Recherche appliquée
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Validation d’une molécule ciblant un récepteur membranaire pour l’imagerie des tumeurs neuroendocrines 1/2
- Recherche appliquée
- Cancers
1 728 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Elles subissent des xénogreffes de tumeurs neuroendocrines, sous la peau ou par chirurgie dans la rate, des anesthésies répétées et des séances d'imagerie, avant prélèvement des tumeurs et des organes. Le porteur met au point une molécule d'imagerie visant le récepteur à la somatostatine, avec une extension thérapeutique espérée. Il affirme que l'usage d'un "organisme entier" est "indispensable" pour évaluer la toxicité.
Objectifs
Les Tumeurs NeuroEndocrines (TNE) sont des tumeurs rares et hétérogènes dans leur présentation anatomopathologique et clinique. Cela rend leur diagnostic, leur pronostic et la prise en charge thérapeutique particulièrement difficiles. L’approche théranostique (utilisation de l’imagerie pour cartographier les cellules cancéreuses et les traiter de manière ciblée) est particulièrement développée pour ce type de tumeurs. Celle-ci utilise en effet la présence d’une molécule particulière à la surface des cellules tumorales (le récepteur à la somatostatine). Cette stratégie thérapeutique est actuellement la plus efficace pour le traitement des TNE mais elle comporte quelques limites. En effet, le récepteur à la somatostatine n’est pas toujours présent, notamment dans les tumeurs les plus agressives. Nous savons qu’il existe un autre récepteur présent dans ces tumeurs, le récepteur X, et nous souhaitons l’utiliser pour développer une nouvelle approche théranostique. Cela nous permettrait de proposer un nouvel outil pour l’imagerie, et à plus long terme pour la thérapie. Cette stratégie pourrait s’avérer profitable dans d’autres pathologies tumorales puisque ce récepteur existe dans d’autres types de cancers. Dans ce projet, nous proposons de cibler le récepteur X grâce à une petite molécule appelée aptamère, qui est facile à produire. Notre agent ciblant le récepteur X sera dans un premier temps couplé à une molécule fluorescente, puis à un élément radioactif. Nous souhaitons démontrer que l’aptamère peut être utilisé en imagerie des TNE grâce à deux modèles murins de progression tumorale que nous maîtrisons au laboratoire.
Bénéfices attendus
En cas de réussite, ce projet appuiera la transition de notre stratégie de l’imagerie vers la thérapie. Pour cela, il suffira de modifier le couplage de l’aptamère en utilisant un composé radioactif adapté aux traitements anticancéreux. Cela constituera une stratégie thérapeutique complémentaire à celle déjà existante pour le traitement des TNE. Les retombées potentielles de ce projet pourront également concerner d’autres cancers. En effet, le récepteur X est présent dans de nombreux types de tumeurs.
Procédures
- Anesthésies répétées (pour chirurgie et imagerie) - Injections sous-cutanées - Injections intraveineuses - Procédure chirurgicale : greffe intrasplénique (10 minutes depuis le début de l’anesthésie jusqu’à la suture de la laparotomie) dans 3 procédures (2, 4 et 6) - Pousse tumorale limitée (taille inférieure à 1500mm3 pour le modèle sous-cutané, nodules hépatiques millimétriques dans le modèle intrasplénique)
Impact sur les animaux
La xénogreffe par injection sous-cutanée est réalisée sur animal vigile. Les tumeurs développées dans ce modèle sont de petite taille. Elles n’entraînent pas de gêne chez les animaux. Aucune métastase n’est observée. La xénogreffe par injection intrasplénique implique une petite chirurgie sous anesthésie générale avec un risque de douleur au réveil. L'imagerie implique également une petite anesthésie générale.
Devenir
Mise à mort de tous les animaux à l’issue de chaque procédure pour analyse des tumeurs développées et des organes prélevés.
Remplacement
Notre projet vise à développer un nouvel outil permettant l’imagerie in vivo des tumeurs neuroendocrines grâce au récepteur X, puis de développer un agent thérapeutique. L’utilisation d’un organisme entier est donc indispensable car il faut évaluer la toxicité éventuelle de notre molécule au niveau des différents organes. La molécule a été au préalable testée sur des cultures de cellules tumorales afin de remplacer une partie des travaux chez la souris.
Réduction
Quatre aptamères différents ont été testés sur des cultures de cellules tumorales. Seuls deux de ces aptamères seront testés chez la souris. De plus, le nombre d'animaux par groupe a été réduit au minimum tout en générant des résultats valables sur le plan statistique. A chaque étape du projet, nous sélectionnerons la meilleure molécule et le meilleur modèle, ce qui permettra de réduire également le nombre d’animaux utilisés.
Raffinement
Les animaux seront hébergés avec dômes et boules de coton dans les cages. Ils seront pesés deux fois par semaine. Si des signes de souffrance sont identifiés après la chirurgie (prostration, difficulté de déplacement), une analgésie pourra être maintenue (par exemple par ajout de Doliprane dans l’eau de boisson). Si une perte de poids supérieure à 20% du poids maximal (28g) survient, l’animal sera immédiatement mis à mort. La xenogreffe sous-cutanée est réalisée par le personnel de la plateforme qui maîtrise parfaitement le geste. Les animaux reçoivent des analgésiques (buprénorphine 0.05 mg/kg, et lidocaïne en crème 5% au niveau de la zone de la laparotomie) avant la chirurgie afin de prévenir toute souffrance. La petite laparotomie nécessaire à l’injection est suturée à l’aide de fil chirurgical résorbable, ce qui améliore considérablement le confort des animaux.
Choix des espèces
Pour acquérir les données nécessaires à la validation de nos séquences aptamères pour l’imagerie des TNE, nous avons besoin d’utiliser des modèles mimant au mieux la pathologie. Nos modèles de xénogreffes sur souris ont été validés lors d’études antérieures et sont bien caractérisés et maîtrisés. La souris est relativement proche de l’homme. De, plus l'utilisation de souris immunodéficientes facilite la prise tumorale. Toutes les xénogreffes seront réalisées sur des souris Athymic nude ou Swiss nude de 5 à 7 semaines, qui est l'âge optimal d'utilisation des souches de souris immunodéprimées et pour lequel nos modèles de xénogreffes ont été validés lors d'études antérieures.
Imagerie nucléaire par Tomographie par Emission de Positon (TEP)
- Recherche appliquée
- Diagnostic des maladies
Rats : 520
1 820 souris et rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures déclarées de gravité légère. Chaque animal reçoit sous anesthésie une injection intraveineuse de radiotraceur, suivie d'une imagerie TEP de vingt minutes à deux heures, avant mise à mort par dislocation cervicale, surdose anesthésique ou perfusion intracardiaque de fixateur. Le projet développe des candidats-imagerie et des candidats-médicaments pour diverses pathologies. Le porteur justifie le recours à l'animal par l'impossibilité réglementaire de mener ces recherches chez l'humain sain et par l'absence d'alternative.
Objectifs
Nous poursuivons 2 objectifs scientifiques et technologiques principaux: i) le développement de nouveaux candidats-imagerie afin d’améliorer la détection et le suivi des pathologie, ii) amener des candidats-médicaments aux phases précliniques de validation ce qui apporterait de nouvelles possibilités de traitements contre différentes pathologies.
Bénéfices attendus
Un des problèmes majeurs de nombreuses pathologies, parmi lesquelles les cancers, est le diagnostic tardif ce qui rend leur traitement difficile. Parallèlement à la recherche de nouveaux traitements, la recherche en imagerie médicale permet de détecter l’apparition de pathologies plus précocement, plus précisément et/ou plus spécifiquement, contribuant ainsi à un meilleur diagnostic des pathologies, à évaluer l’éligibilité des patients à une thérapie donné, et/ou à un meilleur suivi de l’évolution.
Procédures
Les animaux reçoivent, sous anesthésie une injection intraveineuse de maximum 100μL de radiotraceur (5-10MBq selon les radiotraceurs) en solution isotonique stérile et apyrogène. Le volume injecté sera expérience dépendant en fonction de l'efficacité du radiomarquage. Si des injections sont réalisées plusieurs fois sur un même animal, une période de récupération d'au minimum 48H est alors envisagée. A noter qu’une personne habilitée (partie prenante de la collaboration) à travailler avec des radioéléments sera en charge des animaux, des injections jusqu’aux manipulations pré- et post-imagerie. 0 minutes à 2 heures (selon le traceur utilisé) après injection, l’acquisition en imagerie sous caméra microTEP/CT est réalisée pour une durée de 20 à 120 minutes, sous anesthésie. La caméra est équipée d’un système de monitoring cardiaque et respiratoire ainsi que d’un système de chauffage permettant de corriger la diminution de température corporelle induite par l’anesthésie. L'animal fait l'objet d'une surveillance visuelle pendant toute la durée de l'examen. En fin de procédure l’animal est réveillé, placé dans une pièce de stabulation post-examen, chauffé, avec eau et nourriture ad libitum.
Impact sur les animaux
L’imagerie TEP est une procédure non douloureuse réalisée sur animal anesthésié. Tous les animaux seront examinées et surveillées avant, durant et après l’imagerie. Pendant l’examen, un support chauffant permet de lutter contre l’hypothermie due à l’anesthésie et la respiration est suivie. Les seules sources de stress sont l’induction anesthésique, l'injection du radiotraceur et le réveil. Le protocole sera arrêté si l’animal présente des difficultés à respirer (augmentation de la fréquence respiratoire visible au niveau des flancs), si l’animal est prostré ou en retrait, ou s’il présente une perte de poids supérieure ou égale à 20% du poids de départ. Les animaux sont suivis quotidiennement, week-end compris, pour s'assurer de leur bien-être et de l'absence de souffrance. Nous effectuerons un contrôle préalable de l’état physiologique des animaux avant de les inclure dans la procédure expérimentale.
Devenir
Les animaux ne nécessitant pas d'étude immunohistochimiques seront mis à mort à la fin de la procédure d'imagerie soit par dislocation cervical soit par surdose anesthésique. Les animaux nécessitant des études immunohistochimiques seront mis à mort à la fin de la procédure d'imagerie par perfusion intracardiaque de paraformaldéhyde sous anesthésie profonde.
Remplacement
Le recours à l’expérimentation animale se justifie par l’impossibilité réglementaire de conduire ce type de recherche chez l’homme sain, et le choix de l’espèce par le besoin d’un modèle animal déjà documenté, en l'absence d'alternative possible.
