Procédures légères

Deux injections espacées de quinze jours déclenchent une uvéite, inflammation de l'intérieur de l'œil, chez chaque lapin inclus. 1 800 lapins vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré, la plupart tués à la fin pour des analyses histologiques et des dosages, 180 d'entre eux étant réutilisés dans d'autres protocoles parce qu'ils n'auront reçu que les examens préalables. Selon le traitement testé, ils reçoivent des collyres jusqu'à six à huit fois par jour, ou des injections dans l'œil sous microscope chirurgical une à deux fois par semaine, certains restant seuls en cage jusqu'à dix semaines. Le porteur décrit ce que l'uvéite provoque chez l'humain, rougeurs, larmoiements, démangeaisons et douleurs, et annonce des points limites "suffisamment prédictifs et précoces" sans dire lesquels ni ce que ressentent les lapins.

Objectifs

L’objectif de ce projet est d’utiliser un modèle in vivo d’uvéite chronique induite par l’antigène Mycobacterium Tuberculosis inactivé (H37RA) chez le lapin afin d’évaluer de nouveaux traitements dans la prévention de récidive de l’uvéite. Les uvéites sont des inflammations intraoculaires, souvent d’origine auto-immune, pouvant représenter une réelle menace pour la vision des patients. Dans les pays occidentaux, l’incidence des uvéites serait de 17 à 52 cas pour 100 000 habitants par an. Chaque année, environ 17% des patients atteints d’uvéites actives présente une diminution ou une perte de l’acuité visuelle. Les formes sévères d’uvéite antérieure et postérieure nécessitent souvent des doses élevées de corticoïdes pouvant entraîner des effets secondaires. Lorsque ces traitements sont inefficaces ou mal tolérés ils peuvent être remplacés par des immunosuppresseurs. Cependant, les uvéites ne guérissent pas définitivement et les symptômes reviennent périodiquement après arrêt des traitements. Le praticien se retrouve donc très limité en ce qui concerne le traitement et la prévention de récidive.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus seront de participer à l'élaboration de traitement luttant contre les uvéites et leur récidive, pour améliorer la vue de patients.

Procédures

Au début de l’étude, tous les animaux reçoivent deux injections espacées de 15 jours afin d’induire une uvéite, une inflammation touchant plusieurs zones de l’œil. L’évaluation de cette pathologie se fait par des examens ophtalmologiques rapides, durant seulement quelques minutes. Une anesthésie peut être pratiquée si une immobilisation complète de l’animal est nécessaire. Le traitement à tester est administré par un seul mode choisi pour chaque animal : soit par injection intraoculaire, soit par collyre, soit par voie orale. Ces procédures sont très brèves, ne dépassant généralement pas 1 à 2 minutes. Les collyres peuvent être appliqués plusieurs fois par jour, avec une moyenne de trois administrations et un maximum de six à huit. Les injections intraoculaires sont réalisées sous anesthésie locale, voire générale si nécessaire. Leur fréquence est plus limitée, à raison d’une à deux fois par semaine. Ces interventions, un peu plus longues, nécessitent l’utilisation d’un microscope chirurgical et prennent environ cinq minutes par animal. Les prélèvements sont effectués sur des animaux vigiles, sans anesthésie, et ne durent pas plus de cinq minutes, à raison d’une fois par semaine maximum. Enfin, certains lapins seront hébergés individuellement dans leur cage pendant la durée de l'étude maximum 10 semaines.

Impact sur les animaux

Le modèle entraine une uvéite, une inflammation des structures oculaires chez le lapin, chez l'homme les uvéites provoquent des rougeur, troubles, larmoiements, démangeaisons et douleurs au niveau de l’œil. Les risques liés aux administrations de produits sont l’apparition de signes d'inflammations, de saignements au site d'injection ainsi qu'une grosseur due à l'injection sous cutanée au moment de l'induction de la pathologie. Au cours de l’anesthésie jusqu’au réveil, une baisse de la température corporelle pouvant induire un stress est attendue. Elle sera minimisée par l’utilisation de tapis chauffant.

Devenir

A l'issue de la procédure, tous les animaux qui auront suivi la totalité de la procédure expérimentale : examens, induction de la pathologie et traitements, seront mis à mort pour permettre de réaliser les évaluations ex vivo (évaluations histologiques, dosage de produit...). Mais nous estimons qu’une proportion de 10% animaux ne suivra pas la totalité de la procédure. Ces animaux auront suivi la procédure jusqu’aux examens « baseline » qui servent à révéler un défaut ou une particularité anatomique ou physiologique susceptible de biaiser les résultats. Ces animaux n'auront pas reçu d'induction de la pathologie, ni d'administration de traitement, seulement des examens qui ne sont pas invalidants mais qui potentiellement nécessitent une anesthésie. Ils pourront être réutilisés dans d’autres procédures expérimentales compatibles avec l’avis du vétérinaire.

