Procédures légères

Pour remplacer une injection sous-cutanée par un anticorps anti-TNF avalé, 821 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue. 422 subissent des procédures d'un niveau de souffrance léger, 399 d'un niveau modéré. 160 d'entre elles ingèrent pendant cinq jours du DSS, un produit qui enflamme l'intestin, et 146 le reçoivent trois fois à dix jours d'intervalle, dont 82 avec six semaines de gavage quotidien. Le porteur indique que cette inflammation provoque douleur modérée, stress et diarrhée, suivis par une grille de score qui déclenche la mise à mort quand un point limite est atteint.

Objectifs

Les maladies inflammatoires chroniques de l’intestin (MICI), regroupant principalement la maladie de Crohn et la rectocolite hémorragique, touchent plus de 10millions de personnes dans le monde, 3 millions de personnes en Europe et environ 300000 personnes en France. Les MICIs sont un groupe de troubles inflammatoires affectant le tube digestif. Les 2 principales MICIs sont : - la maladie de Crohn qui affectant toutes les partie du tractus gastro-intestinal, de la bouche à l'anus, le plus souvent la partie terminale de l'intestin grêle et le côlon. - la rectocolite hémorragique (RCH) qui se limite principalement au côlon et au rectum. Les symptômes communs aux MICIs incluent des douleurs abdominales, diarrhées (souvent sanglantes), fatigue, pertes de poids, et parfois des complications extragastro-intestinales, comme des atteintes articulaires, de la peau, des yeux… Les causes exactes des MICIs sont mal comprises, on pense qu'elles résultent d'une interaction complexe entre des facteurs génétiques, environnementaux et immunologiques. Le traitement vise généralement à contrôler l'inflammation, à soulager les symptômes. Les MICIs n’ont pas encore de traitement curatif, mais il existe des biothérapies et la chirurgie. Parmi les biothérapies, il y a les anti-TNF comme l’Adalimumab qui bloque une protéine responsable de l’inflammation, le facteur de nécrose tumorale (TNF). En inhibant cette protéine, l'Adalimumab réduit l'inflammation et les douleurs. Il est administré par injection sous-cutanée. L’adalimumab est un anticorps monoclonal humain de type IgG. Nous avons créé un anticorps de type sIgA avec les mêmes régions variables, c’est-à-dire celles permettant de reconnaitre les mêmes épitopes (cibles) que l’Adalimumab. La sIgA (immunoglobuline A sécrétoire) joue un rôle clé dans l'immunité des muqueuses. Elle est présente dans les sécrétions comme la salive, les larmes, le mucus respiratoire, le lait maternel et les sécrétions intestinales. Le but du projet est d’obtenir un nouvel anticorps de type sIgA ciblant le TNFα et ayant un effet supérieur ou au minimum équivalent à l’Adalimumab. Cet anticorps pourra être administré par voie oral ce qui facilite la vie quotidienne des patients, diminue la toxicité du produit et donc les effets secondaires. Cette molécule pourra aussi servir de traitement pour certaines maladies inflammatoires ou lors d’arthrite rhumatoïde.

Bénéfices attendus

Cet anticorps pourra être administré par voie orale ce qui facilite la vie quotidienne des patients, diminue la toxicité du produit et donc les effets secondaires. Cette molécule pourra aussi servir de traitement pour certaines maladies inflammatoires ou lors d’arthrite rhumatoïde.

Procédures

Tous les animaux vont avoir un prélèment de tissus au niveau de la queue sous anesthésie gazeuse ce qui va entrainer un léger stress de quelques minutes. Elles seront bouclées lors de cette anesthésie.15 souris vont avoir une injection par voie intra-veineuse et 2 prélèvements sanguin sous mandibulaire sous anesthésie gazeuse le même jour. 25 souris vont avoir une injection sous-cutanée, 30 auront une administration par voie orale (gavage). Ces 75 souris auront ensuite une injection par voie intra-veineuse et un prélèvement sanguin sous mandibulaire sous anesthésie gazeuse le même jour. 160 souris vont ingérer du DSS pendant 5 jours. Parmi ces animaux, 7 auront une seule injection en sous-cutanée, 25 auront de 2 à 6 injections en sous-cutanée. Ensuite 82 souris auront un gavage pendant 7 jours. Les autres n’auront pas de traitement. Pour finir, 146 souris vont ingérer 3 fois du DSS pendant 5 jours, espacé de 10 jours. Puis 32 auront 1 à 6 injection sous-cutanée et 82 autres auront 6 semaines de gavage. Les injections par voie intra-veineuse, en sous-cutanée, les gavages et le prélèvement de sang vont entrainer un stress de quelques minutes à chaque manipulation.

Impact sur les animaux

Les injections par intra-veineuse ou en sous-cutanée n’entraineront pas de douleur supérieure à celle d’une piqure d’aiguille. Elles entraineront un léger stress de quelques secondes pour les injections en sous-cutanées et de quelques minutes pour les injections intra-veineuse (contention dans un tube spécifique). L’ingestion du DSS va induire une inflammation de l’intestin qui peut entraîner une douleur modérée, du stress, de la diarrhée, durant le traitement et quelques jours après, et qui seront étroitement surveillés grâce à une grille de score des points limites. Dans la littérature, il n'y a pas de perte de poids durant les 4-5 premiers jours de taitement et le DSS dans l'eau de boisson n'impacte pas la quantité ingérée par les animaux.

Devenir

Après le traitement, chaque cohorte sera mise à mort à un temps donné afin de prélever les organes (colon, rate, sang) pour observer la longueur du colo, la taille de la rate... En parallèle, des analyses permettront d’observer les populations immunitaires recrutées au niveau de l'inflammation permettant de valider l’action des anticorps médicaments.

