématodes) et au respect des 3R. De plus, l'évaluation de ces TPs par les stagiaires convergent vers la nécessité les préserver.
Réduction
Ce projet à but pédagogique n’est pas basé sur l’obtention de résultats. Ainsi les méthodes statistiques requises habituellement ne peuvent s’exercer dans ce cas. Le nombre d’animaux est alors évalué en fonction du nombre de stagiaires inscrits à la formation. Ce nombre est donc prévu pour couvrir l’ensemble des TPs (TP1, TP2 et TP3) sur l’animal avec la prise en compte du nombre d’animaux mis à mort et du nombre d’animaux utilisés pour les exercices de contention – injection et prélèvement. L'objectif primaire de ces séances est de fournir une expérience pratique à la fois utile et en adéquation avec les points abordés lors des enseignements théoriques. Nous estimons que l'indépendance et la mise en situation des stagiaires sont des principes indispensables à ce type de formation. Pour cela, tout est mis en œuvre pour diminuer le nombre d'animaux. L'équipe pédagogique et encadrante (conforté par les résultats de satisfaction des séances de TPs par les stagiaires) a évalué qu'une souris par stagiaire était le minimum afin de pouvoir suivre la progression et conseiller les stagiaires individuellement à la pratique des gestes techniques et d'optimiser le temps de pratique pendant les séances. La réalisation de binôme ou trinôme pour l'expérimentation animale ne semble pas adapté du fait : les besoins des stagiaires ne sont pas les mêmes, certains gestes doivent être répétés plusieurs fois pour les "acquérir", ou ne peuvent être réalisés raisonnablement qu'une seule fois (prélèvement intracardiaque). Au-delà de ces considérations liées à l'enseignement, nous nous efforçons de maintenir les règles de distanciation sociale pendant ces séances. Le nombre de rat est adapté aux objectifs du TP1 et TP2 (manutention et injection intrapéritonéale) et au nombre de stagiaires. Pour terminer, les stagiaires se préinscrivent à minima, trois semaines avant le début de la formation, permettant de commander le plus petit nombre d'animaux nécessaire.
Raffinement
Les animaux sont commandés et réceptionnés à minima 14 jours avant le début des séances de travaux pratiques. Lors des journées de TPs : Les animaux seront acclimatés dans la salle de TP, d’une à deux heures avant le début de la séance afin de diminuer leur stress. Dans cet optique, les animaux seront utilisés dans une ambiance sereine et calme favorisant la lumière naturelle dès que possible. Lors du TP1, aucune souffrance physique n'est infligée à l'animal. L'état de stress des animaux (agressivité/prostration) est évalué tout au long de la séance par les encadrants. Si l'animal apparait trop stressé, il sera remplacé. Les injections réalisées pendant le TP2 sont faites avec du sérum physiologique (par voie intrapéritonéale, sous-cutanée, gavage, IV). Les volumes injectées maximales correspondent au volume optimal en fonction du poids de l'animal soit 1mL/100g de souris - 1 à 5 ml/kg de rat. Le choix des dimensions de l'aiguille doit correspondre à la voie d'administration étudiée, l'espèce et au poids de l'animal. Dans le cadre de mauvaise manipulation (injection ou prélèvement par le stagiaire), les encadrants jugeront du maintien de l’animal dans l’expérience, du remplacement ou de la mise à mort de l’animal en se référant à l'annexe 1. Lors du TP3, toute souffrance est évitée par l'anesthésie de l'animal avec des agents médicamenteux adaptés suivie de la mise à mort de l’animal à la fin de l'enseignement. Les animaux ne sont pas utilisés deux jours successifs pour éviter. En dehors des journées de TPs, les animaux sont monitorés quotidiennement par du personnel qualifié en fonction des scores et points limites établis en annexe 1. Les souris et rats sont hébergés sur des portoirs ventilés en groupe (adapté à la masse des animaux et surface de la cage), dans un environnement enrichi (copeaux, dôme, alimentation solide). L'eau et la nourriture sont en accès libres et illimités. Les locaux sont monitorés en permanence avec un suivi de l'hygrométrie et température. Une alternance jour/nuit de 12h est également mise en place.
Choix des espèces
Les souris et les rats sont les principales espèces utilisées pour les études précliniques. Il existe une forte demande de formation vis-à-vis institutions privées ou publiques pour ces deux espèces. Ces espèces sont la base de l'enseignement pour l'expérimentation animale Afin de faciliter la contention, manipulation et injection par les stagiaires les animaux seront adultes. De plus, conventionnellement, l’expérimentation animale est réalisée chez des rongeurs adultes âgés de minimum 6 à 8 semaines.
Atteintes microcirculatoires et modification de la cinétique des anti-infectieux aux cours des états de choc par péritonite chez le porcelet anesthésié et ventilé.
- Formation professionnelle
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
100 porcelets vont être utilisés dans une procédure menée sous anesthésie, les animaux étant tués avant tout réveil. Chaque porcelet subit pendant treize heures l'induction d'un choc septique par péritonite, une ouverture chirurgicale de l'abdomen et la pose de cathéters, pour mesurer la diffusion des anti-infectieux dans les tissus. Le porteur précise qu'un réveil est impossible car le choc et les souffrances d'organes seraient douloureux. Il indique aussi que ces animaux servent à former des médecins réanimateurs, formation qu'il présente comme "indispensable" à leur pratique.
Objectifs
Les états de choc sont la principale cause de décès des patients de réanimation. Ils sont à l'origine d'atteintes vasculaires responsables d'un mauvais fonctionnement des organes. Mieux comprendre les facteurs influençant ce mauvais fonctionnement des organes pourrait modifier le pronostic des patients. Deux types de traitements sont couramment utilisés. Le premier est le remplissage vasculaire (RV). Il consiste à perfuser au malade des produits pour augmenter son volume de sang. C'était l'objet de travaux précédents qui portaient sur l'évaluation de l'efficacité de différents liquides de RV pour traiter les états de choc infectieux chez le porcelet endormi (anesthésié) et sous respirateur. L'autre principal traitement des chocs infectieux est la prescription de médicaments pour tuer les bactéries ou les champignons (antibiotiques et antifungiques) responsables de l'infection. L'efficacité de ces médicaments dépend de leur quantité dans le sang et de leur capacité à aller dans les organes. L'objectif de ce projet consiste à étudier la concentration des anti-infectieux dans un modèle de choc infectieux pour mieux comprendre leur répartition lors de l'infection et pouvoir adapter les doses et les temps d'injection. Il s'agit de la deuxième étape d'étude sur cette thématique, faisant suite à un premier modèle de choc créé par injection intraveineuse de toxine de la bactérie Eschérichia Coli. Dans cette nouvelle étude nous avons décidé de tester un modèle de choc plus physiologique en induisant une péritonite (infection abdominale). Les animaux ne seront soumis qu'à une seule procédure sans réveil qui consistera dans un premier temps à induire un choc infectieux, puis ensuite à traiter les animaux avec le médicament à tester. Tout au long de de la procédure les animaux resteront anesthésiés et ventilés mécaniquement, leur évitant ainsi stress et douleur liée au choc. Nous étudierons la concentration des antibiotiques non seulement dans le sang, mais également dans les tissus par une technique de microdialyse qui permet de collecter des échantillons en temps réel et de réaliser des mesures sans avoir à prélever les tissus. L'atteinte des vaisseaux quant à elle sera étudiée par microcope laser. Cette technique avait déjà été utilisée dans nos projets précédents.