Remplacement

Malgré les recherches pour développer des modèles alternatifs, les systèmes in vitro comme les organoïdes ou les organes sur puces, ne représentent pas complètement la complexité d’une maladie comme l’uvéite qui implique l’interaction entre les différents tissus de l’œil et aussi le système immunitaire. En effet, l’œil est composé de différents tissus (vasculaires, rétinien neuronal, vitréen, cornéen, humeur aqueuse ...) de physiologie différente et soumis aux variations environnementales, aux interactions des tissus et organes voisins. Les études in vivo permettent d’observer les réponses physiologiques d’un traitement dans un organisme vivant en tenant compte des pharmaco cinétiques, des métabolites générés. Compte tenu de la complexité de l’organe nous aurons donc recourt à des animaux.

Réduction

Le nombre maximum d’animaux prévu pour ce projet a été déterminé en fonction de la distribution théorique rencontrée dans les données bibliographiques et tient compte des variations du métabolisme, de la robustesse des mesures et de notre expérience. Ce nombre limité doit nous permettre de conclure sur l’efficacité ou non d’un traitement. L'effet d'un traitement sera évalué à l'aide des tests statistiques avec possibilité d'effectuer des comparaisons multiples. Chaque groupe traité sera comparé à celui du groupe témoin. Un calcul de l’effectif sera réalisé avant chaque étape afin d’ajuster et de revoir à la baisse si possible le nombre d’animaux à inclure dans les procédures. Des évaluations non invasives de la pathologie sont utilisées tout au long de l'étude pour éviter la mise à mort de l'animal.

Raffinement

Un suivi quotidien des animaux sera effectué afin de minimiser au maximum l’impact des procédures sur leur bien-être. Les animaux seront hébergés en binôme, avec différents enrichissements adaptés à l'espèce, enrichissement collectif (ambiance sonore, hébergement à plusieurs, interaction visuelle, sonore et olfactive) et enrichissement individuel nutritif (rondin végétal par exemple) et non nutritif comme des buchettes de bois ou balle de cellulose. Les examens choisis pour évaluer les signes cliniques de la maladie sont non invasifs et semblables à ceux pratiqués chez l'homme en cabinet d'ophtalmologie ou chez l’animal en clinique vétérinaire. Afin de réduire le stress de l'animal lors d'examens nécessitant l'immobilisation de l'animal, une administration d'anesthésique sera réalisée. Lors des anesthésies des substituts de larmes sont régulièrement instillés sur les cornées pour éviter le dessèchement, un dispositif est prévu pour éviter l’hypothermie (tapis chauffants, ou lampe). Des points limites adaptés, suffisamment prédictifs et précoces permettent de limiter une éventuelle douleur à son minimum.

Choix des espèces

Le lapin a une physiologie, une anatomie et un métabolisme largement décrits dans la bibliographie scientifique. L’extrapolation à l’homme des effets sur l’œil en est d’autant plus facilitée. Le système immunitaire possède des similitudes avec celui de l’homme dans le cas des uvéites. De plus, les modèles expérimentaux concernant cette pathologie sont largement utilisés et décrits sur cette espèce, les publications de référence sur laquelle le projet est basé. Les animaux seront de jeunes adultes à leur arrivée dans notre animalerie. Les lapins inclus dans l'études auront 2 à 3 mois conformément aux publications de référence qui servent de base à ce modèle. Ils entrent en étude après une période d’acclimatation d'un minimum de 5 jours.

Une capsule contenant des larves ou des nymphes de tiques infectées, collée sur le dos sous anesthésie : 2 569 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Le projet cherche à savoir comment le fond génétique de l'hôte modifie la sensibilité à un flavivirus neurotrope transmis par les tiques, et la capacité des souris à le retransmettre à des tiques saines. Chaque animal peut aussi recevoir une injection du virus, subir jusqu'à quatre prises de sang en quinze jours et rester isolé cinq jours pour éviter que ses congénères n'arrachent la capsule, le porteur admettant une perte de poids, une apathie et une paralysie possibles. Aucune souris ne sort vivante du protocole, parce qu'elles portent des pathogènes dangereux pour l'humain et parce que leurs tissus sont prélevés après la mort.

