Procédures légères

Six souris issues de l'élevage interne sont affectées à l'apprentissage des gestes techniques par deux expérimentateurs, et quinze reproductrices sont réintégrées dans le protocole pour produire des sérums hyperimmuns. 141 souris génétiquement modifiées pour développer spontanément des plaques d'athérome vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, toutes tuées à l'issue. Injections de vaccin antigrippal et ponctions veineuses se pratiquent sur animal vigile, sans anesthésie, le porteur les jugeant peu invasives et non douloureuses. Aucun calcul d'effectif ne vient justifier le nombre de 141 souris, la rubrique consacrée à la réduction énumérant seulement les animaux mutualisés entre plusieurs usages.

Objectifs

Certaines maladies chroniques liées à l’âge, comme les maladies cardiovasculaires ou neurodégénératives, sont favorisées par une inflammation persistante de faible intensité, souvent silencieuse mais délétère à long terme. L’athérosclérose, épaississement progressif des parois artérielles, en est un exemple typique. Elle résulte de l’accumulation de graisses dans les vaisseaux, mais aussi — et surtout — d’une activation prolongée du système immunitaire, qui entretient une inflammation locale et systémique. Depuis quelques années, des études montrent que les personnes vaccinées contre la grippe présentent un risque réduit d’infarctus, d’accident vasculaire cérébral ou de démence. Cet effet bénéfique, observé même sans infection grippale, suggère que la vaccination pourrait exercer une protection plus large, possiblement liée à une modulation des mécanismes inflammatoires communs à plusieurs maladies du vieillissement. Le projet vise à étudier, chez la souris, l’effet de différentes formulations vaccinales contre la grippe sur l’inflammation chronique dans deux contextes : les artères (athérosclérose) et le cerveau (neuroinflammation). L’objectif est de déterminer si le vaccin peut influencer la réponse immunitaire dans ces organes et atténuer leurs conséquences pathologiques. Nous utiliserons un modèle de souris déficientes pour la protéine ApoE, connues pour développer simultanément des lésions d’athérosclérose et de neurodégénérescence, permettant d’explorer dans un même animal deux formes d’inflammation chronique. Des souris sauvage (qui constituent le fond génétique des lignées athérosclérotiques) serviront de comparaison. Les animaux recevront différentes solutions vaccinales, puis un suivi biologique sera réalisé à trois temps à partir de prélèvements sanguins. En fin de protocole, une analyse post-mortem des tissus artériels et cérébraux évaluera localement l’impact de la vaccination. Ce double niveau d’analyse, dans le sang et au niveau des tissus, est essentiel pour comprendre l’effet du vaccin dans ces contextes pathologiques. Ce projet pourrait aider à préciser le rôle de la vaccination dans la prévention de complications chroniques du vieillissement. Il repose sur l’utilisation de vaccins déjà disponibles en pratique clinique, ce qui en facilite la transposition à la médecine humaine.

Bénéfices attendus

Ce projet vise à poser les bases mécanistiques nécessaires à une transposition vers la recherche clinique. Grâce à un modèle expérimental combinant deux contextes pathologiques majeurs du vieillissement (athérosclérose et neuroinflammation), il permettra de confirmer la capacité du vaccin antigrippal à moduler l’inflammation chronique de faible intensité. Notre schéma expérimental, qui intègre différentes formulations vaccinales, dont un vaccin recombinant contenant une protéine vaccinale cible, permettra d’identifier la spécificité de l’effet observé et de désigner une protéine vaccinale putative. Ces données sont indispensables pour soutenir la pertinence d’un futur essai clinique, avec constitution d’une cohorte humaine, dans le cadre d’un programme de recherche translationnelle. À terme, ce projet pourrait contribuer à un changement de paradigme : considérer certains vaccins, notamment le vaccin antigrippal, non plus seulement comme des outils de prévention infectieuse, mais comme de véritables leviers thérapeutiques pour contrôler l’inflammation liée au vieillissement et prévenir ou ralentir la progression des maladies chroniques responsables de la majeure partie de la morbi-mortalité chez les personnes âgées.

Procédures

Toutes les interventions prévues dans ce projet seront réalisées sur des souris vigiles (éveillées), sans anesthésie, car elles sont considérées comme peu invasives et non douloureuses. Des souris athérosclérotiques seront dédiées à l’apprentissage des gestes techniques (injections et prélèvements) de deux expérimentateurs, sous la supervision du personnel animalier qualifié. Chaque animal sera soumis à un seul geste technique par session, d’une durée comprise entre 5 et 10 minutes, incluant la contention, la réalisation du geste et la vérification post-manipulation. Un intervalle minimal de 7 jours sera respecté entre deux gestes techniques sur un même animal. La cohorte principale de souris athérosclérotiques recevra deux injections sous-cutanées de vaccin antigrippal (à 11 et 13 semaines d’âge) d’une durée d’environ 5 minutes. Trois prélèvements sanguins (100 µL) seront réalisés par ponction veineuse — avant la première vaccination, 15 jours après le rappel et avant la fin du protocole — chacun durant environ 5 à 10 minutes. Les souris reproductrices, âgées de 6 à 7 mois, recevront trois injections vaccinales espacées de deux semaines, dans les mêmes conditions, afin de stimuler une réponse anticorps robuste.

Impact sur les animaux

Chez les souris déficientes de la protéine, les principales sources de gêne sont les injections et les ponctions sanguines sur animaux vigiles. Les formulations vaccinales ont déjà été administrées chez la souris et l’humain sans effets notables, hormis des réactions inflammatoires transitoires comparables à celles observées chez l’homme (érythème ou œdème localisés, 12 à 72 h). L’administration peut entrainer une gêne locale et se traduire par un grattage ou un léchage temporaire. Aucune douleur persistante ni trouble comportemental durable n’est attendu. Les prélèvements sanguins peuvent entraîner une croûte ou ecchymose légère. L’ensemble de ces interventions peuvent générer du stress pour les animaux.

