Procédures modérées

24 gobies à tache noire, des poissons de rivière, vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, tous tués à l'issue par surdose de MS-222. Pêchés à l'hameçon ou à la nasse dans la Saône, ils restent environ 24 heures à jeun en bourriche, puis jusqu'à 24 heures seuls dans une chambre de respirométrie immergée dans la rivière, pour mesurer leur consommation d'oxygène. Le projet cherche à comprendre la tolérance de cette espèce invasive aux variations de température et d'oxygène, avec des retombées pour la gestion des milieux renvoyées "à plus long terme". Le porteur les fait tuer plutôt que relâcher parce que l'espèce est invasive, en invoquant la réglementation.

Objectifs

Les cours d’eau sont des environnements fortement variables dans le temps, en particulier à l’échelle du cycle journalier, avec des fluctuations importantes de température et de disponibilité en oxygène. Ces variations représentent une contrainte majeure pour les organismes aquatiques, car une augmentation de la température accroît les besoins énergétiques tandis qu’une diminution de l’oxygène peut limiter la capacité à satisfaire ces besoins. Dans ce contexte, certaines espèces de poissons semblent particulièrement capables de tolérer ces conditions, notamment le gobie à tache noire (Neogobius melanostomus), une espèce invasive aujourd’hui largement répandue dans les cours d’eau français. Comprendre les mécanismes qui sous-tendent cette capacité de tolérance constitue un enjeu important pour mieux appréhender les dynamiques d’invasion biologique en milieu aquatique. L’objectif général du projet est de quantifier, en conditions naturelles, les performances métaboliques de cette espèce, en mesurant sa consommation d’oxygène directement en rivière, sur un cycle complet de 24 heures. Ces mesures permettront d’estimer le métabolisme minimal et maximal des individus, ainsi que leur capacité à ajuster leur dépense énergétique en fonction des variations naturelles de température et d’oxygène dissous. Plus spécifiquement, le projet vise à : (i) caractériser la variabilité du métabolisme individuel en conditions naturelles fluctuantes ; (ii) analyser la relation entre consommation d’oxygène et conditions environnementales (température, oxygène dissous) ; (iii) identifier dans quelle mesure ces capacités physiologiques peuvent contribuer à la tolérance de cette espèce aux conditions environnementales variables. Ce projet repose sur des mesures réalisées directement en milieu naturel, au plus proche des conditions écologiques rencontrées par les individus, afin de mieux comprendre le fonctionnement physiologique des poissons dans leur environnement réel.

Bénéfices attendus

Ce projet apportera des connaissances nouvelles sur la manière dont une espèce de poisson invasive, le gobie à tache noire (Neogobius melanostomus), ajuste son métabolisme face aux variations naturelles de son environnement. En mesurant directement la consommation d’oxygène des individus en rivière, sur un cycle complet de 24 heures, il permettra de mieux comprendre comment ce poisson répond à des fluctuations rapides de température et d’oxygène dissous, deux facteurs majeurs pour le fonctionnement des organismes aquatiques. Le projet contribuera ainsi à améliorer les connaissances sur les mécanismes physiologiques susceptibles de favoriser la tolérance de cette espèce à des conditions environnementales variables, voire contraignantes. Cette meilleure compréhension est particulièrement pertinente dans le contexte actuel de réchauffement des eaux continentales et d’augmentation de la fréquence des épisodes extrêmes, qui peuvent modifier les équilibres écologiques et favoriser certaines espèces opportunistes ou invasives. Au-delà du seul cas du gobie à tache noire, ce projet présente également un intérêt méthodologique et conceptuel plus large. Il permettra d’évaluer la faisabilité et l’intérêt d’une approche de respirométrie réalisée directement en milieu naturel, au plus près des conditions réellement rencontrées par les poissons. Cette démarche pourra alimenter de futurs travaux en écophysiologie de terrain en fournissant un cadre expérimental utile pour étudier les réponses physiologiques des animaux dans des environnements fluctuants. Enfin, les résultats obtenus pourront contribuer, à plus long terme, aux réflexions menées sur la gestion des milieux aquatiques et des espèces invasives, en identifiant certains contextes environnementaux potentiellement favorables au maintien ou à l’expansion de cette espèce.

Procédures

Les poissons seront capturés dans la Saône, soit par pêche au coup avec appât, soit à l’aide de nasses appâtées relevées dans un délai maximal de 12 heures. Après capture, ils seront maintenus temporairement dans l’eau de la rivière, dans de grandes bourriches, afin de limiter le changement de conditions environnementales. Ils resteront à jeun pendant environ 24 heures avant les mesures, afin de limiter l’influence de la digestion sur la consommation d’oxygène. Chaque poisson sera ensuite placé individuellement dans une chambre de respirométrie installée dans la rivière pendant 24 heures, afin d’enregistrer sa consommation d’oxygène dans des conditions naturelles. Le dispositif fonctionne en flux intermittent, avec une alternance de phases de mesure et de renouvellement de l’eau. Chaque animal est utilisé une seule fois dans la procédure. Il n’y a ni chirurgie, ni prélèvement invasif sur animal vivant, ni administration expérimentale de substance. À l’issue de la mesure, les poissons sont euthanasiés conformément à la réglementation applicable à cette espèce invasive.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables attendus sont principalement liés au stress physiologique induit par : (i) la capture en milieu naturel (pêche au coup, nasses), (ii) le maintien temporaire en bourriche (mise à jeun), et (iii) le confinement en chambre de respirométrie en milieu naturel, ainsi qu’aux manipulations associées (transferts, installation dans les chambres). Ces contraintes peuvent entraîner des réponses comportementales (agitation, prostration transitoire), une augmentation de la ventilation, et potentiellement favoriser des troubles immunitaires chez des individus fragilisés. Effets indésirables spécifiques attendus : • Lésions légères possibles au niveau buccal lors de la pêche au coup (hameçon), et stress/confinement dans les nasses (limité par un relevé ≤ 12 h). • Jeûne pré-mesure (24 h en bourriche) : potentiellement inconfortable mais nécessaire pour éviter les biais liés à la digestion. • Isolement temporaire lors de la respirométrie (< 24 h) pouvant induire un stress social/comportemental ; il sera limité au strict nécessaire. • En respirométrie en milieu naturel, l’oxygène dissous et la température varient naturellement au cours du nycthémère ; ces fluctuations peuvent induire une contrainte physiologique (hyperventilation, baisse d’activité). Elles seront encadrées par des points limites et des critères d’arrêt. Tous les signes cliniques et comportementaux (respiration, posture, activité, lésions) seront surveillés. Les individus présentant des altérations persistantes seront retirés du protocole. En cas d’atteinte des points limites ou à l’issue de la procédure expérimentale, une euthanasie sera pratiquée par surdose de MS-222 tamponné, conformément à la réglementation applicable à cette espèce invasive.

Devenir

À l’issue des mesures, les poissons ne sont pas relâchés dans le milieu naturel, le gobie à tache noire étant une espèce invasive dans les rivières françaises. Conformément à la réglementation en vigueur, tous les individus sont euthanasiés à l’issue des mesures, par surdose d’anesthésique, afin d’éviter toute dispersion de l’espèce. Ce choix permet à la fois de répondre aux contraintes réglementaires liées à la gestion des espèces invasives et de garantir une fin de procédure rapide, limitant la souffrance des animaux. Si un individu doit être retiré du protocole avant la fin de la mesure (par exemple en cas de blessure ou de signes de détresse), il est immédiatement euthanasié selon la procédure décrite, afin d’éviter toute souffrance prolongée.