Objectifs

L’objectif global de ce projet est d’étudier le rôle du fond génétique de l’hôte dans la sensibilité à l’infection par les virus transmis par les tiques, le virus étudié neurotrope émergent en Europe. Ce virus peut provoquer des atteintes neurologiques sévères chez l’humain, dont les mécanismes physiopathologiques demeurent encore largement méconnus. En particulier, les troubles neurocomportementaux pouvant survenir à la suite de l’infection, ainsi que les modalités de transmission du virus entre l’hôte et le vecteur, restent à élucider. Ce projet, prévu sur une durée de 5 ans, vise à mieux comprendre comment la variabilité génétique de l’hôte influence à la fois la gravité de l’infection et la dynamique de transmission du virus entre tiques et souris. Plus précisément, les objectifs scientifiques de ce projet sont les suivants : 1. Identifier les différences de sensibilité à l’infection systémique par les virus transmis par les tiques entre différentes lignées de souris, notamment en ce qui concerne la charge virale dans certains organes, les symptômes cliniques, la virémie et la survie. 2. Caractériser la variabilité de la réponse des souris à une infection par exposition à des tiques infectées, en reproduisant les conditions naturelles de transmission. 3. Déterminer la capacité des souris infectées à transmettre le virus à des tiques naïves, en fonction de leur fond génétique. 4. Mettre en évidence les variants génétiques de l’hôte associés à une forme grave ou légère de la maladie, ainsi qu’à une meilleure (ou moindre) transmission du virus aux tiques. 5. Identifier les lignées les plus pertinentes pour servir de modèles expérimentaux dans l’étude de la pathogénie et de la transmission des virus transmis par les tiques.

Bénéfices attendus

À court terme, ce projet permettra d’identifier des lignées de souris particulièrement sensibles ou résistantes à l’infection par les virus transmis par les tiques, qui constitueront des modèles pertinents pour étudier la physiopathologie de l’infection neuroinvasive induite par ces virus. Ces modèles pourront également être exploités pour le développement de stratégies préventives ou thérapeutiques, notamment dans le contexte du renforcement de la surveillance du virus étudié en Europe. Le projet apportera par ailleurs des informations précieuses sur l’impact du fond génétique de l’hôte dans la sensibilité à l’infection et dans la capacité de transmission du virus aux tiques. L’analyse des profils génétiques des lignées de souris sensibles ou résistantes permettra d’identifier de nouveaux gènes ou variants associés à la pathogénie ou à la transmission virale. À plus long terme, ces travaux contribueront à améliorer la compréhension des mécanismes biologiques impliqués dans les infections virales transmises par les tiques, en particulier ceux responsables de la neuroinvasion et des formes cliniques sévères. Si le virus étudié constitue le virus central de l’étude, les connaissances générées pourront également éclairer les processus pathogéniques d'autres virus neurotropes de la même famille transmis par les tiques, qui partagent des caractéristiques virologiques, écologiques et cliniques. Cela représente un enjeu de santé publique majeur, dans un contexte d’expansion géographique du virus étudié en Europe, favorisée par les changements environnementaux, la dynamique des populations de tiques et l’augmentation des cas humains autochtones. Les résultats obtenus pourront ainsi être transposés à d’autres virus apparentés ou à d'autres systèmes vecteur-hôte, apportant une valeur à la fois fondamentale et appliquée à l’ensemble du champ des maladies infectieuses émergentes. .

Procédures

Une partie des souris sera infectée avec un virus transmis par les tiques, par injection, réalisée une seule fois et d’une durée de quelques secondes. L’autre partie sera infectée par piqûre de tiques placées dans une capsule fixée sur le dos de l’animal. Enfin, des souris préalablement infectées seront équipées d’une capsule permettant l’exposition de tiques non infectées. La pose et la dépose de la capsule se feront sous anesthésie, pour une durée d’environ 20 minutes. Durant la période où la capsule sera placée sur les souris, les animaux seront hébergés individuellement pour une durée maximale de 5 jours. Des prises de sang seront réalisées, au maximum 4 prélèvements sur 15 jours consécutifs, chaque prélèvement durant environ 30 secondes. Les volumes et la régularité des prélèvements seront adaptés en fonction du volume sanguin déjà prélevé par les tiques. Des pesées seront également réalisées au minimum tous les 3 jours afin de contrôler l’évolution de la courbe de poids, chaque pesée durant environ 30 secondes.

Impact sur les animaux

Le projet s'articule autour de 3 procédures de sévérité modérée. Dans certains cas, l'infection aura un impact très modéré sur l'état de santé des souris, avec une perte de poids inférieure à 5% et transitoire (quelques jours). Dans d'autres cas, les souris pourront développer une perte de poids plus importante dont l’ampleur sera à déterminer, une apathie et des troubles neurologiques tels qu’une paralysie. Un stress physique d’environ 5 minutes pourra être ressenti lors de la prise de sang et des injections, accompagné d’une douleur de type piqûre, de courte durée (environ 3 secondes) et d’intensité légère. Une anesthésie fixe par injection d'une durée d’environ 20 minutes sera induite, pouvant s’accompagner d’un stress physique transitoire au moment de l'injection. Une capsule destinée à contenir les tiques (larves ou nymphes) sera fixée sur la peau à l’aide d’une colle non toxique. Cette capsule pourra occasionner une gêne les 2 à 3 premiers jours, le temps que l’animal s’y habitue. Afin de prévenir le retrait de la capsule par un congénère, un hébergement individuel temporaire (maximum 5 jours) de l’animal sera nécessaire, ce qui pourra être à l’origine d’un stress social. Lors de la pose des tiques dans la capsule un stress physique ponctuel de quelques minutes pourra être observé.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure. Ils ne peuvent être ni réutilisés, ni replacés, ni adoptés car ils seront infectés par des pathogènes dangereux pour l’Homme et/ou feront l’objet de prélèvements de tissus post-mortem.

