Procédures modérées

Préparées, anesthésiées puis opérées par des groupes de deux ou trois étudiants vétérinaires de cinquième année, 320 brebis gravides en fin de gestation subissent une césarienne d'environ une heure, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Un cathéter est posé à la jugulaire, et le porteur prévoit après l'opération des douleurs cutanées et abdominales, une gêne à la marche et des complications possibles comme des saignements, une plaie qui se rouvre ou une infection. L'exercice est noté, chaque étudiant devant valider huit "incontournables" dans un logiciel d'évaluation. Une fois passé le délai d'attente "viande" des médicaments administrés, les brebis partent à l'abattoir, et le résumé ne dit rien du sort des agneaux extraits par césarienne.

Objectifs

Réalisation d'une césarienne par des étudiants vétérinaires de 5eme année dans un contexte académique hospitalier. Les objectifs comprennent la préparation de l’animal, la participation aux étapes chirurgicales, l’évaluation des besoins anesthésiques et analgésiques, la surveillance du réveil et le suivi postopératoire. Les compétences mise en oeuvre lors de ces travaux pratiques sont évaluées individuellement avec le logiciel CompetVet Eval. L'étudiant doit valider 8 incontournables et obtenir au moins 2 évaluations lors de cette rotation de travaux pratiques. Les étudiants réalisent l'ensemble des actes sous supervision, ils peuvent être assistés s'ils en éprouvent le besoin ou si l'encadrant le juge nécessaire.

Bénéfices attendus

Le bénéfice immédiat attendu est l’acquisition de compétences pratiques et de raisonnement clinique dans un cadre supervisé, en complément de la simulation et des stages. À plus long terme, cette formation vise à préparer les futurs vétérinaires aux interventions obstétricales et à la prise en charge la douleur chez les ruminants. Cette séance conforte aussi de manière plus générale l'acquisition de compétences nécessaires lors d'actes médicaux et chirurgicaux dans leur globalité quelle que soit l'espèce considérée. Le bénéfice potentiel concerne ainsi la qualité des soins et le bien-être des animaux pris en charge en pratique vétérinaire.

Procédures

Une procédure chirurgicale sous anesthésie (césarienne) d'une durée d'une heure environ

Impact sur les animaux

Les brebis seront soumises à une césarienne sous anesthésie et analgésie. Malgré les mesures de raffinement mises en œuvre, les manipulations, la contention et les injections peuvent entraîner un stress transitoire et une douleur brève au point d’injection. La pose d'un catéther à la veine jugulaire pourra occasionner une douleur brève et, éventuellement, un hématome local. L’intervention peut entraîner une douleur cutanée et abdominale postopératoire, une gêne à la locomotion et une diminution transitoire de l’appétit ou de l’activité. Cependant, tous les animaux reprennent généralement leur alimentation dès leur placement en parc après réveil. La DAP prévoit une nociception faible à modérée au cours des 24 à 48 premières heures postopératoires sous traitement analgésique. Les complications possibles comprennent notamment des saignements, une déhiscence de la plaie ou une infection. Ces complications font l’objet d'une surveillance spécifique et correspondent aux effets indésirables possibles après la réalisation d'un acte chirurgical par tout vétérinaire chez un ruminant.

Devenir

Au terme du délai d'attente "viande" des médicaments administrés, les animaux sont acheminés vers un abattoir agréé par un transporteur professionnel conformément à leur destinée initiale.

Remplacement

L’enseignement d'obstétrique s'appui d’abord sur des méthodes sans recours à l'animal vivant : apprentissage théorique associé à des activités en salle de simulation en 4eme année, et juste en amont de la chirurgie, deux demi-journées d'enseignement par simulation comprenant l’entraînement aux sutures sur reproductions tissulaires en silicone, aux gestes anesthésiques sur modèles de brebis, aux mises-bas sur mannequin et à la réanimation néonatale sur mannequin ventilable. Ces activités permettent de s'assurer de l’acquisition préalable des gestes techniques et remplacent une partie de l’apprentissage qui serait autrement réalisée sur les animaux. Le recours à des brebis vivantes concerne l’intégration de ces gestes dans une prise en charge complète : adaptation aux tissus vivants et aux conditions opératoires, appréciation des réponses de l’animal à l’anesthésie et à l’analgésie, surveillance du réveil, puis évaluation clinique de la douleur et de la récupération postopératoires. Les simulateurs utilisés permettent de préparer ces différentes étapes, mais ne reproduisent pas l’ensemble des réponses physiologiques ni leur évolution au cours du suivi. Le remplacement est donc partiel. L’intervention sur l'animal vivant est réservée à cette phase d’apprentissage intégré, après la préparation théorique et pratique sur simulateurs.

Réduction

Un à deux jours avant de réaliser l'opération, les étudiants réalisent des activités en salle de simulation durant 2 demi-journées (entrainement sutures sur reproductions tissulaires en silicone, anesthésies sur modèles brebis, mises-bas avec mannequin de vêlage, entraînement à la réanimation du nouveau-né sur mannequin veau ventilable...). Cela améliore leur niveau de confiance et leur efficacité, au bénéfice du bien-être des animaux. Ceci permet de réduire le nombre d'animaux utilisés. Le nombre d'animaux est limité en n'utilisant qu'une brebis par groupe de 2 ou (plus souvent) 3 étudiants.