Remplacement

À ce jour, il n’existe pas d’alternative permettant de répondre à l’objectif du projet sans recourir à des poissons vivants. Le projet vise à mesurer, en conditions naturelles, la consommation d’oxygène du gobie à tache noire en lien avec les variations de température et d’oxygène dissous rencontrées en rivière au cours d’un cycle de 24 heures. Ces réponses dépendent du fonctionnement intégré de l’organisme entier, incluant la respiration, la circulation, l’activité spontanée et les interactions avec l’environnement. Des approches alternatives, telles que les mesures physico-chimiques du milieu, la modélisation, l’exploitation de données bibliographiques ou des approches sur tissus et cellules isolés, peuvent contribuer à interpréter les résultats, mais elles ne permettent pas d’estimer directement la consommation d’oxygène d’individus vivants dans leur environnement naturel, ni d’appréhender leurs réponses physiologiques en situation réelle. Le recours à des animaux vivants est donc indispensable pour atteindre les objectifs scientifiques du projet. Le protocole a toutefois été conçu de manière à limiter au maximum l’utilisation des animaux à ce qui est strictement nécessaire, avec une approche peu invasive reposant sur une mesure réalisée directement en milieu naturel, sans chirurgie, sans administration de substance et sans maintien prolongé en captivité.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés dans ce projet a été limité au strict nécessaire afin de répondre aux objectifs scientifiques tout en garantissant la robustesse des analyses. La stratégie de réduction repose sur un plan d’échantillonnage contraint par le dispositif expérimental de terrain. Les mesures de consommation d’oxygène étant réalisées sur une durée de 24 heures par individu, et le dispositif comprenant deux respiromètres fonctionnant simultanément, le nombre maximal d’individus pouvant être étudiés est de deux par jour. Sur une période de 12 jours, l’effectif total est ainsi limité à environ 24 individus. Ce nombre correspond au compromis entre (i) la nécessité de couvrir une variabilité environnementale réaliste (cycle jour/nuit et fluctuations naturelles de température et d’oxygène dissous) et (ii) la contrainte de durée des mesures individuelles. Il permet d’obtenir un nombre suffisant de réplicats indépendants pour analyser la variabilité interindividuelle et les relations entre métabolisme et conditions environnementales. L’approche retenue ne repose pas sur des procédures répétées sur un même individu, ce qui permet de limiter la contrainte cumulée et d’éviter une augmentation du nombre total d’animaux liée à des pertes ou des effets d’habituation. Enfin, aucun animal n’est soumis à des procédures invasives ou à des manipulations supplémentaires (chirurgie, prélèvements, traitements expérimentaux), ce qui permet de maximiser l’information obtenue par individu tout en maintenant un effectif global réduit.

Raffinement

Le protocole a été conçu afin de réduire au minimum la douleur, le stress et la durée des manipulations imposées aux animaux. La capture est réalisée à l’aide de méthodes peu traumatiques et sélectives (pêche à la ligne avec appât et nasses appâtées), avec un relevé des nasses dans un délai maximal de 12 heures afin de limiter le confinement prolongé. Les manipulations sont brèves, réalisées avec du matériel humidifié et en limitant au maximum l’exposition à l’air. Après capture, les poissons sont maintenus en bourriches immergées directement dans l’eau du site, ce qui permet de conserver des conditions physico-chimiques proches de leur environnement naturel (température, oxygène dissous), et de limiter le stress lié à un changement de milieu. Cette phase inclut une période de mise à jeun d’environ 24 heures, nécessaire pour la mesure du métabolisme, tout en permettant une récupération partielle du stress de capture. La respirométrie in situ constitue une approche peu invasive, reposant uniquement sur un confinement temporaire dans une chambre immergée, sans chirurgie, sans prélèvement sur animal vigile et sans administration de substance. Le dispositif fonctionne en flux intermittent, assurant un renouvellement régulier de l’eau à partir du milieu naturel. Afin de limiter les contraintes physiologiques liées aux variations naturelles de l’environnement (température, oxygène dissous), des points limites et des critères d’arrêt sont définis. Toute altération marquée et prolongée du comportement ou de la respiration (perte d’équilibre, ventilation excessive, absence de récupération) entraîne l’arrêt de la mesure et le retrait de l’individu. Une surveillance régulière des animaux est assurée tout au long du protocole, en particulier lors des premières mises en place, afin de vérifier le bon fonctionnement du dispositif et l’absence de détresse. Les manipulations répétées sont évitées afin de ne pas perturber les mesures et de limiter le stress. À l’issue de la procédure, les animaux sont euthanasiés par surdose d’anesthésique (MS-222 tamponné), permettant une perte rapide de conscience et limitant la souffrance, conformément à la réglementation applicable aux espèces invasives.

Choix des espèces

Le gobie à tache noire (Neogobius melanostomus) a été choisi comme modèle en raison de son impact écologique et de son succès invasif dans plusieurs cours d’eau français (notamment Saône, Doubs, Moselle). Espèce benthique exotique envahissante, il colonise rapidement des habitats variés et peut entrer en compétition avec des espèces autochtones, notamment en occupant des zones à faible oxygénation parfois moins accessibles à d’autres poissons. Son comportement locomoteur (déplacements par bursts, maintien au substrat) et sa tolérance apparente aux contraintes de rivière (variations de température et d’oxygène dissous) en font un modèle pertinent pour tester l’hypothèse selon laquelle des aptitudes métaboliques (SMR, MMR, AS, plasticité) favorisent l’établissement et la dispersion en milieu variable. L’espèce est classée LC (préoccupation mineure) ; la capture d’un effectif limité, sous autorisation préfectorale, n’est pas susceptible d’impacter les populations locales. Les animaux utilisés seront des gobies subadultes à adultes, mesurant environ 8 à 15 cm. Ce choix est justifié par deux raisons principales : - (1) Compatibilité technique – cette gamme de tailles est la plus adaptée aux chambres de respirométrie de terrain (volume de chambre et rapport masse/volume permettant une mesure précise de la consommation d’oxygène sur 24 h, tout en laissant au poisson un espace suffisant pour se retourner) ; - (2) Pertinence écologique – ces tailles correspondent aux classes d’âge les plus fréquemment rencontrées dans les populations envahissantes de rivière et impliquées dans l’occupation des habitats et la compétition avec les espèces autochtones. Elles sont donc pertinentes pour tester l’hypothèse d’une tolérance/plasticité métabolique contribuant au succès invasif dans un environnement fluvial variable (température et oxygène dissous).

Jusqu'à huit séances d'imagerie de 45 minutes sous anesthésie, avec pose d'un cathéter dans la queue pour injecter l'agent de contraste : 1 092 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue pour l'analyse de leurs tissus. Leur arthrose ou leur arthrite est provoquée par une injection dans le genou ou par une chirurgie de 20 minutes, pour valider des agents de contraste censés rendre visible l'inflammation articulaire. Le porteur choisit les souris Swiss pour leurs "veines plus larges" et les C57BL/6J pour la reproductibilité de leurs lésions articulaires. Il affirme que ces procédures présentent "un caractère de stricte nécessité" et que seul un "organisme entier" permet de suivre la distribution des agents.