Réduction
Pour notre étude d’une durée totale de 5 ans, nous envisageons d’utiliser au maximum 1300 souris (Mus musculus) et 520 rats (Rattus norvegicus). Ce nombre total d’animaux sera déterminé au plus juste, mais il nous faudra dans le même temps disposer de suffisamment d’échantillons pour obtenir des résultats statistiquement exploitables et fiables avec des tests statistiques Paramétrique ou non (définis en fonction de la taille de l’échantillon et de l’évaluation de la normalité de la distribution).
Raffinement
Le personnel impliqué est formé et qualifié à l’expérimentation animale (niveaux 1 et 2). Les animaux seront commandés chez un fournisseur agréé et seront livrés directement à l’animalerie de CERIMED au minimum une semaine avant la première procédure expérimentale. Les animaux sont suivis quotidiennement, week-end compris, pour s'assurer de leur bien-être et de l'absence de souffrance. Nous effectuerons un contrôle préalable de l’état physiologique des animaux avant de les inclure dans la procédure expérimentale. Suivant la grille d'évaluation de la souffrance (annexe), si le score est élevé (15 à 20), la mise à mort sera réalisée sans délais. Dans ce protocole, le comportement et le poids des animaux seront observés régulièrement. En fonction des scores obtenus grâce à la grille d'évaluation de la douleur, l'analgésie sera réalisée par administration de paracétamol (200mg/kg, voie orale ou Carprofène à 20mg/kg, ou de buprénorphine voie s.c. 0.05 mg/kg)).
Choix des espèces
Les études biomédicales font appel à des modèles animaux qui visent à mimer au plus près les processus physiologiques et pathologiques rencontrés chez l’humain. Les rongeurs sont des animaux de choix à double titre : d’une part par les facilités d’élevage et de stabulation en animalerie, d’autre part en raison de l’avènement des techniques de manipulations génétiques chez la souris Les animaux seront utilisés au stade adulte, à six - huit semaines, car c’est le protocole communément utilisé dans la littérature. Après réception, les animaux sont hébergés au minimum pendant une semaine avant le début du protocole.
Etude de l’efficacité d’un vaccin contre Pseudomonas aeruginosa
- Recherche appliquée
- Troubles respiratoires
258 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour prélèvement de la rate, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à sévère, dont 120 en gravité sévère. Elles reçoivent quatre injections vaccinales, des prélèvements de sang en rétro-orbitaire, puis une inoculation de la bactérie Pseudomonas aeruginosa par voie nasale, avec un suivi clinique toutes les quatre heures. Le porteur indique que l'infection peut provoquer des douleurs élevées et présente cette étape comme "indispensable" avant le passage à l'humain. Le bénéfice annoncé se limite au déclenchement d'essais cliniques ultérieurs.
Objectifs
Le projet vise à étudier l’efficacité d’un vaccin optimisé contre Pseudomonas aeruginosa, bactérie pathogène représentant un problème de santé publique majeur. Ce projet permettra de mettre au point la preuve de concept de ce vaccin candidat en modèle pré-clinique murin. Cette étape est indispensable afin de passer aux essais sur l’homme.
Bénéfices attendus
Obtention de résultats précliniques concernant l'efficacité d'un vaccin contre Pseudomonas aeruginosa permettant de passer au déclenchement des phases cliniques suivantes.
Procédures
4 injections de doses vaccinales seront réalisées en sous-cutanée sur les animaux vigiles. 3 prélèvements de sang en rétro-orbitaire seront effectués sous brève anesthésie générale volatile. L'inoculation bactérienne sera unique par voie intranasale sous brève anesthésie générale volatile. L'état clinique des animaux sera observé sur animaux vigiles toutes les 4 heures lors du développement de l'infection. Le prélévement de la rate des animaux sera réalisé post-mortem.
Impact sur les animaux
Une douleur de niveau légère sera générée par l’injection de la dose vaccinale et de niveau modérée pour les potentiels effets de la vaccination. Des douleurs de niveau élevé pourraient résulter de l’infection induite à Pa.
Devenir
Tous les animaux sont mis à mort à la fin des expériences pour le prélèvement et l'étude de la rate.
Remplacement
Dans le cadre de ce projet scientifique, un vaccin vivant atténué a été développé et optimisé. Une souche de Pseudomonas aeruginosa (bactérie pathogène pour l’Homme) modifiée génétiquement est inactivée par un traitement photochimique de façon à empêcher sa propagation suite à la vaccination et permettant de contrôler la dose injectée. La souche conserve cependant une activité métabolique permettant de déclencher une réponse immunitaire efficace. Ce vaccin présente ainsi la sécurité d’utilisation de bactéries mortes combiné à l’efficacité d’un vaccin vivant atténué. Le vaccin a fait l’objet d’optimisations tant sur le protocole de préparation des doses vaccinales que sur l’échelle de production et la forme du produit final de celui-ci. Le remplacement n'est pas possible dans le cas de cette étude pré-clinique indispensable pour valider la sécurité d'utilisation et l'efficacité du vaccin développé. Ce projet permettra d’évaluer la réponse immunitaire complexe suite à la vaccination à l’aide d’un vaccin candidat optimisé et ensuite face à un challenge infectieux à dose létale en modèle pré-clinique murin. Cette étape est indispensable afin de passer aux essais sur l’Homme.
Réduction
Chaque groupe expérimental sera constitué d’un nombre d'animaux suffisant en adéquation avec les protocoles standards utilisés dans la littérature. Les lots d'animaux seront constitués de 6 souris répété 1 fois (2*6 souris par groupe expérimental) hormis les groupes utilisés dans l'étude préliminaire qui ne nécessitent pas d'être répétés (1*6 souris par groupe test) : nombre minimal et suffisant pour un traitement statistique approprié.
Raffinement
Les animaux seront placés en conditions SPF (« specific pathogene-free »). Les souris seront placées dans des cages standards et adéquates au niveau de la taille, de la propreté, de la température (23 +/- 2°C), du cycle lumineux (12h) et des congénères (toujours les mêmes souris ensemble dans une cage). La nourriture et la boisson sont disponibles en continu. Les animaux auront bénéficié d’une semaine d’acclimatation. Pour chaque prélèvement sanguin, les souris subiront une brève aesthésie générale. Des points limites ont été définis afin de limiter la souffrance inutile des animaux. Dans le cas où les points limites seraient atteints, l’animal sera mis à mort avant la fin de procédure pour arrêter toutes souffrances inutiles.
Choix des espèces
La souris est l’espèce la plus susceptible de fournir des résultats satisfaisants et comparables aux études précédemment publiées dans le cadre des études de l’équipe de recherche et dans cette thématique de façon plus générale. Les souris C57BL/6 sont les modèles choisies car elles sont sensibles aux infections à Pa (aiguës ou chroniques) et qu’elles sont capable de produire des taux d’anticorps élevés. Stade de développement des animaux : âgés de 6 à 8 semaines. À ce stade, les animaux auront un système immunitaire mature.
Evaluation des effets thérapeutiques d’une nano molécule immuno-modulatrice dans un modèle murin de maladie de Parkinson
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
1 020 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour prélèvement du cerveau, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère, dont 360 en gravité sévère. Elles reçoivent des injections répétées d'une neurotoxine, le MPTP, pour reproduire une maladie de Parkinson, puis un dendrimère testé comme candidat-médicament. Le porteur signale une mortalité aiguë d'environ 10 % liée à la neurotoxine et un effet néfaste sur le système cardiovasculaire. La preuve d'efficacité recherchée reste au stade de l'espoir, présentée comme une "pré-maturation" du candidat.
Objectifs
La maladie de Parkinson est le deuxième trouble neurodégénératif le plus fréquent après la maladie d'Alzheimer. Les caractéristiques cliniques comprennent des tremblements, une rigidité musculaire, une lenteur des mouvements volontaires et une instabilité posturale. Ces symptômes sont attribués principalement à un déficit en dopamine dans le cerveau. Parmi les différents systèmes dopaminergiques du système nerveux central, la voie nigro-striée ascendante a été identifiée comme la plus gravement endommagée dans la maladie de Parkinson. Plusieurs traitements sont actuellement disponibles. Ils permettent une amélioration de la qualité de vie et une diminution des symptômes. Cependant, ces médicaments ne sont efficaces que sur une partie des patients et, fondamentalement, ne permettent pas la guérison de cette maladie. Il est donc nécessaire de développer de nouvelles thérapies. A l’heure actuelle, ni la cause ni les mécanismes sous-jacents à la mort des neurones dopaminergiques nigro-striataux ne sont connus. Mais, il est maintenant communément admis que l’inflammation chronique contribue à la dégénérescence neuronale. Les cellules microgliales, macrophages résidents du système nerveux central, participent à l’instauration et au maintien de cette neuroinflammation chronique. Tout agent capable de moduler ces cellules et donc ce phénotype délétère sera un candidat-médicament de choix pour le traitement de cette maladie. Nous développons en ce moment dans le laboratoire, une molécule qui pourrait remplir cette fonction. En effet, nous avons précédemment montré que des molécules synthétiques de taille nanométrique, les dendrimères phosphorés, ont des propriétés anti-inflammatoires et immuno-modulatrices inédites. En particulier, nous avons apporté les preuves de concept in vivo du potentiel thérapeutique du dendrimère ABP dans des modèles murins de trois maladies inflammatoires chroniques : la polyarthrite rhumatoïde, la sclérose en plaques et le psoriasis. Nous avons depuis des résultats in vitro qui prouvent que ce dendrimère ABP pourrait aussi être efficace pour combattre la composante inflammatoire dans la maladie de Parkinson. L'objectif global de ce projet est donc d'évaluer le potentiel thérapeutique de ce composé dans un modèle murin de la maladie de Parkinson.
Bénéfices attendus
Au terme de ce programme de pré-maturation nous espérons apporter la preuve d’efficacité dans le modèle murin de maladie de Parkinson (modèle d’intoxication au MPTP) et valider le dendrimère ABP en tant que candidat-médicament pour combattre la maladie de Parkinson. Ainsi, nous souhaitons valider notre concept de rééducation de la microgliose réactive par le dendrimère ABP qui sera alors un candidat-médicament validé pour le traitement de la maladie de Parkinson. Pour rappel, la microgliose réactive est commune à la plupart des maladies neurodégénératives. De fait, le dendrimère ABP sera un candidat-médicament pour d’autres maladies neurodégénératives, telles que la maladie d’Alzheimer et la sclérose en plaque amyotrophique. En outre, le rôle de la microglie dans l’étiologie d’autres pathologies neurologiques telles que l’autisme et l’épilepsie étant de plus en plus décrit, l’utilisation du dendrimère ABP pourrait aussi y être envisagée.