Raffinement

Avant et après césarienne, les brebis sont entretenues, sur aire paillée, en parcs abrités, en groupes d'au moins 6 animaux, pour ne pas contrarier leur instinct grégaire. La ventilation du bâtiment est adaptée selon les conditions climatiques. Les manipulations sont réalisées de manière groupée pour limiter le stress induit. Les brebis sont nourries avec du foin à volonté, et un complément alimentaire appétant distribué par les animaliers matin et soir ; l'abreuvement est assuré par des abreuvoirs automatiques adaptés aux ovins.

Choix des espèces

Ces travaux cliniques sont conduits sur des animaux de l'espèce ovine qui, avec l'espèce bovine, constituent les espèces pour lesquelles les interventions obstétricales dont la césarienne sont couramment pratiquées en clientèle vétérinaire. La procédure portant sur une césarienne, les animaux opérés sont des brebis adultes gravides en fin de gestation.

Pour 1 112 souris utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, le protocole prévoit selon les groupes jusqu'à deux injections par jour pendant neuf jours, l'implantation sous anesthésie d'une puce à capteur de température, ou une série de cinq à sept tests de comportement. Ces tests portent sur l'interaction sociale, la mémoire, l'anxiété, la locomotion et le seuil de douleur, ce dernier sur une plaque chauffante dont le porteur reconnaît qu'elle "peut entraîner une douleur persistante au-delà de l'arrêt du test". Le THC injecté provoque une hypothermie qui peut durer au-delà de six à huit heures, dans une étude sur le rôle d'une molécule du cerveau, la pregnénolone, face à ses effets. Toutes les souris sont tuées à l'issue pour prélever sang et cerveau, et les bénéfices se résument à de "nouvelles pistes de recherche" qui "pourront être explorées ultérieurement".

Objectifs

Dans le cerveau, il existe une machinerie, appelée « système endocannabinoïde », qui joue un rôle majeur dans le bon fonctionnement du cerveau, liés notamment aux émotions, à la mémoire et à certains comportements. Le cannabis contient une substance active, appelée THC, qui agit sur ce système. En cas de consommation répétée, le THC peut dérégler ce système et ces modifications peuvent provoquer une dépendance, malgré les conséquences négatives. Ce projet cherche à comprendre le rôle d’une molécule produite par le cerveau, appelée pregnénolone (PREG). Il a été montré que lorsque le THC arrive dans le cerveau, il augmente la production de cette molécule. Celle-ci agit alors comme un mécanisme naturel de défense en limitant certains effets nocifs du THC. Plus précisément, cette étude cherche à comprendre comment fonctionne ce mécanisme chez la souris, dans des conditions mimant la dépendance au cannabis, et à vérifier si la PREG intervient également dans le fonctionnement normal du système endocannabinoïde, en dehors de la consommation de cannabis. Cette étude permettra de mieux comprendre le fonctionnement du cerveau et les mécanismes impliqués dans les effets de la dépendance au cannabis. À plus long terme, elle pourrait contribuer à identifier de nouvelles pistes pour le développement de traitements contre l’addiction au cannabis.

Bénéfices attendus

Le THC, en agissant sur le système endocannabinoïde, peut dérégler le fonctionnement de certains comportements liés notamment aux émotions et à la mémoire. Notre organisme a mis en place un système de défense naturel avec la production d’une molécule protectrice, la pregnénolone. Cette production locale lui permet d'exercer une action rapide afin de maintenir des conditions optimales pour le fonctionnement cérébral. Ce projet vise à comprendre les mécanismes d’action du THC et de la pregnénolone dans le cerveau. L’identification de ces mécanismes vise à proposer de nouvelles pistes de recherche. Celles-ci pourront être explorées ultérieurement dans des contextes pathologiques ou thérapeutiques.

Procédures

Les types d’intervention seront les suivants : •584 souris seront anesthésiées sous isoflurane (4% pendant 3 min) avec la mise en place d’une puce RFID (1.25 x 7mm) (en sous-cutanée). •188 souris vigiles seront soumises à des injections répétées (30 s par injection ; deux injections par jour espacées de 8h) pendant 9 jours. •396 souris vigiles seront soumises à des injections répétées (30 s par injection ; une injection par jour) pendant 6 jours. 144 souris vigiles seront soumises à une injection (30 s par injection). •384 souris vigiles seront soumises à deux injections espacées de 10 min (30 s par injection). •116 souris vigiles seront soumises à des tests comportementaux pendant 4 jours consécutifs. Ces tests ont pour objectif d’étudier les performances d’interaction sociale, les capacités de mémoire, ou des comportements liés à l’anxiété. Sept tests seront effectués chez le même animal avec trois expositions maximum par jour, espacées d’une à deux heures (exposition entre 15 min et 1h pour chaque test). Chaque test ne sera réalisé qu’une seule fois. •252 souris vigiles seront soumises à 5 tests comportementaux réalisés sur une même journée (exposition entre 30 sec et 15 min pour chaque test, soit 40 min par jour). Chaque test sera réalisé deux fois avec un intervalle de 6 jours. Ces tests ont pour objectif d’analyser la locomotion, les mouvements volontaires, les capacités de mémoire ou le seuil de nociception. •384 souris vigiles seront soumises à 5 tests comportementaux réalisés sur une même journée (exposition entre 30 sec et 15 min pour chaque test, soit 40 min au total). Chaque test ne sera réalisé qu’une seule fois. Ces tests ont pour objectif d’analyser la locomotion, les mouvements volontaires, les capacités de mémoire ou le seuil de nociception.