Remplacement

Des tests in vitro ont été au préalable effectués afin d’évaluer le potentiel thérapeutique de notre traitement cependant le recours à des techniques totalement in vitro ou sur organes isolés est impossible car la complexité de l’environnement cellulaire est primordial et la voie d’administration de notre molécule est primordial sur la biodistribution. En effet, les différents traitements testés ont besoin de l’environnement cellulaire afin d’être efficaces car ils engendrent des mécanismes cellulaires (par exemple, le recrutement des cellules du système immunitaire muqueux ou le trafic sanguin et lymphatique). Enfin, ces techniques in vivo nous permettent de vérifier l’accessibilité de notre traitement à la zone de l’inflammation.

Réduction

Afin de tester ces différentes conditions de manière fiable, il faut un nombre suffisant d’animaux afin d’obtenir des résultats robustes nous permettant de passer à des études pré-cliniques réglementaires puis cliniques chez l’Homme. Les doses et conditions testées ont été longuement réfléchies afin de réduire au maximum le nombre d’animaux nécessaire. Une approche statistique a aussi été étudiée afin d'obtenir un nombre suffissant de données permettant de valider l'étude expérimentale avec le nombre minimal d'animaux nécessaire.

Raffinement

Afin de limiter le stress des animaux, une période minimale de 5 jours d'acclimations à la zone d'hébergement expérimentale sera effectuée. Ils seront également progressivement manipulés régulièrement lors du change et des surveillances afin de les habituer aux contentions et autres manipulations. Toutes les manipulations et expérimentations seront effectué par du personnel qualifié. Les animaux seront surveillés strictement tout au long de l'expérimentation grâce à la grille de score permettant de détecter tous signes de souffrance et pouvoir évaluer si un point limite est atteint.

Choix des espèces

L’espèce a été choisie pour son temps de gestation court, de plus, cette espèce est utilisée à des fins scientifiques internationalement et possède un système immunitaire proche de celui de l’Homme. Les animaux utilisés auront entre 2 et 8 mois afin d'avoir un système immunitaire non défaillant.

Apprendre à implanter des cellules cancéreuses dans l'organe d'origine et à injecter dans une tumeur : la finalité de ce projet est l'entraînement de manipulateurs, pas la production de connaissances. 360 souris vont être utilisées sur cinq ans, 60 dans des procédures d'un niveau de souffrance léger et 300 d'un niveau modéré, toutes tuées à l'issue puis autopsiées pour vérifier que la tumeur a pris. Chaque apprenant dispose d'environ cinq souris par geste, opérées trente à quarante minutes sous anesthésie, avec jusqu'à trois injections intratumorales sur animal vigile. Le porteur reconnaît que l'implantation peut provoquer des métastases dans le péritoine ou le cerveau, tout en affirmant que les signes cliniques ne devraient pas apparaître, et qualifie d'"indispensable" l'apprentissage sur animal vivant.

Objectifs

L’objectif de ce projet est de former de nouveaux expérimentateurs aux gestes techniques indispensables à la maîtrise d’une chirurgie avec l’implantation de cellules tumorales dans différents organes pour le développement de différents modèles de cancer orthotopique (Les modèles orthotopiques de cancer impliquent l'inoculation directe de cellules cancéreuses dans l'organe d'origine, permettant une meilleure récapitulation de la progression de la maladie et du microenvironnement tumoral). De plus, l’injection intra-tumorale dans une tumeur implantée en sous-cutanée sera également apprise. Ce projet permettra également le tutorat de ces gestes en l’absence d’études afin de maintenir ces différentes compétences à jour pour les expérimentateurs n’ayant eu l’opportunité de pratiquer régulièrement ces gestes. Ce projet s’inscrit dans le cadre de l’arrêté du 1er février 2013 relatif à l'acquisition et à la validation des compétences des personnels des établissements utilisateurs d'animaux utilisés à des fins scientifiques. Notre objectif est de former les utilisateurs aux gestes techniques pour assurer le bien-être des animaux, garantir la bonne exécution de ces procédures et la qualité des études menées ensuite dans le cadre de projets de recherche. Toutes les personnes concernées par ce projet (tuteurs et apprenants) sont titulaires d’un diplôme d’expérimentation animale et ont suivi une formation obligatoire en chirurgie expérimentale sur rongeurs. Les animaux utilisés dans le cadre de ces formations seront autant que possible des animaux surnuméraires (en provenance de fournisseurs agréer ou des élevages interne) et/ou des animaux exclus d’un autre projet approuvé (ex : animaux n’ayant pas développés de tumeur ou d’une taille non satisfaisante...). Le but étant de ne pas avoir recours à des animaux supplémentaires.

Bénéfices attendus

La formation pratique des utilisateurs est indispensable et indissociable du bien-être animal. Seule la maitrise des gestes techniques assure que la finalité d’un projet ait été assurée sans remettre en cause le bien-être de l’animal. L’apprentissage des gestes est réalisé avec un tuteur technique dont la parfaite maitrise du geste et la pédagogie est reconnue par ses pères et la structure du bien-être animal de l'EU. La formation continue au sein de l'EU permet de maintenir une veille des pratiques expérimentales et des évolutions éthiques tout en assurant un haut niveau d’excellence des pratiques et des compétences des utilisateurs.

Procédures

Dans ce projet les animaux seront soumis aux interventions suivantes : Procédures chirurgicales sous anesthésie et analgésie pour induction d’un modèle de cancer adapté pour la formation (durée d’environ 30 à 40 minutes). Injection intra-tumorale sur animal vigile, maximum 3 injections pour une durée de 1 minutes (avec la contention)

Impact sur les animaux

La contention sur des animaux vigiles peut générer un stress, les animaux seront manipulés et déposés en douceur dans leur cage après chaque geste. L’acte chirurgical peut induire une hémorragie et le recourt aux anesthésies peut poser des problèmes cardio-respiratoires et entrainer la mort de l’animal. Du fait de l’injection orthotopique des cellules tumorales, la croissance tumorale ne sera pas visible et peut engendrer des métastases dans le péritoine (insuffisance hépatique, ascites, …) et/ou dans le cerveau (désorientation) suivant le modèle tumoral. Notre expérience antérieure de ces modèles tumoraux et du tutorat de ces derniers montre que les signes cliniques liés aux tumeurs ne devraient pas être observés puisque le contrôle de la bonne implantation tumorale se fera en amont de leur apparition.