Procédures
Interventions sur animaux : 1) Injection intrapéritonéale de la neurotoxine MPTP ou PBS sur 720 souris vigiles (durée 5 sec ; 4x toutes les 2 heures sur 1 jour) 2) Injection intraveineuse du dendrimère ABP sous anesthésie générale sur 510 souris (durée 2 min): Phase 1 (150 souris) : 50 souris recevront 1 dose du dendrimère ABP ou PBS ; 50 souris recevront 2 doses du dendrimère ABP ou PBS espacées de 3 jours ; 50 souris recevront 3 doses du dendrimère ABP ou PBS espacées de 3 jours. Phase 2 (360 souris) : Posologie préventive (180 souris) : 180 souris recevront 3 doses du dendrimère ABP ou PBS espacées de 3 jours en traitement préventif puis, 60 souris recevront 3 doses du dendrimère ABP ou PBS espacées de 3 jours ; 60 souris recevront 5 doses du dendrimère ABP ou PBS espacées de 3 jours ; 60 souris recevront 10 doses du dendrimère ABP ou PBS espacées de 3 jours. Posologie curative (180 souris) : 60 souris recevront 3 doses du dendrimère ABP ou PBS ; 60 souris recevront 5 doses du dendrimère ABP ou PBS espacées de 3 jours ; 60 souris recevront 10 doses du dendrimère ABP ou PBS espacées de 3 jours. 3) Injection intracérébroventriculaire (Intervention chirugicale stéréotaxique) du dendrimère ABP sous anesthésie générale sur 510 souris (durée 20 min) : Phase 1 (150 souris) : 50 souris recevront 1 dose du dendrimère ABP ou PBS ; 50 souris recevront 2 doses du dendrimère ABP ou PBS espacées de 3 jours ; 50 souris recevront 3 doses du dendrimère ABP ou PBS espacées de 3 jours. Phase 2 (360 souris) : Posologie préventive (180 souris) : 180 souris recevront 3 doses du dendrimère ABP ou PBS espacées de 3 jours en traitement préventif puis, 60 souris recevront 3 doses du dendrimère ABP ou PBS espacées de 3 jours ; 60 souris recevront 5 doses du dendrimère ABP ou PBS espacées de 3 jours ; 60 souris recevront 10 doses du dendrimère ABP ou PBS espacées de 3 jours. Posologie curative (180 souris) : 60 souris recevront 3 doses du dendrimère ABP ou PBS ; 60 souris recevront 5 doses du dendrimère ABP ou PBS espacées de 3 jours ; 60 souris recevront 10 doses du dendrimère ABP ou PBS espacées de 3 jours. 4) Mise à mort par perfusion intracardiaque (durée 3 min) : Toutes les souris (1020) du projet subiront cette intervention chirurgicale sous anesthésie profonde.
Impact sur les animaux
Un des effets indésirables de l’intoxication au MPTP, est la forte mortalité aiguë (pour la souche C57BL/6 de l’ordre de 10%). Les effets du composé sur le système nerveux central ne sont pas mis en cause. Par contre, il semble qu’ils soient reliés à une diminution de la température corporelle et à un effet néfaste direct sur le système cardiovasculaire. Ces effets sont visibles 24h.
Devenir
Les souris de la prodédure 1 (Génération des souris MPTP modèles de la maladie de Parkinson) sont utilisés dans les procédures 2 et 3. Ensuite, toutes les souris des procédures 2, 3 (Et donc 1) sont utilisées dans la procédure 4. Cette dernière procédure consiste à la mise à mort des animaux afin de prélever leur cerveau pour des analyses de biologie cellulaire et moléculaire. Ces analyses permettront de détailler les mécanismes cellulaires et moléculaires sous-jacents à l’effet thérapeutique du dendrimère ABP. Les animaux ne seront donc pas gardés en vie car nous allons collecter leur cerveau pour procéder les expériences suivantes : 1) Mesure de la fluorescence émise par ABP dans le cerveau pour établir la distribution de la nanoparticule dans le cerveau après injection i.v. ou i.c.v.. 2) Extraction et mise en culture de la microglie pour évaluer par cytométrie en flux leur profil pro- ou anti-inflammatoire dans le modèle MPTP suite aux injections i.v. ou i.c.v. d'ABP. 3) Immunohistochimie afin d'évaluer l'effet protecteur d'ABP sur la neurodégénérescence des cellules dopaninergiques de la substance noire. 4) Exprériences de RT-PCRq pour étudier les gènes impliqués dans le profil pro- ou anti-inflammatoire de la microglie.
Remplacement
Les animaux sont utilisés après des analyses réalisées in vitro afin de confirmer des résultats démontrés et des hypothèses formulées à partir des travaux réalisés sur cellules. A ce stade de l’expérimentation, l’utilisation de l’animal est inévitable. Actuellement aucun modèle in vitro ne permet de mimer le phénomène étudié dans son ensemble et dans sa complexité. Les études sont systématiquement optimisées (doses inhibiteurs, durée du régime) d’après la littérature ou les observations réalisées au laboratoire. De plus, les traitements sont administrés de la façon la moins invasive possible (par priorité : alimentation ou boisson/injection i.p./ injection i.v./injection i.c.v.).
Réduction
L’utilisation de l’animal est réduite au maximum et les effectifs des cohortes sont limités par l’outil statistique. Dans cette optique, nous utiliserons des groupes de 10 souris par groupe expérimental et nous répéterons les expériences 3 fois afin de rendre nos résultats exploitables. Pour chaque expérience, le maximum d’échantillons autorisés réglementairement seront prélevés sur l’animal afin d’éviter d’avoir à reproduire l’expérience par manque de tissus. Chaque fois que cela sera possible, nous analyserons un maximum de paramètres cellulaires et moléculaires sur les mêmes individus afin de limiter le nombre d’expériences in vivo.
Raffinement
Le bien-être des animaux sera suivi tout au long de nos expériences et fera l’objet de procédures strictes. Les souris seront toujours hébergées en groupes dans des cages avec une surface réglementaire, avec un libre accès à l’eau et la nourriture. Un suivi des animaux a été mis en place en accord avec le comité de suivi du bien–être animal de notre établissement pour limiter la douleur, la souffrance ou l’angoisse de l’animal. Les animaux sont hébergés dans des conditions définies par la directive européenne 2010/63/UE et auront à disposition des igloos, des bâtons à ronger et cotons pour la nidification. Les animaux sont suivis quotidiennement, permettant la détection précoce d’anomalies éventuelles. Un animal sera euthanasié s’il présente une prostration continue, une déshydratation ou une perte de poids supérieure à 20%. Des périodes d’acclimatations à l’hébergement comme à la manipulation permettront de limiter l’angoisse des animaux. La douleur liée à l’expérimentation sera limitée par l’utilisation systématique d’analgésiques. En outre, les responsables du projet ont été formés à l’utilisation des animaux à des fins scientifiques et garantissent de la formation et l’encadrement des autres expérimentateurs impliqués dans les procédures expérimentales.
Choix des espèces
Le travail de notre équipe s’inscrit dans la recherche et le développement de nouveaux médicaments pour combattre les maladies inflammatoires chroniques. Ainsi, le but de cette étude est de démontrer que le dendrimère ABP est un candidat médicament pour la maladie de Parkinson. On appelle « développement d’un médiatement », le processus de fabrication d’un nouveau médicament. Il englobe les différentes étapes (toutes essentielles), de la conception à la demande d’autorisation de mise sur le marché. L’étude préclinique est la seconde étape fondamentale de ce processus. Elle fait appel à l’expérimentation animale. Cette étape permet de définir la valeur thérapeutique potentielle d’une nouvelle molécule et d’obtenir les premiers éléments sur le comportement d’un candidat médicament (toxicité, efficacité, etc…). C’est un prérequis obligatoire pour justifier l’investigation et la première administration chez l’Homme. En effet, ces expériences in vivo ont une valeur prédictive supérieure à celles réalisées in vitro. Nous en sommes à cette étape concernant le dendrimère ABP dans la MP.L’expérimentation animale est indispensable au processus de création de nouveaux médicaments. Elle est donc rationnelle dans notre projet de développement d’une nouvelle molécule thérapeutique et elle sera réalisée en suivant les bonnes pratiques et en garantissant un traitement éthique des animaux.
Cinétique d’accumulation et d’élimination de la MC-LR libre et liée aux protéines chez la carpe après exposition répétée à une dose sublétale
- Recherche appliquée
- Toxicologie (hors obligations réglementaires)
86 carpes juvéniles vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent par leur alimentation une cyanotoxine, la microcystine-LR, pendant dix jours, suivis de vingt et un jours sans contamination, avant prélèvement post-mortem du foie et des muscles. Le porteur affirme choisir des doses inférieures au seuil létal pour éviter tout effet toxique, et présente ces données comme "indispensables" à l'évaluation du risque sanitaire. L'exposition vise à mesurer l'accumulation et l'élimination de la toxine chez un poisson parfois consommé.
Objectifs
Les cyanobactéries sont des bactéries photosynthétiques capables de coloniser des environnements très divers, qu’ils soient terrestres, marins ou dulcicoles. En eau douce, lorsque les conditions environnementales (température, nutriments, lumière, etc.) sont favorables, principalement en périodes estivales et automnales, ces organismes sont capables de proliférer rapidement, formant des « blooms », ce qui entraine des désagréments visuels et olfactifs mais peut également poser des problèmes sanitaires. En effet, certaines cyanobactéries sont productrices de toxines. Les toxines produites, appelées cyanotoxines sont susceptibles d’affecter la faune mais également l’homme via notamment une exposition alimentaire (consommation d’organismes aquatiques ou d’eau contaminée) ou récréative par le biais de la pratique d’activités nautiques (baignade, sports nautiques, etc.). Les microcystines (MC) sont les cyanotoxines les plus fréquemment rencontrées et les plus étudiées, connues pour leur toxicité. Les MC font l’objet d’une réglementation quant à leur teneur dans l’eau destinée à la consommation humaine, et de recommandations de suivi concernant leur présence dans les eaux récréatives. Les MC s’accumulent notamment chez les poissons, sous une forme libre bien étudiée, mais aussi sous une forme liée aux protéines, très peu prise en considération bien que majoritaire dans les tissus. De plus, d’autres zones d’ombre demeurent, comme les cinétiques d’accumulation des deux formes dans la chair de poisson, et le temps nécessaire de dépuration. Malheureusement, les données disponibles dans la littérature sont insuffisantes et ne permettent pas de répondre entièrement aux questions posées. Elles ont néanmoins permis de définir des fréquences de consommation de poisson à ne pas dépasser selon la contamination en MC-LR (variant de MC le plus étudié), pour les enfants et les adultes. Dans le cadre de ce projet nous avons pour objectif de déterminer la cinétique d'accumulation et d’élimination de la MC-LR chez la carpe, en conditions contrôlées. Afin de tenir compte de l’existence des MC accumulées sous forme libre ou liée aux protéines, ces deux formes seront analysées par chromatographie liquide couplée à la spectrométrie de masse en tandem (LC-MS/MS).