Remplacement

Les phénomènes biologiques que nous devons étudier se développent au niveau de l’organisme entier (développement de l'infection, réponse immunitaire, conséquences neurocomportementales) voire à l’interface entre deux organismes indépendants (transmission du virus entre la souris et la tique et imposent donc de recourir à des modèles animaux vivants. Des approches alternatives, telles que les cultures cellulaires, les organoïdes ou les modèles ex vivo, seront utilisées autant que possible en amont ou en complément des expérimentations in vivo. Ces méthodes permettent une analyse fine et contrôlée des mécanismes cellulaires et moléculaires de l’infection, notamment l’entrée virale, la réplication, la réponse immunitaire innée ou encore les effets dans des tissus cibles comme le cerveau. Elles offrent également la possibilité de tester un grand nombre de conditions expérimentales en limitant l’usage d’animaux, conformément aux principes des 3R. Cependant, ces approches ne permettent ni de simuler la transmission naturelle du virus par la piqûre de tique, ni d’appréhender les effets systémiques de l’infection sur l’ensemble de l’organisme, en particulier les manifestations neurologiques complexes. Elles ne reproduisent pas non plus la diversité génétique des individus ni les interactions dynamiques entre vecteur, virus et hôte dans leur environnement physiologique complet. La souris est l’espèce la plus adaptée pour ce projet, car elle constitue à la fois un modèle expérimental puissant grâce à la diversité génétique disponible et un réservoir naturel connu pour le virus étudié dans certaines régions. Cela en fait un modèle biologiquement pertinent pour étudier l’infection, sa transmission par les tiques, et les facteurs génétiques impliqués dans la sensibilité.

Réduction

L’étude de la charge virale dans le sang ou les tissus d’une lignée donnée, comme nous l’avons observé dans de précédents travaux sur un autre virus, pourra généralement être menée avec 5 à 7 souris par groupe. La virémie du virus étudié étant légèrement plus faible, un effectif de 7 souris par groupe a été retenu. Celui-ci pourra néanmoins être ré-évalué au cours des procédures selon les premiers résultats et estimations de la variabilité observée. Les procédures impliquant la transmission par des tiques nécessiteront une planification rigoureuse, dans la mesure où l’efficacité de la transmission peut varier en fonction de la souche de souris, du nombre de tiques appliquées et du délai post-infection. Ces facteurs seront mesurés et pris en compte lors des analyses statistiques La conception expérimentale reposera systématiquement sur une analyse statistique préalable, afin d’optimiser le nombre et la répartition des animaux par groupe, tout en évitant les biais, liés à la cage et à la portée principalement. Les données obtenues seront analysées avec des tests statistiques appropriés, de type modèles mixtes afin de prendre en compte la structure des données. Lorsque nécessaire, des experts en biostatistique seront consultés pour affiner les plans expérimentaux ou nous accompagner dans l'analyse des données. Pour les modèles où une absence de différence entre sexes a déjà été établie, et afin de simplifier les manipulations, certaines procédures ne seront réalisées que sur un seul sexe. Les deux sexes seront néanmoins utilisés pour valider les résultats et dans les procédures où une différence pourrait être attendue. Certaines expériences pourront être répétées, mais uniquement si cela est indispensable pour valider des résultats ou confirmer une observation inattendue. Ces cas sont justifiés dans le détail de chaque procédure.

Raffinement

Toutes les procédures seront mises en œuvre avec une attention particulière portée à la limitation de la douleur et de la détresse des animaux. Les manipulations telles que les injections par voie systémique ou les prélèvements sanguins entraînent une douleur passagère et légère, ne justifiant pas l’usage d’anesthésie ou d’analgésie. Dans la plupart des cas, l’infection aura un impact très modéré sur l’état de santé des souris. Dans d’autres cas, les souris pourront développer une perte de poids plus importante, une apathie ou des troubles neurologiques tels qu’une paralysie. Les animaux infectés seront surveillés quotidiennement pendant la période symptomatique, avec plusieurs points limites prédéfinis : un score clinique basé sur cinq critères, ainsi qu’un suivi de la perte de poids. Un gel nutritif sera placé dans les cages dès l’apparition de signes d’affaiblissement ou de paralysie, afin de garantir un accès facile à la nourriture pour les animaux les plus atteints. Lors des procédures impliquant des tiques, les souris seront anesthésiées pour permettre la pose d’une capsule contenant les tiques sur leur dos. Cette méthode permettra d’assurer une fixation efficace des tiques dans des conditions indolores et sécurisées, tout en empêchant leur dispersion et en limitant le stress des animaux. Les souris porteuses de tiques seront hébergées individuellement pendant la durée de l’exposition. Afin d’atténuer l’impact de cet hébergement individuel passager, un enrichissement environnemental adapté sera systématiquement mis en place. Chaque cage sera équipée de matériaux de nidification, d’objets à ronger et d’objets de manipulation, avec des aménagements renouvelés régulièrement afin de maintenir une stimulation suffisante, sans compromettre la fixation de la capsule. Après le repas sanguin des tiques, si besoin les souris seront réhydratées pour compenser la perte volémique. Les protocoles seront régulièrement réévalués afin d’intégrer les améliorations possibles en matière de bien-être animal.