Bénéfices attendus
L'augmentation de la perméabilité vasculaire observée lors du choc septique et l'oedème tissulaire qui en découle influence la diffusion et la concentration des anti-infectieux dans l'organisme. Connaître cette atteinte microvasculaire et la modification de la pharmacocinétique des anti-infectieux lors du choc septique est fondamentale pour la prise en charge optimale des patients. L'étude pharmacologique nécessite un modèle reproductible stable, permettant une modélisation fiable. Le modèle porcin remplit toutes les conditions pour permettre de répondre à cette problématique. De plus, les groupes étudiés vont permettre de continuer l'étude de la micro-circulation par microscopie confocale lors du choc septique.
Procédures
La procédure complète se déroulera sur 13 heures : 1 heure environ pour la préparation de l'animal, 4 heures pour l'induction du choc septique, et 8 heures pour la collecte des données. En raison du choc septique et des souffrances d'organes, un réveil est impossible car responsable de douleur. La phase la plus douloureuse est la réalisation d'une microlaparotomie au niveau abdominal pour la mise en place d'une sonde urinaire. Elle sera réalisée après l'injection intraveineuse de sufentanil afin de prévenir la douleur. Cette ouverture chirurgicale permet également d'avoir accès au mésentère de l'intestion grêle afin de réaliser des images par Cellvizio (endomicroscope confocal laser) pour l'évaluation de la porosité des vaisseaux (ces images sont réalisées après injection intraveineuse de dextran 70 kda couplé à la fluorescéine).
Impact sur les animaux
Les animaux ne seront soumis qu'à une seule procédure sans réveil qui consistera dans un premier temps à induire un choc infectieux, puis ensuite à traiter les animaux avec le médicament à tester. Tout au long de de la procédure les animaux resteront anesthésiés et ventilés mécaniquement, leur évitant ainsi stress et douleur liée au choc induit. Nous étudierons la concentration des antibiotiques non seulement dans le sang, mais également dans les tissus par une technique de microdialyse qui permet de collecter des échantillons en temps réel et de réaliser des mesures sans avoir à prélever les tissus. L'atteinte des vaisseaux quant à elle sera étudiée par microcopie confocale. Cette technique avait déjà été utilisée dans nos projets précédents.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort en fin de procédure.
Remplacement
Il s'agit d'une étude descriptive qui a pour objectif de démontrer une théorie pharmacocinétique. Il n'existe pas de méthode alternative permettant d'atteindre cet objectif dans des conditions le plus proches possibles des cas cliniques.
Réduction
L'étude de la pharmacocinétique (devenir du médicament dans l'organisme) des anti-infectieux se fait par modélisation mathématique qui nécessite 8 données pour chaque temps de prélèvement. Afin d'anticiper des pertes dues à l'état de choc mais qu'il est difficile de prévoir, il a été décidé de relever ce nombre à 10. Ainsi pour chaque anti-infectieux, nous utiliserons un groupe de 10 porcelets et chaque animal sera son propre témoin. En considérant l'étude de 2 anti-infectieux par an, nous envisageons d'utiliser 20 animaux par an, soit 100 animaux sur 5 ans. L'ensemble des analyses statistiques sera effectuée par une équipe de médecins statisticiens agréés qui a validé ce modèle de cinétique dans des publications internationales. De plus, les animaux de ce projet permettront en parallèle de former les médecins réanimateurs à la réalisation de gestes sous échographie et à la prise en charge du choc infectieux, indispensable à leur pratique professionnelle et requise pour la validation de leur formation.
Raffinement
Nous attacherons une importance majeure au raffinement des conditions d’hébergement et d'enrichissement pendant la période d'acclimatation d'une semaine. - Contact et observations quotidiennes par les soigneurs (apparence physique externe, comportement , réponses comportementales aux stimuli externes...). Toute anomalie est remontée au responsable du bien-être des animaux pour examen approfondi, traitements adaptés et/ou consultation du vétérinaire référent. - Environnement adapté et enrichi : les animaux sont hébergés en groupe. L'enrichissement est réalisé en créant une zone de repos couverte de litière, leur permettant de s'allonger tous ensemble et de répondre à leur comportement de fouissement. Ils disposent également de jouets suspendus à mordiller. - Procédure expérimentale réalisée par du personnel qualifié et expérimenté. L’animal reste sous anesthésie générale jusqu'au décès. Au cours des expérimentations, les animaux seront anesthésiés profondément Lors des quelques gestes invasifs et possiblement douloureux, un morphinique sera utilisé (SUFENTANIL 10 μg/h). La mise en place des cathéters sera réalisée sous échographie, évitant l'ouverture cutanée à l'exception de la ponction à l'aiguille. En raison du choc septique et des souffrances d'organes, un réveil est impossible car responsable de douleur. C'est la raison pour laquelle tous les animaux seront mis à mort en fin de procédure.
Choix des espèces
Le porc est un bon modèle d'étude cardio-vasculaire proche de la physiologie humaine. Le comportement hémodynamique et la vascularisation sont également proches de l'Homme, ce qui permet de se former sur l'animal avant l'usage chez l'Homme. De plus, notre équipe de recherche a acquis une expérience de plusieurs années sur ce modéle de grand animal permettant d'optimiser au mieux le modèle. Les animaux sont choisis au terme du post-sevrage à l'âge de 2-3 mois, pour des raisons techniques d'une part (poids entre 25 et 35 kg, permettant des groupes homogènes) et pour des raisons de coût d'autre part.
Formation aux techniques de prélèvement et d’injection
- Formation professionnelle
Rats : 600
1 200 animaux non-humains, 600 souris et 600 rats, vont être utilisés dans des procédures classées sans réveil, pour former le personnel aux gestes de prélèvement et d'injection. Chaque animal peut subir jusqu'à deux voies de prélèvement et deux voies d'injection, avec un maximum de trois essais infructueux par méthode, avant d'être tué au CO2. Le porteur présente cette formation comme un moyen d'améliorer le "bien-être" animal et la fiabilité des résultats, et prévoit d'utiliser des animaux de réforme voués à l'euthanasie. Il affirme que ces gestes ne peuvent être appris de façon réaliste sur simulateur et juge l'usage de l'"organisme entier" incontournable.
Objectifs
Les mauvais gestes de prélèvement ou d'injection chez les petits animaux peuvent engendrer des dommages ou du stress pour l'animal. Ces perturbations peuvent avoir un impact significatif sur le bien-être de l’animal et sur la valeur scientifique des résultats. L’objectif de ce projet est d'assurer une formation continue de qualité pour notre personnel ou utilisateurs afin d'améliorer le bien-être animal, de diminuer le nombre d'animaux utilisés dans les différents projets et de contribuer au bon déroulement des protocoles expérimentaux.
Bénéfices attendus
Ce projet fait appel à différentes procédures expérimentales à visée éducative. Il a pour but de raffiner les procédures de prélèvement et d'injection afin d’éviter la souffrance des animaux, de réduire le nombre d’animaux et d’obtenir des résultats scientifiques plus fiables et reproductibles.
Procédures
Les injections (per os - gavage, intraveineuse directe, intrapéritonéale, sous cutanée) seront faites sur animaux vigiles (rat et souris). Une anesthésie générale à base d’Isoflurane (4% pour induction et entre 1.5 à 2.5% pour le maintien) et une analgésie à base de buprénorphine (0.05mg/kg pour les rats et 0.1mg/kg pour les souris 30 minutes avant les manipulations) seront utilisées pour tous types de prélèvements sanguins. Nous prévoyons au maximum deux voies de prélèvements et deux voies d’injection par animal. Le nombre d’essai infructueux ne dépassera pas 3 par méthode. Le temps de manipulation pour chaque animal est estimé à 5 minutes. Après quoi, l’assistance de l’encadrant est demandée pour effectuer un dernier geste technique. Le volume total des prélèvements/animal ne dépassera pas 10 % du volume sanguin total (souris et rat).