Bénéfices attendus
A l’issue de cette étude, nous disposerons de données en matière de cinétique d’accumulation de la MC-LR sous formes libre et liée aux protéines chez des carpes juvéniles après exposition quotidienne répétée pendant 10 jours à une dose non létale de toxine, ainsi que de données de cinétique d’élimination des deux formes de MC-LR sur une période de 21 jours. De telles données ne sont actuellement pas disponibles dans la littérature, et pourtant indispensables pour aider à l’évaluation du risque sanitaire.
Procédures
Pendant la durée de l'étude, les animaux ne seront soumis à aucune intervention, le mode d'exposition des animaux à la toxine étant l'alimentation volontaire. La toxine est mélangée pendant notre étude à des aliments pour poissons issus du commerce. Les concentrations choisies de toxines sont basées sur la littérature scientifique afin de se placer en deçà des concentrations léthales pour la carpe. Une pré-étude de 10 jours sera consacrée aux choix de la dose de MC, trois concentrations seront testés afin de choisir la concentration optimale permettant une accumulation chez l’animale sans observer de toxicité. La concentration choisie sera alors administrée par alimentation volontaire pendant une période de 10 jours suivie d’une période d’élimination de 21 jours sans contamination.
Impact sur les animaux
Le choix des concentrations utilisées durant la pré-étude (strictement en deçà de la dose léthale pour la carpe) permet d’éviter tout effet indésirable pour le poisson. Les animaux seront suivis quotidiennement et différents points limites seront suivis. Une attention particulière sera apportée à la surveillance des poissons après chaque période d’alimentation.
Devenir
L’objectif de notre étude est de pouvoir suivre l’accumulation et l’élimination des formes totales de MC chez la carpe. L’analyse des formes totales de MC nécessite de réaliser des prélèvements post-mortem des tissus (muscles, foie). Aucune autre procédure ne peut permettre d’estimer la présence de MC chez le poisson.
Remplacement
L'objectif de ce projet est d'étudier la cinétique d'accumulation et d'élimination des microcystines chez la carpe suivant une exposition par voie alimentaire. Pour ce faire, seules les expérimentations sur des organismes vivants sont susceptibles de nous permettre d’évaluer l’assimilation et l'élimination à la suite d'expositions à des doses contrôlées de toxine. Aucun autre modèle ne nous permet actuellement de remplacer leur usage.
Réduction
Dans un premier temps, notre étude nécessite de déterminer la toxicité de la microcystine-LR via une exposition par alimentation volontaire quotidienne pendant 10 jours chez des carpes juvéniles d’un été et pesant en moyenne 30g. Dans un objectif de raffinement, cette pré-étude permettra d’ajuster au mieux les doses utilisées par la suite et donc d’éviter les effets toxiques chez les poissons employés lors de l’étude cinétique tout en ayant néanmoins une accumulation suffisante chez les organismes afin de détecter et déceler les variations de microcystines chez les carpes au cours du temps d’exposition et de dépuration. A la suite de cette pré-étude, la concentration choisie sera utilisée pour le reste de la procédure. Des carpes juvéniles seront exposées pendant différents plusieurs pas de temps d'exposition (1 à 10 jours) et une période d'élimination (1 à 21 jours) sera observée. Ces durées ont été choisies pour mimer la durée des épisodes de proliférations de cyanobactéries auxquels les carpes peuvent être exposés dans leur milieu naturel.
Raffinement
Les carpes d’un été (30g en moyenne) seront placés dans des bacs de 120 litres, ces bacs présentent des parois lisses et opaques pour ne pas blesser les poissons et diminuer leur stress. L’eau des bacs sera renouvelée à hauteur de 30% chaque semaine afin de maintenir les conditions de stabulation constantes devant rester conforme aux conditions d'élevage classiques et non stressantes pour ces animaux. Chaque semaine, des tests biologiques colorimétriques permettront de s’assurer de la bonne qualité de l’eau des bacs. Des pompes seront placées dans chacun des 4 espaces de l’aquarium pour permettre une circulation de l’eau homogène dans l’ensemble de l’aquarium. Pour limiter le stress, des enrichissements tels que des tuyaux PVC et des plantes aquatiques apportent une zone refuge pour les poissons. En travaillant avec des conditions d’élevages adaptées à l’espèce employée et non stressantes et en privilégiant une méthode d'exposition non-invasive (l'alimentation volontaire), notre étude vise à limiter au maximum de manipuler ou de placer les animaux dans des conditions stressantes ou douloureuses. De plus, un suivi quotidien sera réalisé avec des points limites adaptées à l'espèce (changement de position dans la colonne d'eau ; consommation de nourriture ; apparence physique).
Choix des espèces
Les Cyprinidés dont la carpe (Cyprinus carpio) sont exposés aux cyanobactéries lors de proliférations massives par leur régime alimentaire. Ces poissons accumulent ainsi des cyanotoxines telles que la microcystine dans le foie mais également dans la chair. Or, la consommation occasionnelle de cette espèce pourrait donner lieu à un risque sanitaire. Les carpes utilisées seront au stade juvénile (un été, 30g en moyenne) dans l'objectif de minimiser la taille et le poids des individus pour faciliter l'expérimentation.
Impact de la perte d’expression de régulateurs clés du cycle de division de l’hépatocyte et de l’immunosurveillance dans la NAFLD et la carcinogenèse hépatique
- Recherche appliquée
- Troubles gastrointestinaux
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
2 132 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures de souffrance légère à modérée. Elles subissent une injection intrapéritonéale, une injection rétro-orbitale sous anesthésie et des prélèvements mensuels de sang à la queue pendant six à douze mois, pour étudier le cancer du foie et la maladie du foie gras. Le porteur reconnaît une prise de poids importante liée aux régimes imposés et une altération de l'état général due au développement tumoral attendu au foie. Il présente le modèle murin comme "indispensable", seul modèle permettant selon lui d'invalider des gènes de façon tissu-spécifique.
Objectifs
Le foie est un organe vital qui intervient dans le stockage du glucose, la fabrication de la bile et la détoxification. L'incidence du cancer du foie (CHC) est en forte augmentation depuis 20 ans et ce cancer représente la 3ème cause de mort par cancer dans le monde. Ce cancer grave dispose de très peu de traitements efficaces et l’apport de nouvelles stratégies thérapeutiques représente donc un enjeu majeur dans la prise en charge de cette maladie. Bien que des progrès aient été accomplis dans le déchiffrage des mécanismes moléculaires du CHC, la dissection des événements précoces de la carcinogenèse hépatique, notamment comprendre la transformation tumorale des hépatocytes, cellules majoritaires du foie, est centrale pour mieux comprendre le développement de ce cancer. Des études récentes ont montré que le développement du CHC était intimement lié à un contexte d’altérations au niveau génétique, métabolique et inflammatoire, qui favorise un remaniement du cycle de division de l’hépatocyte. Dans ce cadre, nos travaux visent notamment à décrypter les mécanismes cellulaires et moléculaires régulant le cycle de division des hépatocytes, pour assurer ainsi le maintien de l’intégrité du tissu hépatique. Ce projet nécessitera 2132 souris et sera mené pour une durée de 3 ans.
Bénéfices attendus
Les résultats de ce projet nous permettront de définir le rôle de STING, RhoA, ATM, ATR, DNAM-1 et LECT2, dans le contrôle prolifératif des hépatocytes, mais aussi dans la compréhension des mécanismes sous-jacents assurant l'intégrité génomique dans le foie, mécanismes faisant défaut au cours de l'hépatocarcinogenèse humaine. Ces travaux devraient conduire à élaborer chez l’Homme de nouveaux outils diagnostic/pronostic et des stratégies thérapeutiques innovantes pour ce cancer grave sans traitement effectif.
Procédures
Dans le cadre de ce projet, une injection intra-péritonéale sera réalisée (une fois, à 5 semaines de vie, durée 30 secondes ) sur animal vigile (756 animaux). Une injection rétro-orbitale sera réalisée (une fois, à 5 semaines de vie, durée : 1 minute) sur animal anesthésié (820 animaux). Un prélèvement au niveau de l'apex de la queue de l'animal sera réalisé pour une mesure de glycémie de manière mensuelle (6 répétitions, pendant 6 ou 12 mois suivant l’expérimentation, durée : 30 secondes - 1 minute) sur animal vigile (2132 animaux).
Impact sur les animaux
Dans le cadre de ce projet nous procéderons à une injection intrapéritonéale et un certain inconfort, limité dans le temps (passage de l’aiguille au travers de la peau et du péritoine) pourra être ressenti par les animaux. Par ailleurs, du fait des différents régimes alimentaires auxquels seront soumis les animaux, une prise de poids importante est attendue. Enfin, du fait d’un développement tumoral attendu au niveau du foie, les animaux pourraient être sujets à une altération de leur état général.
Devenir
Pour ce projet de recherche, des prélèvements et analyses sont nécessaires post-mortem et cela implique donc l’euthanasie (par une méthode réglementaire) de l’ensemble des animaux (2132).
Remplacement
Pour la réalisation de ce projet, l'utilisation d'animaux vivants, en l’occurrence dans notre cas le modèle murin, est indispensable car il constitue le seul modèle préclinique qui permette d’invalider ou d’induire l’expression de gènes de manière tissu-spécifique pour caractériser l’implication de ces derniers dans les mécanismes moléculaires induisant la séquence NAFLD/NASH/CHC.