Devenir

La mise à mort en fin de protocole est indispensable pour permettre une analyse fine des tissus cibles et évaluer les effets locaux de la vaccination sur la progression des atteintes pathologiques, en particulier au niveau vasculaire et cérébral. Ces analyses nécessitent le prélèvement d’organes comme l’aorte et le cerveau dans des conditions de conservation rigoureuses et dans un délai très court, incompatible avec le maintien en vie des animaux. Les examens réalisés incluront des analyses histologiques, immunohistochimiques, transcriptomiques et de cytométrie en flux, toutes essentielles pour caractériser les effets inflammatoires ou protecteurs induits par les différentes formulations vaccinales. Par ailleurs, l’analyse de la réponse humorale nécessite la récupération de volumes sanguins importants, impossibles à obtenir sur animaux vigiles sans compromettre leur bien-être. C’est dans ce contexte que les 15 souris reproductrices seront réintégrées dans le protocole pour être immunisées et mises à mort après la phase vaccinale. Elles permettront de générer des sérums riche en anticorps essentiels à l’analyses. Enfin, les 6 souris de la cohorte d’apprentissage seront nécssaire pour permettra aux expérimentateurs de s’exercer à la microdissection post-mortem en conditions réelles, après une phase préalable sur cadavres. Les tissus prélevés seront utilisés pour la mise au point des protocoles d’immunohistochimie et autres analyses exploratoires.

Remplacement

Ce projet vise à mieux comprendre les mécanismes de l’inflammation qui jouent un rôle central dans deux maladies liées : l’athérosclérose (responsable de nombreuses maladies cardiovasculaires) et la neuroinflammation (impliquée dans certaines maladies neurodégéneratives). Ces deux maladies interagissent entre elles. Pour les étudier, il est indispensable d’observer le fonctionnement global de l’organisme. L’utilisation de l’animal est donc nécessaire pour atteindre ces objectifs. Ce choix a été réfléchi en s'appuyant sur les enseignements de notre projet préliminaire et limité au strict nécessaire : un seul modèle animal a été retenu pour réduire au maximum le nombre d’animaux utilisés. Il s’agit de la souris déficiente pour la protéine ApoE, un modèle bien connu qui développe spontanément des lésions comparables à celles de l’athérosclérose humaine, et qui présente aussi des signes d’inflammation cérébrale en vieillissant. Ce modèle permet ainsi d’étudier, dans un seul protocole, les effets de la vaccination sur ces deux maladies en interaction.

Réduction

Le nombre d’animaux impliqués dans ce projet a été strictement limité grâce à plusieurs mesures de réduction. Quinze souris adultes utilisées comme reproductrices (10 femelles, 5 mâles) seront réintégrées dans le protocole afin de produire des sérums hyperimmuns, évitant ainsi l’utilisation d’animaux supplémentaires pour cette finalité. Par ailleurs, six souris provenant de l’élevage interne seront dédiées à la formation des expérimentateurs aux gestes techniques (vaccination et prélèvements), dans un cadre supervisé. Une fois les expérimentateurs formés, ces animaux seront également réutilisés pour des prélèvements de tissus, permettant la mise au point des analyses post-mortem. L’emploi d’un modèle unique de souris, qui développe à la fois des lésions cardiovasculaires et une inflammation cérébrale, permet d’étudier deux pathologies systémiques au sein d’un même protocole. Ce choix limite le nombre de modèles utilisés tout en répondant aux objectifs scientifiques. Le nombre d’animaux par groupe expérimental (24 souris, soit 12 mâles et 12 femelles) a été défini à partir de calculs de puissance statistique réalisés sur la base de données issues de précédents travaux. Cette taille d’échantillon est la plus faible permettant de détecter une différence significative sur les paramètres étudiés. La répartition équilibrée par sexe permet d’explorer les effets différenciés selon le genre, sans accroître les effectifs globaux, tout en assurant la représentativité des réponses immunitaires.

Raffinement

Les enseignements de notre projet préliminaire ont permis de renforcer les stratégies de raffinement grâce à une familiarisation précoce, une manipulation progressive et une formation encadrée des expérimentateurs, limitant ainsi le stress, la douleur et la variabilité interindividuelle. Dès le sevrage, les souris seront manipulées deux fois par semaine afin de les habituer progressivement au contact humain et d’atténuer leur niveau de stress. La semaine précédant toute procédure invasive, des séances quotidiennes de manipulation et d’habituation spécifiques aux gestes d’injection et de prélèvement seront réalisées. Chaque manipulation sera systématiquement suivie d’une récompense alimentaire (biscuit sucré) afin de favoriser un conditionnement opérant et de renforcer l’acceptabilité des gestes. Ces stratégies visent à réduire la douleur, mais aussi à instaurer des interactions positives. Les injections seront réalisées par voie sous-cutanée entre les omoplates, une méthode choisie pour sa moindre nocivité par rapport à la voie intrapéritonéale, tout en maintenant une efficacité comparable. Les aiguilles seront systématiquement changées entre chaque animal afin de prévenir toute douleur liée à une pointe émoussée et d’éviter les contaminations croisées. Les prélèvements sanguins seront effectués par ponction sous-mandibulaire, une méthode sélectionnée pour son caractère peu invasif au regard du volume nécessaire. Chaque prélèvement sera précédé d’une pesée systématique afin de garantir le respect des seuils éthiques : le volume maximal prélevable par séance est fixé à 10 % du volume sanguin total. Le volume prévu de 100 µL par prélèvement demeure systématiquement inférieur au seuil de 10 % pour l’ensemble des poids attendus (poids théoriques des femelles : 19–26 g ; mâles : 26–33 g). L’intervalle entre deux prélèvements est largement supérieur aux 14 jours requis pour la reconstitution hématologique, ce qui ne justifie pas de compensation systématique. Le volume cumulé par animal sur l’ensemble du protocole sera de 300 µL, compatible avec les recommandations, et les pesées pré- et post-prélèvement garantiront le respect du seuil réglementaire. Enfin, tous les gestes seront réalisés par des expérimentateurs spécifiquement formés, et des points limites prédictifs et adaptés au protocole seront appliqués pour garantir à la fois l’absence de souffrance inutile et la qualité de vie des animaux jusqu’à la fin du protocole.