Impact sur les animaux

Les tests expérimentaux et l’administration de substances, ainsi que la contention nécessaire à leur réalisation peuvent entrainer de légères douleur et un incomfort modéré de courte durée. La mise en cage individuelle (avec la présence d’enrichissement dans la cage et sans isolement visuel, sonore et olfactif), de courte durée, peut entraîner un stress modéré. L’exposition sur une plaque chauffante peut entraîner une douleur persistante au-delà de l’arrêt du test (qui a lieu dès l’apparition de signes de douleur ou avec un délai de 30 sec maximum). L’hypothermie, induite par le THC, peut être durable (au-delà du délai de 6 à 8 h, correspondant au retour vers des valeurs normales). L’implantation sous-cutanée d’une puce munie d’un capteur de température, réalisée sous anethésie générale, peut engendrer un petit saignement et une légère réaction inflammatoire au niveau du site de l’implantation, et une hypothermie de courte durée.

Devenir

A l’issue des procédures, les animaux seront mis à mort afin de récupérer des échantillons (sang, structures cérébrales et/ou biopsie de queue) nécessaires pour des analyses ultérieures.

Remplacement

Dans le cadre de la stratégie de remplacement, des approches substitutives à l’expérimentation animale ont été réalisées en amont de ce projet. Ces approches ont permis d’identifier comment notre molécule d’intérêt se liait à sa cible, et ces connaissances ont permi de créér le modèle d’étude. Ce modèle a été validé par des approches in vitro (modèles cellulaires) avant d’être étudier chez l’animal. Bien que nous menons ces études in vitro, qui permettent certes d’appréhender certains processus moléculaires; ce projet a pour objectif l’étude de systèmes intégrés (mettant en jeu des comportements), qui ne peuvent être réalisés que chez l’animal vivant.

Réduction

Nous avons utilisé une formule de calcul qui permet d’ajuster le nombre d’animaux par groupe en fonction de la variabilité des paramètres mesurés. Nous utiliserons des souris mâles et femelles afin de déterminer d’éventuelles différences liées au sexe. Le cas contraire, les données des mâles et femelles seront regroupées. Les effets analysés seront les effets du traitement, du génotype et du sexe. Le nombre d’animaux sera optimisé en combinant les stratégies suivantes. Tout d’abord, nous effectuerons plusieurs tests chez les mêmes animaux, lorsque cela est possible sans biaiser les résultats de l'experience. De plus, des études pilotes seront réalisées (chez un nombre réduit d’animaux) afin de déterminer les conditions expérimentales optimums. Selon les résultats, les groupes seront complétés avec la condition la plus appropriée. Aussi, des efforts de réduction seront réalisés pour la production des animaux transgéniques, en adéquation avec les besoins expérimentaux.

Raffinement

Pour réduire la souffrance pouvant être imposée par le protocole, les règles suivantes seront appliquées pour améliorer le bien-être des animaux : (1) Des points limites suffisamment prédictifs et spécifiques au projet seront appliqués et des critères d’arrêt seront mis en place si nécessaire. (2) La mise en cage individuelle temporaire sera réalisée dans des conditions pour maintenir des contacts olfactifs, sonores et visuels entre les animaux. (3) La manipulation des animaux se fera à l’aide des tunnels en carton présents dans les cages, afin de réduire le stress pouvant être lié à cette manipulation. (4) L’administration (locale ou générale) d’analgésiques est prévue pour minimiser les douleurs éventuelles liées à certaines procédures. (5) De nouvelles règles pourront être mises en place au cours du projet sur la base de données scientifiques ou réglementaires, et/ou de préconisations faites par le responsable du bien-être animal et du vétérinaire.

Choix des espèces

La souris est un modèle animal communément utilisé pour réaliser des modifications génétiques, de par la similitude du génome de la souris et celui de l’être humain. La souris permet d'étudier des mécanismes conservés du système endocannabinoïde et dispose de modèles génétiques et comportementaux adaptés. De plus, les effets comportementaux étudiés dans ce projet ont été clairement décrits et validés chez la souris. Enfin, le modèle murin utilisé dans le projet a été validé. Tous les animaux utilisés seront de jeunes-adultes car les systèmes étudiés ne subissent pas à cet âge de modifications majeures, comme celles survenant au cours du développement ou au cours du vieillissement, ce qui limite la variabilité des mécanismes étudiés dans ce projet et renforce la pertinence des résultats obtenus.