Choix des espèces

La souris est un modèle validé pour l’étude des virus transmis par les tiques, car elle reproduit fidèlement plusieurs aspects de la physiopathologie humaine, y compris les signes cliniques et les atteintes neurologiques. Espèce réservoir naturelle du virus étudié, elle permet d’explorer les interactions hôte–virus–vecteur et la dynamique de transmission entre tiques et mammifères. Ce modèle sert aussi à l’étude d’autres virus neurotropes de la même famille, responsables d’encéphalites chez les rongeurs. Il offre une approche comparative des mécanismes d’infection, de pathogénicité et de persistance virale. La souris facilite l’infestation expérimentale par tiques infectées, rarement réalisable dans d’autres modèles, et dispose d’outils génétiques avancés pour analyser l’impact du fond génétique sur la sensibilité à l’infection. Enfin, la manipulation du virus exige un confinement strict, techniquement plus simple avec la souris qu’avec des espèces animales plus grandes ou difficiles à gérer. Pour la plupart des procédures, nous utiliserons des souris jeunes adultes (5-7 semaines) ou adultes (8-16 semaines) en nous basant sur la littérature et sur notre propre expérience concernant leur sensibilité au virus.

2 880 rongeurs, 1 440 souris et 1 440 rats, vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré, tous tués à l'issue pour prélever fluides et organes. Ils reçoivent une injection unique de vecteurs de thérapie génique, parfois précédée d'une chirurgie de dix à quarante minutes, puis subissent des pesées deux fois par semaine pendant deux mois, des prélèvements de sang ou d'urine et des hébergements individuels de vingt-quatre heures. Le porteur n'exclut ni toxicité hépatique, ni réponse immunitaire au vecteur, ni troubles de cicatrisation après injection intracérébrale. Les bénéfices annoncés pour les patients, doses plus faibles et toxicité moindre, restent au conditionnel, et le porteur écarte les méthodes sans animaux au motif que la biodistribution exigerait des "organismes complexes".

Objectifs

Les études de biodistribution d'un agent thérapeutique ont pour but d'évaluer la distribution, la localisation et la persistance de ce dernier dans les organes d'un rongeur. Ces études sont nécessaires pour évaluer la sécurité, l'efficacité et le potentiel thérapeutique des traitements de thérapie génique. Le suivi de la distribution permet de localiser l'agent thérapeutique suite à son administration et de vérifier qu'il cible la ou les régions visées. Des vecteurs viraux recombinants (adenovirus, lentivirus et virus adéno-associé) ou non-viraux (nanoparticules lipidiques, liposomes) peuvent être utilisés comme thérapie génique. L’administration de ce type de thérapie permet l’introduction d'un gène sain ou modifié dans l'ADN de l’organisme pour remplacer ou corriger un gène défectueux, l’inactivation ou la suppression d'un gène défectueux ou encore la correction d'une mutation génétique spécifique. Le risque potentiel de toxicité des agents thérapeutiques est évalué sur l'animal (toxicité propre du composé ou dûe à la distribution ciblée ou non ciblée sur les différents organes). Ces études sont réalisées à différents temps (de quelques jours à plusieurs semaines) afin de s'assurer que l'agent thérapeutique n'est pas éliminé rapidement, persiste pendant plusieurs semaines dans les tissus/organes ciblés et n'entraine pas d'effets délétères. Les études de biodistribution incluent également l'évaluation de l'expression génique de la protéine ciblée afin de déterminer le potentiel thérapeutique.

Bénéfices attendus

Les thérapies géniques constituent une classe de médicaments relativement récente. Pour certaines pathologies, ce sont les seules approches envisageables (par exemple les maladies génétiques). Dans certains domaines, ils ont permis des avancées significatives pour des pathologies qui ne répondent pas aux approches plus « traditionnelles ». Ce projet permettra d’évaluer l’efficacité et la sécurité de ces thérapies, afin de répondre aux mêmes critères de qualité pharmaceutique que n’importe quel autre médicament. Ce projet permettra aussi d’évaluer la possibilité de transfert et de ciblage de ces agents thérapeutiques. Un meilleur ciblage permet de limiter les doses utilisées chez les patients, de minimiser la toxicité liée à un ciblage non spécifique dans d’autres organes ou encore de limiter la réponse immunitaire à l'encontre des agents thérapeutiques. Ces études permettent d'évaluer de nouvelles thérapies pour des maladies où aucun traitement n'exitste jusqu'à maintenant (exemple de la maladie d'Alzheimer ou de Parkinson) ou d’optimiser les solutions thérapeutiques déjà existantes (patients qui deviennent résistants aux traitements traditionnels).