Choix des espèces

La souris a été choisie comme espèce expérimentale car elle est largement utilisée dans les recherches sur l’athérosclérose (maladie des artères) et l’inflammation du cerveau. Elle bénéficie d’un important recul scientifique et de nombreux modèles validés. Le modèle utilisé ici correspond à une lignée de souris génétiquement modifiées, couramment employée pour étudier le développement de plaques dans les artères, similaires à celles observées chez l’humain. Ces souris développent naturellement des lésions dès l’âge de 8 semaines, qui s’accélèrent avec une alimentation riche en graisses. Cela permet de reproduire une forme précoce de la maladie humaine. Par ailleurs, leur système immunitaire est suffisamment proche de celui de l’humain pour évaluer les effets d’un vaccin. Le modèle choisi permet donc d’étudier, dans un même animal, l’impact d’un vaccin antigrippal sur deux organes particulièrement touchés par le vieillissement : les vaisseaux sanguins et le cerveau. Les souris seront incluses dans le protocole à l’âge adulte (9 semaines) et suivies jusqu’à l’âge de 6 mois environ. Pendant dix semaines, elles recevront une alimentation spéciale afin de favoriser l’apparition de plaques dans les artères, sans aller jusqu’à des stades sévères de la maladie. Ce choix permet de tester l’effet du vaccin dans une approche dite de « prévention secondaire », c’est-à-dire avant que n’apparaissent les complications. Au niveau du cerveau, cet âge correspond également à une période où l’on observe des signes précoces d’inflammation, sans atteinte neurologique irréversible. C’est donc une fenêtre idéale pour étudier si le vaccin peut limiter cette inflammation dite « silencieuse ». Enfin, utiliser des souris jeunes adultes permet d’éviter les effets liés à un système immunitaire encore immature (chez les jeunes) ou à un affaiblissement global (chez les plus âgées), assurant ainsi des résultats fiables et plus facilement transposables à l’humain.

Identifiées par puce électronique, les souris reçoivent des composés immunogènes ou pathogènes, subissent des prélèvements sanguins répétés, des prélèvements vaginaux quotidiens pendant plusieurs jours voire plusieurs semaines, des prélèvements d'urine et de fèces obtenus par contention et massage du ventre, enfin un prélèvement terminal sous anesthésie. 1 500 souris, dont des souris humanisées porteuses de lymphocytes humains, vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Aucune approche statistique n'a servi à fixer cet effectif, calculé d'après les études des années précédentes et une croissance anticipée conforme au plan commercial de l'établissement. 1 400 souris seront tuées faute de recouvrer leur état de santé, et 100 partiront, sur décision vétérinaire, vers un projet de formation interne aux gestes techniques.

Objectifs

L’objectif de ce projet est de développer et de caractériser différents modèles d’immunisation chez la souris, aussi bien immunocompétente qu’humanisée, afin d’évaluer la production d’anticorps spécifiques ainsi que les réponses immunitaires induites par divers types d’antigènes dans un contexte physiologique et humanisés, ainsi que tester les différents traitements à visée thérapeutique. De plus, en vaccinant des souris exprimant des lymphocytes T et B humains, et en exposant ces populations cellulaires à un agent pathogène ou chimique, nous modélisons, fidèlement, une réaction vaccinale chez l’homme. Ces immunisations pourront inclure : • Antigènes pathogènes inactivés (virus, bactéries, parasites) utilisés à des fins de vaccination expérimentale ou d’étude de la réponse immunitaire innée et adaptative. • Antigènes protéiques recombinants ou purifiés, associés ou non à des adjuvants, permettant de stimuler des réponses humorales et cellulaires. • Agents chimiques ou haptenes pour modéliser des réponses d’hypersensibilité immédiate (type I) ou retardée (type IV). • Particules ou formulations vaccinales innovantes dans le but de tester leur immunogénicité et d’étudier leur mécanisme d’action. Les différentes immunisations pourront être associées ou non à des adjuvants selon le protocole et le model à utiliser.

Bénéfices attendus

Ce projet présente plusieurs bénéfices scientifiques, méthodologiques et translationnels qui justifient son importance dans le domaine de l’immunologie préclinique. 1. Avancées scientifiques et médicales : L’étude des mécanismes d’immunisation chez des souris immunocompétentes et humanisées permettra de mieux comprendre les réponses immunitaires adaptatives et innées face à différents antigènes (pathogènes inactivés, antigènes recombinants, peptides ou agents chimiques). L’analyse des réponses humorales et cellulaires fournira des données essentielles sur la diversité et la spécificité des réponses immunitaires. Ces travaux contribueront à identifier de nouveaux biomarqueurs de réponse vaccinale et à améliorer la compréhension des mécanismes impliqués dans l’allergie, l’auto-immunité, l’inflammation et la protection contre les agents infectieux. 2. Développement de modèles précliniques pertinents. L’utilisation de souris immunisées, y compris humanisées, permettra de développer des modèles innovants plus proches de la physiologie humaine. Ces modèles serviront à évaluer des candidats vaccins, adjuvants et immunothérapies avec une meilleure prédictivité des résultats cliniques. Ils permettront également d’explorer les risques d’effets indésirables tels que les réactions d’hypersensibilité immédiate (type I) ou retardée (type IV). 3. Impact translationnel et réduction des échecs cliniques. En intégrant des modèles humanisés, ce projet améliorera la transposabilité des résultats précliniques vers l’homme. Cela contribuera à limiter les échecs lors des essais cliniques et à optimiser le développement de nouvelles stratégies thérapeutiques. Les données générées permettront de rationaliser les choix de molécules candidates et d’accélérer leur progression vers la clinique. 4. Valeur ajoutée en recherche et santé publique. Les connaissances issues de ce projet permettront de renforcer l’expertise dans le développement de modèles précliniques de vaccination et d’immunothérapie. À terme, ces avancées bénéficieront directement à la recherche biomédicale et au développement de nouvelles approches thérapeutiques pour répondre à des enjeux majeurs de santé publique, tels que les maladies infectieuses émergentes, l’augmentation des pathologies inflammatoires chroniques et la recherche de traitements innovants en immuno-oncologie.

Procédures

Identification par puce électronique : 2 fois maximum si puce non fonctionnelle ou perdue. Durée de quelques secondes. Des administrations de composés immunogènes, pathogènes ou thérapeutiques seront réalisés avec ou sans anesthésie. Une anesthésie gazeuse sera appliquée en fonction de la voie choisie. Les volumes administrés seront proportionnels au poids de l’animal avec un maximum défini. La durée sera généralement de 10-15 secondes. Le nombre est défini selon le protocole d’étude et dépendra de la fréquence. Ceci sera évalué par le vétérinaire. Des prélèvements sanguins seront réalisés avec ou sans anesthésie. Les volumes maximaux de prélèvements seront proportionnels au poids et à l’âge de l’animal avec une limite fixée sur une période glissante de 14 jours. Une réhydratation avec du sérum physiologique sera réalisée si nécessaire. La répartition des prélèvements figurera dans le protocole de l’étude et sera contrôlé par un vétérinaire. Chaque prélèvement durera quelques secondes. Pour les analyses nécessitant un volume plus important, un prélèvement terminal sous anesthésie gazeuse sera réalisé. Des prélèvements vaginaux pourront aussi être pratiqués quotidiennement pendant au moins cinq jours, voire plusieurs semaines pour caractériser le cycle œstral. Des prélèvements d’urines et de fèces pourront être pratiqués par contention et massage du ventre. Les animaux recevront des injections de solution saline isotonique contenant des plasmides, une ou deux fois selon la durée de l’étude. Ces injections, administrées uniquement aux souris de plus de 18 g, dureront entre 10 et 15 secondes. Les injections pourront être répétées selon le protocole et dureront quelques secondes. À l’issue des études, les animaux seront euthanasiés selon les méthodes réglementaires. Toutes les interventions seront réalisées sous un suivi clinique rigoureux afin de minimiser douleur et stress des animaux.