Impact sur les animaux
Les injections seront faites avec du sérum physiologique au volume adapté au poids de l’animal (stérile, isotonique, ph physiologique et réchauffé) qui ne cause aucune douleur pour les animaux. Pour les prélèvements le nombre d’essai devrait se limiter à trois (ponctions). Par la suite l’assistance de l’encadrant doit être demandée. L’arrêt de saignement doit être assuré avant de retourner l’animal dans sa cage. Dans le cas d'une mauvaise manipulation, l’encadrant jugera du besoin de remplacement de l’animal, ou le cas échéant si un point limite est atteint de la mise à mort de l’animal.
Devenir
A la fin de chaque séance de formation, les animaux ayant subi des interventions d’injection et/ou de prélèvement ne seront pas conservés en vie pour éviter des souffrances inutiles, ils sont mis à mort par CO2.
Remplacement
L’apprentissage des procédures de prélèvement et d’injection chez les petits animaux comme la souris et le rat ne peut être simulée de façon réaliste et didactique. En outre, il n’est pas possible d’apprendre à faire par des prélèvements rétro-orbitaires ou sous maxillaires sur des vaisseaux artificiels. L’usage de l’organisme entier est incontournable.
Réduction
Les études statistiques requises habituellement dans les études scientifiques ne peuvent pas être appliquées car le projet est pour but éducatif. Le nombre des animaux est évalué en fonction du nombre des participant à cette formation. Pour réduire le nombre d’animaux commandés, nous utiliserons des souris et des rats provenant de notre établissement (animaux de réformes ou de génotype non désirés destinés à l’euthanasie).
Raffinement
Avant les procédures, Les animaux sont hébergés en groupes sociaux, dans des environnements enrichis par la présence de tunnel en carton pour les rats, des maisonnettes en plastique et dôme pour les souris, au sein d’une animalerie exempte de pathogènes et dont les paramètres physiques et sanitaires sont strictement contrôlés. L'alimentation et l'eau seront distribué à volonté. Les injections seront faites avec du sérum physiologique qui sera réchauffé à l’aide d’un bain-marie ou tapis chauffant afin d’éviter la diminution de la température corporelle lors de l’administration.
Choix des espèces
Notre animalerie héberge principalement des rats et souris. La majorité des demandes de travaux pour les procédures d’injection et de prélèvement dans notre établissement utilisateur concernent principalement les deux espèces souris et rat. Afin de rentabiliser le nombre de souris, nous allons utiliser des souris de réforme en provenance de notre établissement qui doivent être mise à mort : souris en fin de reproduction, ou souris sauvage issus des différents accouplements des lignées transgéniques (2-3 mois). Dans le but de faciliter la contention, manipulation et injection pour les participants, nous utiliserons des rats adultes de 300 à 350 g commandés chez un fournisseur agréé.
Formation du personnel aux techniques utilisées dans les procédures et développement/raffinement de techniques chez le lapin, furet, miniporc et chien
- Formation professionnelle
Chiens : 625
Furets : 40
Cochons : 175
1 590 animaux non-humains, lapins, chiens, cochons et furets, vont être utilisés pour former du personnel aux prélèvements, injections et chirurgies, et mettre au point des techniques, dans des procédures allant de la souffrance légère à la chirurgie sous anesthésie sans réveil. Une partie est réutilisée dans d'autres projets ou proposée à l'adoption, le reste est tué à l'issue des procédures chirurgicales. Le porteur indique des nuisances brèves lors des prélèvements et une douleur post-opératoire de quelques jours. Il affirme que la formation exige de reproduire sur animaux vivants les "conditions réelles" des expériences, et qu'avoir du personnel formé est "exigé par la réglementation".
Objectifs
Les objectifs sont de : - former le personnel de l’établissement utilisateur aux gestes techniques de prélèvement, d’administration et de chirurgie - le maintien de ces compétences dans le temps. Avoir du personnel formé et maintenir ses compétences est exigé par la réglementation. - mettre au point et/ ou développer de nouvelles techniques d’administration, d’anesthésie de prélèvement ou de chirurgie ou de modèles. Ces mises au point/ développements sont requis en amont des études précliniques réglementaires ou des procédures de prélèvements qui nécessitent des voies d’administrations, de prélèvements ou des procédures chirurgicales particulières ou des modèles particuliers, afin de valider ces techniques - améliorer des techniques déjà utilisées (raffinement de procédures/techniques existantes pour réduire l’impact négatif des procédures sur le bien-être animal).
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus sont les suivants pour la partie formation : • avoir du personnel formé , compétent et aux compétences entretenus garantit in fine la fiabilité des données générées dans les autres projets de l’établissement (évite la répétition éventuelle d’études) • limiter le stress, les contraintes et la durée des procédures/ contention pour les animaux lors des procédures. Les bénéfices attendus sont les suivants pour la partie développement/ raffinement de techniques : • permettre l’évaluation préclinique de nouvelles thérapies / médicaments pour l’homme ou pour les animaux, thérapies/ médicaments apportant un gain d’efficacité par rapport aux thérapie existantes, ou moins invasives que les thérapies existantes ou des effets indésirables moindres ou un degré de contrainte moindre pour le patient futur. • Diminuer le stress, les contraintes pour les animaux dans les études précliniques avec la validation de techniques moins invasives, ayant moins d’effets secondaires, ou plus rapides.
Procédures
Prélèvement de sang (1 à 2 par jour), Gavage orale (1 à 2 par jour maximum), Injection sous-cutanée, intra- musculaire ou intradermique (1 par jour) , Examen opthalmologique (1 par jour) – ces actes durent au maximum quelques minutes. Chirurgie sous anesthésie (jusqu’à quelques heures) avec un protocole et un suivi postopératoire adapté à l’espèce. Cette liste est non exhaustive.
Impact sur les animaux
Les nuisances pour les animaux peuvent être les suivantes : - Stress, inconfort ou douleur brève lors de procédures d’administration, de prélèvement de sang ou de pose de cathéter, n’excédant pas quelques minutes - Douleur légère à modérée en post-opératoire (quelques jours) pour les développements de techniques incluant de la chirurgie
Devenir
A l’issue des procédures N°1 à 4, les animaux seront réutilisés si possible dans un autre projet (par exemple études de toxicologie) si leur âge/ gabarit et antécédents est compatible. Les animaux ne pouvant pas être réutilisés seront proposés à l’adoption si leur état de santé est compatible et qu’il ne présente pas de danger pour l’environnement, la santé animale et les hommes. Les animaux seront euthanasiés a l’issue des procédures 5 et 6
Remplacement
Nécessité de réaliser les dernières étapes de la formation sur animaux vivants afin de mimer les conditions réelles des procédures expérimentales. L’utilisation d’animaux dans ce projet est essentielle afin de développer de nouvelles techniques qui seront utilisés ensuite dans des études précliniques ou dans des procédures de collecte de matrices (qui serviront pour le développement et la validation de techniques analytiques utilisées dans les études précliniques). Il est nécessaire de s’assurer au préalable que ces techniques sont bien adéquates et il faut donc mimer les conditions expérimentales de ces futures études ou procédures. C’est la raison pour laquelle, ce projet ne peut être réalisé in vitro, in silico ou ex vivo.