Procédures

Les agents thérapeutiques sont administrés une seule fois par un bolus rapide qui dure quelques secondes. Dans certains cas, l'administration nécessitera une phase chirurgicale durant entre 10 et 40 minutes. Les animaux seront manipulés pendant l'étude pour le suivi du poids corporel, ce qui peut entrainer un léger stress (quelques secondes, 2 fois par semaine sur maximum 2 mois). Des prélèvements sanguins ou d'urine (avec animaux hébergés individuellent pendant 24 heures maximum) ou des évaluations comportementales peuvent également être envisagés pendant l'étude (maximum une fois par semaine sur une durée de 2 mois) ou en fin d'étude pour compléter les données in vivo par des données biochimiques ou histologiques.

Impact sur les animaux

Dans ce projet, les phases d'administration et de prélèvement peuvent induire un léger stress chez l'animal, notamment du fait de la contention de ce dernier. Pour des administrations nécessitant une chirurgie au préalable, des douleurs post-opératoires peuevnt apparaitre malgré des soins péri-opératoires. Des problèmes de cicatrisation peuvent également être observés lors d'administrations intracérébrales, notamment si l'animal se gratte au niveau de la tête. Il ne peut être exclu l'apparition d’effets indésirables liés à l’administration des agents thérapeutiques, qui pourraient être ponctuels ou persister dans le temps. Il peut s’agir de douleurs ou d’un inconfort (par exemple perte de poids, douleur localisée au site d’injection, hyperthermie, stress, d'une toxicité (par exemple hépatique) ou d'une réponse immunitaire au vecteur et/ou au transgène.. Des périodes d'hébergement individuel (avec conservation de contact multi-sensoriel) pourraient être nécessaires dans le cadre de phase de récupération ou pour le recueil d’échantillons (par exemple urine, duree maximum de 24 heures), entrainant un léger stress des animaux.

Devenir

A l'issue de chaque procédure, les animaux sont euthanasiés pour prélévment (fluides et organes).

Remplacement

Les analyses in silico et les études in vitro permettent d’apporter les preuves de concept, de sélectionner les designs les plus pertinents, de raffiner les conditions d’utilisation des agents thérapeutiques. Cependant, le développement de telles stratégies thérapeutiques requiert des études menées sur des organismes complexes pour évaluer la biodistribution, la tolérance et éventuellement la toxicité.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés pour chaque test sera optimisé en incluant dans une même expérience le groupe « contrôle » nécessaire (groupe négatif ) ainsi que les groupes traïtés avec l'agent thérapeutique (dose-réponse). Les effectifs de chaque groupe seront définis afin d’obtenir une puissance statistique suffisante pour interpréter les résultats avec les tests statistiques les plus pertinents selon le(s) paramètre(s) étudié(s) et le design choisi, et apporter une conclusion. La réalisation d’un suivi clinique au cours de l’expérience (analyses comportementales, suivi hématobiochimique ou dosage de biomarqueurs par exemple) permettra de collecter des données supplémentaires sans inclusion d’un plus grand nombre d’animaux dans une étude donnée. Les échantillons qui seront prélevés pourront être utilisés pour des analyses complémentaires, dans le cas où certaines données seraient à confirmer.

Raffinement

Les procédures décrites seront optimisées pour limiter la douleur chez l'animal. Une période d’acclimatation des animaux est prévue à leur arrivée dans l’établissement. Les animaux seront hébergés groupés avec un enrichissement complet (par exemple des objets de nidification, des objets à ronger, la présence de congénères…). Pour les administrations nécessitant une chirurgie, des soins per- et post-opératoires seront réalisés (analgésie adaptée avant le début de la chirugie jusqu'à 48 heures après la chirugie). Des points limites clairement définis seront suivis pour évaluer les animaux dans chacune des études (aspect général, aspect du pelage, des yeux, la posture, les réactions de l’animal quand il est approché ou stimulé, la respiration, l’appétit, le poids, l’état d’hydratation, les tremblements ou les convulsions, la présence de plaie, de tumeurs ou autres évènements imprévisibles). Ainsi, la douleur sera réduite au maximum grâce au suivi des animaux.

Choix des espèces

Les études de biodistribution sont généralement réalisées chez des rongeurs sains car le potentiel thérapeutique de ces traitements géniques peut être évalué dans de nombreux modèles pathologiques chez la souris et le rat. Des modèles sont également mis en place sur des animaux présentant un système immunitaire humanisé, particulièrement d’intérêt dans le cadre d’études liées à la composante immunitaire..