Impact sur les animaux

-Identification par puce électronique classique ou thermopuce (prise de température) : stress, gêne, douleur dans les heures suivants l’injection. -Prise de température rectale : stress transitoire, inconfort ou légère douleur à l’insertion du thermomètre, risque minimal de blessure rectale. -Injection(s) de solution saline isotonique contenant des plasmides : les nuisances attendues sont des hématomes et des troubles cardio-respiratoires et une altération marquée de l’état général, pendant les minutes suivants l’injection. -Administration de composés immunogènes, pathogènes ou thérapeutiques : effets potentiellement toxiques des composés à visées thérapeutiques, hématome, douleur, lésion au site d’administration (notamment si administrations répétées) - Prélèvements sanguins : hématome, anémie, douleur, lésion au site de prélèvement (notamment si prélèvement répétés). -Prélèvement d’urine et de fèces : stress, gêne. -Prélèvement vaginaux : douleur et/ou lésion au site de prélèvement (notamment si prélèvement répétés). Les nuisances attendues en lien avec les réactions immunitaires et le challenge par des agents pathogènes peuvent varier selon la nature du composé administré, de l’antigène ou de l’agent infectieux utilisé. Ces effets sont en général modérés et transitoires : réactions locales au site d’injection (rougeur, induration, gonflement, douleur transitoire, voire petit nodule ou abcès localisé), réactions systémiques liées à l’activation immunitaire : fièvre modérée, léthargie temporaire, diminution transitoire de l’activité ou de la prise alimentaire, piloérection, signes d’inflammation ou de réponse aiguë : perte de poids légère à modérée, altération passagère de l’état général, modification du comportement (moins d’exploration, regroupement), en cas de challenge infectieux (si applicable) : symptômes liés à la pathologie induite (ex. inflammation locale, troubles respiratoires légers, diarrhée, ou altération de l’état général selon la voie d’infection et le modèle), réactions immuno-allergiques rares : réactions exacerbées ou imprévisibles à certains antigènes ou adjuvants, généralement de faible intensité grâce aux doses et voies d’administration adaptées. Des nuisances peuvent également être induites par le stress dû aux contentions. La douleur peut se manifester, entres autres, par une perte de poids, une hypo- ou une hyperactivité, une prostration ou des difficultés à se déplacer.

Devenir

Tous les animaux en fin d'étude, ayant atteints les point limites ou sur demande du vétérinaire seront euthanasiés. Ils ne recouvreront pas leur état de santé et de bien-être général. Des souris issues de cette procédure pourront être réutilisées dans le projet « Formation interne aux procédures et gestes techniques appliqués aux souris » sur décision vétérinaire.

Remplacement

Les tests in vitro seront envisagés si ceux-ci sont appropriés. Néanmoins, il n'est actuellement pas possible de recréer in vitro une séroconversion et d’évaluer son impact protecteur sur un organisme vivant. La souris humanisée constitue donc un modèle scientifiquement valide, robuste et indispensable pour le développement et la mise au point de thérapies innovantes pour les patients.

Réduction

Un total de 1500 souris seront utilisées, couvrant une période de 5 ans et permettant de réaliser 50 études précliniques de 5 à 10 individus par groupe (1 groupe placebo et 3 groupes traités). Aucune approche statistique n'a été réalisée pour le nombre total d’études ou pour le nombre total d’animaux dans le projet. L’estimation du nombre d’animaux est réalisée sur base du nombre d’études effectuées les années antérieures et anticipant une croissance chaque année, en accord avec le plan commercial. Le nombre d’animaux utilisés dans chaque étude sera réduit au maximum par des analyses rétrospectives systématiques.

Raffinement

En début d'étude et tout en respectant la réglementation en vigueur, les souris seront hébergées par groupes sociaux, préférentiellement stables, de 2 à 5 individus. Des compléments alimentaires pourront être administrés suivant l’état de santé des animaux. La cage contiendra à minima une couche de litière permettant aux souris de creuser, de se cacher et de réaliser un nid, élément essentiel à leur bien-être. En outre, des enrichissements de qualité seront fournis dans chacune des cages : morceaux de bois, tunnel en carton, kraft et/ou boules de cotons. À leur entrée dans l’animalerie, les souris bénéficieront d’une période d’acclimatation de minimum 4 jours. Les souris pourront recevoir des puces électroniques permettant de mesure la température corporelle afin d’éviter une prise rectale plus impactante. Lors d’un changement de zone au sein de l’animalerie, les souris bénéficieront d’une période d’acclimatation d’une nuit au minimum. Pour limiter la douleur, la souffrance et l’angoisse, une échelle de scores cliniques (pelage, mobilité, état général, activité, comportement, etc…) sera appliquée dès le premier geste invasif ou dès qu’un signe d’altération sera observé lors de la surveillance quotidienne. Des traitements antalgiques préventifs et curatifs seront mis en œuvre dès que nécessaire, sous avis vétérinaire et administrés avant toute procédure potentiellement douloureuse (par exemple : intervention chirurgicale, implantation de certains dispositifs ou cathéters, manipulations invasives des tissus, injection répétées). Un relais per os dans l’eau de boisson à 1 mg/kg/jour pourra ensuite être réalisé. Le vétérinaire aura pleine autorité pour euthanasier un animal ou mettre en œuvre un traitement anti-douleur. Concernant les prélèvements sanguins, le volume maximal est défini pour un prélèvement unique, au-delà il s’agira d’un prélèvement terminal sous anesthésie. Les fréquences sont limitées et une réhydratation est prévue. Les points limites déclenchant l’euthanasie incluent : atteinte sévère de l’état général, douleur non contrôlée ou tout score clinique dépassant les seuils définis ou perte de poids dépassant le seuil défini.