Devenir

Dans le cadre de la formation, tous les animaux sont mis à mort à l'issue de chaque procédure. Pour les procédures de chirurgie, les animaux seront autopsiés pour vérifier la présence de tumeur.

Remplacement

La formation aux gestes techniques en expérimentation animale ne peut être réalisée que sur animal vivant ayant toutes ces capacités à s’échapper, manifester ou sanctionner tout signe de mal être et d’inconfort. Afin de garantir la maitrise et l’excellence de nos expérimentateurs, il est indispensable que l’apprenant puisse apprendre et répéter le/les gestes utiles autant de fois que nécessaire jusqu’à ce que sa compétence puisse être reconnue et validée par le tuteur. L’apprentissage à l’aide de moulage d’animaux ne peut être utilisé puisque la validation du geste se fera par une prise tumorale visible. L’utilisation de vidéos servira à expliquer le principe de chaque geste, les attentes et les difficultés afin de rendre la pratique plus sereine et respectueuse des animaux. Ces alternatives ne peuvent cependant pas produire les réactions d’un animal vivant pour l’entraînement aux techniques de chirurgie. Pour réaliser ce projet, nous utiliserons la souris, puisque c’est l’espèce animale concernée par ces procédures. L’apprentissage de l’injection intra-tumorale sera effectué autant que possible sur des animaux exclus d’autres projets, sous le contrôle permanent et assidu du tuteur.

Réduction

La formation aux nouveaux gestes ainsi que le maintien des compétences s'inscrivent dans la réglementation mais aussi permet de diminuer l'impact de la variabilité inter expérimentateur. Le nombre d'animaux par procédure sera estimé par le tuteur, en fonction du niveau des apprenants et du ou des gestes réalisés, sous le contrôle de la SBEA. De fait, notre expérience montre qu’un nombre moyen de 5 animaux par apprenant et par procédure d’implantation orthotopique et qu’un nombre moyen de 5 animaux par apprenant pour l’injection intra-tumorale est réaliste pour un maximum de 360 souris sur 5 ans. L’apprentissage pour l’injection intra-tumorale sera effectué autant que possible sur des animaux exclus d’autres projets. Aucune analyse statistique ne sera réalisée dans le cadre de la formation.

Raffinement

La formation est réalisée avec pour objectif de garantir le bien-être de l’animal et réduire au maximum l’inconfort, le stress et la souffrance. Durant l’étude in vivo, nous portons une attention particulière au bien-être de l’animal. Les animaux sont hébergés en groupes sociaux afin de réduire le stress et un enrichissement du milieu (coton ou papier kraft, tunnel de change et bâtonnets à ronger) est prévu dans chaque cage. Les animaux sont toujours manipulés en douceur. Une période d’acclimatation et une période d’habituation aux gestes sont respectées avant de démarrer un protocole pour que les animaux puissent s’habituer à leur nouvel environnement et ainsi, diminuer le stress lié au transport et à la manipulation. Les injections intra-tumorales s’effectueront sur animal vigile. Lors de la chirurgie, les animaux seront sous anesthésies locale et générale et sous analgésie. L’analgésie sera poursuivie 24h après la chirurgie. Afin d’éviter une hypothermie due à l’anesthésie, l’animal est placé sur un tapis chauffant de son endormissement à son réveil. Des points limites, permettant l'arrêt de la procédure avant un impact sur le bien-être animal, ont été établis dans le but de soustraire l’animal à toute souffrance. Aucune conséquence de l'implantation des cellules ne sera visible sur l'état physiologique de l'animal.

Choix des espèces

La souris est l’espèce présente au sein de notre établissement utilisateur. Le choix est donc dicté par la nécessité de former les manipulateurs pour l’espèce concernée pour les différentes études menées dans l’établissement. Souhaitant utiliser des animaux exclues des études pour l’injection intra-tumorale, l’âge des animaux n’est pas défini à l’avance. Pour les objectifs scientifiques des futures études dans des modèles orthotopiques, nous utiliserons des animaux âgés entre 7 et 10 semaines lors de l’injection des cellules tumorales.

Capturées à la pêche électrique, au carrelet ou à la nasse dans deux marais, 2 120 anguilles européennes sauvages vont être anesthésiées par balnéation puis relâchées à l'endroit exact de leur capture, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Deux mille reçoivent une puce électronique en trois minutes, et 120 subissent une incision d'un centimètre refermée par deux points de suture pour recevoir en plus une marque acoustique. L'espèce est classée en danger critique d'extinction, et le projet vise à mesurer combien d'individus parviennent à quitter les marais malgré les ouvrages hydrauliques, pour ajuster la pêche et la gestion des vannes. Le porteur écrit qu'aucun modèle numérique ne peut remplacer ce travail faute de données existantes, et se dit "très confiant" sur l'absence d'effets létaux au vu des marquages précédents.

Objectifs

Le projet s’intéresse à l’anguille européenne, une espèce de poisson migratrice classée en danger critique d’extinction par l’Union Internationale pour la Conservation de la Nature (UICN). Le projet a deux objectifs, le premier est de caractériser la population des anguilles européennes Anguilla anguilla, aux stades jaunes et argentées, de deux marais. Le second est d’évaluer la proportion d’anguilles argentées qui arrive à quitter les marais pour rejoindre leur site de reproduction avec identification des voies migratoires de l’espèce face aux nombreux ouvrages hydrauliques présents dans la zone.