Les rats qui ne se mettent pas à boire de l'alcool en excès après environ huit semaines d'accès à une bouteille d'alcool à 20 % sont tués, de même que ceux qui n'apprennent pas à appuyer sur un levier pour en obtenir. 3 240 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, pour comprendre pourquoi certaines personnes perdent le contrôle de leur consommation d'alcool. Les rats retenus sont opérés du cerveau pendant 90 à 120 minutes pour recevoir un vecteur viral et une lentille d'imagerie, logés seuls, puis s'administrent de l'alcool cinq jours par semaine pendant trois à quatre mois, et les tests de compulsion ajoutent de la quinine à l'alcool ou des chocs électriques aux pattes, jusqu'à 0,35 mA, sur neuf séances au plus. Sur 30 rats par groupe au départ, le porteur prévoit que 5 à 6 au plus développeront le comportement compulsif étudié, et qu'il faudra parfois refaire l'expérience sur une seconde cohorte.

Objectifs

L’alcoolodépendance est une maladie chronique caractérisée par une perte progressive du contrôle de la consommation d’alcool. Certaines personnes continuent à rechercher ou à consommer de l’alcool malgré des conséquences négatives importantes. Les traitements actuellement disponibles ne sont pas efficaces chez tous les patients, et les raisons de cette efficacité variable restent encore mal comprises. Ce projet vise à mieux comprendre les mécanismes cérébraux impliqués dans les comportements liés à l’alcool, en particulier la motivation à obtenir de l’alcool, la persistance de la recherche d’alcool malgré une conséquence négative, et la reprise de ce comportement après une période d’arrêt. Pour cela, nous utiliserons un modèle chez le rat permettant de suivre plusieurs dimensions du comportement : la consommation volontaire d’alcool, l’apprentissage d’une réponse pour obtenir de l’alcool, la motivation, la perte de contrôle, l’extinction du comportement et sa reprise. Les animaux seront aussi étudiés avant et après administration de traitements pharmacologiques afin d’identifier pourquoi certains individus répondent à un traitement alors que d’autres y répondent peu ou pas. Le projet utilisera deux approches complémentaires. La première permettra d’enregistrer l’activité de neurones chez l’animal éveillé pendant les tests comportementaux. La seconde permettra de modifier temporairement l’activité de certains groupes de neurones pendant ces mêmes tests, afin de déterminer s’ils participent directement aux comportements observés. Ces approches permettront de mieux relier l’activité cérébrale aux comportements liés à l’alcool et à la réponse aux traitements.

Bénéfices attendus

Ce projet devrait permettre de mieux comprendre pourquoi les individus ne sont pas tous égaux face au risque de perte de contrôle de la consommation d’alcool. Certains sujets développent des comportements persistants malgré des conséquences négatives, alors que d’autres restent plus sensibles à ces conséquences et diminuent leur recherche d’alcool. Les résultats attendus permettront d’identifier des mécanismes cérébraux associés à ces différences individuelles. Ils permettront également d’étudier comment l’activité de certains groupes de neurones change pendant la consommation, la motivation, la persistance du comportement et la reprise de la recherche d’alcool après une interruption. Un autre bénéfice important du projet est de mieux comprendre pourquoi certains traitements de l’alcoolodépendance sont efficaces chez certains individus mais pas chez d’autres. En comparant les animaux répondeurs et non répondeurs aux traitements, il sera possible d’identifier des signatures comportementales et cérébrales associées à une bonne ou à une mauvaise réponse thérapeutique. À plus long terme, ces connaissances pourraient contribuer à améliorer la compréhension des mécanismes de l’alcoolodépendance et à orienter le développement de stratégies thérapeutiques mieux adaptées aux différences individuelles entre patients.

Procédures

1- Chirurgies (Implantation de lentille, injection de vecteur viral, implantation de lentilles) : 1 seule chirurgie par rat - Durée de la chirurgie : 90 à 120 minutes. 2- Deux prélèvements de sang par rat au maximum sous anesthésie générale : durée de l'intervention : 3 minutes. 3- Auto-administration d'alcool : protocole de 15-30 minutes par jour, 5jours par semaine pendant 3-4 mois. 4- Injection intra-péritonéales : chaque animal recevra plusieurs injections sur toute la durée des mois d'auto-administration - Maximum de 12-14 injections.

Impact sur les animaux

Les nuisances attendues sont classées comme modérées. L’hébergement individuel est indispensable pour mesurer précisément la consommation d’eau et d’alcool de chaque rat, attribuer les réponses opérantes à un individu donné et éviter les biais liés à la hiérarchie sociale ou à l’accès différentiel aux bouteilles. Il peut entraîner un stress social. Cette contrainte sera compensée par un enrichissement compatible avec les objectifs expérimentaux et par une habituation régulière aux manipulations. Les étapes de consommation d’alcool ne sont pas associées à une douleur. Les procédures chirurgicales peuvent entraîner une douleur post-opératoire transitoire, un risque d’infection locale, une perte de poids transitoire ou une gêne liée à l’implant. Dans le cadre de l’imagerie in vivo, la connexion du miniscope à la base fixée sur le crâne est brève et non douloureuse, mais elle nécessite une manipulation à laquelle les animaux seront progressivement habitués. Les traitements pharmacologiques ou les ligands chemogénétiques pourront entraîner une gêne brève liée à la contention et à l’injection, ainsi que des effets transitoires dépendant du composé: baisse d’activité, sédation légère, modification de la locomotion ou irritation locale. Ces effets seront limités par l’utilisation de doses déjà décrites dans nos publications ou nos études en cours comme compatibles avec des tests comportementaux chez le rongeur, par l’adaptation des volumes au poids corporel, par l’habituation aux injections factices et par une surveillance post-administration. Toute altération persistante du comportement, de la mobilité, de l’alimentation ou du poids entraînera l’arrêt de l’administration, l’avis du responsable du bien-être animal et, si nécessaire, du vétérinaire.Les tests de compulsion pourront utiliser soit l’adultération de la solution d’alcool par la quinine, soit une punition électrique brève et de faible intensité, comprise entre 0,1 et 0,35 mA pendant 0,5 sec, au maximum pendant 9 sessions opérantes de 15 min. Cette conséquence peut induire une gêne transitoire aux pattes, évitable par l’arrêt de l’appui sur le levier actif. La perfusion transcardiaque réalisée sous anesthésie terminale sera effectuée uniquement sur des animaux profondément anesthésiés, sans réveil, et ne provoquera donc pas de perception consciente de douleur. Les nuisances associées seront limitées à la phase précédant l’anesthésie intrapéritonéale kétamine/xylazine.