Choix des espèces

La procédure expérimentale d’humanisation a été mise au point et est actuellement maîtrisée chez la souris. Les souches utilisées sont particulièrement réceptives à la greffe du système immunitaire ce qui va permettre à cette espèce d’exprimer des lignées lymphocytaires humaines. Cette particularité permet d’étudier les effets prophylactiques d’une vaccination en condition in vivo, et d’extrapoler, avec davantage de sécurité, les effets qu’auront les traitements chez l’utilisateur final : l’homme. D’autres souches de souris, en particulier non-humanisées, pourront être utilisées dans le cadre d’études préliminaires. Pour les souris non humanisées, les animaux seront inclus aux études à partir de l’âge minimum de 6 semaines, animaux matures d’un point de vue physiologique. Pour les souris humanisées, les animaux seront inclus aux études à partir de l’âge minimum de 8 semaines, première apparition des cellules immunitaires humaines dans le sang.

Tuées dès qu'un point limite est atteint, ou dirigées vers d'autres protocoles et vers le renouvellement des trios reproducteurs, les souris de cet élevage ne quittent pas le circuit expérimental. 27 588 souris appartenant à vingt-six lignées immunodéficientes vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. L'acte déclaré se réduit à une biopsie de l'oreille au poinçon de 2 mm, pratiquée avant le vingt-et-unième jour de vie sur 7 260 d'entre elles. Le porteur affirme que ces lignées sont "indispensables" à l'étude du rejet de greffe, que les organoïdes ne modélisent qu'imparfaitement le réseau immunitaire, et que l'immunodéficience reste sans conséquence tant que les animaux vivent en conditions stériles.

Objectifs

L’objectif global de ce projet est d’étudier les réponses immunitaires dans le contexte de la transplantation d’organes. La transplantation d’organe consiste à remplacer un organe non fonctionnel par un organe provenant d’un donneur de la même espèce mais génétiquement différent. Un des principaux risques après une transplantation est le rejet de l’organe greffé. Celui-ci résulte de la capacité du système immunitaire du receveur à discriminer comme étranger le tissu transplanté. Les patients soient maintenus sous immunosuppresseurs (médicaments permettant de calmer le système immunitaire) pour réduire le risque de rejet. Cependant, malgré les traitements, le risque de rejet reste encore un point critique majeur pour les patients transplantés. Pour mieux comprendre les mécanismes de rejet et trouver de nouvelles voies thérapeutiques pour améliorer la survie des greffons et la qualité de vie des patients transplantés, il est nécessaire d’utiliser des lignées de souris présentant différents types d’immunodéficiences (26 lignées au total). Ce projet concerne que la gestion des souffrances liées au phénotype dommageable de différentes lignées de souris, l’ensemble des projets expérimentaux menés sur ces animaux sont validés en parallèle.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra à court terme de générer les animaux qui rentreront ensuite dans différents projets de recherche ayant pour objectifs de mieux comprendre les réponses immunitaires dans le contexte de la transplantation d’organes, et ceci en réduisant les nuisances du phénotype dommageable en élevage (conditions d'élevage stériles comme décrit précédemment), et en optimisant l’élevage. A moyen terme, cela pourrait déboucher sur de nouveaux traitements pour les patients transplantés.

Procédures

Un prélèvement de tissu par biopsie de l'oreille pour génotypage avant le 21ème jour de vie pour 7260 animaux.

Impact sur les animaux

Les souris ont un phénotype dommageable (immunodéficience) mais qui ne se déclarera pas dans les conditions d'hébergement et de reproduction décrites. Pour les lignées de souris qui nécessitent d’être géntoypées, le prélèvement de tissus nécessite de contentionner l’animal, ce qui peut induire un stress transitoire de courte durée chez les animaux. Ces gestes, réalisés une seule fois peuvent causer de la douleur légère et de l’inconfort chez l’animal.

Devenir

Tout animal ayant atteint un point limite sera automatiquement mis à mort. Les autres animaux produits seront utilisés encontinu pour le renouvellement des trios reproducteurs, dans les protocoles validés par le ministère sur ces lignées ou hors-projet (prélèvement d'organes post-mortem pour études in vitro ou mise au point de protocoles).

Remplacement

L’utilisation des lignées de souris immunodéficientes est indispensable pour l’étude des réponses immunitaires dans le contexte de la transplantation d’organes. Des études in vitro ont été préalablement réalisées. Cepedant, le réseau complexe de cellules immunitaires impliquées dans la régulation des réponses immunitaires étudiées dans ce projet ne peut être reproduit in vitro et n’est qu’impartialement modellisé par les techniques actuelles telles que la production d'organoïdes. En effet, dans ce cas, la composante temps et développement reste imparfaite. D'autre part, l'interaction entre plusieurs organes étant nécessaire à l'apparition des phénotypes que nous étudions, des modèles in vitro ou in silico ne permettent pas d'accumuler des données suffisamment prédictives ou représentatives de la situation pathologique. Cette étude nécessite donc la réalisation d’expériences à l’échelle de l’animal. Les objectifs des projets scientifiques justifient donc l’existence de ces lignées.

Réduction

Des calculs d'effectifs ont permis d'établir le nombre minimal d'animaux par lignée nécessaire en reproduction pour permettre de réaliser les différents projets de cette thématique. Nous nous sommes basés sur un nombre moyen théorique d'animaux par portées (6) et le nombre moyen théorique de portées par femelle et par semestre (3). Nous avons calculé au plus juste le nombre de cages de reproduction nécessaires avec ces chiffres et compte-tenu du nombre d'animaux nécessaires pour les expérimentations en aval. Lorsqu’un génotypage est réalisé, le nombre de cage de reproduction est augmenté pour tenir compte des animaux de génotype non-désiré. Si certains animaux ne peuvent être utilisés pour nos protocoles expérimentaux, ils seront utilisés hors protocole pour des prélèvements post-mortem permettant la mise au point et l'optimisation des expériences (par exemple, mise au point des immuno-marquages multiparamétriques sur des suspensions cellulaires de rate). Enfin, les trios reproducteurs sont changés tous les 6 mois pour ne pas garder de trios peu productifs, ce qui impliquerait d'augmenter leur nombre pour garder une production constante. La dimension de l'élevage sera dynamiquement évaluée pour prendre en compte l'objectif de réduction et s'adapter aux besoins des projets (notamment une réduction de l'élevage dans les phases de diminution des besoins des projets).