Réduction
Le nombre d’animaux pour ce projet a été estimé en tenant compte du nombre théorique de personnel à former (recrutement pour remplacer ou création de postes, retour de congé longue durée, ….) et pour lequel un entretien de compétence est nécessaire, la variété de gestes techniques qui nécessitent une formation pratique, les potentiels développements nécessaires pour les futures études. Les gestes techniques suivants ne sont pas enseignés sur des animaux à seule visée de formation mais sont soit enseignés par tutoriat au cours des études soit ex-vivo réduisant ainsi le nombre d’animaux utilisés : implantation de micropuce, euthanasie, anesthésie, technique de suture des tissus. Pour la partie développement de techniques, des échanges sont réalisés avec les autres sites du groupe afin de collecter les pratiques et les procédures, ce qui permet in fine de limiter le nombre d’animaux utilisés. Dans la mesure du possible, les techniques sont d’abord mises au point ex vivo (si pertinent) afin de réduire le nombre d’animaux utilisés).
Raffinement
Le nombre d’actes de formation pouvant être réalisé par jour est limité (cf chaque procédure – 2 gavages maximum par jour). Les animaux utilisés dans les formations sont suivis quotidiennement (a minima une observation quotidienne), et ont regulièrement un examen physique. Les animaux utilisés dans ce projet bénéficient d’un programme d’enrichissement adapté à l’espèce (ex : planche de repos, batonnet de bois à ronger, jouet pour les lapins). Des points limites basés sur le comportement, l’état clinique et la perte de poids sont décrits dans une PSO interne et appliqués aux animaux de stock utilisés pour ce projet. Pour les développements/ mise au point, des points limites spécifiques sont décrits dans le plan d’étude ou la note technique si les points limites généraux de la PSO ne sont pas pertinents ou sont incomplets.
Choix des espèces
Il s’agit des espèces utilisées ensuite dans les études précliniques, les formations et développements de technique doivent donc se faire sur ces espèces. Du fœtus à l’âge adulte, puisque ces stades de développement sont utilisés dans l’étude préclinique
Formations à la manipulation, aux gestes techniques et aux outils d’imagerie in vivo chez la souris
- Formation professionnelle
3 930 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, non pour produire des connaissances mais pour entraîner du personnel aux gestes techniques et à l'imagerie. Elles servent de support à des injections, gavages et prélèvements de sang répétés, ainsi qu'à des séances d'imagerie sous anesthésie. Le porteur indique recourir majoritairement à des animaux de réforme qui devaient de toute façon être mis à mort, et présente cette réutilisation comme un raffinement. Il affirme que les mannequins et supports vidéo ne suffisent pas et qu'une pratique "de visu" sur l'animal est "indispensable".
Objectifs
La plateforme d’expérimentation in vivo présentée dans cette demande d’autorisation de projet est agréée en tant qu’établissement utilisateur d’animaux à des fins scientifiques. L'activité de l'animalerie est donc étroitement liée à différents projets de Centre de Recherche et d'hôpitaux associés. Les utilisateurs scientifiques sont donc nombreux et très souvent renouvelés du fait qu’ils s’agissent de post-doctorant, doctorant ou personnels techniques en CDD. Même s’ils possèdent déjà une formation de base règlementaire sur l’expérimentation animale, cette expérience ne permet pas forcément d’acquérir des techniques/gestes particuliers « classiques » à la bonne réalisation de leurs protocoles. C’est pourquoi afin d’améliorer la technicité des utilisateurs et de parfaire leurs connaissances des règles sur le bien-être lors de la manipulation des animaux, des formations dédiées devront être régulièrement proposées aux scientifiques et techniciens. Une première formation regroupera les gestes les plus simples et s’organisera sur une même séance sur une demi-journée et sur les mêmes animaux. Elle enseignera la manipulation sans stress, les injections péritonéales, sous-cutanées et intramusculaires et l’apprentissage de l’anesthésie gazeuse et chimique. Cette formation groupée sera proposée 2 fois par an pour 10 apprenants. Des gestes plus techniques seront également enseignés et auront une formation propre et distincte sur une demi-journée : Injection ou prélèvement dans le sinus rétroorbitaire ; Gavage ; Injection en veine caudale ; prélèvement de sang par la veine mandibulaire. Ces 4 formations différentes seront proposées une fois par an avec 10 personnes au maximum pour chaque formation. De plus en plus de protocoles en expérimentation animale nécessitent l’utilisation d’appareils d’imagerie in vivo demandant une connaissance et une bonne formation pour être utilisée en autonomie. C’est pourquoi des formations pour les 4 appareils que possède la plateforme seront proposées de façon spécifique 4 fois par an avec aux maximum 3 personnes par session.
Bénéfices attendus
Il est important de contrôler que tous les gestes techniques de bases en expérimentation soient assurés notamment au niveau du bien-être animal. Beaucoup de protocoles au sein de notre animalerie nécessitent une maîtrise parfaite de ces gestes. Les effectifs d’animaux de tous ces projets ne tiennent pas toujours compte de cela et un entraînement parait alors indispensable. Pour aller plus loin, de mauvais gestes peuvent entraîner des biais au niveau de l’expérimentation (mauvaises injections ou blessures de l’animal) pouvant conduire à écarter des animaux, créant un problème statistique, et conduisant à recommencer les expériences. Ces remarques s’accompagnent d’une réelle demande importante des utilisateurs de la plateforme d’être formés afin d’avoir une bonne confiance sur leur expertise pour manipuler les animaux. Les expérimentateurs tiendront compte de leur formation lors de la rédaction de leur DAP permettant de limiter le nombre d’animaux et la répétition des expériences. Enfin des gestes maîtrisés limiteront les blessures des animaux et permettront de diminuer les conséquences sur son bien-être et le besoins de soins médicamenteux.
Procédures
Les animaux seront soumis selon le geste étudié au stress de l’anesthésie ou de la contention et à la douleur légère provoquée par une aiguille ou une sonde de gavage. Pour les formations des différentes voies d'administration, du NaCl 0,9% sera injecté et de l'eau pour le gavage. Pour le geste de prélèvement rétroorbitaire ou dans la veine mandibulaire 50 µL maximum de sang seront prélevés toutes les 72 heures. Les injections intra-péritonéales, intra musculaires et sous-cutanée pourront être reproduites toutes les 48h. Les injections en veine caudale et dans le sinus rétroorbitaire ainsi que le gavage pourront être répétées toutes les 72h. Les entrainements ne dépasseront pas 2 ou 6 semaines selon la technicité du geste. Pour les techniques d'imagerie des agents exogènes peuvent être injectés de façon unique par les différentes voies d'administration citées et utilisées pour les formations.
Impact sur les animaux
Les animaux seront soumis selon le geste étudié au stress de l’anesthésie ou de la contention et à la douleur légère provoquée par une aiguille ou une sonde de gavage. On peut aussi prendre en compte la gêne provoquée par la manipulation des personnes en cours de formation.
Devenir
Les souris sont mises à mort à la fin de l'ensemble des procédures car non utilisées dans d'autres projets
Remplacement
La bonne pratique de l’expérimentation animale dans la manipulation et la maîtrise des gestes techniques utilisés au sein de l'animalerie est l’objectif même de ce projet. Les formations reposeront donc sur la souris car cet animal représente la quasi entièreté de l’activité de la plateforme. Des supports vidéo sont utilisés pour la théorie ainsi que des mannequins qui sont des moyens très utiles pour des formations initiales pour un premier abord avec l’animal mais seule une pratique de visu sera efficace pour un apprentissage correct. Il est en effet important d’avoir le ressenti exacte des tissus de l’animal et de leur résistance, ce que ne peut pas apporter les mannequins et les supports vidéos. Pour les procédures d’imagerie décrites dans cette demande d’autorisation, un opérateur de la plateforme est chargé de conseiller les utilisateurs sur les possibilités et limites des techniques d’imagerie afin de ne pas utiliser des modèles animaux dans des conditions non adaptées.