Réduction
Nous estimons que pour ce projet, 2132 animaux seront étudiés. Les groupes expérimentaux sont constitués du minimum d’animaux nécessaire et suffisant pour permettre une analyse statistique robuste des effets observés. La taille des groupes a été déterminée selon nos travaux préliminaires ou basée sur l’expérience de nos études antérieures. Nous pourrons être amenés à manipuler moins de souris si l’effet observé s’avère significatif au cours des premières expériences. L’étude sera arrêtée si l’expérience initiale invalide l’hypothèse de travail. Plusieurs tissus seront prélevés et soumis à diverses analyses (immunologiques, histologiques ou de biologie cellulaire et moléculaire) pour extraire le maximum de données de chaque expérimentation.
Raffinement
Les animaux provenant de l’extérieur seront stabulés une semaine au sein de l’animalerie. Les animaux seront observés quotidiennement afin de respecter leur bien-être. Les souris seront placées dans des conditions optimales (température, hygrométrie, cycle jour-nuit 12h/12h, enrichissement des cages, nourriture ad libitum). Les manipulations seront réalisées dans le souci constant de réduire au maximum l’inconfort et la souffrance des animaux. Toute manipulation invasive (injection à l’œil) sera précédée d’une courte anesthésie générale. Le niveau d’anesthésie sera régulièrement contrôlé tout au long de la procédure par test des réflexes et de la respiration et pour prévenir d'une potentielle hypothermie les animaux seront placés sur une plaque chauffante. La mise en place d’une grille de suivi strict des points limites permettra d’éviter au maximum le stress et/ou la douleur au cours de l’expérimentation. Dans le cas où un point limite sera atteint avant la fin de l’expérimentation, la mise à mort anticipée de l’animal sera faite. Enfin une veille scientifique continue sera effectuée, évitant ainsi toute expérimentation déjà rapportée dans la littérature.
Choix des espèces
Pour la réalisation de ce projet, l'utilisation d'animaux vivants est indispensable pour déterminer les mécanismes moléculaires conduisant au CHC. Nous avons choisi la souris, car en plus de partager plus de 90% de gènes communs avec l’homme, il existe pour cette espèce des modèles génétiquement altérés pertinents pour l'étude. Les souris utilisées pour ce projet de recherche sont de jeunes adultes (5 semaines de vie) afin de disposer d'un foie largement engagé dans un état de différenciation avec un système immunitaire en fin de maturation. A ce stade, le tissu hépatique garde une capacité de prolifération en réponse à différents stimuli environnementaux, capacité essentielle notamment dans la régulation des lésions hépatiques qui prennent place dans la séquence NAFL/NASH. Une souris juvénile ou trop âgée induirait un biais dans l'expérimentation.
HTAM IL1: Etude du rôle de l’inflammasome dans l’hypertension artérielle maligne chez la souris 1/2
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
720 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des injections intrapéritonéales quotidiennes, l'implantation chirurgicale d'une mini-pompe et des séjours en cage métabolique, avant un prélèvement sanguin terminal, pour reproduire une hypertension artérielle maligne. Le porteur reconnaît de possibles atteintes du cœur, des reins et de la rétine, ainsi que des douleurs post-opératoires. Les bénéfices, identifier les patients à risque et de nouvelles cibles, sont formulés au conditionnel.
Objectifs
L’intérêt de ce projet est de comprendre pourquoi certains patients avec hypertension artérielle vont développer une forme grave de cette hypertension, appelée hypertension artérielle maligne, avec une atteinte sévère du coeur, des reins et de la rétine et du cerveau pouvant conduire à la mort des patients. Notre équipe a identifié des mécanismes pouvant expliquer cette aggravation sévère de l'hypertension artérielle et cherche à valider ces mécanismes complexes dans un modèle d'hypertension artérielle chez la souris.
Bénéfices attendus
Si notre projet confirme nos hypothèses, cela pourrait permettre d'identifier les patients hypertendus susceptibles de développer une forme grave d'hypertension artérielle maligne. Nous pourrions également identifier des marqueurs prédictifs et/ou diagnostic de l'hypertension artérielle maligne. De plus, la démonstration qu’une altération des petts vaisseaux est en cause dans certains troubles graves du rythme cardiaque pourrait ouvrir de nouvelles perspectives thérapeutiques.
Procédures
Injection intrapéritonéale quotidienne pendant 5 jours. Une procédure chirurgicale: implantation d'une mini-pompe osmotique sous-cutanée. Prélèvement urinaire en cage métabolique sur animal vigile. Prélèvement sanguin terminal sur animal anesthésié.
Impact sur les animaux
Effets indésirables liés au traitements: inconfort lié à la préhension des animaux, douleur au point d'injection, inconfort lié aux cages métaboliques. Effets de la chirurgie: douleurs post-opératoire. Effets du modèle pathologique d'HTA: potentiellemnt atteinte des organes cibles, coeur, reins et rétines
Devenir
Tous les animaux du projet seront mis à mort afin de prélever les organes et analyser les atteintes microvasculaires des organes cibles de l'hypertension artérielle.
Remplacement
Nous utilisons différentes approches pour analyser les mécanismes de l'atteinte microvasculaire liés à l'hypertension artérielle, incluant les cultures cellulaires (in vitro). En général, les expériences de remplacement ne peuvent pas reproduire la complexité des mécanismes mis en jeu au cours de l'HTA comme les interactions entre les vaisseaux et le système immunitaire. C'est pourquoi nous aurons aussi recours au modèle animal, en choisissant la souris comme modèle classique de mammifère, et comme modèle expérimental établi, avec de nombreux outils génétiques disponibles, un temps de génération court et des portées de grande taille.
Réduction
Réduction : le nombre d'animaux est calculé sur la base d’un plan expérimental stéréotypé permettant d’obtenir la puissance statistique nécessaire à l’obtention de conclusions biologiquement pertinentes. Un calcul d'effectif a été réalisé au préalable permettant d'évaluer le nombre d'animaux requis. Nous prélevons un maximum d'organes d'intérêt par animal afin de réduire le nombre d'animaux utilisés.
Raffinement
Raffinement : les animaux seront élévés en cages enrichies en coton et surveillés au cours des procédures pour repérer l’éventuelle apparition de signes cliniques pouvant indiquer une souffrance ou un mal-être. Les souris hypertendus urinent beaucoup. Pour cette raison, le nombre d'animaux par cage est limité à 3 et les cages sont changés plus fréquemment et dès que nécessaire. En cas d’apparition de signes cliniques, ou à la fin de la procédure, les animaux sont mis à mort. Les procédures chirurgicales sont réalisées sous anesthésie générale avec une analgésie péri-opératoire. Les échographies cardiaques qui sont non invasive sont réalisées sous anesthésie gazeuse.
Choix des espèces
La souris est le seul modèle permettant à la fois de réaliser des expériences de physiopathologie de mammifère et d’utiliser la recombinaison homologue ou l’excision allélique dirigée afin de connaître la fonction des produits des gènes in situ et in vivo. Souris adultes agées de 10 à 20 semaines car il faut de jeunes adultes. En effet, l'age est un facteur de risque de fibrose rénale et utiliser des souris trop agées induirait une plus grande variabilité de nos résultats expérimentaux.
Remultiplication de souches de coccidies du poulet et de la dinde
- Recherche appliquée
- Maladies animales
Dindes : 325
1 430 poulets et 325 dindes vont être utilisés, tous tués, dans des procédures classées de souffrance légère à modérée. Chaque oiseau reçoit par sonde œsophagienne une suspension de parasites coccidies, puis est mis à mort par électronarcose et exsanguination pour récupérer une génération fraîche de parasites. Le porteur reconnaît que l'objet n'est pas la recherche mais la production régulière de souches, faute selon lui de pouvoir les multiplier in vitro. Il qualifie cette remultiplication sur oiseaux d'"indispensable" et la répète environ tous les six mois.
Objectifs
Les coccidioses des volailles sont des affections très fréquentes dues à des organismes unicellulaires parasites du genre Eimeria. Elles ont des conséquences économiques et sanitaires majeures. Les coccidies se multiplient dans le tube digestif des oiseaux à l'intérieur de cellules intestinales, entraînant une baisse de l'absorption des nutriments, des diarrhées, de la prostration, et parfois de la mortalité en fonction des espèces de coccidies et des quantités de parasites ingérées. Les coccidioses sont les maladies parasitaires les plus importantes en aviculture avec un coût annuel mondial estimé à plus de 12 milliards d'euros. Dans le cadre d’études pour mieux connaître les coccidies parasites du poulet et de la dinde, et investiguer de nouvelles approches pour contrôler leur développement, il est nécessaire de produire régulièrement sur oiseaux des nouvelles générations de ces parasites pour les avoir toujours à disposition. Les oocystes (formes de résistance dans l’environnement) de ces coccidies peuvent survivre un an ou plus, mais au-delà de six mois, une proportion croissante de ces oocystes meurt, rendant impossible leur exploitation, notamment le dénombrement des formes viables et infectieuses. Or, dans nos activités, il est indispensable de maîtriser les doses infectieuses pour les essais de recherche conduits avec ces parasites. Il n’existe pas de moyen de disposer de ces parasites autrement qu’en infectant des oiseaux hôtes. Le développement sur cellules in vitro a des rendements négatifs, la cryoconservation (conservation par le froid) permet de conserver les souches, mais pas de les réutiliser rapidement et aux quantités souhaitées. Ainsi, nous devons remultiplier ces coccidies par passages sur oiseaux environ tous les six mois. Il est prévu d’entretenir par passages réguliers six espèces de coccidies du poulet et trois espèces de coccidies de la dinde qui constituent notre collection. Les oiseaux seront infectés par voie orale avec une suspension d’oocystes. Les matières fécales contenant la nouvelle génération d’oocystes excrétés et les contenus intestinaux et caecaux seront collectés entre cinq et huit jours après inoculation, en fonction des espèces de coccidies.
Bénéfices attendus
La remultiplication régulière des souches de coccidies détenues par notre laboratoire est un prérequis indispensable aux travaux en coccidiologie aviaire que nous réalisons. Elle permet de disposer de populations de parasites frais dont tous les individus sont viables et infectieux. Les quantités administrées de parasites sont ainsi maîtrisées lors d'infections expérimentales ou d'essais in vitro.
Procédures
L'administration des parasites se fera en une seule prise, par voie orale, sur animaux maintenus en contention individuellement, avec une sonde oesophagienne, sous un volume d'un mL. Cette étape dure moins de deux minutes par animal. L'intervention suivante sera la mise à mort, par électronarcose directement suivie d'exsanguination. Cette étape dure moins d'une minute par animal.