Bénéfices attendus

L’anguille européenne étant une espèce en danger critique d’extinction, il est important de pouvoir réaliser une évaluation des populations dans différents milieux et de voir quelle proportion de cette population participe à la reproduction et donc au maintien de l’espèce. Les résultats de l’étude permettront d’adapter la gestion locale des anguilles européennes, soit par un meilleur contrôle de l’activité de pêche, soit par l’amélioration de l’utilisation des ouvrages hydrauliques se situant sur les voies de migration préférentielles de l’espèce. Dans les deux cas, l’objectif de gestion sera d’augmenter la proportion d’individus participant à la reproduction pour ainsi améliorer le statut de l’espèce.

Procédures

Ce projet comprend deux types de procédures pour répondre aux deux objectifs du projet. La première procédure, d’une durée totale de 3 minutes,comprend l’insertion unique d’une puce électronique de type « Passive integrated Transponder » (PIT), qui se fait sous anesthésie générale réalisée en balnéation, mais ne nécessitant pas de réaliser une incision ni une suture. Le marquage PIT nous permettra d’identifier les poissons qui seraient recapturé par les pêcheurs des marais étudiés et ainsi obtenir une estimation des taux de captures et de l’abondance de l’espèce dans ces environnements par la méthode de capture marquage recapture. L’objectif est de marquer 2000 individus > 20 cm sous cette procédure. La seconde procédure, d’une durée totale de 5 minutes,est une procédure chirurgicale avec insertion de deux marques : une marque acoustique et un PIT. Cette procédurenécessite une incision d’environ 1 cm et 2 points de suture. Les marques acoustiques émettent un signal ultrasonique régulièrement ce qui permet de suivre le déplacement des individus marqués dans un rayon compris entre 20 m et 500m selon les conditions locales de bruits et de turbidité, et ainsi estimer le taux d’échappement des anguilles argentées. L’objectif est de marquer 120 individus avec cette procédure. Les deux procédures se feront sous anesthésie générale par balnéation. Les deux marques sont encapsulées dans une coque moulée en résine epoxy inaltérable et biotolérée afin de n’avoir aucune incidence sur le bien-être du poisson pendant toute la durée de leur vie, ce qui dans le cas des anguilles argentées sera de 3 ou 4 ans après la date du marquage car les individus meurent après leur reproduction. Tous les individus seront mesurés et pesés avant marquage afin de de ne pas dépasser la charge des marques à 2% du poids du poisson et ainsi ne pas impacter sa capacité de nage.

Impact sur les animaux

Comme toutes expériences en écologie comportementale, le stress lors des captures doit être pris en compte. Pour cela, seuls des pêches électriques et carrelets et nasses seront utilisés pour la capture des anguilles. Ces engins sont des pièges et non des filets, et disposent d’un volume assez conséquent dans lequel les poissons sont piégés. De plus, ces pièges sont relevés quotidiennement afin de réduire le stress d’une captivité prolongée. Malgré les précautions prises, un problème lors de l’insertion chirurgicale est toujours à envisager. Mais l’expérience de l’équipe et la robustesse des anguilles européennes nous amène à être très confiants sur l’absence d’effets létaux ou délétères lors du marquage. Sur les marquages précédents, aucune mortalité à court terme (48h) n’a jamais été observée. De plus, des tests d’effet ont déjà été réalisés sur les anguilles et n’ont jamais montré aucune mortalité ni effet délétère. Le marquage chirurgical sera réalisé sous anesthésie générale et un analgésique local sera injecté par prévention de toute douleur. Après le marquage, l’individu est placé dans un bac de réveil pendant 1 heure au maximum.

Devenir

Tous les animaux marqués seront replacés dans leur milieu naturel, à l'endroit de leurs captures.

Remplacement

Les données sur la population des anguilles européennes Anguilla anguilla et leurs voies migratoires n’existent pas encore dans les marais étudiés. Il n’est donc pas possible de remplacer ce modèle écologique par des modèles numériques et/ou physique et/ou de l’analyse de données existantes

Réduction

Le nombre d’individus marqués en PIT (N = 2000) est statistiquement suffisant pour estimer l’abondance de la population par capture marquage et recapture. Le nombre d’individus marqués en acoustique (N = 120) a été pensé de manière à minimiser fortement le nombre d’animaux utilisé. Nous prévoyons de marquer 60 individus en 2025 et 60 individus en 2026, ce qui correspond à la limite statistique pour ce suivi.

Raffinement

Plusieurs mesures ont été mises en place afin de limiter la souffrance et le stress des individus lors des captures et des marquages. La capture se fera avec les engins les plus adaptés pour limiter les blessures, ainsi que leur stress. Les engins de pêche seront relevés tous les jours afin de limiter le temps de captivité. La pose de marque télémétrique et PIT s’effectuera sous anesthésie générale en balnéation, avec entretien par flux continu et ajustement si nécessaire de manière à maintenir la stabilité de l’anesthésie tout au long de l’intervention. Avant incision, un analgésique sera injecté localement pour prévenir toute douleur pendant et après la procédure. Après marquage, les animaux seront placés en réveil dans un bac d’eau oxygénée jusqu’à dissipation totale des effets de l’anesthésiant et récupération complète avant relâche dans le milieu naturel à l’endroit de la capture. Les points limites seront atteints si une détresse post-opératoire est observé (altération du comportement de nage, réactions violentes, ou au contraire absence de reprise d’activité normale).

Choix des espèces

L’anguille européenne est une espèce animale en danger critique d’extinction. Toutes les mesures visant à améliorer le statut de l’espèce, comme l’augmentation du nombre de géniteurs présents sur le site unique de reproduction sont essentielles. L’étude portera sur plusieurs stades de vie des anguilles européennes : les stades anguilles jaunes et argentées. Nous souhaitons dans un premier temps déterminer l’abondance d’anguilles jaunes pour connaitre la capacité des marais étudiés à produire des anguilles argentées. Dans un second temps, l’étude se focalisera sur le stade anguilles argentées, afin d’étudier leurs possibilités de rejoindre le milieu marin pour leur reproduction, leurs voies migratoires. Le but de l’étude étant d’améliorer la gestion des ouvrages hydrauliques si cela s’avèrerai nécessaire.