Objectifs

L'arthrose est une maladie articulaire dégénérative caractérisée par la destruction progressive du cartilage, un remodelage de l'os sous-chondral et une inflammation synoviale. Ces altérations, qui touchent l’ensemble de l’articulation, entrainent notamment des douleurs chroniques et une diminution de la mobilité. En préclinique, si l'étude de la physiopathologie arthrosique est bien établie, peu de techniques permettent un suivi longitudinal non invasif, pourtant indispensable pour évaluer l'efficacité de traitements potentiels. De plus, les techniques d’imageries actuelles en pratique clinique se limitent globalement à une évaluation de la destruction articulaire, mais ne sont pas en mesure d’évaluer la participation inflammatoire à un temps donné, ce qui limite les propositions thérapeutiques et ne permet pas de proposer une médecine personnalisée. L’objectif de ce projet est donc de valider une nouvelle approche d’imagerie moléculaire non invasive permettant de visualiser l’inflammation articulaire dans des modèles murins d’arthrose. Chez l'homme, il a été démontré que l'inflammation synoviale est marquée par une surexpression de marqueurs de l’inflammation des vaisseaux sanguins et de la membrane synoviale. Ces protéines sont impliquées dans le recrutement de cellules immunitaires induisant une inflammation de l’articulation. Les taux circulants de certaines de ces protéines sont d'ailleurs reconnus comme biomarqueurs prédictifs du risque de chirurgie de la hanche et du genou en cas d’arthrose sévère. L’imagerie permettra de visualiser l’inflammation grâce à des agents de contraste magnétiques ciblant les protéines d’adhésion cellulaire. Cette stratégie permettra de caractériser la dynamique inflammatoire au cours de différentes formes d’arthrose expérimentale, et d’évaluer la possibilité de proposer un traitement ciblé (anti-inflammatoire ou anti-arthrosique selon la prédominance ou non de l’inflammation). Collectivement, ces résultats permettraient une approche non invasive, translationnelle, permettant in fine de mieux appréhender la maladie arthrosique chez les patients pour leur proposer le traitement le plus adapté.

Bénéfices attendus

Cette étude serait la première à démontrer la possibilité d'imager l'inflammation articulaire de manière aussi précise in vivo, dans des modèles murins d’arthrose et d'arthrite. La validation de cette technique fournirait une méthode d'étude non invasive permettant un suivi longitudinal et diminuerait significativement le nombre d'animaux nécessaires aux études précliniques. De plus, les produits de contraste sont développés de manière à être biocompatible et biodégradable, afin de pouvoir être utilisés en clinique. De cette manière, cette méthode permettrait de faciliter le diagnostic de l’arthrose et d’autres maladies inflammatoires ainsi que l’évaluation de l’efficacité des traitements. L’utilisation d’agents de contraste biodégradables renforcent la possibilité de translation clinique.

Procédures

Les animaux seront exposés à des pesées 1 fois par semaine (durée inférieure à 5 minutes) ; injection dans le genou (environ 2 min) pour l’induction d’arthrite ou d’arthrose chimique et pour l’administration de traitements ; une chirurgie rapide pour l’induction de l’arthrose mécanique (environ 20min) pratiquée sous anesthésie générale avec une analgésie adaptée ; pose d'un cathéter pour l'administration de l'agent de contraste sous anesthésie profonde (environ 15 minutes) ; réalisation d'examens d'imagerie (environ 45 minutes). Les traitements anti-arthrosiques auront lieu soit par injection soit par prise orale 1 à 5 fois par semaine selon le protocole. L’ensemble des souris passeront maximum 1 fois par semaine en imagerie sur une période de 8 semaines.

Impact sur les animaux

L’induction d’arthrite ou d’arthrose (modèle chimique) n'entraîne pas de souffrance particulière à l’animal (pas de boiterie ou de douleur particulière). L’induction de l’arthrose chirurgicale peut entraîner des douleurs liées à l’ouverture des différents plans (peau et muscle). Après les différents protocoles d’induction de l’arthrose, aucune douleur n’est attendue après 24h. Les examens d’imagerie se dérouleront sous anesthésie générale des animaux. Cependant, la pose du cathéter veineux dans la queue pour l'administration de l'agent de contraste peut provoquer un hématome.

Devenir

Les animaux sont mis à mort à l’issue des procédures afin de pouvoir procéder à l’analyse des tissus.

Remplacement

Les tests in vitro réalisés sur des lignées de cellules ne permettent pas d’évaluer l’action des agents de contraste dans un organisme entier, leur distribution dans l’organisme, ni leur capacité à détecter une inflammation articulaire dans un contexte physiopathologique réaliste. Les modèles in vitro ne permettent pas non plus de reproduire fidèlement la complexité de l’articulation, qui repose sur des interactions entre plusieurs tissus (os, cartilage, synoviale, endothélium) et sur une composante mécanique essentielle dans l’apparition et l’évolution de l’arthrose. Le recours au modèle murin permet d’intégrer ces différents paramètres au sein d’un organisme entier. Ainsi, les procédures expérimentales décrites dans ce projet présentent un caractère de stricte nécessité et ne peuvent pas être remplacées par des méthodes alternatives sans animaux permettant d’obtenir un niveau d’information équivalent.

Réduction

Le nombre d’animaux a été déterminé à l’aide de tests statistiques de puissance afin d’utiliser un effectif suffisant pour mettre en évidence des différences biologiquement pertinentes, tout en évitant l’utilisation d’un nombre excessif d’animaux. Le recours à l’imagerie permet un suivi non invasif des mêmes animaux au cours du temps, réduisant ainsi le nombre total de souris nécessaires par rapport à des approches nécessitant des mises à mort à différents temps. De plus, la validation de l’imagerie de l’inflammation permettra sa réutilisation dans d’autres projets portant sur les maladies inflammatoires, permettant à terme une réduction du nombre d’animaux utilisés dans ce domaine de recherche.

Raffinement

Les animaux seront contrôlés quotidiennement pour évaluer et réduire au maximum tout risque de douleur. Des points limites spécifiques ont été définis pour chaque procédure. Les gestes susceptibles d’entraîner une douleur ou un stress seront réalisés sous anesthésie et l’administration d’un analgésique est prévu pour limiter la douleur. Les conditions de vie seront améliorées au maximum. Les souris seront hébergées en groupes sociaux de 5 individus maximum par cage, avec un accès à la nourriture et à l’eau à volonté et du matériel de nidification et un igloo.

Choix des espèces

Pour les expériences de validation des agents de contraste dans un modèle d’arthrite, des souris Swiss seront utilisées. Cette souche est particulièrement adaptée car elle présente un accès vasculaire facile facilitant la pose du cathéter (veines plus larges) et le modèle d’arthrite sur cette souche est bien décrit dans la littérature. Pour les expériences d’arthrose, des souris C57BL/6J seront utilisées, car cette souche est largement utilisée et validée dans les modèles murins d’arthrose, notamment pour tester l’efficacité de nouveaux traitements anti-arthrosiques. Elle présente une bonne reproductibilité des lésions articulaires et des réponses inflammatoires. L’ensemble des souris SWISS et C57BL/6J seront âgées de 8 à 10 semaines. Ce stade de développement correspond à des animaux adultes, en fin de croissance.

Une chirurgie de six heures pour implanter une chambre d'enregistrement dans le crâne, jusqu'à cinq séances d'IRM sous anesthésie, puis deux heures par jour en chaise cinq jours par semaine : 5 macaques rhésus vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. L'entraînement et les enregistrements de neurones durent de 6 à 24 mois selon l'estimation du porteur, pour comprendre comment le cortex auditif code la voix. À la fin, le connecteur est retiré mais les électrodes restent sous la dure-mère, et les macaques peuvent être réutilisés dans d'autres projets, potentiellement 3 sur 5, ou replacés dans des groupes reproducteurs d'élevage, potentiellement 2. Le porteur mentionne un "contrôle hydrique" quotidien sans en préciser les modalités ni la quantité d'eau laissée aux macaques.