Devenir

Pour induire une forte consommation d'alcool chez les rats, une première étape de consommation volontaire intermittente est réalisée pendant environ 8 semaines. Les rats ont accès à deux bouteilles pendant 24 heures : une contenant de l'alcool à 20% v/v et une contenant de l'eau. Certains rats développent une consommation excessive d'alcool après environ 10 à 12 sessions, tandis que d'autres ne le font pas. Ceux qui ne développent pas une consommation excessive d'alcool sont euthanasiés, et des échantillons de tissus tels que le foie ou le cerveau peuvent être prélevés sur ces animaux pour des tests ultérieurs. Les rats qui réussissent la tâche d'auto-administration opérante d'alcool sont sélectionnés pour les chirurgies. Ceux qui ne parviennent pas à acquérir cette compétence sont également euthanasiés eet des échantillons de tissus peuvent être prélevés sur eux. À la fin de l'étude, une perfusion transcardiaque sera réalisée pour chaque animal afin de réaliser des analyses histologiques, anatomiques ou neurobiologiques. La perfusion transcardiaqu sera effectuée sous anesthésie générale profonde, sans réveil de l’animal. L’anesthésie sera induite par une injection intrapéritonéale de kétamine/xylazine à la dose de 200/20 mg/kg. La perfusion ne sera initiée qu’après vérification de la profondeur anesthésique, comprenant l’absence de réflexe cornéen, l’absence de réflexe de retrait à un pincement de la patte et l’absence de réaction à une stimulation nociceptive. Si ces critères ne sont pas atteints, la perfusion sera différée et l’anesthésie sera prolongée ou complétée avant toute intervention. Après confirmation de l’anesthésie profonde, une thoracotomie sera réalisée, puis la perfusion transcardiaque sera effectuée avec une solution tampon, suivie si nécessaire d’une solution fixatrice adaptée aux analyses prévues, par exemple du paraformaldéhyde à 4 %. L’animal restera sous anesthésie profonde pendant toute la procédure. La mort sera confirmée par l’arrêt respiratoire et cardiaque à l’issue de la perfusion.

Remplacement

Les études de mécanismes complexes de maladies psychiatriques comme l'addiction ne sont pour le moment pas remplaçables par des méthodes in vitro ou in sillico. Les mécanismes impliqués sont trop complexes pour pouvoir être simplifiés à ce jour. Les modèles que nous avons choisis font partie des modèles les plus utilisés et les plus complets avec une validité de ressemblance, une validité de construction et une validité de prédiction très bien décrites dans la littérature. L'animal dans son entièreté est le seul modèle disponible actuellement pour remplir les objectifs de ce projet.

Réduction

Pour les tests comportementaux, nous identifions le minimum d’animaux nécessaires pour un résultat statistiquement significatif, qui est déterminé en utilisant une « power analysis » basée sur nos résultats précédents, et un n = 30/groupe est généralement suffisant. Il est donc nécessaire de commencer avec un grand nombre d'animaux dans nos groupes. Si nous avons initialement 30 rats par groupe, nous perdrons ensuite environ 15 à 20 % des rats après la première étape d'acquisition de consommation volontaire excessive d'alcool, puis encore 15 à 20 % à la seconde étape d'acquisition de tâche opérante. Cela nous amènera à avoir une vingtaine de rats par groupe avant les tests de compulsivité. Théoriquement, nous aurons au maximum 5 à 6 rats qui développeront un comportement compulsif. Cela représente le nombre minimum nécessaire pour effectuer des tests statistiques. A noter donc qu’il est des fois nécessaires de répéter chaque expérience sur deux cohortes indépendantes, si le nombre de rats compulsif est inférieur à 5. Les tests statistiques utilisés seront des analyses ANOVA suivi d’analyses post hoc. Ces études se feront de manière longitudinale, afin de tester plusieurs paramètres (la consommation du type «binge »; perte de contrôle ; motivation ; consommation compulsive ; abstinence et rechute) chez le même animal afin de réduire au maximum le nombre de rats utilisés. Par ailleurs, les animaux sont surveillés quotidiennement.