Tuées à la fin du protocole pour que leurs muscles tibiaux antérieurs soient prélevés, sans réutilisation ni adoption possibles, 42 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Un virus est injecté dans les muscles des deux pattes arrière sous anesthésie, puis les animaux courent sur tapis roulant cinq jours par semaine pendant quatre semaines, trente minutes à une heure par séance. Le porteur précise qu'un animal peut être "stimulé légèrement et brièvement" pour le motiver à courir, et compare les lésions musculaires attendues à des crampes et des courbatures humaines. Il affirme que les cellules musculaires cultivées in vitro n'ont pas de jonction entre muscle et tendon, ce qui rend selon lui l'animal "nécessaire" pour cette question.

Objectifs

Nos muscles sont reliés aux tendons à des endroits particuliers appelés jonctions myotendineuses, qui permettent de transmettre la force quand nous bougeons. Ces zones sont particulièrement sollicitées pendant l’exercice et sont souvent les premières à subir des lésions provoquant des blessures. Bien que l’on sache qu’elles s’adaptent à l’exercice, on ne comprend pas bien comment cela se passe à l’intérieur des cellules musculaires. Ce projet vise à étudier quels types de protéines sont fabriqués spécifiquement au niveau de cette jonction, à la fois au repos et après un effort physique. Pour cela, nous utiliserons une méthode permettant de visualiser la machinerie responsable de la fabrication des protéines, ce qui nous permettra de voir ce qui est activement produit au niveau de cette jonction entre le muscle et le tendon. Cela nous aidera à mieux comprendre comment les muscles restent en bonne santé, se réparent et ce qui peut mal fonctionner en cas de maladie.

Bénéfices attendus

Ce projet va nous aider à mieux comprendre le fonctionnement d’une partie essentielle du muscle, la jonction entre le muscle et le tendon et comment elle s’adapte à l’exercice. Comme cette zone est souvent sujette aux blessures, notamment lors d’une activité physique ou avec l’âge, comprendre ce qui s’y passe au niveau des protéines pourrait permettre de mieux la protéger. À long terme, cette recherche pourrait améliorer la récupération après des blessures musculaires, guider les stratégies de rééducation, et même contribuer au développement de traitements contre certaines maladies musculaires ou le déclin musculaire lié à l’âge. Elle pourrait aussi nous aider à garder des muscles plus forts et en meilleure santé en vieillissant.

Procédures

1. Injection d’analgésique et d’anesthésique : Il s'agit de 2 injections très rapides espacées d'environ 15 à 20 min. Une injection ne dure que quelques secondes et l'intervention sur chaque souris ne prendra qu'une minute par injection. 2. Injection de virus adéno-associés sous anesthésie générale : Il s’agit d’une intervention très rapide, de l’ordre de 30 sec. 3. Le programme d’exercice est réalisé une fois par jour, 5 fois par semaine pendant 4 semaines. Il comprend 3 jours de 15 à 20 min de course d’habituation sur tapis roulant suivi de 17 jours de courses de 30 min à 1 h maximum à raison de 5 jours d’exercice/semaine. L’animal pourra être stimulé légèrement et brièvement pour le motiver à courir.

Impact sur les animaux

Nos souris ont un élément marqué génétiquement dans leur cellule qui nous permet de l’extraire facilement. Ce marquage ne provoquer aucun effet indésirable. Les virus adéno-associé (AAV) que nous utilisons sont de petit virus à ADN, qui peuvent infecter localement les muscles de nos souris, mais qui ne provoquent pas de maladie. Ainsi, ce projet n’entraîne aucune nuisance sur les animaux, mises à part celles liés aux injections d'AAV et à l’exercice d’endurance. Les lésions musculaires causées par la voie d’administration peuvent causer quelques difficultés motrices légères la semaine suivant les injections. L’exercice d’endurance est un exercice de 30 min à 1h maximum répété 5 jours/semaines pendant 4 semaines, sauf les 3 premiers jours où l’exercice dure 15 à 20 min (habituation) ce qui induit de légères lésions musculaires pouvant provoquer comme chez l’homme des crampes et des courbatures.

Devenir

Pour parvenir à des conclusions scientifiques solides avec le nombre minimal d'animaux, les 42 souris qui seront utilisés pour ce projet seront mises à mort à la fin des procédures pour collecter les muscles tibiaux antérieurs. Par conséquent, nous ne réutiliserons pas, ne remplaçons pas et ne ferons pas adopter les animaux.

Remplacement

Bien qu’il soit possible de différencier des cellules musculaires in vitro, celles-ci ne possèdent pas de jonction myotendineuse et restent immatures. Par conséquent, cet aspect de la biologie musculaire ne peut pas être étudié de manière pertinente à l’aide de modèles en culture cellulaire. L’utilisation de l’animal reste nécessaire pour cette application.

Réduction

Nous commencerons par valider notre stratégie expérimentale avec 3 animaux du même sexe, dans un souci de réduction du nombre d’animaux, pour réaliser 2 tests soit 6 animaux, puis nous utiliserons des mâles et des femelles dans des proportions équivalentes dans les cohortes suivantes et les données obtenus seront analysés séparément en utilisant les tests statistiques appropriés. Nous réaliserons ensuite les expériences sur muscle entier et sur la jonction myotendineuse entre le muscle et le tendon (JMT) au repos, afin de confirmer que nous pouvons détecter des événements traductionnels spécifiques à cette jonction. Ce n’est qu’après cette expérience sur muscles au repos que nous passerons à l’expérience sur muscles et sur la jonction après exercice. Nous injecterons également le même muscle des deux membres postérieurs afin de réduire davantage le nombre de souris nécessaires. Nous avons déterminé que 6 animaux par groupe (3 mâles et 3 femelles) seront nécessaires afin d’obtenir une robustesse statistique.