Objectifs

La voix humaine est l’un de nos signaux sociaux les plus puissants. En une fraction de seconde, nous reconnaissons qui parle, percevons son émotion et devinons son intention. Cette aptitude remarquable n’est pas propre à l’être humain : les macaques, les ouistitis et d’autres primates extraient eux aussi des informations sur l’identité et l’état affectif à partir des vocalisations, afin de s’orienter dans leurs environnements sociaux complexes. Les études de neuroimagerie ont mis en évidence des « patchs vocaux» (« voice patches ») chez l’humain—, et plus récemment chez le macaque et le ouistiti, suggérant l’existence d’une architecture neuronale conservée pour le décodage des voix, façonnée par des millions d’années d’évolution des primates. Cependant, nous ne disposons toujours pas d’un modèle au niveau neuronal expliquant comment les voix sont représentées dans le cerveau. L’IRM fonctionnelle permet de localiser les régions du cerveau sensibles à la voix, mais ces cartes ne permettent pas d’expliquer comment les populations de neurones encodent les voix. Ce projet vise à combler ce fossé en passant des cartes corticales aux neurones individuels chez le macaque. Le projet cartographiera les neurones sélectifs aux voix chez n=5 macaques à l’aide d’enregistrements des neurones à haute densité guidés par IRM fonctionnelle. Il modélisera comment les neurones respondent aux voix à partir de descripteurs acoustiques et de réseaux neuronaux profonds, afin de révéler les stratégies de représentation vocale chez le macaque.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra une compréhension unique de l’information vocale contenue dans l’activité de populations de neurones individuels du cortex auditif secondaire. Ceci contribuera à notre connaissance des mécanismes neuronaux de la communication, avec un impact potentiel sur le développement des nouvelles générations d’implants corticaux pour restaurer/augmenter l’audition.

Procédures

Chaque animal sera soumis aux interventions suivantes : - Déplacement au centre IRM pour acquisition d'images IRM, sous anesthésie pour une durée totale d'environ 3h ; - Chirurgie d'implantation de chambre d'enregistrement, sous anesthésie, pour une durée d'environ 6h ; - La prise quotidienne de l'animal en chaise pour entrainement et enregistrements électrophysiologiques, environ 2h, 5 jours par semaine, ainsi que le contrôle hydrique . Un maximum de 5 sessions d’imagerie par animal sera effectué pour la localisation des aires sensibles à la voix (limitées à 1 ou 2 en cas de résultats concluants). L’entrainement à la tâche et l’enregistrement pendant la tâche seront effectués 5j/semaine pendant la durée de l'expérience, qui n'est pas définissable a priori. Une estimation vraisemblable serait entre 6 et 24 mois (entrainement 3- 6 mois / enregistrement 3-18 mois) selon l'avancement de l'entraînement des animaux et la qualité des enregistrements. Dans le cas d'un protocole d'enregistrement plus long, une prolongation serait demandée à la SBEA.

Impact sur les animaux

Stress lié à la capture en cage de contention: Douleur liée à la piqûre pour les anesthésies; Risques liés à l'anesthésie pour l’IRMf et la chirurgie d’implantation; Irritation de la trachée liée à l’intubation pour l’anesthésie gazeuse; Douleur post-opératoire pour l'implantation; Possibles infections au niveau des implants.

Devenir

Tous les animaux sont gardés en vie à l'issue de la procédure. Une fois les enregistrements terminés, les animaux subissent une chirurgie de dé-implantation du connecteur (les électrodes subdurales sont laissées en place pour éviter une nouvelle craniotomie). Après cicatrisation et récupération, ils peuvent soit être réutilisés dans es projets pour lesquels la présence d’électrodes dans le lobe temporal n’est pas gênante (potentiellement 3/5), ou replacés dans des groupes reproducteurs dans des élevages (potentiellement n=2).

Remplacement

Le but du projet est de comprendre comment les neurones dans les aires sélectives à la voix du cortex auditif traitent l’information vocale. Les enregistrement de neurones isolés dans les aires de la voix sont inexistants chez l’humain, il est donc nécessaire d’avoir recours à des animaux pour cette recherche.

Réduction

Réduction du nombre d’animaux au minimum (n=5) pour obtenir des résultats chez au moins deux (voire trois singes) sur chacune des expériences prévues sur 5 ans, étant donné la complexité de la chirurgie qui implique un certain risque, et la possibilité que des matrices cessent de donner du signal exploitable après quelques mois. Si nous obtenons suffisamment de données neurophysiologiques pour une analyse statistique satisfaisante chez trois animaux, nous n'en utiliserons pas d’autres. Pour chaque animal, l’enregistrement avec plusieurs microélectrodes multi-contacts permettra de mesurer l’activité de populations neuronales dans plusieurs structures corticales et sous-corticales. La richesse des enregistrements multi-électrodes offre la possibilité de réaliser de très nombreux types d’analyses portant sur les potentiels d’actions de neurones isolés (modulation de fréquence de décharges ou de synchronisation entre neurones dans différentes périodes de la tâche ou dans différentes structures), sur les populations de neurones (distribution spatiale de l’activité, moyennes de populations), sur les potentiels de champs locaux (LFP) et sur la synchronisation entre LFP et potentiels d’actions. La répétition des séances d’enregistrement sur plusieurs mois a pour objectif d’augmenter le nombre de neurones différents enregistrés dans chaque structure. Cette augmentation permet d’augmenter la puissance statistique de nos analyses. La durée totale des enregistrements pour un animal est étroitement dépendante de la durée de vie des implants, qui cessent de donner un bon signal après une période pouvant aller de plusieurs mois à quelques années. LA REUTILISATION D'ANIMAUX PERMETTRA LA REDUCTION DU NOMBRE DE NOUVEAUX ANIMAUX UTILISES.

Raffinement

Les animaux sont hébergés en paires dans des cages et volière enrichis de perchoirs, de cordes et de jeux suspendus, pour favoriser les comportements exploratoires et aussi le retour à une activité normale en période post-chirurgicale. Après un délai minimal d'une semaine et selon l'état de récupération après l’implantation, l'animal sera sorti en chaise afin de reprendre une routine qui lui est familière. Les méthodes de renforcement positif (training et habituation) seront utilisées afin de réduire le stress des sujets. L'IRM anatomique et fonctionnelle seront réalisés sous anesthésie générale afin de s'assurer de l'inconscience de l'animal, réduisant de fait le stress de l'animal lors de la réalisation de la procédure. Lors d'interventions chirurgicales, en plus de l'anesthésie, un analgésique sera administré et prolongé en période post-opératoire. Des points limites précoces et adaptés seront appliqués.