Raffinement

Les animaux seront stabulés dans des cages enrichies grâce à un tube en carton et une buchette en bois. Les animaux seront manipulés 5 jours par semaine avec une intensification du "handling" durant les jours suivant l'arrivée des animaux au sein de la plateforme, permettant ainsi une forte réduction du stress. Par la suite tous les jours de la semaine (5 jours par semaine) les animaux seront manipulés avant et après la mise en place dans les cages d'auto-administration. Nous utiliserons la Rat Grimace Scale (RGS) tout au long de ce projet pour l'évaluation du niveau de souffrance/douleur. En fonction du score différentes procédures d'analgésie (paracétamol, Pracétam 20% 100 ou 200 mg/kg) seront appliquées pour réduire voire annuler toute souffrance ressentie par les animaux. Dans les cas où un rat présenterait une faiblesse musculaire, tonique, nous lui administrerons une injection de solution glucosée (5%, 10 mL/kg) 2 fois par jour en intra-péritonéale et nous utiliserons de l'aliment en poudre supplémenté en solution glucosée (5%) pour faciliter la prise alimentaire. Pour la chirurgie, une prémédication au paracétamol (Pracétam 20%) à 200 mg/kg 24 heures avant la chirurgie sera mise en place. Les animaux seront sur un tapis chauffant avec pose de gel occulaire. La profondeur de l'anesthésie sera controlée toutes les 5 minutes. Les opérations d'injection ou d'implantation seront réalisées sous anesthésie gazeuse et analgésie générale et locale. Au cours de la période post-opératoire, les rats recevront automatiquement une dose de 200 mg/kg de paracétamol dans l'eau de boisson pour au minimum 3 jours. Ensuite en fonction du score obtenu par la RGS, nous utiliserons soit une dose de 200 mg/kg (score de 5 et 6) ou 100 mg/kg (score de 3 et 4).

Choix des espèces

Le rat est l’animal le plus couramment utilisé dans les études d’auto-administration opérante d’alcool de part ses capacités d’apprentissage de la tâche opérante mais également pour son attrait naturel pour l’alcool. Les rats adultes seront agés de 8 semaines à leur arrivée au laboratoire pour une utilisation allant de quelques semaines à plusieurs mois.

Rendus malades d'une insuffisance pancréatique que le porteur juge "non compatible avec leur maintien en vie dans de bonnes conditions", 114 des 117 miniporcs Göttingen sont tués à l'issue, trois seulement pouvant être gardés en vie et réutilisés si la ligature échoue en cours d'opération. Ces cochons d'environ deux ans vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, avec une chirurgie de deux à quatre heures pour ligaturer un conduit du pancréas et parfois implanter des dispositifs d'administration et de prélèvement. Ils sont ensuite hébergés seuls jusqu'à la fin de l'étude, six semaines en général, nourris d'un régime enrichi en graisses, et peuvent recevoir des enzymes dans le duodénum jusqu'à trois fois après chaque repas pendant sept jours. Le porteur affirme que l'utilisation d'un "modèle animal reste nécessaire" et que le miniporc permet de "maximiser la pertinence des données obtenues".

Objectifs

L’insuffisance pancréatique exocrine (IPE) est une pathologie caractérisée par une diminution de la sécrétion d’enzymes digestives, entrainant une mauvaise digestion, en particulier des lipides, et des complications cliniques telles que la stéatorrhée, la perte de poids et des carences nutritionnelles. Elle est observée dans plusieurs contextes cliniques, notamment la pancréatite chronique, la mucoviscidose et certaines résections pancréatiques. À ce jour, la prise en charge repose principalement sur la supplémentation en enzymes pancréatiques, qui permet une amélioration symptomatique mais reste imparfaite, avec une variabilité importante de réponse interindividuelle et une efficacité parfois insuffisante, notamment en conditions de régime riche en lipides ou en cas d’altération sévère de la fonction pancréatique. Dans ce contexte, le développement de nouvelles stratégies thérapeutiques nécessite des modèles précliniques pertinents reproduisant fidèlement la physiopathologie humaine. Le présent projet vise ainsi à établir et caractériser un modèle d’IPE induite par ligature du conduit pancréatique accessoire chez le miniporc Göttingen(PDL= Pancreatic Duct Ligation), une espèce dont la physiologie digestive est proche de celle de l’Homme. Plus spécifiquement, ce modèle permettra d’évaluer l’impact de différents régimes lipidiques sur la maldigestion, ainsi que l’efficacité de traitements enzymatiques substitutifs, dans une optique de validation d’un outil robuste pour le criblage et l’évaluation préclinique de nouvelles approches thérapeutiques.

Bénéfices attendus

Sur le plan préclinique et translationnel, ce modèle constituera un outil pertinent pour évaluer l’efficacité de stratégies thérapeutiques existantes, telles que la supplémentation enzymatique, dans des conditions contrôlées et comparables à la clinique, et surtout il permettra de tester de nouvelles approches (e.g. formes galéniques améliorées, enzymes de nouvelle génération, combinaisons thérapeutiques...), en tenant compte de variables critiques comme la teneur en lipides du régime, qui influence fortement la réponse au traitement. Ceci répond à un besoin identifié, les traitements actuels présentant une efficacité variable et parfois insuffisante chez certains patients. À plus long terme, les résultats issus de ce modèle devraient contribuer à optimiser les stratégies thérapeutiques chez les patients atteints d’IPE, en améliorant le contrôle des symptômes digestifs, l’absorption des nutriments et la qualité de vie. Enfin, la disponibilité d’un modèle préclinique robuste et bien caractérisé pourrait permettre de rationaliser le développement de nouveaux traitements, contribuant ainsi à réduire l’incertitude lors du passage en clinique et, indirectement, à limiter le recours à des études animales supplémentaires en phase exploratoire.