Pour savoir si un régime cétogène suivi pendant la gestation produit chez la descendance des altérations comparables à un modèle d'autisme, 400 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour prélever leur cerveau. 320 relèvent du niveau de souffrance modéré, 80 du niveau léger. Elles subissent jusqu'à huit injections, quatre prélèvements de sang à la queue sur animal conscient, une chirurgie de trente minutes suivie d'une douleur post-opératoire modérée et une séance d'imagerie de trente minutes, les souriceaux étant en outre isolés de leur mère cinq minutes. Le porteur annonce des tests comportementaux sans les nommer, et estime l'effectif "sur la base de nos travaux précédents", sans autre précision.

Objectifs

Le trouble du spectre de l’autisme (TSA) reste encore mal compris, bien que des facteurs génétiques et environnementaux jouent un rôle clé dans l’apparition des symptômes chez les patients. Le TSA se caractérise par des troubles du comportement, en particulier dans les interactions sociales, ainsi que par des altérations des réseaux neuronaux cérébraux. Ce projet vise à déterminer si l’exposition maternelle à un régime cétogène, composé d’environ 80 % de lipides, pendant la gestation induit des changements comportementaux et cérébraux similaires à ceux observés dans un modèle classique de TSA. Étant donné la popularité croissante de ce régime alimentaire, il est essentiel d’en évaluer les risques pour la santé. Les résultats obtenus pourraient contribuer à une évaluation objective de la sécurité du régime cétogène pendant la gestation, en identifiant ses effets sur la santé neurocomportementale de la progéniture.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de mieux comprendre les mécanismes par lesquels une diète cétogène maternelle pourrait influencer le développement cérébral et les comportements de la progéniture. Ces connaissances pourront éclairer les professionnels de santé et les familles sur les implications de l’utilisation d’un régime cétogène durant la grossesse.

Procédures

Injections (entre 1 et 8 ; quelques secondes), prises de sang à l'extrémité de la queue sur animal vigile (4 moins de 1 minute), chirurgie sous analgésie et anesthésie (1, 30 minutes) et séance d’imagerie (30 minutes). Isolation maternelle pendant 5 minutes.

Impact sur les animaux

Douleurs légères et de courte durée lors des injections intrapéritonéales (IP) et sous-cutanées (SC), ainsi que lors des prélèvements sanguins. Douleur postopératoire modérée. Stress lié à l’habituation des animaux au cadre métallique, au dispositif d’imagerie ultrasonore et aux tests comportementaux.

Devenir

Les animaux seront mis à mort pour prélèvement et préservation de leur cerveau pour analyse post-mortem.

Remplacement

Aujourd’hui, les modèles en laboratoire (comme les cultures de cellules ou les organoïdes) ne permettent pas de remplacer totalement les animaux pour étudier le développement du cerveau des mammifères pendant la gestation, ni pour comprendre ses effets sur le comportement et le fonctionnement cérébral à l’âge adulte. Les animaux restent donc indispensables pour ces recherches.

Réduction

Le nombre de souris requis a été estimé sur la base de nos travaux précédents et les résultats analysés avec des tests statistiques adaptés.

Raffinement

Les souris seront élevées en groupes sociaux dans un environnement enrichi. L’apparition de signes de stress ou de douleur sera attentivement suivie et la poursuite des expériences déterminées en fonction d’une évaluation régulière de points limites appropriés. Des anesthésiques et analgésiques seront utilisés pour prévenir la douleur des animaux.

Choix des espèces

La souris représente un organisme modèle de choix pour mener ces études sur le développement des circuits cérébraux, principalement en raison de la similarité des mécanismes fondamentaux du développement entre la souris et l'homme. Nous utilisons des femelles gestantes d’au moins 6 semaines, car c’est le début de leur période de fertilité. Nous utilisons des souriceaux et animaux adultes de 2-4 mois car les tests comportementaux et les analyses de connections du cerveau ont été établies à cette âge.

Tuées pour prélever leur rate et leurs ganglions lymphatiques, 310 souris vont être utilisées dans ce projet modifié, 248 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger et 62 un niveau modéré. Chacune reçoit trois injections d'antigène espacées de quinze à vingt-et-un jours, parfois avec adjuvant, et subit jusqu'à trois prélèvements sanguins sur animal vigile à la veine saphène ou submandibulaire, chaque prise pouvant atteindre 10 % du volume sanguin circulant. Les souris génétiquement altérées, choisies pour produire des anticorps de spécificité humaine, peuvent en outre subir une biopsie tissulaire à dix jours d'âge. Le porteur reconnaît que des méthodes non animales produisent déjà les anticorps déjà caractérisés, et situe les solutions contre la syphilis, le paludisme et les virus Nipah et Hendra à "plus long terme".