Choix des espèces

Les raisons justifiant le choix des macaques comme espèce de comparaison sont les suivantes : - Ils sont relativement proches de nous sur le plan phylogénétique de sorte que les résultats nous renseigneront sur l'histoire de l'évolution relativement récente ; - Ils utilisent des vocalisations complexes et variées, bien caractérisées acoustiquement; - Il s'agit d’un modèle neuroscientifique largement étudié, en particulier pour les neurosciences auditives, de sorte que les résultats obtenus seront interprétables en relation avec une grande quantité de données complémentaires; - Enfin, ils peuvent être scannés en IRMf sur le même scanner que les humains, ce qui constitue un pont unique entre l'IRMf humaine et la littérature électrophysiologique sur les singes. Les animaux seront préférentiellement utilisés au stade de jeune adulte/adulte. A ce stade du développement, les animaux ne sont plus en croissance et leurs besoins physiologiques sont stabilisés. Cela permet un contrôle plus précis des protocoles expérimentaux, que ce soit en termes de volume des récompenses utilisées pour l'apprentissage par renforcement, de contrôle du régime alimentaire dans la cage ou de localisation des structures cérébrales cibles pour les implants chirurgicaux. Par ailleurs, les animaux étant encore jeunes, ils présentent une meilleure tolérance aux procédures expérimentales et une meilleure récupération suite aux procédures nécessitant une anesthésie. Des animaux plus jeunes mais ayant déjà atteints leur maturité sexuelle pourraient être utilisés pour les premières phases d'habituation (entrainement à la tâche auditive) et être ainsi jeunes adultes lors du commencement des parties ultérieures de la procédure (implantation, électrophysiologie).

180 souris, issues d'une lignée privée d'un gène ou d'une lignée porteuse d'un gène rapporteur, vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. Elles reçoivent une injection d'interféron, qui peut provoquer une douleur locale, un stress aigu, une inflammation des organes ou une stéatose du foie, puis sont tuées pour prélever foie, muscle, tissu adipeux et cerveau. Le but est d'identifier les ARN ciblés par une protéine que le porteur appelle "notre protéine d'intérêt", impliquée selon lui dans la défense antivirale. Il présente la souris comme "le modèle le plus adapté", tout en indiquant que des cultures de macrophages et de cellules dendritiques servent déjà à une partie des analyses.

Objectifs

Notre gène d'intérêt permet la production d'une protéine multifonctionnelle impliquée dans la régulation du métabolisme des lipides, la biologie des acides ribonucléiques, et la réponse immunitaire. Bien que son rôle dans le métabolisme soit bien documenté (résistance à l’obésité et au diabète sous régime riche en graisses), des études récentes suggèrent qu’elle joue également un rôle clé dans la défense antivirale. En effet, elle est induite par l’interféron (IFN), une protéine produite naturellement par notre organisme pour aider à se défendre contre les infections, surtout les virus, et semble impliquée dans la réponse aux infections par des virus tels que ceux de l’hépatite C et de la dengue. Ses activités enzymatiques lui permettent de moduler la stabilité des ARN et de participer à la régulation de l’expression génique, ce qui en fait une candidate idéale pour étudier son implication dans la réponse immunitaire, notamment via les voies de l’interféron. Deux lignées de souris ont été générées : une lignée avec une inactivation complète de son expression, et une lignée avec un gène rapporteur permettant de suivre son expression dans l'organisme. Les souris n'exprimant plus la protéine sont viables et ne présentent pas de phénotype délétère, ce qui permet d’étudier leur réponse immunitaire sans biais lié à une pathologie sous-jacente. Ce projet vise à explorer le rôle de cette protéine dans la réponse antivirale et la régulation immunitaire, en se concentrant sur : 1) L’expression spatio-temporelle de cette protéine dans les tissus immunitaires (rate, foie, ganglions lymphatiques, poumons) après stimulation par de l’interféron. 2) L’identification de ses acides ribonucléiques cibles par séquençage du transcriptome, en comparant les profils d’expression génique entre tissus de souris sauvages et mutantes.

Bénéfices attendus

L'étude de cette protéine et la réponse interféron apporte des avancées scientifiques, médicales et sociétales. Elle clarifie le rôle de notre protéine d'intérêt dans la signalisation interféron et la réponse antivirale, en identifiant ses acides ribonucléiques cibles via le séquençage du transcriptome, révélant ainsi ses mécanismes moléculaires. Sur le plan médical, cette protéine pourrait devenir une cible thérapeutique pour renforcer les thérapies antivirales (hépatite C, dengue) ou moduler les réponses immunitaires excessives dans les maladies auto-immunes. Des modulateurs de cette protéine pourraient améliorer la réponse antivirale ou limiter l’inflammation, tandis que son expression pourrait servir de biomarqueur pour évaluer la sévérité des infections ou la réponse aux traitements. Méthodologiquement, ces sourisoffrent des outils pour explorer son rôle dans d’autres pathologies comme le cancer. Les techniques transcriptomiques, protéomiques et histologiques permettent une analyse complète de la réponse immunitaire. Enfin, cette étude pourrait réduire les coûts des maladies virales chroniques et préparer aux futures épidémies en développant des antiviraux ou modulateurs immunitaires ciblant cette protéine, impactant ainsi la santé publique et la médecine personnalisée.

Procédures

Cette étude sur le rôle de notre protéine d'intérêt dans la réponse interféron implique une injection d’interféron, qui ne prends que quelques secondes, par animal. À la fin de l’étude, les souris sont mises à mort pour prélever divers tissus (foie, muscle, tissu adipeux, cerveau) afin d’effectuer des analyses approfondies.

Impact sur les animaux

Cette étude sur le rôle de notre protéine d'intérêt dans la réponse interféron implique des nuisances animales. Les injections d’interféron peuvent causer une douleur locale et un stress aigu. Les organes cibles (foie, rate, poumons) pourront présenter des réactions spécifiques, comme une inflammation ou une stéatose hépatique.

Devenir

Tous les animaux sont mis à mort en fin de procédure expérimentale afin de prélever les tissus d'intérêt.

Remplacement

Dans cette étude, il n’existe pas d’alternative in vitro ou in silico permettant d’étudier la réponse interféron systémique dans un contexte physiologique complet. Cependant, des approches complémentaires sont utilisées pour limiter le recours aux animaux. Par exemple, des cultures cellulaires primaires (macrophages, cellules dendritiques) sont employées pour certaines analyses ex vivo, réduisant ainsi le nombre d’animaux nécessaires pour les expériences in vivo. De plus, les résultats obtenus chez la souris pourront être validés in vitro sur des lignées cellulaires murines ou humaines, ce qui permettra de réduire le nombre d’expériences animales futures.

Réduction

Dans cette étude, le nombre d’animaux est limité à 8 par groupe expérimental, un effectif qui permet d’atteindre une puissance statistique de 80 à 90 % pour détecter des différences significatives dans la réponse interféron ou l’expression des gènes stimulés par l’IFN. HELZ2 étant une ribonucléase, notre hypothèse est qu’elle aura un impact significatif sur le transcriptome suite à son induction et conduit à un effectif minimal de 8 animaux par groupe permettant de détecter les différences biologiquement pertinentes attendues tout en respectant le principe de réduction du nombre d'animaux utilisés. Les échantillons prélevés sont réutilisés pour plusieurs analyses (histologie, qPCR, Western blot), maximisant ainsi les données obtenues par animal.

Raffinement

Les animaux sont hébergés dans des cages enrichies (nids, tunnels, matériaux à ronger) pour réduire leur stress environnemental. Les manipulations sont réalisées par du personnel formé aux techniques douces, et les injections sont effectuées avec des aiguilles fines pour minimiser la douleur. Une surveillance rapprochée des animaux est assurée, avec des évaluations régulières du comportement des animaux. Des critères d’arrêt stricts sont définis : tout animal présentant une léthargie persistante ou une souffrance apparente sera immédiatement mis à mort.