Procédures

Les miniporcs subiront une chirurgie (Semaine 1, 1 fois, durée estimée de l’ordre de 2 h pour la seule induction du modèle, et jusqu'à 4h en cas d'implantation de dispositifs d'administration et de prélèvement). Ils seront ensuite hébergés individuellement jusqu'à la fin de l'étude (récupération post-chirurgicale, cicatrisation, maintien du catheter, collecte de féces). Des prélèvements sanguins pourront être réalisés avant chirurgie, avant changement de régime alimentaire (Semaine 5), avant traitement (e.g. Semaine 6), et en fin d’étude (soit minimum 4 fois (potentiellement jusqu'à 6 fois), durée de l’ordre de quelques minutes). Les animaux seront pesés environ 2 fois/semaine. En Semaine -1 et à partir de la Semaine 5, les animaux seront soumis à un régime enrichi en lipides selon leur groupe. Une supplémentation enzymatique et/ou un traitement pourront être administrés (selon leur groupe), généralement de manière aiguë ou répétée (max prévu : 2 fois par jour pendant 1 à 2 semaines). En cas d'administration dans le duodénum, elle sera réalisée jusqu'à 3 fois après chaque repas généralement pendant 7 jours (environ 1 min/administration). La durée standard de l’étude est de 6 semaines, avec une extension possible de 1 à 2 semaines dans certains cas particuliers.

Impact sur les animaux

Les nuisances associées à ce projet sont liées à la fois à l’intervention chirurgicale (risque de pancréatique iatrogène), à l’induction de l’IPE et aux procédures de suivi. La procédure chirurgicale est susceptible d’entraîner une douleur post-opératoire, une inflammation locale et un inconfort transitoire (malgré une analgésie pré et post-opératoire adaptées). La mise en place et la présence prolongée (le cas échéant) de dispositifs implantables peuvent entraîner un inconfort local transitoire au site d'implantation. Le modèle étudié vise à reproduire une maladie digestive entraînant une mauvaise digestion des aliments, en particulier des graisses. Cela pourra se traduire par des selles plus fréquentes, plus abondantes ou plus grasses, ainsi qu’une possible perte de poids ou un inconfort digestif. Les procédures expérimentales associées (notamment prélèvements sanguins, pesée et administration de substances le cas échéant) peuvent générer un stress transitoire lié à la contention et à la manipulation. Enfin, l’hébergement individuel, avec maintien de contacts physiques (portes avec barreau), pendant la récupération post chirurgicale et les phases de collecte des fèces, peut constituer une source de stress.

Devenir

Euthanasie, car ces animaux présenteront une insuffisance pancréatique exocrine non compatible avec leur maintien en vie dans de bonnes conditions. Uniquement pour ceux qui auraient subi le début de la chirurgie mais dont la ligature du canal aurait été rendue impossible, sans autre complication majeure nuisant à leur bien-être après le réveil : ces cochons pourraient être gardés en vie et réutilisés. Ce cas de figure reste très peu probable (3 animaux indiqués).

Remplacement

Le recours à l’animal est justifié par l’absence de méthodes alternatives permettant de reproduire la complexité de la digestion et de l’absorption des nutriments à l’échelle de l’organisme entier. Les modèles in vitro ou ex vivo ne permettent pas de mimer de manière satisfaisante les interactions entre sécrétions pancréatiques, transit intestinal, microbiote et absorption des lipides. De même, les approches in silico ne permettent pas à ce jour de prédire de façon fiable les effets de traitements sur la digestion dans un contexte pathologique. Ainsi, l’utilisation d’un modèle animal reste nécessaire pour répondre aux objectifs du projet. Le choix du miniporc, dont la physiologie digestive est proche de celle de l’Homme, permet de maximiser la pertinence des données obtenues.

Réduction

Le nombre d’animaux a été limité au strict nécessaire pour atteindre les objectifs scientifiques. Les études sont conçues avec des effectifs réduits (généralement 4 animaux par groupe), adaptés à la variabilité attendue des paramètres mesurés. La réalisation de mesures répétées chez un même animal (collectes fécales sur plusieurs jours, suivi longitudinal) permet d’augmenter la robustesse des données sans augmenter le nombre d’animaux. Par ailleurs, plusieurs conditions expérimentales peuvent être évaluées au sein d’une même étude, limitant le recours à des expérimentations supplémentaires. Enfin, les données issues de ce projet pourront être utilisées pour optimiser les études ultérieures, contribuant ainsi à une réduction globale du nombre d’animaux utilisés.