Objectifs

L’un des développements les plus intéressants dans le domaine des thérapies est la génération d’anticorps humains pour les utiliser ensuite comme pistes de traitements dans de nombreuses indications cliniques, et particulièrement dans le domaine des vaccins. La Syphilis, le paludisme et l’infection au Nipah/Hendra sont des maladies aux conséquences lourdes dans de nombreux pays et continuent d’être parmi les défis de santé les plus importants. Le développement de vaccins, soit comme mode de prévention (Syphilis, Malaria) soit comme traitement en réponse à une pandémie (Nipah) constituerait une avancée majeure. L’objectif est de fournir de nouveaux anticorps monoclonaux humains contre des antigènes d’intérêt bien identifiés. Ce projet décrit les étapes à mettre en place pour disposer des cellules lymphoïdes secrétant les anticorps d’intérêt chez la souris, après immunisation de ces souris par les antigènes pré-identifiés. L’utilisation de souris génétiquement altérées permet de garantir la spécificité « humaine » des anticorps produits.

Bénéfices attendus

Le bénéfice à court terme est de disposer de cellules murines lymphoïdes secrétant des anticorps humanisés d’intérêt pour des applications thérapeutiques. Le bénéfice à plus long terme, est de disposer de solutions thérapeutiques (anticorps, vaccins) contre la Syphilis, la Malaria, ainsi que les virus Nipah-Hendra.

Procédures

3 injections préférentiellement par voie SC, les voies IP ou IM se font en dernier recours selon la nature de l’antigène, espacées de 15 à 21 jours. Pendant la période d’immunisation des prélèvements de sang de 150µL sont effectués (5 jours avant la première administration puis une semaine après la première et deuxième administration, soit au maximum 3 prélèvements sur animal vigile). Les prélèvements sanguins en cours d’étude sont réalisés sur animaux vigiles à la veine saphène, ou à la veine submandibulaire. Sur la durée totale de l’étude vivo (50 à 60 jours maximum), le volume de sang prélevé en une fois représente au maximum 10% du volume sanguin circulant. La durée de récupération entre chaque prélèvement sera de 12 à 14 jours. Dans quelques cas, le génotypage des souris génétiquement altérées, est effectué de façon invasive (biopsie tissulaire pratiquée à 10 jours d’âge).

Impact sur les animaux

La manipulation répétée de l’animal vigile pour les administrations ou prélèvements sanguins entraine un inconfort léger de courte durée. Les injections répétées d’adjuvant, parfois nécessaire pour stimuler la réponse immunitaire, peuvent entrainer une rougeur ou irritation au point d’injection, effet rarement observé avec les adjuvants utilisés. L’administration d’un antigène peut, très rarement, entrainer une réaction immunitaire exacerbée. Dans quelques cas, le génotypage des souris génétiquement altérées peut être effectué par une méthode invasive .

Devenir

Les animaux sont euthanasiés pour les prélèvements d’organes nécessaires à l’atteinte des objectifs de l’étude (récupération des cellules immunitaires).

Remplacement

Il existe des alternatives non animales pour produire des anticorps d’intérêt déjà caractérisés, mais à ce jour la phase vivo reste nécessaire à la création de clones de cellules compétentes pour de nouveaux anticorps. Elle permet en effet d’obtenir une très grande diversité d’anticorps qui seront ensuite triés, caractérisés par les méthodes alternatives pour générer les meilleurs.

Réduction

Le nombre d’animaux a été spécifiquement adapté pour chaque programme de recherche afin de limiter au maximum le nombre d’animaux. En effet les méthodes employées sont optimisées. Pour un antigène donné, un petit nombre d’animaux suffit à générer un grand nombre de cellules permettant la constitution d’une banque d’anticorps. Cependant il peut exister une plus ou moins grande variabilité de la réponse immunitaire d’un animal à l’autre. Cette variabilité est évaluée par le titrage des anticorps à partir de prélèvements d’échantillons sanguins au cours de l’immunisation. Si les titres d’anticorps sont trop faibles, il sera ajouté une ou deux administrations d’antigène afin d’en augmenter la production, sans avoir recours à des animaux supplémentaires.

Raffinement

Tous les antigènes administrés sont purifiés et caractérisés avant administration. Les adjuvants utilisés sont dépourvus d’effet indésirable, limitant considérablement le risque de réaction au site d’injection. Pour diminuer le stress lié à certaines injections, le geste technique sera réalisé sous anesthésie gazeuse. L’utilisation de cages équipées de système automatisé permettra d’améliorer la surveillance des animaux afin de mettre en place très rapidement les actions pour la prise en charge vétérinaire. Lors de l’observation de comportement agressif il sera ajouté de l’enrichissement au milieu d’hébergement.

Choix des espèces

L’animal utilisé est la souris immunocompétente car l’objectif est de générer des anticorps monoclonaux. L’utilisation de souris génétiquement altérées est prévue pour garantir la spécificité « humaine » des anticorps produits. Pour un antigène donné, un petit nombre d’animaux suffit à générer, à partir de la rate ou des ganglions lymphatiques, un grand nombre de cellules immunes B permettant la constitution d’une banque importante d’anticorps garantissant l’identification de candidats. Sachant que la réponse immunitaire est dépendante de l’âge, les études de génération d’anticorps monoclonaux seront réalisées sur des animaux âgés de 7-15 semaines pour garantir une réponse immunitaire optimale.