Réduction
Afin de limiter la manipulation de ces animaux et d’en restreindre l’effectif, une première approche théorique avec des supports vidéos se substitueront à certaines démonstrations. De plus, certains actes pratiqués étant de sévérité légère, les animaux seront employés pour plusieurs gestes techniques, ce qui va dans le sens d’une réduction du nombre d’animaux manipulés. Majoritairement des animaux de réformes qui initialement devaient être mis à mort car hors protocole (mauvais génotype, pas le bon sexe, …), seront utilisés pour former les personnes aux gestes techniques. Cependant, il pourrait y avoir quelques exceptions notamment pour correspondre d’avantage aux besoins de formation et aux futurs protocoles d’imagerie que le stagiaire utilisera dans ces projets. En conséquence il pourra être nécessaire de commander avec des fournisseurs agréés des animaux plus spécifiques. Il ne s’agit pas d’un projet expérimental mais pédagogique. Une approche statistique n’est donc pas mise en œuvre et le nombre d’animaux manipulés pour cet apprentissage est réduit au strict nécessaire pour maitriser correctement les gestes : de 3 à 10 souris par personne formée en fonction de la complexité du geste. La stratégie pédagogique choisie est de permettre un apprentissage progressif en travaillant en effectif réduit, bien encadré, en multipliant les conseils et les démonstrations. Pour certains gestes techniques l’expérimentateur pourra s’entraîner de nouveau sur ses animaux une fois tous les 2 jours maximum ou une fois par semaine en fonction du geste (cf procédures). La formation sur les techniques d’imagerie a également pour but de promouvoir ces techniques qui permettent d’assurer un suivi longitudinal et donc de réduire le nombre d’animaux.
Raffinement
L’objectif est surtout de donner des consignes de bonnes pratiques pour la réalisation de ces actes et de familiariser la personne formée aux réactions de l’animal ce qui permettra d’améliorer grandement le confort des animaux inclus dans les protocoles et ainsi diminuer le stress induit. L’essentiel des souris utilisées lors des formations seront des animaux de réforme (issus d’élevage, mauvais génotype, pas le bon sexe, …) et n’étaient pas impliqués dans des protocoles expérimentaux, ils devaient donc être mis à mort. L’avantage qui ressort par rapport au « raffinement » est donc d’utiliser des animaux parfaitement familiarisés avec l’environnement de l’animalerie (et qui n’ont pas subi de transport), de cette manière les souris fournies aux personnes en formation sont moins stressées. Les formations sur les techniques d’imagerie ont pour but de promouvoir ces techniques qui permettent d’assurer un suivi longitudinal mois invasifs que les techniques classiques. Les acquisitions par imagerie (et l’épilation) sont réalisées sous anesthésie générale (isoflurane) afin d’éviter toute méthode de contention prolongée. Les échographies sont réalisées avec du gel d’échographie chauffé à 37°C, cette procédure reste non invasive et le degré de la douleur est estimé comme léger. L’imagerie photoacoustique, l'imagerie par fluorescence et l'imagerie X peuvent nécessiter en plus l’injection d’agent de contraste et de sondes fluorescentes par voie intra-péritonéale ou par voie intra veineuse ou voie lymphatique, le degré de douleur reste léger. L’imagerie par bioluminescence oblige préalablement à une injection de luciférine par voie intra-péritonéale, le degré de douleur est aussi estimé comme léger.
Choix des espèces
La recherche préclinique chez l’animal est devenue indispensable avant toute application clinique de nouvelles thérapeutiques. Les modèles de souris sont le plus souvent utilisés en cancérologie notamment par l’existence de modèles transgéniques mimant la pathologie humaine et d’outils permettant de caractériser ces modèles. C’est pourquoi toutes les formations proposées reposent sur la souris par rapport aux utilisateurs de l'animalerie et à leurs thématiques de recherche principales. Ceci justifie également que le plateau d’imagerie a exclusivement choisi d’acquérir des appareils d’imagerie destinée à ces rongeurs. Le stade de développement sera assez variable et fonction de la disponibilité des animaux de réforme au moment des formations. Cependant il sera privilégié des souris âgées de 8 semaines, pour manipuler des animaux adultes jeunes susceptibles de mieux supporter les manipulations des nouveaux utilisateurs. S’il s’agit de souris transgéniques susceptibles de présenter un phénotype dommageable, elles entreront dans le cadre de la formation bien avant que le phénotype n’apparaisse.
Etudes histologiques chez les rongeurs
- Enseignement supérieur
- Formation professionnelle
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
- Système immunitaire
- Système nerveux
Rats : 100
200 souris et 100 rats vont être utilisés dans des procédures menées sous anesthésie, les animaux étant tués avant tout réveil par exsanguination puis dissection. Ils ne servent pas à produire des connaissances mais à mettre au point des protocoles d'histologie et à former étudiants et collaborateurs à ces techniques. Le porteur justifie le recours aux animaux par la baisse du nombre de pièces anatomiques disponibles et par le souci de ne pas "gaspiller" des tissus issus de projets scientifiques. Il affirme qu'il n'est "pas possible de remplacer l'utilisation des animaux" puisque l'histologie porte sur des pièces anatomiques.
Objectifs
L’objectif du projet est de développer et valider des protocoles d’histologie (2D et 3D), pour la plateforme. En effet, l’histologie reste la méthode de référence pour visualiser post mortem les biomarqueurs ou les différents types cellulaires présents dans un tissu biologique. La réduction du nombre d’animaux dans les études fait qu’il n’y plus de reliquat de pièces anatomiques non utilisées dans les projets. Il n’est pas pertinent de compter uniquement sur les animaux dédiés à une étude pour à la fois mettre en place un protocole d’histologie et réaliser une étude complète, les zones d’intérêt étant parfois très petites (structures cérébrales) ou le protocole d’histologie difficile à mettre au point (multi-marquage et histologie 3D). Ce projet vise donc à utiliser des animaux afin à mettre au point de nouveaux protocoles d’histologie avant de les utiliser pour les projets scientifiques, tels que les études de vieillissement ou les études sur le cancer. Les développements méthodologiques que sont les multiples marquages, l’histologie 3D, ou révélation de la vascularisation d’un organe entier nécessitent de nombreuses mises au point. Les multiples marquages permettent de visualiser sur une même coupe de tissus plusieurs marqueurs, permettant la visualisation de colocalisations de marqueurs ou le dénombrement de différentes cellules dans une même région. Les nouvelles techniques d’histologie en 3D nécessitent également beaucoup de mises au point, pour obtenir un immunomarquage visible en profondeur, en rendant transparent la pièce anatomique. La visualisation de la vascularisation d’un organe entier, en rendant transparent la pièce anatomique, est particulièrement intéressante pour corréler avec l’imagerie IRM mais également très difficile à mettre en place, nécessitant de nombreux ajustements. Ce projet vise aussi à obtenir assez de pièces anatomiques pour pouvoir vérifier un protocole déjà validé sur une espèce sur une autre espèce ou une autre souche. Enfin, et de façon non négligeable, il est nécessaire de disposer de pièces anatomiques pour former les étudiants et les collaborateurs, aux techniques d’histologie, sans gaspiller une pièce « précieuse » car issue d’un projet scientifique. La prise en main des techniques (découpes, immunomarquages et microscopie) nécessitant un apprentissage important, notamment sur la découpe au cryostat.