Impact sur les animaux
Les doses infectieuses pour les remultiplications sont inférieures aux doses pathogènes susceptibles d’entraîner des troubles chez les sujets, le but n’étant pas de reproduire la maladie mais seulement d’obtenir une génération fraîche de parasites. Le nombre de remultiplications est réduit à 1 par an pour les coccidies les moins utilisées, le but étant de maintenir ces souches même si une proportion des oocystes est déjà morte. Pour l’évaluation de la conservation du potentiel pathogène, seulement trois poulets seront utilisés, et les doses utilisées correspondront à un développement intermédiaire, avec des lésions typiques et une morbidité faible.
Devenir
Mise à mort de tous les animaux. Pas de réutilisation possible pour des essais avec coccidies car le système immunitaire des oiseaux a été sollicité et perturbe le développeemnt des parasites lors de réinfection. Nécessité de maintenir des souches pures, donc impossibilité de réutiliser les animaux pour d'autres remultiplications car une excrétion résiduelle des parasites peut persister longtemps (plusieurs semaines).
Remplacement
Il n’existe pas de moyen de produire ces parasites autrement qu’en infectant des oiseaux hôtes. Le développement sur cellules in vitro a des rendements négatifs, la cryoconservation permet de conserver les souches, mais pas de réutiliser rapidement et aux quantités souhaitées. Le redémarrage à partir des souches cryoconservées demande quatre à cinq passages sur oiseaux pour obtenir suffisamment de parasites, avec un délai dépassant quatre mois. Pour avoir des parasites pour nos travaux réguliers, nous sommes obligés de les multiplier régulièrement sur oiseaux.
Réduction
Le remplacement n’étant pas possible, nous avons réduit les effectifs au minimum pour pouvoir néanmoins obtenir suffisamment de parasites pour conduire les essais associés. De plus, pour les coccidies les moins étudiées, seulement un passage annuel est prévu.
Raffinement
Les installations sont équipées des raffinements et enrichissements suivants : élevage en groupes homogènes, cordelettes suspendues, rampes d’abreuvement par pipettes qui servent également de perchoirs, éclairage naturel complété par un éclairage artificiel en jours courts.
Choix des espèces
Les coccidies des volailles sont strictement inféodées aux espèces qu’elles parasitent (sauf rares exceptions). Ainsi, les coccidies du poulet (Gallus gallus) ne se développent que chez cet hôte, et les coccidies de la dinde (Meleagris gallopavo) ne se développent que chez la dinde. Il n’existe pas de modèle in vitro ou ex vivo qui permette de réaliser le cycle dans sa totalité de façon satisfaisante et susceptible de produire les quantités d’oocystes nécessaires à nos travaux. Age maximal à la fin de la remultiplication : 8 semaines, valable seulement pour E. necatrix, l’espèce la moins prolifique. Pour les cinq autres souches et les coccidies du dindon, âge maximal de six semaines. Pour E. necatrix nous utiliserons des oiseaux plus âgés que ceux utilisés pour remultiplier les autres espèces de coccidies, car cette espèce est très peu prolifique, et le rendement est meilleur si l’intestin est plus long, ce qui est le cas sur sujets plus âgés.
Caractérisation des effets antiarythmiques de peptides dans un modèle murin du syndrome du QT long de type 3.
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
184 souris vont être utilisées et toutes tuées, 160 sous anesthésie sans réveil et 24 dans des procédures de souffrance sévère. Les souris porteuses d'une mutation du canal sodique cardiaque, qui provoque des arythmies et une mortalité de 50 % dès sept semaines, sont euthanasiées à quatre semaines après un électrocardiogramme sous anesthésie, pendant lequel des peptides dérivés de venins sont testés. Le porteur reconnaît que la mutation entraîne un "phénotype dommageable" et justifie la mise à mort précoce par des raisons éthiques liées à la sévérité de la maladie. Les souris reproductrices, génétiquement modifiées, sont elles aussi tuées à quarante semaines.
Objectifs
Le syndrome du QT long (SQTL) congénital de type 3 est une maladie rare à transmission autosomique dominante due à des mutations gain-de-fonction du gène codant le canal sodique cardiaque Nav1.5. L'allongement de l'intervalle QT sur l'électrocardiogramme (ECG) est associé à un risque élevé d'arythmies cardiaques sévères pouvant conduire à des syncopes et des morts subites, le plus souvent au repos ou lors du sommeil. Ces symptômes apparaissent généralement à partir de la préadolescence, mais parfois plus tôt, ce syndrome étant suspecté d'être à l'origine d'une partie des cas de mort subite du nourrisson. Les bétabloquants, qui sont très efficaces pour prévenir les arythmies chez les patients atteints d'un SQTL de type 1 ou 2, ne montrent qu'une efficacité relative chez seulement 30-35% des patients atteints d'un SQTL de type 3. L'objectif de ce projet est de tester les effets antiarythmiques de peptides dérivés de toxines extraites de venins sur un modèle de souris porteuse de l'une des mutations identifiées chez les patients, la souris knock-in hétérozygote Scn5aWT/DelQKP1510-1512 (souris Scn5aWT/DelQKP). Ces peptides ont été sélectionnés in vitro pour leurs effets sur les deux cibles thérapeutiques potentielles identifiées lors de nos travaux antérieurs : le canal Nav1.5 lui-même, en inhibant le courant sodique persistant induit par la mutation, et le récepteur de la ryanodine de type 2, Ryr2 (canal calcique du réticulum sarcoplasmique), dont nous avons montré l'implication dans le déclenchement des arythmies in vitro sur des cardiomyocytes ventriculaires isolés de souris Scn5aWT/DelQKP.
Bénéfices attendus
Ce projet devrait permettre d'identifier : 1. au moins un inhibiteur du courant sodique persistant induit par la mutation de Nav1.5, capable de normaliser la durée de l'intervalle QT sur l'ECG et de prévenir la survenue des arythmies ventriculaires, offrant ainsi de nouvelles perspectives thérapeutiques, et 2. au moins un peptide stabilisateur de Ryr2 susceptible de prévenir la survenue des arythmies malgré l'allongement de l'intervalle QT, permettant ainsi de confirmer in vivo que Ryr2 participe effectivement au déclenchement des arythmies, et offrant là aussi une solution thérapeutique possible.
Procédures
Elevage pour l'obtention de souris Scn5aWT/delQKP, à phénotype sévère. Les souris Scn5aWT/delQKP seront euthanasiées à l'âge de 4 semaines, à l'issue d'un enregistrement de leur électrocardiogramme, limitant ainsi le risque de mort subite et d'insuffisance cardiaque, dont l'incidence augmente fortement après 4 semaines. Examen électrocardiographique. L'enregistrement d'un électrocardiogramme sera réalisé sous anesthésie en conditions contrôles et pendant l'injection de doses croissantes des peptides thérapeutique à tester. Cet examen durera 35 minutes sous anesthésie.
Impact sur les animaux
Les effets indésirables attendus sur les souris lors de la procédure expérimentale (procédure 2) mise en œuvre lors de ce projet sont leur contention et leur anesthésie par isoflurane. En effet, cette procédure consiste en l'enregistrement d'un ECG sous anesthésie avec euthanasie de l'animal en fin d'examen (classe sans réveil). En revanche, la mutation conduit à un phénotype dommageable, puisqu'elle entraine des arythmies ventriculaires plus ou moins sévères chez les souris porteuses qui conduisent, à partir de 4 semaines à une forte mortalité : 50% de mortalité à l'âge de 7 semaines. Les souris qui ont peu ou pas d'arythmies (seulement un allongement de l'intervalle QT) survivent jusqu'à l'âge adulte mais développent une hypertrophie myocardique conduisant à terme à une insuffisance cardiaque. Pour limiter les conséquences de ce phénotype sur le bien-être des animaux, deux décisions ont été prises : (1) pour l'entretien de la lignée (procédure 1), nous n'utilisons pas de souris porteuses de la mutation (voir paragraphe 5.10.3), et (2) notre étude sera réalisée à l'âge de 4 semaines, avant la survenue des premiers décès.
Devenir
Tous les souriceaux Scn5aWT/delQKP et contrôles inclus dans l'étude seront euthanasiés à l'âge de 4 semaines à la fin de la procédure 2 pour des raisons éthiques compte-tenu de la sévérité du phénotype cardiaque au delà de cet âge. Les souriceaux surnuméraires des portées seront également euthanasiés à 4 semaines à l'exception des souriceaux Scn5aWT/Neo-delQKP et Flp qui seront conservés pour renouveler les souris utilisées pour la reproduction. Les souris reproductrices sont euthanasiées à l'âge de 40 semaines et remplacées, dans la mesure où elles sont génétiquement modifiées et ne peuvent être utilisées pour d'autres études.
Remplacement
Cette étude est focalisée sur un modèle de pathologie cardiaque qui nécessite une exploration fonctionnelle in vivo. Seule l'expérimentation animale peut permettre de déterminer si le traitement testé présente un intérêt clinique en normalisant la durée de l'intervalle QT à l'ECG et/ou en prévenant les arythmies. Les peptides qui seront testés chez la souris ont été sélectionnés pour leurs effets sur nos deux cibles thérapeutiques à l'issue d'un screening réalisé sur des lignées cellulaires, réduisant ainsi le recours au modèle animal.
Réduction
Un maximum de 20 souris (10 souris sauvages et 10 souris mutées) par peptide nous semble nécessaire pour réaliser une étude statistique fiable. Toutefois, cette étude s'étalant dans le temps dans la mesure où l'on ne peut escompter qu'un maximum de 2 souris mutées par portée, une première analyse statistique sera réalisée après inclusion de 16 animaux (8 souris sauvages et 8 souris mutées). Si les effets observés sont statistiquement significatifs, les souris supplémentaires ne seront pas incluses, réduisant ainsi le nombre de portées nécessaires. Les effets des molécules le rythme sinusal, la conduction de l'influx électrique cardiaque et la repolarisation ventriculaire seront évalués par analyse de variance à une voie pour mesures répétées, complétée par un test de Tukey pour comparaisons multiples. Les effets des molécules sur la survenue des arythmies ventriculaires sera évaluée avec un test de Fisher.