Raffinement

Les animaux sont hébergés dans des cagées à portoirs ventilés et manipulés par un personel expérimenté en conditions stériles. Le phénotype dommageable (immunodéficience) ne se déclare pas lorsque les souris sont élevées dans ces conditions. Certaines de ces lignées de souris sont hébergées dans notre animalerie depuis plus de 5 ans avec une observation quotidienne, nous avons donc le recul nécessaire pour affirmer que le phénotype d'immunodéficience n'est pas dommageable en condition d'élevage SPF mais requiert des conditions d'infections controlées pour s'exprimer expérimentalement. Une biopsie d'oreille est parfois requise à des fins de génotypage. Cette biopsie sera effecuée à l’aide d’une méthode éprouvée, précise, rapide et standardisée qui limite les effets indésirables stress/douleurs. La biopsie sera réalisée avant le 21ème jour de vie à l'aide d'un poinçon de 2mm (régulièrement nettoyé et stérilisé par autoclavage) spécifique pour réaliser ce genre de prélèvement. Cet limite d’age a été choisie en fonction du développement des nouveaux-nés pour réaliser une biopsie indolore, ne nécessitant pas d’administration d’antalgique. La biopsie pourra être réalisée en même temps que le tatouage, afin d’éviter la préhension de l’animal plusieurs fois à quelques jours d’intervalle. Le lendemain de la biopsie, une attention particulière sera portée aux oreilles des animaux. En cas de lésions infectées, un lavage au sérum physiologique sera réalisé suivi d'une application de pommade antiseptique et cicatrisante sur conseil vétérinaire. Si l'infection auriculaire s'aggrave dans les 48h, l'animal sera euthanasié.

Choix des espèces

Du fait de leur similarité avec l'homme en termes de génétique, d'anatomie et de physiologie, la souris représente un modèle expérimental privilégié pour l'étude des réponses immunitaires dans le contexte de la transplantation. La sélection de la souris permet également de bénéficier d’un nombre important de modèles génétiquement modifiés pertinents développés précédemment (comme c'est le cas ici) et facilite donc le raffinement du plan expérimental. Des souris âgées de plus de 6 semaines et de moins de 12 mois seront utilisées pour la reproduction du fait de leur maturité sexuelle et avant la décroissance de la fertilité.

Pour faire disparaître une population de lymphocytes T régulateurs chez des souriceaux âgés de un à sept jours, puis chez des souris de quatre semaines, 1 200 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Trois injections sous la peau, sur animal vigile, sont pratiquées en une semaine, avant la mise à mort de l'ensemble des animaux pour prélever leurs organes. Le porteur affirme que la mise en place du système immunitaire périnatal résulte d'interactions complexes qui ne peuvent pas être reproduites in vitro, ce qui l'oblige à recourir à un modèle in vivo. Le suivi annoncé est hebdomadaire, et les points limites dont l'atteinte déclencherait une mise à mort anticipée ne sont pas décrits.

Objectifs

Les lymphocytes T régulateurs sont une population de cellules du système immunitaire cruciales dans la prévention de l’auto-immunité mais délétère dans les réponses anti-cancéreuse du fait de leur puissant effet immunosuppresseur. Il a récemment été montré que les lymphocytes T régulateurs produits au cours de la période néo-natale présentaient des propriétés particulières et protégeaient l’organisme tout au long de la vie. Il a été observé, chez la souris qu’une déficience pour une protéine spécifique altérait drastiquement la survie de cette population cellulaire. Nous souhaitons évaluer les conséquences de la disparition de ces cellules durant la période néonatale mais également chez la souris de 4 semaines via l’administration de molécules spécifiques ciblant ces cellules. Nous souhaitons également restaurer la survie des lymphocytes T régulateurs néonataux chez la souris déficiente pour la protéine identifiée, grâce à un traitement ciblé.

Bénéfices attendus

Ce projet permettrait de mieux comprendre les mécanismes contrôlant la mise en place des lymphocytes T régulateurs chez le nouveau-né et les conséquences à long terme d’une perturbation de ces mécanismes. Ces travaux pourraient ainsi ouvrir la voie à de nouvelles approches thérapeutiques visant à moduler l’influence de ces cellules, bénéfique dans la prévention de l’auto-immunité mais délétère dans la mise en place d’une immunité anti-tumorale efficace.

Procédures

3 injections sous la peau seront réalisées sur animal vigile (30s/souris/injection) sur une durée d’une semaine

Impact sur les animaux

Les injections sous la peau peuvent induire un stress léger et des douleurs légères de courte durée.

Devenir

L'ensemble des animaux sera mis à mort dans le but de prélever les organes pour analyser les cellules immunitaires et l'expression de plusieurs protéines d'intérêt.

Remplacement

Des données bio-informatiques nous ont permis d’identifier des molécules importantes dans la survie des cellules T régulatrices. Des tests in vitro soutiennent également notre hypothèse. Cependant le système immunitaire est composé de nombreuses cellules qui interagissent entre elles. La mise en place de celui-ci lors de la période périnatale est le résultat d’interactions complexes qui ne peuvent pas être reproduites in vitro nous obligeant ainsi à utiliser un modèle in vivo.

Réduction

Les effectifs ont été calculé en utilisant une étude statistique garantissant la validité des données obtenues et l’utilisation d’un nombre réduit d’animaux. Les résultats seront analysés à l'aide de tests statistiques adaptés.

Raffinement

Les animaux sont maintenus dans des groupes de plusieurs individus dans un environnement enrichi. Un suivi hebdomadaire de la part de l’équipe scientifique sera mis en place. De plus des points limites ont été définis, s’ils sont atteints, une mise à mort anticipée des animaux sera réalisée.

Choix des espèces

La souris est le modèle de référence dans l’étude du système immunitaire. En effet, de nombreuses voies de régulation sont conservées entre souris et homme, permettant une extrapolation des résultats obtenus. Enfin, la disponibilité de données bibliographiques importantes sur la physiopathologie de la souris est un atout important dans l'analyse et l'interprétation de nos travaux de recherche sur ce modèle animal. L’étude du système immunitaire et de ses modulations entre le stade néonatal et adulte nécessite l’utilisation de souriceaux âgées de 1 à 7 jours et de jeunes souris âgées d’au moins 4 semaines.

Trois à quatre injections intrapéritonéales, puis des tests de champ ouvert, de boîte noire et illuminée, d'enfouissement de billes et de reconnaissance d'objet, de dix minutes chacun : le protocole tient dans une séance de travaux pratiques de quatre heures. 400 souris femelles vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Ces séances initient des étudiants aux analyses comportementales en neurosciences, hors de toute production de connaissances. Le porteur présente ces travaux pratiques comme un apprentissage précoce de la règle des 3R, et prévoit de mutualiser les souris entre les séances du matin et de l'après-midi, puis de récupérer leurs corps pour des travaux pratiques de dissection.