Choix des espèces

La souris (Mus musculus) est le modèle le plus adapté pour étudier le rôle de notre protéine d'intérêt dans la réponse à l’interféron. Son génome hautement conservé avec l’humain, notamment pour les gènes impliqués dans la réponse immunitaire, permet une extrapolation fiable des résultats. Les lignées génétiquement modifiées, spécifiques à cette étude, permettent d’analyser précisément les effets de l’inactivation ou de l’expression de notre protéine sur la signalisation de l’interféron, sans interférence avec des phénotypes pathologiques sous-jacents. La souris est également le modèle de choix pour les études immunologiques, grâce à la disponibilité d’outils spécifiques (anticorps, cytokines recombinantes) et à sa réponse immunitaire bien caractérisée. Son utilisation permet d’étudier les interactions cellulaires complexes et les effets systémiques de notre protéine, impossibles à reproduire in vitro. Aucun autre modèle animal ne combine ces avantages pour une étude aussi complète. L'âge des souris utilisées dans cette étude, 6 à 8 semaines, a été choisi pour des raisons scientifiques, physiologiques et pratiques. À cet âge, les souris ont atteint une maturité immunitaire complète, ce qui est crucial pour étudier les réponses immunitaires innées et adaptatives. Leur système immunitaire est pleinement développé, avec des populations cellulaires (lymphocytes, macrophages, cellules dendritiques) et des voies de signalisation (comme celles de l’interféron) comparables à celles des adultes. Cela permet d'éviter les variations liées à l'immaturité immunitaire des souris plus jeunes ou aux altérations liées au vieillissement chez les souris plus âgées. De plus, les souris de 6 à 8 semaines présentent une taille et un poids optimaux pour les manipulations expérimentales. Leur taille facilite les injections intrapéritonéales et les dissections. Enfin, cet âge correspond à une période de stabilité physiologique, où les souris ne sont ni en croissance rapide (comme les jeunes) ni sujettes aux pathologies liées à l’âge (comme les souris plus âgées). Cela garantit des résultats reproductibles et minimise les variations inter-individuelles, assurant ainsi la rigueur scientifique de l’étude.

Les souris de ce projet portent des méningiomes, des tumeurs des enveloppes du cerveau, obtenus par modification génétique ou par injection, et les formes malignes peuvent provoquer convulsions, amaigrissement et perte de motricité au point d'empêcher l'alimentation. 540 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue pour une analyse histologique du cerveau. Elles subissent une chirurgie d'une heure pour une injection dans le cerveau ou sous la dure-mère, et jusqu'à six injections sans anesthésie. Elles sont suivies de 2 à 15 mois, car dans les lignées génétiquement modifiées les tumeurs bénignes apparaissent tard, ce qui impose selon le porteur un suivi d'"au moins 12 mois".

Objectifs

Les méningiomes sont les tumeurs primitives du système nerveux central les plus fréquentes chez l'adulte. Les formes de haut grade ont une fréquence élevée de mutations de certains gènes et représentent un quart des méningiomes avec des récidives multiples associées à une morbidité et une survie réduite sans option disponible médicamenteuse ou d’immunothérapie. Les méninges jouent un rôle clé dans la communication neuro-immunitaire par la diversité de leurs cellules immunes et la présence de vaisseaux lymphatiques méningés. Les données récentes, montrent une infiltration fréquente des méningiomes bénins par des cellules immunitaires. Notre hypothèse est que le microenvironnement immunitaire constitué par les cellules immunes méningées et les lymphatiques méningés, régule la progression histologique maligne des méningiomes et leur comportement d’échappement à la surveillance immunitaire. Nos principaux objectifs sont d’utiliser nos modèles de souris de méningiomes de différents grades de malignité en manipulant le micro-environnement pour déterminer (i) si les lymphatiques méningés régulent effectivement la malignité des méningiomes et (ii) évaluer la participation des populations de cellules immunitaires dans l'initiation et la progression du méningiome. MODIFICATION: sur les 3 ans d'autorisation initiale du projet, nous n'avons pas eu le temps de réaliser l'ensemble des procédures décrites et aurions besoin d'étendre la durée d'autorisation au maximum de 5 ans au total pour pouvoir terminer notre projetsans autres modifications (même nombre d'animaux, mêmes actes que décrit précédemment).

Bénéfices attendus

Notre projet va permettre de caractériser précisément le rôle du microenvironnement immunitaire dans la malignité des méningiomes en manipulant ses composantes lymphatiques et immunitaires dans les méninges, pour pouvoir ultérieurement potentialiser les approches thérapeutiques associées à l'immunothérapie dans les méningiomes agressifs chez l’homme.

Procédures

Les procédures chirurgicales pour réaliser une injection spécifique dans une zone du cerveau (Durée: 1 heure, préparation: 30 min) seront réalisées sous anesthésie générale après une prise en charge première de la douleur par des médicaments, une hydratation et suivies d'un protocole de prise en charge de la douleur en post-opératoire. Ces interventions sont réalisées en conditions stériles chirurgicales. Les autres procédures ne nécessiteront pas d’analgésie ou d’anesthésie de l’animal et consistent en des injections pour la mise en place de notre modèle (Durée : 5 minutes maximum par injection, 6 fois maximum, avec 2 jours minimum entre chaque injection). Les animaux seront euthanasiés par une méthode réglementaire en fin de protocole en vue des prélèvements d'intérêt.

Impact sur les animaux

Les animaux peuvent développer des symptômes cliniques liés à la présence de méningiomes malins, pas bénins. Les symptômes observés chez l’animal peuvent être : une perte de motricité empêchant l'alimentation, un amaigrissement, des crises convulsives. Les gestes pratiqués chez les souris dans ce projet incluent les nuisances suivantes : les risques anesthésiques lors de l’injection sous durale et intracérébrale tels que dépression cardio vasculaire, hypothermie, hypovolémie, sécheresse cornée et les douleurs post-opératoires. Le stress de la contention et la douleur de très courte durée lors de l’introduction de l’aiguille pour les injections intra-péritonéales ou sous-cutanées dans les expériences de modulations des cellules immunitaires.

Devenir

L'euthanasie de tous les animaux à la fin de l'ensemble des procédures est justifié par la nécessité de réaliser une analyse histologique complète du cerveau pour répondre aux objectifs de l'ensemble des procédures expérimentales.

Remplacement

Les modèles in vitro et sur animaux invertébrés ne permettent pas l'obtention de méningiomes avec un aussi grand niveau de complexité et de reproduction de la pathologie humaine que les modèles souris déjà existants. La complexité du cerveau/méninges des souris est nécessaire pour une observation comparative avec le cerveau/méninges humain. L’utilisation d’un modèle murin est donc primordiale pour cette étude.

Réduction

Nous avons réduit au maximum le nombre d’animaux utilisés (Nombre total : 540 animaux) pour nous permettre de générer des données statistiques solides. Afin d'assurer la fiabilité statistique et de limiter le nombre d'animaux, nous avons estimé l’effectif a priori sur la base de travaux antérieurs et sur un calcul de puissance, et il sera nécessaire de procéder à des tests statistiques pour une interpétation fiable des résultats.

Raffinement

A la réception des animaux en provenance de l’exterieur, une procédure d’acclimatation d’une semaine aux nouveaux locaux sera réalisée. Pendant toute la durée de l’expérimentation les animaux seront hébergés en cage en portoir ventilé par groupes de 3 afin de fournir un environnement social enrichi. Les animaux auront à disposition des composants de nidification, des bâtonnets à ronger et des maisons sont également disponibles. Ils auront à disposition de la nourriture en permanence et accès à l’eau. Si l’animal a du mal à se déplacer, par exemple juste après une chirurgie, les croquettes seront mouillées et déposé sur la litière et une solution d’hydratation gélifiée sera mis en place. Les paramètres environnementaux (lumière, température, hygrométrie,) seront surveillés quotidiennement. Un suivi de l’ensemble des animaux sera effectué quotidiennement par l’équipe zoothechnique et chaque jour de la semaine par un des membres de l’équipe de recherche (et plus si nécessité). Le poids des souris sera vérifié deux fois par semaine tout au long de la procédure expérimentale à partir de la première expérimentation (à l’âge de 2 mois) jusqu’à l'euthanasie (entre 5 et 15 mois selon les procédures). Le cahier opératoire sera rempli le jour de l’intervention pour renseigner le temps per-opératoire et post opératoire immédiat, aux jours 1 àu 2 et 8 post-chirurgie. Il servira à notifier les éléments de surveillance, ainsi que les administrations d’antalgiques.