Raffinement
Les souris seront hébergées en cages ventilées enrichies de tunnels pour se camoufler, ou de papier pour fabriquer des nids. L'enregistrement de l'ECG sera réalisé sous anesthésie. Comme mentionné précédemment, la mutation conduit à un phénotype dommageable, puisqu'elle entraine des arythmies ventriculaires plus ou moins sévères chez les souris porteuses qui conduisent, à partir de 4 semaines à une forte mortalité : 50% de mortalité à l'âge de 7 semaines. Les souris qui ont peu ou pas d'arythmies (seulement un allongement de l'intervalle QT) survivent jusqu'à l'âge adulte mais développent une hypertrophie myocardique conduisant à terme à une insuffisance cardiaque. Nous avons donc choisi de ne pas conserver de souris mutées au-delà de l'âge de 4 semaines. Les souris mutées sont obtenues par croisement de souris porteuses de la cassette de recombinaison FRT-neomycin-FRT-delQKP (souris Scn5aWT/Neo-delQKP), qui n'expriment pas la mutation, avec des souris exprimant la flipase, permettant ainsi l'excision de la cassette neomycin et l'expression de la mutation chez 25% des souriceaux résultant de ces croisements. Les souris Scn5aWT/Neo-delQKP et les souris flipase n'ont pas de phénotype dommageable.
Choix des espèces
La souris est actuellement la seule espèce dans laquelle une mutation responsable de SQTL3 a été introduite. C'est un bon modèle de cette pathologie humaine, avec cependant une sévérité plus importante des arythmies par rapport aux patients. L'étude sera réalisée sur des souris de 4 semaines pour deux raisons. La première est scientifique : chez l'humain, les symptômes de la maladie étudiée apparaissent très tôt, avant l'âge adulte, ce qui est d'ailleurs observé sur le modèle de souris. La seconde raison est d'ordre éthique : au-delà de 4 semaines, la mortalité des souris mutées devient très élevée.
Transfert de gènes par voie intraveineuse et intracérébrale chez la souris saine : screening des nouveaux vecteurs AAVs optimisés pour la transduction du CNS
- Recherche appliquée
- Maladies animales
- Troubles nerveux
194 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger pour 104 d'entre elles et sévère pour 90. Elles reçoivent des injections stéréotaxiques dans le cerveau sous anesthésie et des injections intraveineuses de vecteurs AAV, pour comparer des voies d'administration en thérapie génique des maladies neurodégénératives. Le porteur évoque une possible perte de poids et prévoit l'euthanasie des animaux dont l'état ne s'améliore pas. Il affirme que le recours aux souris est "essentiel", aucune culture cellulaire ne reproduisant selon lui la complexité du cerveau.
Objectifs
Malgré d’importants efforts de recherche, il n’existe encore aujourd’hui aucun traitement capable de combattre de façon efficace la progression des maladies neurodégénératives, une préoccupation croissante en santé publique. Des nouvelles approches thérapeutiques sont essentielles pour progresser dans la prise en charge des patients. Parmi ces nouvelles approches prometteuses se trouvent la thérapie génique. Les vecteurs adéno-associés (AAV) sont administrés dans le cerveau pour tester de nouvelles stratégies thérapeutiques dans des maladies neurodégénératives. La modulation du métabolisme du cholestérol est une cible thérapeutique intéressante. Le bénéfice thérapeutique de la modulation du métabolisme du cholestérol par surexpression d'une enzyme clé du metabolisme du cholesterol cérebrale appelée CYP46A1, a été prouvé dans plusieurs études récentes. En effet, cette approche a été démontrée comme efficace dans les modèles murins de la maladie d’Alzheimer, de Huntington et enfin les Ataxies. Ces preuves de concepts ont été établies par injections intracérébrales de vecteurs AAV (AAV codant pour la protéine agissant sur le metablolisme du cholesterol, comme la proteine CYP46A1). Cependant, dans l’optique d’une application clinique chez l’Homme, l’administration intracérébrale peut induire des risques additionnels dans un cerveau déjà en dégénérescence et atrophié par la maladie. L’objectif de ce projet est donc de valider l’efficacité thérapeutique de l’administration par voie intraveineuse de vecteurs AAV modifiés de façon à passer la barrière hématoencéphalique, étant ainsi capable d’amener une transduction plus homogène dans le cerveau. Ceci avec le but de prévenir une approche invasive d'injection intracérébrale remplacée par une injection intraveineuse.
Bénéfices attendus
Le but de ce projet est de valider l’efficacité thérapeutique de l’administration intraveineuse de vecteurs AAV codant pour des protéines différentes : CYP46A1, et/ou aussi des gènes rapporteurs comme la GFP et/ou aussi la luciférase. Le but final est de trouver un traitement efficace et de le valider chez la souris, en utilisant un mode d’administration le moins invasif possible, afin de pouvoir l’appliquer chez l’Homme et plus précisément chez les patients atteints de maladies neurodégénératives
Procédures
deux procédures : 1. Injections stéréotaxiques sous anesthésie générale (durée 70min), animal endormi, avec une prise en charge analgésique afin d'eviter la douleur, par l'administration d'analgesique avant et après la chirurgie. 2. injections intraveineuses sous anesthésie générale (durée 5min), animal endormi.
Impact sur les animaux
Une perte de poids dû à l'injection de AAV pourrait être observé (5 à 7% du poids totale), bien que les concentrations des AAVs utilisées ont déjà été évaluées in vitro et dans nos précédentes études afin d'éviter toute toxicité chez la souris. Si ces effets seront observés, des actions seront menées par les expérimentateurs. L’animal sera euthanasié si les actions menées ne permettent pas d'améliorer son état.
Devenir
- Procédure 1 et procédure 2 : mise à mort, Les souris seront euthanasiées 3-8 semaines après les injections de la procedure 1 ou 2 ( le temps d'expression des AAVs etudiés) - pour les differentes etudes biocellulaires et biomoleculaires
Remplacement
Remplacement: Le recours aux modèles animaux est essentiel, car aucun type de culture cellulaire ou système synthétique ne permet à ce jour de reproduire la complexité architecturale des cellules du cerveau en particulier leurs interactions structurelles et fonctionnelles. De plus, nous avons déjà utilisé des souris sauvages pour mettre au point des protocoles. Les animaux utilisés dans le cadre de ce projet sont nés et élevés en captivité dans des élevages agrées.
Réduction
Réduction: Le nombre d’animaux utilisés est optimisé pour obtenir des résultats statistiques. Leur nombre (194) a été restreint au minimum indispensable de façon à obtenir des données nécessaires pour valider l’efficacité d’une stratégie thérapeutique innovante qui peut être considérée comme cible dans plusieurs maladies neurodégénératives. En effet, des travaux précédents ont permis d’établir les doses de vecteurs à injecter et les temps d'analyses.
Raffinement
Raffinement: Les protocoles d’anesthésie et d’analgésie ont été définis et validés par une équipe vétérinaire. L’application de critères d’arrêts standards en élevage/utilisation, et le suivi quotidien des animaux hébergés en groupe certifient le bien-être des animaux. De plus, en cas d’observation de la moindre douleur, les souris recevront un traitement analgésique et anti-inflammatoire, et si cette douleur devait persister, les animaux seraient euthanasiés pour éviter toute souffrance.
Choix des espèces
L’objectif de ce projet est d’évaluer et de comparer des sérotypes d’AAV modifiées et donc améliorer l’expression des transgènes, étape importante pour maximiser l’effet d’un traitement dans une future thérapie génique après injection d’un AAV exprimant des gènes thérapeutiques dans la structure cible. Nous commencerons par valider nos vecteurs dans des souris saines avant son utilisation future chez la souris modèle. Les souris qui seront utilisées sont des souris adultes (4-8 semaines), dans lesquelles nous avons déjà optimisé les coordonnés d’injection dans le cerveau. Ce protocole a déjà été validé dans notre laboratoire. Les animaux sont identifiés par tatouage après une semaine d’acclimatations.
Optimisation chez le rat (Rattus norvegicus) du produit d’intérêt FTP-101 dans le traitement des maladies de la contraction musculaire
- Recherche appliquée
- Troubles musculosquelettiques
654 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures classées de souffrance légère. Ils reçoivent une injection intramusculaire d'un myorelaxant candidat, puis sont soumis au test du "digit abduction score", où l'animal, tenu par le torse, est lâché en chute simulée pour observer l'écartement de ses doigts de pied. Le porteur décrit ce test comme "bref, indolore et peu stressant" et annonce des retombées pour les patients atteints de dystonie ou de spasticité. Il indique avoir tenté de réutiliser les animaux lors d'un projet précédent sans succès, ce qui le conduit à tous les tuer.
Objectifs
Nous démontrerons les bénéfices de nos produits face aux produits de référence utilisé en clinique. Ce projet expérimental d’optimisation concerne le produit d’intérêt FTP-101 identifié suite à nos travaux exploratoires. Cette étude a pour objectif d’optimiser les paramètres d’utilisation du candidat Lead (en particulier la formulation et la cinétique d’injection). Dans cette étude, le produit sera injecté localement aux rats, dans les membres postérieurs pour un suivi du « digit abduction score » (DAS). Cette procédure (injection et test DAS) est brève, indolore, et peu stressante pour les animaux. Notre produit sera comparé au traitement actuel de référence. La voie de développement choisie (d’abord la formulation, la dose, la cinétique d’injection puis la vérification de stabilité de la molécule) pour ce Lead suivra le même principe que celle utilisée pour le Lead FTP-501 à travers différentes demandes d’autorisation de projets (déjà validées par le CEEA)
Bénéfices attendus
Les troubles du mouvement sont des maladies neuromusculaires, qui handicapent durablement les patients et ont donc un impact sociétal important. La dystonie, par exemple, est un trouble qui se caractérise par des contractions musculaires involontaires, pouvant entrainer des mouvements répétitifs ou des postures figées. La spasticité musculaire, quant à elle, est considérée comme une sur-contraction inhabituelle et involontaire du ou des muscles. Ce trouble du système nerveux central résulte en une crispation et une rigidité accrue du muscle touché. Le traitement de ces maladies implique généralement la prescription de traitements administrés oralement : le baclofène, les benzodiazépines, le dantrolène… Ces traitements systémiques comportent cependant tous des effets secondaires conséquents. Alternativement, l’injection intramusculaire de certains produits directement dans le muscle affecté peut soulager ces malades : le phénol ou la toxine botulique. Cette approche présente des avantages devant celles présentées précédemment, notamment concernant les effets secondaires. Cette approche doit encore être optimisée : les patients et soignants attendent des myorelaxants offrant encore moins d’effets secondaires, capables d’être efficaces rapidement après l’injection, et dont les effets seraient durables. L’objectif de notre projet global est de mettre en évidence les effets bénéfiques de l’utilisation locale de différents produits myorelaxants novateurs à effet rapide et durable, sur la contraction musculaire pour les patients souffrant de troubles du mouvement comme la dystonie et la spasticité. Au cours d’une étude princeps, nous avons pu identifier au moins 5 produits présentant une activité myorelaxante d’intérêt ; ensuite, grâce aux différents projets déposés, nous avons avancé notre premier Lead (FTP-501) quasiment au terme de son développement préclinique. Chacun des produits identifiés au cours de l’étude princeps semble avoir des caractéristiques pharmacologiques différentes : certains induisent une myorelaxation très rapide (le cas de FTP-101 ici), et d’autres offrent un effet durable par exemple (le cas du premier Lead FTP-501). Or, selon la maladie neuromusculaire, le besoin clinique est différent, et donc chaque caractéristique est plus ou moins critique. Nous visons ainsi le développement de plusieurs produits, car nous envisageons la possibilité de positionner chacun des produits finaux pour le traitement de différentes maladies neuromusculaires.