Bénéfices attendus
Le bénéfice attendu est la mise au point de nouveaux protocoles complexes d’immunomarquages en 2D et 3D pour pouvoir réaliser ensuite des études complètes en histologie sur les projets scientifiques de la plateforme. Le bénéfice est également de pouvoir réaliser la formation des étudiants sans gâcher des pièces anatomiques « précieuses » car issu d’un projet et de pouvoir contrôler les résultats sur un animal sain en cas de résultat inattendu (ex : perte neuronale dans une souche de rat).
Procédures
Une procédure chirurgicale sans réveil, comportant une exsanguination perfusion puis une dissection afin de recueillir des organes d’intérêt. La procédure est déclinée en plusieurs possibilités : 1 : procédure standard d’exsanguination perfusion, puis recueil des organes, durée totale estimée à environ 15 à 20 minutes en fonction du nombre d’organes à prélever. 2 : Injection intracardiaque, intra-artérielle ou intraveineuse préalable d’un marqueur coloré (colorant vasculaire), avant exsanguination perfusion et recueil des organes. Le produit est laissé agir 5 min avant de commencer la procédure d’exsanguination perfusion, durée totale estimée à environ 30-40 minutes, en fonction du site d’injection et du nombre d’organes prélevés. 3 : Injection d’un marqueur coloré (colorant vasculaire) pendant la procédure d’exsanguination perfusion et recueil des organes, durée totale estimée à environ 15 à 20 minutes en fonction du nombre d’organes à prélever. 4 : Injection d’un marqueur coloré (remplissage vasculaire) à la fin de la procédure d’exsanguination perfusion et recueil des organes, durée totale estimée à environ 15 à 20 minutes en fonction du nombre d’organes à prélever.
Impact sur les animaux
Procédures sans réveil.
Devenir
Une procédure sans réveil pour histologie
Remplacement
L’histologie concerne les pièces anatomiques, il n’est pas possible de remplacer l’utilisation des animaux.
Réduction
Les études rats étant moins nombreuses que les études sur souris, le nombre de 20 rats/an a été déterminé par le nombre de projets nécessitant ce type de mise au point. Les études souris sont beaucoup plus nombreuses mais nous avons déjà accumulé également plus de données histologique, nous pensons donc que 40 souris /an seront suffisantes, en tenant compte des besoins de formation. Soit un total maximal de 100 rats et 200 souris en 5 ans. Il est estimé qu’environ 10 à 15 % de ces animaux seront utilisés pour les action de formation et 85 à 90% pour des actions de mise au point en histologie. Une partie des animaux peuvent être des animaux de réforme issus de projets antérieurs, ou des élevages du CEA, n’ayant subi soit aucune procédure, soit des procédures légères ou modérées n’ayant pas entrainés de signes cliniques persistants. Les actions de formations seront réalisées sur ces animaux. Les mises au point peuvent également être réalisés sur ces animaux à l’exclusion des animaux suivants : - Animaux ayant des signes cliniques, pathologiques ou non. - Animaux d’un âge trop avancé pour l’expression des biomarqueurs d’intérêt (en fonction des marqueurs) - Animaux qui ont reçu un traitement (y compris produits de contraste) - Animaux qui ont subi des procédures chirurgicales lourdes (craniotomies …) - Animaux qui ont subi des procédures pouvant entrainer une inflammation (ouverture de la barrière hémato-encéphalique) - Animaux issus de souche atypique, de souche immunodéficiente ou encore ayant un métabolisme pathologique (sans forcément présenter des signes cliniques - Animaux de l’élevage ayant déjà montré une déficience cellulaire/moléculaire (sans signes cliniques) Les animaux jeunes et sains sont privilégiés pour ces mises au point, limitant les facteurs pouvant troubler l’analyse de l’expression des marqueurs et permettant d’avoir des points de comparaisons avec des animaux ayant une pathologie ou un traitement. Des animaux d’élevage n’ayant absolument subi aucune procédure, peuvent cependant servir pour les mises au point en histologie quand cela concerne l’expression des biomarqueurs liés à l’âge, à condition que la souche soit identique à celle prévue dans le projet lié à l’âge et que les animaux n’ont pas déjà été identifié comme déficients/anormaux pour les marqueurs d’intérêts. Les animaux provenant d’autres animalerie que celle de notre plateforme, seront gardés en quarantaine à réception jusqu’à utilisation.
Raffinement
Procédure sans réveil Une antalgie sera réalisée par injection sous-cutanée de Buprénorphine (0,06 mg/kg pour les souris et 0,03 mg/kg pour les rats), 30 minutes avant anesthésie.. Les animaux seront anesthésiés par une injection intrapéritonéale d’un mélange Kétamine/Xylazine (100/10 mg/kg, dose de 10 ml/kg).
Choix des espèces
La plupart des projets scientifiques sont réalisés sur le rongeur, les mises au point techniques se sont donc en priorité sur ces espèces. Des souris de 6-8 semaines environ, pour un poids de 20-25 g, et des rats de 8 semaines environ, pour un poids de 300 g, seront utilisés de préférence, sauf pour mettre au point des études histologiques sur des animaux plus âgés, où des animaux de plus de 6 mois seront utilisés. En effet, les tissus et en particulier le cerveau montre des différences importantes au cours du temps, avec par exemple la diminution de certains types cellulaires et l’augmentation de dépôts protéiques susceptibles d’interagir avec les anticorps et de donner de faux positifs.
Travaux pratiques de Master 1ère année en Physiologie Animale : Impact d’un régime hyperlipidique sur le métabolisme énergétique de la souris.
- Enseignement supérieur
250 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, non pour la recherche mais pour des travaux pratiques de master. Soumises dix à douze semaines à un régime gras, elles subissent une calorimétrie et un test de tolérance au glucose avec incision de la veine de la queue, avant d'être tuées pour le prélèvement d'organes. Le porteur indique que le régime gras peut provoquer une forte prise de poids, altérer les capacités motrices au point d'empêcher l'accès à la nourriture, et induire un état dépressif et de l'anxiété. Il affirme qu'un organisme vivant entier est "indispensable" pour ces travaux pédagogiques, tout en précisant recourir en priorité à des souris déjà destinées à l'euthanasie.
Objectifs
Initier les étudiants à la réalisation d’un protocole expérimental de type "recherche" impliquant le modèle souris depuis le stade de la conception jusqu'à l'interprétation et la présentation des résultats en passant par l’application de techniques de physiologie et de biochimie. En s’appuyant sur les résultats expérimentaux obtenus et sur la littérature, les étudiants approfondiront leurs connaissances concernant le métabolisme énergétique et particulièrement les dérégulations métaboliques liées à l’obésité.
Bénéfices attendus
La réalisation de ce projet devrait permettre à l’étudiant d’acquérir ou de renforcer les compétences suivantes : - capacités à se familiariser avec l’animal et à réaliser des expérimentations sur ce modèle. - capacités à appliquer un protocole expérimental (dosage enzymatique, protéique, sanguin, spectrophotométrique…) - capacités à travailler en équipe (binôme / promotion) - capacités à analyser la littérature scientifique, - capacités à exposer les résultats de travaux en français ou en anglais. - capacités à respecter des bonnes pratiques de laboratoire et des règles d’hygiène et de Sécurité D’un point de vue théorique, l’étudiant approfondira ses connaissances concernant le métabolisme énergétique et particulièrement les dérégulations métaboliques liées à l’obésité. Le fait d’analyser différents paramètres et plusieurs organes lui permettra d’avoir une approche intégrative de la régulation de l’homéostasie énergétique.
Procédures
Dans ce projet, les animaux sont tout d’abord soumis soit à un régime standard soit à un régime hyperlipidique (60% lipides à base de lard) pendant 10 à 12 semaines. On réalise ensuite des mesures de dépense énergétique par calorimétrie indirecte puis on pratique un test de tolérance au glucose. Enfin, les animaux sont mis à jeun 12h avant d’être anesthésiées puis mises à mort en vue de prélèvements d’organes.