Raffinement

Les injections d'AAV seront réalisées sous anesthésie générale afin d’éviter tout mouvement et toute gêne ou souffrance qui pourrait en résulter et un analgésique sera également administré pour réduire la douleur. Après injections les animaux seront réchauffés sur une plaque maintenue à 37°C jusqu'à leur réveil et nous appliquerons un gel pour éviter toute sécheresse oculaire puis nous les remettrons dans leur cage où nous les surveillerons quotidiennement pendant la première semaine puis 2 à 3 fois par semaine les semaines suivantes jusqu’à la fin de la procédure. Le suivi comprend l’observation du comportement général (apathie, yeux fermés, perte de poids flagrante visible à l’œil nu), l’interaction avec les congénères, les déplacements (boiterie, problèmes pour bouger les membres postérieurs). Un tunnel et un carré de cellulose seront placés dans chaque cage. Le tunnel sera utilisé pour tous les déplacements d’animaux. Ces mesures permettront de réduire le niveau de stress des animaux. Au cours de notre projet, tout signe de douleur sera pris en charge par des mesures appropriées en fonction du niveau, ou par la mise à mort prématurée des animaux concernés en cas d’atteinte de point limite. Si les souris ont des difficultés à manger de la nourriture solide (croquettes) ou à accéder au biberon, de la nourriture en gel sera placée dans le fond de la cage.  Nous n’attendons pas de douleur supérieure à une douleur légère de type inconfort d’un ou plusieurs membres ou légère boiterie, de façon passagère, après les injections ou juste après 5 jours d’exercice physique, comparable à des crampes et des courbatures chez l’homme.

Choix des espèces

Les techniques de modifications génétiques que nous utiliserons ont toutes été développées et validées dans le système murin. Par conséquent, la souris constitue le modèle le plus approprié pour ce projet. Nous injecterons les souris à partir de l’âge de 10 semaines, lorsque le développement musculaire est achevé et que les animaux ont atteint le stade adulte.

894 souris vont être utilisées, chacune pouvant recevoir jusqu'à quarante gavages, douze à vingt-quatre séances d'imagerie sous anesthésie et douze injections, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Un virus déposé dans leur trachée active un gène qui déclenche un cancer du poumon, pendant qu'un régime riche en graisses et en sucres leur fait prendre du poids sur plusieurs mois. Le porteur indique que les grosses tumeurs peuvent bloquer les voies respiratoires et provoquer des complications sévères, et que la maladie mène parfois à la cachexie. Les bénéfices annoncés vont de nouvelles cibles thérapeutiques à des "arguments scientifiques solides" pour des politiques de santé publique, tous renvoyés au moyen et au long terme, quand les 894 souris sont toutes tuées à l'issue pour le prélèvement de leurs poumons, rate, pancréas, foie et ganglions.

Objectifs

Ce projet cherche à comprendre comment le syndrome métabolique, une maladie fréquente liée au surpoids et à une alimentation riche en graisses et en sucres, peut favoriser le développement du cancer du poumon et influencer la réponse aux traitements. Le syndrome métabolique associe souvent obésité abdominale, excès de graisses dans le sang, hypertension et résistance à l’insuline. Sa fréquence est en forte augmentation dans la population mondiale. De nombreuses études montrent que les personnes atteintes de syndrome métabolique ont un risque plus élevé de développer un cancer, en particulier lorsqu’elles présentent aussi une mutation du gène KRAS, très souvent retrouvée dans les cancers du poumon. Cependant, on ne connaît pas encore précisément les mécanismes par lesquels ce trouble métabolique induit la maladie ou l’aggrave. Pour répondre à ces questions, nous devons utiliser l’animal. La souris permet de reproduire fidèlement les effets du régime alimentaire occidental sur le métabolisme, l’immunité et le développement du cancer. Aucun autre modèle (culture cellulaire, informatique) ne peut à ce jour recréer l’ensemble des interactions entre organes et le système immunitaire. Nous analyserons les différentes étapes du développement tumoral et testerons des traitements déjà utilisés contre le diabète et l’obésité, afin de savoir s’ils peuvent aussi limiter la progression du cancer du poumon. À terme, ce projet vise à mieux prévenir les cancers liés au mode de vie et à améliorer la prise en charge précoce des patients les plus à risque, en réduisant l’impact négatif du syndrome métabolique.

Bénéfices attendus

À court terme, ce projet permettra de mieux comprendre comment le syndrome métabolique, lié à une alimentation riche en graisses et en sucres, influence le système immunitaire et favorise l’apparition de lésions précancéreuses dans le poumon. Ces connaissances sont indispensables pour identifier les mécanismes par lesquels le surpoids et les troubles métaboliques augmentent le risque de cancer du poumon. À moyen terme, ce projet pourra conduire à l’identification de nouvelles cibles thérapeutiques pour les personnes à risque de développer un cancer du poumon du fait de leurs maladies concomittantes, en particulier lorsque ces dernières sont difficiles à corriger par des mesures de mode de vie seules. À plus long terme, grâce aux nouvelles connaissances générées, ce projet fournira des arguments scientifiques solides pour soutenir les politiques de santé publique visant à réduire l’impact du syndrome métabolique sur la santé. Les résultats pourront ainsi contribuer à la mise en place de stratégies de prévention plus efficaces et à une meilleure protection de la population face au risque accru de cancer.

Procédures

Prélèvements sanguins : réalisés sur souris éveillée par petite ponction à la queue, maximum deux fois pendant l’étude, anesthésie locale, durée 2 minutes. Administration dans la trachée : dépôt d’un petit volume de solution contenant un virus inoffensif servant à activer un gène, via un petit tube souple, sous anesthésie générale (n=1,durée 1 minute). • Imagerie médicale : réalisée sous anesthésie générale, durée 4 minutes, n=12-24. • Gavage oral : administration de traitements à l’aide d’un petit tube souple introduit dans la bouche, limité en fréquence pour réduire le stress, durée 1 minute,vigile, n maximum = 40. • Injections sous anesthésie locale, n max=12, durée 1 minute. Dans certains cas, pour récupération d'organes exploitables pour des analyses post-mortem, une chirurgie terminale de perfusion intracardiaque pourra être mise en oeuvre, durée 5 minutes, n=1.