Choix des espèces

Le modèle animal est le seul moyen de pouvoir manipuler le micro-environnement des méningiomes bénin ou malin, notamment en raison de l'absence de cultures cellulaires de méningiomes en général et plus particulièrement avec le profil mutationnel désiré et les différents composants du micro-environnement. Les autres expériences prévues dans le projet doivent être réalisées chez la souris car elles utilisent un modèle souris déjà publié et validé par la communauté scientifique internationale. Les animaux seront utilisés de 2 à 15 mois de manière similaire aux précédents modèles de meningiomes publiés précédemment, un suivi d’au moins 12 mois étant nécessaire pour les modèles souris de méningiomes bénin génétiquement modifié où les méningiomes apparaissent de manière tardive

À 3 à 5 jours de vie, des souriceaux reçoivent sous anesthésie une injection dans la plante d'une patte arrière, avec dans de rares cas un rejet par leur mère. Six à huit semaines plus tard, les mêmes souris subissent une chirurgie d'une heure trente sous anesthésie générale pour imager leur moelle épinière, et sont tuées avant tout réveil. 70 souris vont être utilisées ainsi, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le projet a un but "exclusivement pédagogique" : former des doctorants à la microscopie biphotonique, à raison de deux souris par participant, la première avec "un taux d'échec élevé attendu".

Objectifs

Ce projet a un objectif exclusivement pédagogique : former des doctorants en neurosciences à la mise en œuvre et à l'utilisation de la microscopie biphotonique in vivo pour l'étude de l'activité neuronale. L'objectif de la formation est de permettre aux participants d'acquérir des compétences techniques qui ne peuvent être obtenues de manière satisfaisante par un enseignement théorique seul ou par l'analyse de données déjà acquises. La microscopie biphotonique in vivo repose sur la maîtrise simultanée de plusieurs étapes critiques, notamment la préparation de l'animal anesthésié, le positionnement de celui-ci sous le microscope, les réglages du système d'imagerie, l'acquisition des signaux biologiques et l'identification des artefacts expérimentaux. Ces compétences nécessitent une mise en situation pratique permettant aux étudiants d'observer directement les contraintes techniques et biologiques associées à cette approche. Par ailleurs, cette technologie de pointe n'est pas disponible dans la majorité des unités de recherche d'origine des participants. La formation vise ainsi à leur donner accès à une expertise spécialisée et à des équipements qu'ils ne peuvent généralement pas utiliser dans leur environnement habituel de travail. Elle permet également d'harmoniser les pratiques expérimentales et de transmettre les bonnes pratiques nécessaires à la réalisation d'expériences conformes aux standards scientifiques et éthiques actuels. L'approche pédagogique repose sur des démonstrations réalisées par des encadrants expérimentés, suivies de sessions pratiques supervisées. Cette organisation permet aux participants d'acquérir progressivement les compétences nécessaires à la réalisation d'expériences d'imagerie in vivo tout en limitant le nombre d'animaux utilisés et en garantissant un niveau élevé de maîtrise technique avant toute manipulation autonome. L'hypothèse pédagogique est que l'acquisition de compétences opérationnelles en microscopie biphotonique in vivo nécessite une expérience pratique encadrée sur un système expérimental réel, permettant aux participants d'intégrer les contraintes techniques, biologiques et éthiques de cette approche, compétences qui ne peuvent être pleinement acquises par un enseignement théorique ou l'observation passive.

Bénéfices attendus

Ce projet présente des bénéfices à la fois pédagogiques et scientifiques. À court terme, il vise à former de nouveaux chercheurs aux méthodes modernes permettant d’étudier la dynamique des circuits synaptiques in vivo, notamment grâce à des techniques d’imagerie avancées. Une meilleure maîtrise de ces approches expérimentales permettra aux futurs chercheurs d’optimiser la conception de leurs protocoles et de réduire le nombre d’animaux utilisés dans leurs travaux de recherche, conformément aux principes de réduction et de raffinement. Sur le plan scientifique, les circuits neuronaux impliqués dans la transmission des informations sensorielles, telles que la douleur et la température, ne sont pas encore entièrement caractérisés. De nombreuses études s’intéressent à ces réseaux en raison de leur implication dans diverses pathologies, notamment la douleur neuropathique. Une meilleure compréhension de la dynamique de ces circuits pourrait, à plus long terme, contribuer à l’identification de nouvelles cibles thérapeutiques et au développement de traitements plus efficaces. Ainsi, ce projet contribue à la fois à la formation de chercheurs qualifiés et à l’avancement des connaissances dans un domaine présentant des enjeux majeurs pour la santé humaine.

Procédures

Les nouveau-nés (âgés de 3 à 5 jours) recevront une injection sous anesthésie (durée : 5 minutes). Entre 6 et 8 semaines plus tard les souris suivront une chirugie sous anesthésie generale sans réveil (durée : 1h30).

Impact sur les animaux

Nuisances liées aux injections dans la région plantaire de la patte arrière : douleur, inflammation, stress liés à l’anesthésie, détresse respiratoire, une variation de la pression artérielle ou de la température corporelle. Dans de très rares cas, la mère des souriceaux n’accepte pas de s’occuper des nouveau-nés injectés. Les effets indésirables potentiels liées aux procédures chirurgicales sont une détresse respiratoire, une variation de la pression artérielle ou de la température corporelle, ou une hémorragie.

Devenir

À l’issue de la procédure, les animaux seront euthanasiés par les expérimentateurs habilités en charge du projet. La moelle épinière sera ensuite prélevée pour la réalisation d’analyses post mortem.

Remplacement

Plusieurs phases de ce projet ont été réalisées in vitro sur différentes lignées cellulaires. Actuellement, nous souhaitons étudier la dynamique des circuits synaptiques impliqués dans la perception de la douleur. Cela nous permettra de mieux comprendre la physiologie de ces circuits neuronaux. L’utilisation d’animaux est donc inévitable. Notre formation repose sur une approche pédagogique de type « apprentissage par la pratique ». Les compétences techniques et analytiques visées ne peuvent être pleinement acquises qu’à travers une mise en pratique directe. Les étudiants doivent pouvoir réaliser eux-mêmes les expériences, notamment afin d’imager la moelle épinière in vivo. À la fin de la séance, ils doivent recueillir des échantillons biologiques viables, nécessaires aux analyses de biologie moléculaire. Ces étapes requièrent des matériaux biologiques d’une qualité et d’une intégrité qui ne peuvent être obtenues à partir de modèle informatique, de cadavres ou de démonstrations filmées.