Impact sur les animaux
En plus d’une altération des paramètres métaboliques, un régime gras de longue durée peut entrainer une prise de poids importante et altérer les capacités motrices de l’animal au point de le rendre incapable d’accéder à la nourriture et la boisson. Le régime gras peut également altérer la santé mentale des animaux et créer un état dépressif et de l’anxiété. Lors du test de tolérance au glucose, le prélèvement d’une goutte de sang nécessite de réaliser une petite incision à la veine caudale pouvant générer une infection.
Devenir
Le sang, le foie et le tissu adipeux prélevés seront analysés ultérieurement afin de déterminer certains paramètres caractérisant le métabolisme glucido-lipidique (dosages de lipides, mesures d’activités enzymatiques, dosages plasmatiques par kits colorimétriques...) et de mettre en évidence les dérégulations métaboliques liées à l’obésité.
Remplacement
Dans ce projet qui vise d’une part à initier les étudiants à l’expérimentation scientifique et d‘autre part à améliorer leur connaissance du métabolisme énergétique, le modèle souris a été privilégié. Afin d’étudier les conséquences d’un régime hyperlipidique sur le métabolisme et de mettre en évidence les interrelations existantes entre les organes, il est indispensable de travailler sur l’organisme vivant entier ce qui justifie de réaliser des expérimentations in vivo. Dans ce cas, aucun modèle cellulaire ne peut se substituer à l’utilisation du modèle animal. Toutefois, en préambule du TP une explication détaillée du déroulement de l’expérience est donnée aux étudiants en s’appuyant sur des documents audiovisuels. L’anatomie des animaux et des techniques de canulation sont par exemple présentées sous forme de films ou diaporamas illustrés. En revanche, l’utilisation de lignées cellulaires in vitro est privilégiée dans d’autres UEs afin d’étudier les mécanismes à l’origine des modifications observées.
Réduction
Dans ce projet à but pédagogique, nous limiterons le nombre d’animaux à une souris par binôme en veillant toutefois à ce que l’effectif total soit suffisant pour permettre une analyse statistique (soit 5 souris de chaque groupe minimum). Ainsi lorsque le nombre d’étudiants suivant l’UE sera faible, chacun se verra attribuer une souris. Afin de minimiser le nombre d’animaux utilisé, les résultats de l'ensemble des étudiants seront groupés afin qu'une exploitation statistique puisse être réalisée.
Raffinement
Afin de réduire le nombre d’animaux et par la même occasion le coût des TPs, les animaux seront utilisés dans plusieurs UEs de Master. En effet, dans un 1er temps des mesures de dépense énergétique en calorimétrie indirecte seront réalisées dans une UE puis l’étude du métabolisme sera réalisée dans le cadre d’une autre UE. De plus des échantillons de foie seront également conservés à -20°C en vue d’une analyse protéomique et moléculaire qui sera réalisée à l’occasion des TP d’une troisième UE). Les TP de cette dernière UE ont été ainsi repensés pour que la mise à mort d’aucun animal ne soit nécessaire. Les animaux utilisés pour ce projet seront dans la mesure du possible des souris non utilisées par les équipes de recherche locales (issues de l’entretien de lignées ou réformées) destinées à l’euthanasie.
Choix des espèces
La souris est un modèle couramment utilisé en recherche il est donc important que les étudiants (dont certains vont s’orienter en Master 2 Recherche) soient formés à manipuler cette espèce. De plus, le métabolisme glucido-lipidique de la souris est adapté à la mise en évidence de phénomènes physiologiques proches de ceux que l'on peut observer chez l'Homme au cours de l’obésité. Les organes prélevés sont ceux qui jouent un rôle majeur dans le métabolisme glucido-lipidique (le foie, le sang et le tissu adipeux). La souris fait partie des espèces les plus étudiées avec des données bibliographiques abondantes ce qui permet de s’appuyer sur la littérature pour justifier certaines hypothèses au lieu de faire une expérience, limitant ainsi le nombre d’animaux utilisés.
Formation du personnel, entrainement et raffinement des techniques chirurgicales
- Formation professionnelle
Rats : 40
Hamsters dorés : 20
100 animaux non-humains, soit 40 souris, 40 rats et 20 hamsters dorés, vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le porteur les opère sous anesthésie, non pour produire des connaissances mais pour entraîner quatre membres du personnel à des techniques chirurgicales, avant une mise à mort et une nécropsie. Il indique que des complications peuvent provoquer une mort prématurée pendant la chirurgie et des infections locales chez les animaux réveillés. Il présente ce recours comme du raffinement et de la réduction, en affirmant qu'il diminuera "à terme" le nombre d'animaux utilisés.
Objectifs
Le recours à différentes techniques chirurgicales est régulièrement nécessaire dans les différents projets de recherche. Ce recours n’est envisageable qu’après l’acquisition d’un niveau d’expérimentation animale (applicateur ou concepteur) et l’obtention d’un diplôme complémentaire en chirurgie expérimentale. Ces formations ne rendent pas directement opérationnel sur tous les types de chirurgie et il est important de continuer à se former et à pratiquer pour obtenir un geste bon et un bon taux de réussite. Cela va dans le sens du concept de raffinement, mais également de celui de réduction de la règle des 3R. Effectivement en acceptant d’utiliser des animaux à des fins de formations et d’entrainement on diminue à terme le nombre d’animaux utilisés dans les projets en améliorant de taux de réussite et le bien-être animal global. Ce projet a pour objectifs de former, d’améliorer, de raffiner les techniques chirurgicales des principales chirurgies déjà réalisées ou à venir dans d’autres projets de la société. Le public visé concerne le personnel disposant déjà des niveaux réglementaires (4 personnes). La formation permettra également de valider 2 jours de formation continue dans le cadre des 3 jours de formation continue à réaliser par fenêtre de 6 ans. La formation sera assurée par une formatrice vétérinaire spécialisée en chirurgie. Après ces 2 jours, le personnel continuera son parcours de formation en relation avec le responsable de chirurgie du site.
Bénéfices attendus
À la suite de ce parcours de formation, une attestation sera délivrée et de nouvelles personnes pourront être identifiées pour réaliser ces différentes techniques dans le cadre de projets de recherches spécifiques faisant l’objet d’autres demandes d’autorisation de projet. La formation permettra également de valider 2 jours de formation continue dans le cadre des 3 jours de formation continue à réaliser par fenêtre de 6 ans. L'amélioration des techniques chirurgicales apportera un bénéfice scientifique en améliorant le taux de réussite et une optimisation de la réalisation des chirurgies dans les projets à venir, mais également en diminuant le nombre d'animaux utilisés à terme et le bien-être animal global.
Procédures
Tous les animaux de ce projet recevront une chirurgie sous anesthésie générale gazeuse (air/isoflurane). La chirurgie durera entre 15 min à 1h. Le poids corporel sera évalué quotidiennement pour tous les animaux après leur réveil et pendant 7 jours.
Impact sur les animaux
Au cours de ce projet, il est possible que des complications lors de la chirurgie entraine une mise à mort prématurée de l'animal (sous anesthésie). Pour les animaux qui seront réveillés, un amaigrissement normal avec reprise de poids sera attendu dans les 3 jours post chirurgie. Des infections locales pourraient également apparaitre (plaies de grattage au niveau du dispositif).