Impact sur les animaux

Certaines interventions peuvent provoquer un inconfort temporaire : • Le régime riche en graisses et sucres entraîne une prise de poids, et peut entraîner une baisse d’activité et parfois des difficultés respiratoires modérées. • Les anesthésies peuvent causer une somnolence brève ou, rarement, des complications respiratoires. • L’administration dans la trachée peut provoquer un essoufflement transitoire. • Le scanner sous anesthésie peut provoquer une légère hypothermie, transitoire. • Le gavage oral et les injections peuvent causer un inconfort momentané au point d’entrée • Les traitements testés peuvent parfois entraîner une perte de poids modérée, de la diarrhée ou une baisse temporaire de l’appétit. • Le développement de lésions pulmonaires précancéreuses ou de petites tumeurs peut, dans certains cas, provoquer un essoufflement ou une fatigue. • Dans le cas de tumeurs pulmonaires de tailles plus importantes, les voies respiratoires peuvent se bloquer entrainant des complications plus sévères. • L’évolution de la maladie entraine parfois une cachexie (perte de la masse graisseuse et musculaire).

Devenir

Tous les animaux utilisés dans ce projet seront euthanasiés à la fin des procédures. pour prélèvement de tissus multiples (poumons, rate, pancréas, tissus adipeux, ganglions lymphatiques, foie) pour des études histologiques, immunologiques et moléculaires.

Remplacement

L'utilisation de modèles animaux vivants est indispensable dans ce projet en raison de la nature systémique du syndrome métabolique (MetS), qui affecte simultanément plusieurs organes et le système immunitaire. À ce jour, aucun modèle in silico ne permet de reproduire fidèlement les interactions complexes inter-organes, dont l'identification précise constitue justement l'un des objectifs majeurs de notre projet. Par ailleurs, les méthodes alternatives in vitro telles que les cultures cellulaires classiques, les organoïdes ou les organes sur puce sont insuffisantes pour étudier les effets systémiques globaux du MetS. Ces modèles in vitro ne peuvent pas reproduire intégralement l'environnement physiologique, les interactions intercellulaires et la réponse immunitaire globale observée chez un organisme entier. Ainsi, l'utilisation d'animaux vivants est incontournable pour appréhender pleinement les mécanismes complexes du MetS et leur impact sur la progression tumorale dans le contexte de ce projet.

Réduction

Le nombre total d’animaux utilisés pour obtenir un résultat est calculé à partir de méthodes statistiques afin d’obtenir des résultats fiables avec le moins d’animaux possible. Ces estimations sont possibles grace aux connaissances du modèle utilisé par l'équipe. Les procédures sont conçues pour permettre plusieurs analyses sur un même animal, évitant ainsi de répéter inutilement les expériences.

Raffinement

L' état de santé des animaux sera évalué quotidiennement par l'équipe de recherche, et les points limites prédéfinis précoces seront appliqués strictement. Pour limiter les biais liés à l’activité physique ou à la prise de poids, tous les groupes auront libre accès à des jouets pour rongeurs. L'utilisation d’aiguilles fines pour les injections, ainsi que de sondes souples pour les gavages, permettra de limiter la douleur et l’inconfort. Toutes les procédures nécessitant une contention prolongée ou potentiellement douloureuses seront effectuées sous anesthésie générale ou locale, selon les cas. En cas de perte de poids liée à la charge tumorale, de signes de souffrance ou d'altération du comportement, des mesures de soutien seront immédiatement mises en place (nourriture appétente, gels de réhydratation). Enfin, toutes les méthodes utilisées dans ce projet sont validées et optimisées pour minimiser le stress, la douleur et l’impact global sur l’animal, conformément au principe de raffinement.

Choix des espèces

Nous utilisons la souris car c’est l’espèce la plus adaptée pour ce type de recherche. Son organisme réagit de façon similaire à celui de l’être humain en ce qui concerne le métabolisme, le fonctionnement du système immunitaire et le développement du cancer du poumon. Des modèles bien établis existent déjà pour reproduire l’obésité, le diabète de type 2 et leurs effets sur l’immunité. Les animaux en procédure seront des adultes ayant un système immunitaire mature et une physiologie métabolique stable.

Tuées à l'issue pour prélèvements, ou parce que leur modification génétique interdit toute réutilisation et tout replacement, 900 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Un fragment de tissu est prélevé sur chaque souriceau vigile pour établir son génotype, et une partie des animaux reçoit pendant un à cinq jours une molécule activant une mutation. Le porteur indique que les tumeurs cérébrales attendues peuvent entraîner un déficit moteur et des crises d'épilepsie, et que l'administration de la molécule expose les mères à la perte de leurs petits. Les souris sont suivies de la naissance jusqu'à douze mois, le temps que les méningiomes apparaissent, et le porteur affirme que le modèle mammifère est le "seul moyen" d'identifier la cellule d'origine de ces tumeurs.

Objectifs

Les méningiomes se développent dans les méninges, les trois membranes qui entourent le cerveau et la moelle épinière. Ils représentent les tumeurs les plus fréquentes du système nerveux central de l’adulte. Bien que la majorité des méningiomes puisse être traitée par la chirurgie, une fraction non négligeable est soit inaccessible à la chirurgie, soit présente une histoire naturelle plus proche des cancers, marquée par une agressivité clinique et histologique. Pour ces tumeurs, aucune alternative à la chirurgie n’existe à l’heure actuelle. Le présent projet propose la création de nouveaux modèles de souris génétiquement modifiées de méningiomes en vue d’une meilleure compréhension de l’origine des méningiomes bénins ou malins.