Réduction

Nous faisons un effort particulier pour faire intervenir, lors de ces formations, des spécialistes expérimentés dans les techniques enseignées. Leur haut niveau d’expertise garantit une démonstration précise et efficace, ce qui permet de limiter le nombre d’animaux nécessaires à l’apprentissage. Grâce à la transmission rigoureuse de leur savoir-faire, les étudiants acquièrent rapidement les compétences requises, réduisant ainsi le besoin de répétition inutile des procédures. Nous utilisons le nombre minimal de souris permettant à la fois de démontrer correctement les techniques et d’offrir aux étudiants une opportunité d’entraînement pratique suffisante pour atteindre les objectifs pédagogiques fixés. Cette approche assure un équilibre entre la qualité de la formation et le respect de principe de réduction dans l’utilisation d’animaux vivants. Chaque participant utilisera deux souris. Le premier animal correspond à la découverte du geste, avec un taux d'échec élevé attendu chez un opérateur novice. Le second permet la correction des erreurs identifiées et la consolidation de la compétence : c'est la répétition qui produit l'apprentissage, non la première tentative. Le facteur de 2 animaux par étudiant est un plafond et non une cible. Les étudiants qui maîtrisent déjà le geste ou qui choisissent de ne pas le réaliser n'utilisent aucun animal.

Raffinement

Pendant tous les procédures expérimentales (injection, chirurgie et séance d’imagerie), nos mesures mises en place pour réduire la douleur impliquent une induction et un suivi de l'anesthésie, une mise en place d'analgésie du contrôle de la température par tapis chauffant. Suite aux injections, une surveillance renforcée sera effectuée pendant la période qui suit le réveil (2h) ainsi que pendant les 4 jours suivants. L'évaluation des points limites se fera selon une grille d'évaluation incluant leur adaptation à la courbe de croissance, la mobilité spontané, l’apparence du poil, l’interaction avec les congénères et les signes de douleur. Selon le score obtenu, les souriceaux pourront recevoir une injection d’un antalgique, et de l’aliment hydraté pourra être ajouté au fond de la cage.

Choix des espèces

La souris a été choisie pour cette formation car elle correspond à l’espèce la plus couramment utilisée dans les laboratoires de recherche en neurosciences, notamment pour les études portant sur le système nerveux central. Les techniques enseignées lors de cette formation — incluant la chirurgie, l’imagerie et les analyses moléculaires — sont directement applicables aux modèles murins utilisés dans la grande majorité des projets de recherche académique et préclinique. De plus, la souris présente des avantages pratiques et scientifiques importants : elle est bien caractérisée sur le plan neuroanatomique et génétique, de nombreux outils et lignées transgéniques sont disponibles, et son utilisation est conforme aux standards internationaux en recherche biomédicale. Ainsi, le recours à la souris permet d’assurer la pertinence, la reproductibilité et le transfert direct des compétences acquises par les étudiants vers leurs futures activités professionnelles. Concernant les injections, nous utiliserons des nouveau-nés âgés de J3 à J5. Réalisée durant cette période, l’injection permet de cibler spécifiquement les neurones de la région d’intérêt. Les chirurgies seront réalisées sur des animaux âgés de plus de 6 semaines, ce qui correspond au stade adolescent à jeune adulte chez la souris. À partir de cet âge, les coordonnées stéréotaxiques de ciblage sont stables et correspondent à celles établies pour ce modèle.

Ce projet remplit une obligation réglementaire : un test de biocompatibilité exigé par la norme ISO avant toute implantation chez l'humain du BRAIN-GUIDE, un implant cérébral censé favoriser la régénération après un traumatisme crânien. 40 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, tous tués à l'issue pour l'analyse histologique de leur cerveau. Chacun subit une chirurgie de 30 minutes sous anesthésie générale pour la pose de l'implant dans le cerveau, puis reste suivi 7 ou 91 jours, avec des risques de douleur, d'infection, d'inflammation et d'œdème. L'objectif annonce une "analyse comportementale", que les procédures ne mentionnent plus et dont aucun test n'est nommé.

Objectifs

Évaluer la réponse tissulaire locale et la biocompatibilité induite par l’implantation d'un implant régénératif dans le cerveau de rat en comparaison avec un matériau de référence contrôle à court-terme, 7 jours, et à long-terme, 91 jours, avec une analyse comportementale et histologique, selon les exigences de la norme ISO et du règlement européen en vigueur. Essai obligatoire avant toute implantation chez l'homme.

Bénéfices attendus

Ce projet de recherche propose une approche thérapeutique innovante destinée à favoriser la régénération cérébrale à la suite d’un traumatisme crânien. L’évaluation de la biocompatibilité du dispositif selon les exigences des normes en vigueur, permettra d’envisager son potentiel de transposition clinique. Une régénération cérébrale pourrait diminuer le handicap chez ces patients.

Procédures

L'ensemble des animaux impliqués sera soumis à 1 chirurgie sous anesthésie générale pour la pose de l'implant (durée 30 min) au niveau cérébral. La mise à mort sera réalisée pour la récupération des tissus cérébraux.

Impact sur les animaux

Nuisances inhérentes à la chirurgie : risque de douleur et de complications, inconfort, complications post-opératoires avec inflammations locales / œdèmes, risque d'infection.

Devenir

La procédure se termine par une mise à mort des animaux pour effectuer l'analyse histologique.

Remplacement

Nous n’avons pas pu trouver de tests in vitro permettant le remplacement de cette expérimentation. Les tests in vitro et in vivo d'ores et déjà réalisés sur le BRAIN-GUIDE ont servi à montrer la non-cytotoxicité, la non-irritabilité, la non-sensibilisation cutanée, la non-pyrogénicité et l'absence d'endotoxines.

Réduction

Comme l’exige le principe de Réduction, nous utilisons des petits groupes de 10 individus. La norme exige n=8 par groupe. Afin d'être sûr d'attendre ce nombre (mortalité, tumeurs spontanées), n=10 rats par groupe sont prévus. Les tests statistiques sont adaptés aux petits échantillons.

Raffinement

Le principe fondamental des 5 libertés est respecté sur toute la durée de l’étude. L'alimentation est disponible en permanence, sans jeûne ni restriction alimentaire. Le suivi de l'état de santé général des animaux est assuré par le personnel de zootechnie régulièrement. Les chirurgies se font sous anesthésie, analgésie, et gel oculaire. Une attention particulière est portée aux animaux opérés, qui font l'objet d'une surveillance quotidienne par le personnel compétent. Au besoin, cette surveillance inclut l'observation de la plaie, du poids corporel, de la mobilité, de l'état du pelage et du comportement des animaux et fait l'objet d'un scoring clinique en supplément de l'évaluation prévue à 1 jour, 7 jours post-transplantation et une fois par mois jusqu’à 91 jours. La valeur du score détermine l'action à réaliser sur l'animal pour une prise en charge de la douleur, une notification de surveillance accrue, une exclusion de l'étude ou une mise à mort. La prise en charge de la douleur est mise en place avec des protocoles stricts validés, prenant en compte le principe de douleur et son impact sur les animaux et les résultats de l'étude. Un enrichissement environnemental est intégré au protocole, comprenant divers éléments pour stimuler cognitivement les rats (tunnels, boule de fouille, boule traversante), ainsi qu'une composante sociale.

Choix des espèces

Les rats adultes sont un modèle privilégié pour l'étude de la récupération fonctionnelle après lésion et greffe d’implants. Ils présentent une organisation cérébrale comparable à celle de l’humain, permettant de reproduire certains mécanismes impliqués dans diverses affections neurologiques telles que les maladies neurodégénératives, l’AVC et le traumatisme crânien : déficits sensorimoteurs handicapant les patients dans la vie de tous les jours. Ce modèle permet une évaluation des effets biologiques, qui ne peuvent être appréhendées par des méthodes in vitro.