Objectifs

Une personne sur quatre souffre de troubles mentaux. Les troubles mentaux regroupent un vaste ensemble de problèmes, dont les origines diffèrent. L’étiologie des troubles mentaux comporte des facteurs individuels (ex : génétique) et environnementaux. Les mécanismes biologiques sous tendant ces troubles sont loin d’être élucidés et ils sont au cœur de plusieurs programmes de recherche. Une majorité de ces recherches, par de leur nature même, impliquent l’étude du comportement et ont donc recours à l’expérimentation animale. Une formation précoce des étudiants à ces thématiques est fondamentale afin de les initier aux pratiques expérimentales auxquelles ils seront confrontés dans la suite de leur parcours d’étude et professionnelle. Les procédures incluses dans ce projet sont destinées à la formation d’apprenants dans le cadre des Travaux Pratiques (TP) axés sur le domaine des neurosciences. Ces procédures se déclinent sous forme de séances de travaux pratiques (TP) d’une durée de 4 h chacune et seront encadrées par des personnes possédant les habilitations réglementaires nécessaires à concevoir et réaliser des procédures expérimentales.. Les objectifs de ces TP sont doubles : - Sensibiliser les étudiants à l’utilisation d’animaux de laboratoire en s’appuyant sur la règle des 3R et leur présenter le cadre légal pour une telle approche (notion d'éthique et à la réglementation en vigueur). - Les initier à la complexité des analyses comportementales (exploration d'un champ ouvert pendant 10 minutes pour évaluer le comportement moteur, test de la boite noire/illuminée pendant 10 minutes pour évaluer les niveaux d’anxiété, test d’enfouissement des billes pendant 10 minutes pour évaluer le comportement compulsif et reconaissance d’objet (deux séances de 10 minutes pour évaluer la mémoire) et à l’interprétation des données nécessaires à la recherche s’intéressant aux troubles mentaux.

Bénéfices attendus

APPRENTISSAGE PRECOCE DE LA REGLE DES 3RS. Le bien-être des animaux de laboratoire passe aussi et surtout par une correcte formation du personnel, impliquant à la fois la maitrise des aspects pratiques des procédures expérimentales utilisant les animaux et la prise de conscience des enjeux éthiques et réglementaires qui les accompagnent. Bien que ces sujets soient largement traités au cours des formations réglementaires, une initiation précoce des étudiants à ces thématiques, aussi à travers une approche pratique, reste fondamentale afin de susciter leur intérêt, transmettre plus efficacement les notions théoriques et leur permettre de prendre des décisions plus éclairées pour la suite de leur parcours d’étude et/ou professionnel (choix du master, stages, insertion dans le monde du travail).

Procédures

Injection (trois ou quatre selon si animaux utilisés dans deux séances de travaux pratiques ou pas). Durèe estimée < 1 minutes. Test de mésure de la motricité (durée 10 minutes), test de mésure de l'anxieté (durée 10 minutes), test de mésure du comportement compulsif (durée 10 minutes), test de mémoire (deux sessions de 10 minutes chacune).

Impact sur les animaux

L’injection des deux produits sera réalisée à des doses largement étudiées en littérature et qui ne génèrent pas d’effets indésirables au-delà des altérations comportementales attendues (hyperactivité, réduction du comportement compulsif pour la procédure 1, amnésie pour la procédure 2).

Devenir

A la fin des procédures les animaux seront euthanasiés afin de pouvoir les mutualiser avec d’autres travaux pratiques (notamment de dissection) réalisé dans le département.

Remplacement

Notre projet repose principalement sur des approches comportementales. Actuellement, il n’y a pas de méthodes substitutives qui pourraient remplacer le recours à l’animal dans nos travaux. Il n’est pas non plus envisageable d’utiliser des modèles animaux moins sensibles. En effet, la souris est un modèle animal de choix de par les approches pharmacologiques qui permettent une manipulation ciblée des voies de transmission étudiées.

Réduction

Concernant le nombre d’animaux utilisés, il faut remarquer que les dates des travaux pratiques seront coordonnées dans la mesure du possible afin de mutualiser les souris avec d’autres travaux pratiques nécessitant l’utilisation de tissues animaux. Plus précisément, sur la base de l’expérience des années précédentes, les carcasses des animaux pourront être récupérées pour des travaux pratiques de dissection. En plus, en partant de l’observation que les effets des deux produits disparaissent après environ 120 minutes, afin de réduire le nombre de souris utilisées, on mutualisera les animaux utilisés dans les TPs du matin et de l’après-midi.

Raffinement

Des comportements agressifs ont été observés les années précédentes. Ces comportements se déclarent dès la réception des animaux et ne sont pas liés à la procédure. Dans les dernières années on a donc préféré l’utilisation de souris femelles. Le fait d’avoir des souris femelles n’a pas modifié les résultats de l’expérience et a considérablement réduit la survenue de comportements agressifs. Dans le but du raffinement, on propose donc d’utiliser seulement des souris femelles. Concernant les procédures expérimentales, les souris seront manipulées 2 ou 3 jours avant les injections intrapéritonéales avec de légères contentions afin de les familiariser avec l’expérimentateur et les habituer à la manipulation nécessaire à l’injection i.p.

Choix des espèces

La souris est un modèle animal de choix de par les approches pharmacologiques qui permettent une manipulation ciblée des voies de transmission étudiées. Utiliser des souris adultes maximise la validité interne, la reproductibilité et la robustesse pédagogique tout en respectant les 3R. On évite les confusions liées au développement, on diminue la variance et on applique des protocoles largement étalonnés pour l’âge adulte, ce qui est idéal pour un TP court et standardisé.

Les fœtus de ce projet portent l'inactivation d'une ou des deux copies d'un gène du développement cérébral, et le porteur précise qu'ils seront tués avant l'apparition des atteintes attendues. 126 souris vont être utilisées, 18 femelles gestantes et 108 fœtus, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, toutes tuées à l'issue. Les femelles reçoivent une ou deux injections de molécules marquant l'ADN aux jours 15 et 16 de gestation, les fœtus étant collectés le lendemain pour prélèvement des cerveaux. Le porteur explique l'effectif par le fait qu'un quart seulement des fœtus porte le génotype recherché, ce qui conduit à en produire 36 par expérience pour en analyser 32.