Bénéfices attendus

En permettant l’identification de la cellule d’origine des méningiomes, ce projet pourrait permettre de mieux comprendre la tumorigenèse méningée bénigne et maligne mais également contribuer à une meilleure connaissance de l’anatomie des méninges. Par ailleurs, si les résultats s’avèrent concluants cela pourrait permettre d’utiliser ces nouveaux modèles animaux plus représentatifs de la maladie dans de futures études pré-cliniques. Ceci permettant donc d’obtenir une meilleure translation des résultats obtenus lors d’évaluation de nouvelles thérapies à ce que l’on pourrait attendre chez l’humain. A plus long terme, ces connaissances pourraient permettre de contribuer à l’amélioration de la prise en charge des patients atteints de méningiomes.

Procédures

Afin de connaitre leur patrimoine génétique un prélèvement d’un petit fragment de tissu sera prélevé chez tous les souriceaux (durée inférieure à 1 minute, une fois, animal vigile). Une molécule sera administrée à une partie des animaux vigiles, pour activer une mutation génétique d’intérêt (1 fois par jour pendant 1 à 5 jours maximum, durée inférieure à 1 minute par administration). Tous les animaux seront euthanasiés par une méthode réglementaire.

Impact sur les animaux

L’administration de la molécule pour activer la mutation génétique génèrera une brève et légère douleur au point d’injection, ou un inconfort lors de l’administration orale, et un risque de perte des petits pour les mères concernées. Si les animaux génétiquement modifiés générés et dont la mutation aura été induite par injection d’une molécule développent bien des tumeurs cérébrales, leur apparition pourra engendrer un possible déficit moteur, et, ou, de possibles crise d’épilepsie. Le prélèvement de tissu pour connaitre le patrimoine génétique des animaux induira une brève et légère douleur et un risque de léger saignement.

Devenir

Les animaux seront euthanasiés en fin de procédure afin de réaliser des prélèvements d’intérêt pour répondre à notre question scientifique, ou parce qu’ils ne pourront pas être réutilisés ou replacés en raison de leur modification génétique spécifique.

Remplacement

Les modèles in vitro et sur animaux invertébrés permettent l'obtention de méningiomes. Ces modèles ont toutefois des limites notamment leur inadéquation en pré-clinique pour des études thérapeutiques et l’impossibilité d’étudier la cellule d’origine des tumeurs. Le modèle animal mammifère est le seul moyen de déterminer avec précision la capacité de chaque population cellulaire méningée à initier ou promouvoir la formation des méningiomes en raison de l’existence de souris génétiquement modifiées générées spécifiquement pour étudier ces populations. La souris reste donc l'espèce la plus appropriée pour cette étude.

Réduction

Nous avons réduit le nombre d’animaux utilisés au maximum (900 animaux pour l’ensemble du projet) pour nous permettre de générer des données statistiques solides. Nous avons réduit le nombre d’animaux nécessaires pour obtenir nos animaux génétiquement modifiés d’intérêt au strict minimum et nous piloterons notre élevage de manière raisonnée de façon à ne produire que le nombre d’animaux strictement nécessaires pour nos lots expérimentaux. Afin d'assurer la fiabilité statistique et limiter le nombre d'animaux, nous avons estimé l’effectif sur la base de travaux antérieurs et nous analyserons les résultats obtenus à l’aide des tests statistiques appropriés.

Raffinement

Les animaux seront hébergés dans des conditions conformes à la réglementation en vigueur pour l’espèce. Ils bénéficieront d’une période d’acclimatation à leur arrivée avant toute entrée en procédure. Un enrichissement de leur environnement leur sera mis à disposition dans les cages (carré de coton pour nidifier et bâtonnet de bois à ronger au minimum). Ils seront observés quotidiennement et en cas d’anomalie celle-ci sera transmise à la structure chargée du bien-être animal, au vétérinaire et à notre équipe pour assurer une prise en charge adaptée de l’animal. Des points limites sont définis et seront respectés pour éviter toute souffrance animale. Les injections pour induire la mutation génétique seront limitées au strict nécessaire, et une vérification de la zone d’injection sera assurée avant chaque nouvelle injection. Nous privilégierons la voie d’administration induisant le moins d’effets secondaires possible dès que cela sera possible. Le prélèvement pour connaitre le patrimoine génétique des animaux sera de la plus petite taille possible. Il s’agit d’un geste rapide et parfaitement maitrisé réalisé dans un endroit calme et dédié. Les souriceaux sont replacés avec leur mère et le reste de la portée rapidement, puis une surveillance est assurée immédiatement et environ 30 minutes après pour vérifier l’absence de saignement et la bonne prise en charge par la mère. Un suivi spécifique sera réalisé pour les animaux présentant un phénotype induit attendu après injection, notamment une surveillance du poids hebdomadaire en cas de signes de difficultés motrices et une surveillance quotidienne de leurs capacités à s’alimenter et de la présence de signes de souffrance physique et d’inconfort (dépilation, poil ébouriffé).

Choix des espèces

La souris est un modèle bien connu, son génome est connu et de nombreux outils sont disponibles pour le modifier, permettant ainsi d’introduire des mutations génétiques spécifiques pour la modélisation de pathologies humaines, il existe déjà des modèles de méningiomes chez la souris, l’existence de ces modèles de méningiomes déjà publiés sera un avantage crucial pour comparer les éventuels nouvelles manifestations cliniques obtenues dans ce projet avec les connaissances de référence sur les modèles murins déjà décrits. Les animaux seront utilisés de la naissance à l'âge de 12 mois en raison de la lenteur d’évolution et d’apparition des tumeurs. Le choix des moments d’activation de la mutation génétique se base sur la chronologie du développement de la méninge chez la souris et l’apparition des différentes populations cellulaires. Le prélèvement pour connaitre le patrimoine génétique des animaux s’effectuera à l’âge de 7 à 10 jours afin de profiter de la cicatrisation rapide observée chez les jeunes animaux et connaitre très tôt leur modification génétique.