Devenir
A la fin des procédures les animaux ne pourront pas être réutilisés dans d'autres projets. Pour cette raison, les animaux seront mis à mort et nécropsiés à la fin de chaque procédure. Cette nécropsie permettra également de de vérifier la bonne implantation des dispositifs chirurgicaux et la création d'Abaque participant ainsi au raffinement des techniques chirurgicales.
Remplacement
L’entrainement à la chirurgie élémentaire peut être pratiqué sur cadavres et/ou mannequins. Passé cette étape, seule la chirurgie sur animal avec réveil et récupération permet de valider la technique et habilité le personnel. Le recours à l’animal est donc indispensable.
Réduction
Le nombre d'animaux utilisé dans ce projet a été déterminé pour obtenir un bon compromis entre réduction maximale et maitrise des différentes techniques chirurgicales. En fonction de l'atteinte du critère de réussite de manière précoce, le nombre d'animaux pourra être davantage réduit. En utilisant des animaux à des fins de formation, de raffinement, on réduit à terme, le nombre d'animaux utilisés dans les autres projets nécessitant de la chirurgie.
Raffinement
Ce projet a pour objectif de raffiner les techniques chirurgicales en faisant intervenir un vétérinaire spécialisé dans le domaine pour la formation. Les actes chirurgicaux seront réalisés sous anesthésie générale gazeuse (air /isoflurane) et un traitement analgésique sera mis en place tout au long des procédures chirurgicales pour une bonne prise en charge de la douleur. Les animaux sont hébergés par groupe de 2 ou 3 dans des cages avec enrichissement (matériel de nidification + tube rouge) et habitué pendant 1 semaine avant le début des protocoles.
Choix des espèces
Les souris, les rats et les hamsters sont les animaux que nous utilisons au sein de notre animalerie, dans nos différents projets et la majorité de ces chirurgies est déjà réalisée et maitrisée par une personne suivant la formation (responsable de chirurgie). Afin de raffiner les méthodes et de former d’autres personnes, il est nécessaire de recourir à l’utilisation des espèces utilisées dans nos projets habituels. Jeunes adultes (8 - 10 semaines), ce qui correspond à l’âge moyen auquel les animaux sont utilisés dans nos différents projets où ils sont susceptibles de recevoir une intervention chirurgicale.
Enseignement pratique de la chirurgie viscérale sur modèle porcin
- Enseignement supérieur
120 porcs vont être utilisés dans des procédures chirurgicales menées sous anesthésie, les animaux étant tués avant tout réveil. Le porteur décrit des interventions d'environ deux heures, plusieurs chirurgiens en formation opérant le même animal le même jour, non pour produire des connaissances mais pour entraîner de jeunes chirurgiens et gastroentérologues. Il indique que l'ablation de tissus ou d'organes et les hémorragies rendraient les animaux invivables, justifiant la mort sans réveil. Il présente ces séances comme une "offre de formation" et affirme qu'il n'existe pas d'autre modèle vivant que l'animal avant le passage chez l'homme.
Objectifs
A l’heure où les recommandations de bonnes pratiques nous interdisent, à juste titre, l’enseignement initial de la chirurgie sur les patients, cette école de chirurgie et de pratiques interventionnelles forme des jeunes chirurgiens ou gastroentérologues en proposant un apprentissage intégré. L’objectif est de faciliter l’acquisition des techniques et des gestes opératoires à la fois par voie abdominale ouverte, laparoscopique répondant parfaitement aux besoins de simulations nécessaires à une formation pratique initiale et continue d’excellence. Ainsi cette école s’adresse à un large public de professionnels de santé à la fois pour formation initiale des internes, et la formation continue (chirurgiens ou praticiens gastroentérologues senior, IBODE, infirmières d’endoscopie). L’école regroupe plusieurs laboratoires qui permettent un apprentissage progressif. 1) Le laboratoire de simulation est une unité qui offre un entrainement sur simulateurs de chirurgie ou d’endoscopie : pelvi-trainer, simulateur robotique Da Vinci, permettant un apprentissage préalable de la gestuelle sur simulateur. 2) Le laboratoire d’anatomie complète l’offre de formation en permettant un apprentissage dans de véritables conditions opératoires humaines. 3) Enfin le laboratoire de chirurgie ouverte, laparoscopique (ou coelioscopique) sur grands animaux (porcs) permet un enseignement des techniques chirurgicales et interventionnelles dans des conditions physiologiques quasi équivalentes à la clinique humaine. Ce lieu d’enseignement est aussi le lieu de mise au point et d’évaluation des dispositifs mis sur le marché, avec perfectionnement de l’implantation de matériel et familiarisation avec de nouveaux matériaux, l’évaluation de technologies innovantes encore non développées en pratique courante chez l’homme.
Bénéfices attendus
L’objectif de ces séances est un apprentissage des compétences techniques de dissections de l’intestin, la réalisation de sutures et d’anastomoses et de ligature des pédicules vasculaires. Une grille d’évaluation des acquisitions est rendue à l’apprenant. L’évolution de l’acquisition des apprentissages sera évaluée au fur et à mesure des séances. L’objectif à plus long terme est l’apprentissage des techniques opératoires avant la réalisation de ceux-ci sur des patients.
Procédures
Les animaux seront soumis à une intervention chirurgicale d'en moyenne 2 heures, sans réveil
Impact sur les animaux
Toutes les procédures chirurgicales sont réalisées sous anesthésie générale avec suivi des constantes physiologiques, traitement analgésique approprié en fonction de la procédure de façon à contrôler la douleur lors de l’intervention chirurgicale. Un risque d’hémorragie existe, contrôlé par l’enseignement. Ce projet d’enseignement ne met en œuvre que des procédures, ou des suites de procédures sans réveil. Les porcs seront sédatés en continu et des antalgiques seront donnés tout le long de la procédure.
Devenir
Les procédures sont réalisées dans le cadre d’un apprentissage professionnelle, possiblement avec ablation de tissus, de vaisseaux ou d’organes, sutures internes, hémorragies, rendant possiblement certains organes non fonctionnels ou partiellement fonctionnels et qui ne permettraient pas de maintenir les animaux en vie dans de bonnes conditions.
Remplacement
Bien que la formation se fasse de façon progressive sur des simulateurs, puis au laboratoire d’anatomie, il n’existe pas à l’heure actuelle d’autres modèles de formation aux procédures chirurgicales sur sujets vivants permettant d’éviter ou de remplacer l’utilisation d’animaux avant de passer chez l’homme.
Réduction
De façon à réduire au maximum le nombre d’animaux utilisés, différentes phases de l’apprentissage sont développées en amont aux laboratoires de simulation et d’anatomie. De plus les différentes procédures ’apprentissage sont réalisées le même jour sur un même animal par plusieurs chirurgiens en formation. Une grille standardisée d’évaluation des acquis des apprenants servira de référence pour justifier du nombre nécessaire de séances de formation, comprenant x procédures, pour acquérir les compétences par chaque individu et définir le nombre minimum d’animaux nécessaires à chaque formation.
Raffinement
Avant procédure, les animaux peuvent être hébergés selon leur taille et leur comportement, par 1, 2 ou 3 par boxes, au sein d’une même pièce. Un enrichissement alimentaire et par jeux est fourni de façon variée aux
Choix des espèces
L’anatomie du porc au niveau thoracique, abdominal et pelvien, ainsi que sa physiologie sont très proches de celles de l’homme, et de ce fait représente un très bon modèle vivant d’apprentissage et d’entrainement des diverses procédures chirurgicales avant d’approfondir l’apprentissage en chirurgie humaine. Il s’agit de jeunes animaux de 5/8 mois d’environ de 80Kg pour la formation en chirurgie digestive, selon les besoins anatomiques de chaque formation.