Objectifs

Le gène que nous étudions joue un rôle important à plusieurs étapes du développement du cerveau. Il intervient à la fois dans la multiplication des cellules qui donneront les neurones, dans leur transformation en neurones matures et dans leur bon fonctionnement. Pour que le cerveau se développe correctement, il faut que ce gène soit exprimé de manière équilibrée : trop d’activité de ce gène peut provoquer les troubles cognitifs que l’on observe dans la trisomie 21, alors qu’un manque d’activité cause un autre syndrome, souvent accompagné d’une petite taille du cerveau, de difficultés intellectuelles et de signes d’autisme. Jusqu’à présent, la plupart des recherches s’étaient concentrées sur le rôle de ce gène dans les neurones dits « excitateurs ». Nos travaux ont révélé qu’il est tout aussi essentiel pour un autre type de neurones, les neurones « inhibiteurs », qui servent à équilibrer l’activité du cerveau. En utilisant une approche expérimentale où nous pouvons désactiver ce gène uniquement dans les cellules destinées à devenir des neurones inhibiteurs, nous avons observé que la perte d’une copie du gène diminue déjà fortement le nombre de ces neurones dans une région du cerveau appelée striatum. Quand les deux copies du gène sont supprimées, cette région ne se forme plus du tout. Cette disparition des neurones vient surtout du fait que beaucoup d’entre eux meurent prématurément après leur naissance (un processus appelé apoptose). Nous avons aussi remarqué, à un stade plus tardif du développement du cerveau chez la souris (vers le 16e jour embryonnaire), que la multiplication des cellules souches neuronales est perturbée : certaines zones où elles se divisent sont plus grandes, et des cellules continuent à se diviser là où elles devraient normalement avoir arrêté pour devenir des neurones matures. Nous cherchons maintenant à comprendre plus précisément comment la perte de ce gène modifie la façon dont ces cellules souches progressent vers leur forme finale de neurones, et comment elles régulent leur cycle de division.

Bénéfices attendus

Cette étude permettra de caractériser les défauts de progression et de sortie du cycle cellulaire lié à un déficit du gène étudié et ainsi de mieux comprendre les mécanismes perturbés dans la neurogénèse des neurones inhibiteurs dans le syndrome associé à la perte du gène étudié. Ces analyses permettront à terme de proposer des cibles thérapeutiques pour ce syndrome.

Procédures

Un tiers des animaux recevra deux molécules permettant de marquer l'ADN, administrées à 1h30 d'intervalle. Les deux autres tiers des animaux ne recevront qu’une des deux molécules.

Impact sur les animaux

Les femelles seront soumises à une douleur légère de courte durée lors des injections. Aucun effet indésirable n’est attendu avec l’administration des molécules. Les foetus seront mis à mort avant apparition des phénotypes dommageables attendus sur ces modèles.

Devenir

Toutes les femelles gestantes et les fœtus sont mis à mort pour récupérer les cerveaux des fœtus pour les analyses immunohistologiques.

Remplacement

Différentes alternatives existent pour l’étude de la prolifération et l’analyse du cycle cellulaire, notamment des modèles in silico, des cultures cellulaires et des organoïdes striataux permettant d’étudier certaines étapes du développement striatal in vitro. Mais chacune de ces alternatives présente des limites majeures. Les modèles in silico, bien qu’utiles pour simuler certains aspects du cycle cellulaire, reposent sur des données préexistantes et ne permettent pas d’obtenir des mesures expérimentales précises des dynamiques de prolifération cellulaire in vivo. Les cultures cellulaires permettent de suivre la progression du cycle cellulaire mais ne reproduisent pas les conditions physiologiques. Les organoïdes, bien que capables de reproduire en 3D l’organisation cellulaire et la diversité neuronale du striatum embryonnaire, manquent encore de standardisation et de reproductibilité. De plus, il leur manque le microenvironnement régional embryonnaire (gradients de signaux moléculaires et morphogénétiques présent dans le télencéphale ventral régulant la prolifération et la différenciation des progéniteurs) ainsi qu’un environnement physiologique complet (système de vascularisation) qui n’est retrouvé que sur des embryons entiers. L’utilisation du modèle animal, notamment la souris qui est génétique et physiologiquement proche de l’homme reste le modèle de choix pour cette étude de pathologie humaine.

Réduction

La stratégie expérimentale consiste à analyser les cellules en prolifération dans le cerveau de souris contrôle, ou ayant une inactivation pour une ou les deux copies du gène étudié grâce à différents marqueurs du cycle cellulaire et au comptage des cellules marquées. Des analyses similaires dans la littérature montrent que 8 échantillons par génotype sont nécessaires afin d’obtenir des résultats exploitables au niveau statistique. Seulement ¼ des foetus aura le génotype attendu. Nous prévoyons trois procédures différentes pour les analyses et aurons besoin, pour chaque procédure un minimum de 8 x 4 =32 fœtus par procédure. Comme une femelle produit en moyenne 6 petits par portée, nous devrons produire 6 portées et donc 6 x 6 = 36 foetus au lieu de 32. Nous utiliserons donc un total de 6 femelles x 3 expériences = 18 et un total de 36 foetus x 3 expériences = 108 foetus. Un total de 126 animaux seront utilisés.

Raffinement

Les femelles seront soumises à un stress et une douleur légère de courte durée lors des injections. Après l’injection, nous vérifierons qu’il n’y a pas de saignement au site d’injection, auquel cas une ouate sèche sera appliquée. Nous observerons le comportement de la souris après injection afin de détecter toute douleur ou complication post-injection. L’administration des molécules n’entraine pas de d’effets indésirables que ce soit sur la mère ou sur les foetus. Ceux-ci seront mis à mort avant apparition des phénotypes dommageables attendus sur ces modèles.

Choix des espèces

Cette analyse s’inscrit dans une étude plus large visant à comprendre les origines cellulaires des déficits cognitifs observés dans les pathologies touchant la neurogénèse. Pour cela, la souris est un modèle de choix car elle est anatomiquement, physiologiquement et génétiquement proche de l’Homme. Elle permet l’étude in vivo de mécanismes neurophysiologiques qui est indispensable à la compréhension des pathologies que nous étudions. De plus, de nombreux outils de manipulation génétique sur ces animaux ont été mis en place, permettant d’avoir des modèles génétiques des pathologies observées en l’absence de mutant spontané dans une espèce de mammifères qui correspond à la maladie humaine. Des femelles en âge de procréer (6 semaines-8 mois) seront utilisées. Les injections se feront aux stades embryonnaires E15.5-E16.5 et les foetus collectés au stade E16.5. Ce stade correspond au stade d’apparition d’une augmentation de la zone proliférative observée chez les mutants.