Procédures
Les rats seront soumis à l’évaluation du digit abduction score (DAS) après injection intramusculaire des composés. Le DAS correspond à l’évaluation après injection, pour chaque animal, de la capacité à écarter leurs doigts de pied lorsque l’animal est soumis à une simulation de chute (ce reflexe est déclenché pour amortir un choc de réception). Le rat est maintenu par le torse par l’expérimentateur. L’expérimentateur lève alors le bras en l’air (le rat ayant sa face ventrale faisant face au sol), et le redescend relativement rapidement, pour simuler une chute ; il arrête bien sûr son geste avant le contact avec le support (par exemple, la paillasse). L’expérimentateur tourne alors l’animal afin d’observer les doigts de la patte postérieure, attribuant un score. Les degrés de DAS seront enregistrés sur une échelle allant de 0 à 4 (Voir schéma en annexe). La réponse DAS sera mesurée à 5, 15, 30 minutes, 1, 2,4, 8 et 24 heures après injection puis toutes les 24 heures tant qu’un DAS>0 est mesuré.
Impact sur les animaux
Dans le cadre de cette procédure, aucun signe clinique ni effets secondaires n’est attendu ici suite à l’injection des composés, d’après nos résultats obtenus dans l’étude princeps et la littérature. En effet lors de notre précédent projet, aucun signe clinique de type infection ou inflammation suite à l’injection n’a été observé. Dans le cadre de nos procédures, les nuisances attendus sont : le stress des animaux dû à la contention pour l’injection et le test du DAS ; une douleur à liée à l’injection i.m. Il est important de noter qu’une étude histo-pathologique sur la toxicité locale suite à une injection i.m. de notre composé a été préalablement réalisée et a permis de vérifier que notre composé ne modifie en rien la structure musculaire et qu’aucune lésion n’est présente.
Devenir
Tous les animaux des différentes procédures seront euthanasiés. En effet, il n’est malheureusement pas possible de les réutiliser dans une nouvelle série d’expériences. Nous avons testé cette possibilité lors du premier projet (APAFiS 18558), malheureusement sans succès. Il est possible que les animaux ayant subi une série d’expériences (suivi d’une période de repos) se soient accoutumés au test DAS, et répondent différemment des animaux naïfs ; le poids plus important des animaux ré-utilisés peut également impacter négativement la réponse au test DAS.
Remplacement
Le remplacement ne peut pas être assuré dans cette étape du programme de travail, car la pertinence des modèles cellulaires de coculture est aujourd’hui encore débattue, et de tels modèles ne prennent de toute façon pas en compte le paramètre de diffusion (qui est essentiel lorsqu’on s’intéresse au profil pharmacodynamique des composés). Le test DAS nous permet au contraire de mesurer l’activité myorelaxante tout en prenant en compte ce paramètre.
Réduction
Pour la réduction, les études précédemment réalisées nous ont donné un certain recul sur la taille des groupes nécessaire pour obtenir des résultats statistiquement significatifs (test de kruskal wallis); Nous utiliserons donc le nombre minimal d’animaux par groupe permettant d’arriver à une conclusion. Soit 6 animaux par groupe.
Raffinement
Concernant le raffinement, les animaux seront hébergés en groupe de 2 avec enrichissement du milieu, et surveillés quotidiennement permettant un suivi clinique de chaque animal. Ainsi, des points limites sont mis en place durant tout ce projet permettant de définir des critères d’arrêt si nécessaire . Nos études précédentes nous ont permis un raffinement du modèle DAS chez le rat : l’injection intramusculaire dans le membre inférieur est réalisée sous contention par un expérimentateur entraîné, et les mesures de DAS sont brèves, indolores et peu stressantes pour les animaux. Au cours de cette étude, nous souhaitons continuer à limiter au maximum le stress des animaux.
Choix des espèces
La comparaison de la rapidité d’action entre notre molécule et les traitements sur le marché ne pourra se faire que sur un modèle : i) exprimant les cibles moléculaires d’intérêt à la jonction neuromusculaire, et ii) dans lequel il existe une limite de diffusion dans les tissus. En effet, la cinétique des molécules après injection intra-musculaire est fortement dépendante de la capacité à diffuser dans le muscle, un tissu très compartimenté comportant plusieurs membranes internes. Or, bien qu’il existe des modèles in vitro qui permettent d’étudier la jonction neuromusculaire, la pertinence de ces modèles pour mimer la fonctionnalité de la jonction est débattue, et ils ne récapitulent pas les problématiques de diffusion qui se jouent in vivo. Le test DAS chez le rongeur, déjà éprouvé lors de notre étude princeps, est au contraire un test reconnu pour sa pertinence pour étudier les myorelaxants. Rats femelles Sprague Dawley femelles âgées de 6 semaines en début d’expérimentation (200g) et 10-12 semaines maximum en fin d’expérimentation (300g). Des animaux juvéniles seront choisis pour leur capacité à exhiber un réflexe lors des tests DAS. Les animaux âgés peuvent effectivement répondre de manière moins spontanée aux stimulations. Ils sont également plus légers, donc plus facile à stimuler
Utilisation des lymphocytes T γδ comme thérapie cellulaire pour le traitement de l’infection au cytomégalovirus.
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
120 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal subit une chirurgie d'implantation de cellules dans la rate puis une injection intraveineuse de cellules immunitaires humaines, avant dissection de la rate, pour tester une thérapie cellulaire contre le cytomégalovirus. Le porteur signale de possibles douleurs post-opératoires, prises en charge par un antalgique. Il qualifie ce modèle d'"indispensable" pour prédire l'efficacité chez les patients, faute de méthode in vitro jugée suffisamment prédictive.
Objectifs
L’infection au cytomégalovirus humain est l’infection virale la plus fréquente et dangereuse chez les patients recevant des greffes. En effet le système immunitaire de ces patients est diminué, et il n’est plus capable d’éliminer le virus. Pour lutter contre le cytomégalovirus, les stratégies de vaccination n’ont pas montré d’efficacité convaincante jusqu’à présent. De nouveaux traitements sont donc envisagés, notamment l’injection de cellules immunitaires aux patients, capables de reconnaitre le virus et de l’éliminer. On parle alors de thérapie cellulaire. Nous avons mis au point une thérapie cellulaire permettant de contrôler efficacement l’infection par le cytomégalovirus humain dans des modèles in vitro. Néanmoins, pour pouvoir évaluer cette thérapie en essai clinique chez les patients, il faut au préalable démontrer son efficacité préclinique in vivo. L’objectif de ce projet est donc d’utiliser un modèle in vivo d’infection au cytomégalovirus humain chez des souris. Ce modèle permettra d’évaluer la capacité des cellules immunitaires injectées aux souris à éliminer définitivement l’infection virale. Le nombre minimal d’animaux nécessaire à la démonstration sera utilisé, et leur bonne santé sera évaluée tout au long de l’expérimentation, selon la législation actuelle. Ce projet est justifié par l’absence de méthodes alternatives suffisamment prédictives de l’efficacité de cette thérapie chez les patients.
Bénéfices attendus
Ce projet constituera la première évaluation préclinique de l’efficacité de cette thérapie cellulaire. Cette démonstration in vivo est obligatoire afin de proposer ensuite cette thérapie cellulaire à des patients transplantés présentant une infection au cytomégalovirus humain. Si les résultats obtenus dans ce modèle préclinique sont probants, on s’attend à des bénéfices sur le long terme en phases cliniques et plus généralement à un fort bénéfice futur pour la prise en charge de ces patients.
Procédures
Les animaux seront soumis à une unique chirurgie permettant l’implantation de cellules dans leur rate (animaux anesthésiés, durée de 10min) et en suivant à une unique injection intraveineuse de cellules immunitaires (animaux anesthésiés).
Impact sur les animaux
La chirurgie réalisée dans ce projet est bien tolérée par les animaux qui se réveillent rapidement sans effets secondaires majeurs. Cependant, un inconfort ou des douleurs post-opératoires sont possibles, qui seront prises en charge par traitement antalgique.
Devenir
A l'issue de la procédure expérimentale, toutes les souris concernées par ce projet (120 souris) devront être euthanasiées pour permettre la dissection de leur rate, et ainsi l'étude de l’efficacité de la thérapie cellulaire.
Remplacement
Des méthodes d’analyse in vitro ont déjà été mises en place pour ce projet et ont donné des résultats probants sur l’efficacité de la thérapie cellulaire. Cependant l’utilisation de ce modèle animal préclinique est indispensable pour prédire l’efficacité de la thérapie chez les patients, et répondre à plusieurs questions ne pouvant être élucidées in silico et in vitro.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés dans cette étude a été défini d’un point de vue statistique afin de réduire leur nombre au maximum. Nous avons en effet déterminé par des tests statistiques qu’un lot de 10 souris par groupe est nécessaire afin d’obtenir des données statistiquement exploitables.
Raffinement
Le bien-être de nos animaux sera pris en compte dès leur naissance jusqu’à leur mort. Ils seront hébergés en cage collective avec enrichissement de leur environnement et application de points limites précoces adaptés à ce protocole. Ces points limites nous permettront de prendre les décisions qui s’imposent face à la souffrance ou l’inconfort de nos animaux.
Choix des espèces
Les souris NSG qui seront utilisées pour cette étude présentent une forte immunodépression. Cela permettra le transfert cellules humaines, sans que celles-ci ne soient rejetés par le système immunitaire de la souris receveuse. Les souris seront incluses dans le protocole expérimental à l’âge adulte de 8 à 10 semaines.