Raffinement

Le raffinement des méthodes expérimentales pour réduire au maximum la souffrance animale est mis en œuvre grâce à l'utilisation de points limites clairement établis, permettant d'euthanasier tout animal présentant des signes de douleur, de souffrance ou d'angoisse dépassant le cadre de l'étude. En cas de doute sur l’état général de l’animal, une évaluation approfondie sera réalisée quotidiennement jusqu'au retour aux paramètres physiologiques attendus ou jusqu’à atteinte des points limites. De plus, suite à la phase de chirurgie, un formulaire interne spécifique à l’espèce sera complété. Il intègre une évaluation de l’appétit, du poids, de l’attitude, de l’activité, et du comportement général de l’animal, ainsi que l’évaluation du comportement vis-à-vis de la zone de chirurgie et de la réaction lors de la palpation de la zone de chirurgie. Ce formulaire d’évaluation de la douleur permet de prendre les bonnes décisions en évitant toute souffrance animale inutile. Il est aussi mis en place un enrichissement complet dans l'hébergement des animaux (e.g. litière, plateformes, bacs de repos, jouets et musique, présence de congénères...). Pour les phases chirurgicales, les animaux sont anesthésiés et analgésiés selon un programme défini par un vétérinaire, afin de réduire au maximum toute douleur ou sensation de souffrance. De plus, la phase de chirurgie est raffinée au maximum, par la mise à disposition d’oxygène ou air ambiant à concentration ajustable, de tapis chauffants et/ou de lampes chauffantes et de soins pré- et postopératoires complets. Le recours à des dispositifs implantables constitue une mesure de raffinement spécifique : la littérature sur le porc montre que ces dispositifs chroniques permettent des prélèvements et administrations répétés avec un stress et une contention nettement réduits par rapport aux méthodes conventionnelles de contention/ponction directe.

Choix des espèces

Le choix du miniporc Göttingen repose sur la forte proximité anatomique, physiologique et fonctionnelle de son système digestif avec celui de l’Homme, en particulier en ce qui concerne la structure du pancréas, la sécrétion des enzymes digestives et la digestion des lipides. Cette espèce est reconnue comme un modèle pertinent en recherche translationnelle pour l’étude des pathologies pancréatiques et des troubles de la digestion, notamment en raison de profils enzymatiques et de mécanismes d’absorption intestinale comparables à ceux observés chez l’Homme. L’utilisation d’animaux adultes (environ 2 ans, d'environ 35 kg) permet de travailler sur un système digestif pleinement mature, limitant ainsi la variabilité liée au développement et améliorant la reproductibilité des données.

Pour produire des marqueurs d'imagerie destinés à de futures évaluations précliniques de traitements, 146 souris, dont des porteuses d'une mutation liée à un syndrome de déficience intellectuelle, vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue pour prélever leur cerveau. La lignée mutante présente une susceptibilité accrue à l'épilepsie, avec un suivi des crises spontanées. Les souris passent trois tests de comportement sur la mémoire à court terme, la mémoire des événements vécus et l'orientation dans l'espace, sans que leurs noms soient donnés, puis sont transportées vers un second établissement pour environ deux heures trente d'IRM sous anesthésie gazeuse, et une partie subit une chirurgie terminale sans réveil. Le porteur annonce aussi vouloir "développer et standardiser" chez la souris la méthode d'imagerie GluCEST, c'est-à-dire fournir un outil pour d'autres expériences sur des souris.

Objectifs

Le syndrome deéficience intellectuelle étudié est une maladie génétique rare qui affecte le développement du cerveau. Les personnes atteintes présentent souvent une déficience intellectuelle, une tête plus petite, un retard de croissance, des troubles du spectre de l’autisme et une susceptibilité accrue à l'épilepsie. Cette maladie est causée par des anomalies d'un gène, qui joue un rôle essentiel dans la formation et le fonctionnement du cerveau. Des recherches récentes ont montré que lorsque ce gène ne fonctionne pas correctement, certaines cellules nerveuses importantes migrent mal au cours du développement. Cela perturbe l'équilibre entre les signaux qui stimulent et ceux qui freinent l'activité cérébrale. L’objectif de ce projet est donc de caractériser les altérations cérébrales associées à la déficience intellectuelleétudiée, chez un modèle de souris, (portant la même anomalie génétique et présentant des caractéristiques proches de celles observées chez les patient) par plusieurs techniques d'imagerie par résonance magnétique (IRM) ainsi que des tests comportementaux. Cette approche fournira des biomarqueurs d'imagerie utilisables comme critères de jugement intermédiaires pour les futures évaluations thérapeutiques précliniques. Ce projet se déroule dans 2 Etablissements Utilisateurs.

Bénéfices attendus

Sur le plan fondamental, ce projet qui se déroulera au sein de 2 Etablissements Utilisateurs permettra de mieux comprendre comment la perte partielle du gène d'intérêt affecte le fonctionnement du cerveau, ainsi que d'autres troubles du développement neurologique liés à un déséquilibre entre les signaux excitateurs et inhibiteurs des neurones. Grâce à une technique d'imagerie appelée GluCEST, il sera possible de mesurer le glutamate qui est la principale molécule excitatrice dans l'ensemble du cerveau de souris porteuses de cette anomalie génétique et de vérifier si ce déséquilibre, déjà observé au niveau des cellules, est également présent à l'échelle de l'organisme entier. Ce projet pourrait aussi avoir des retombées pour les patients. En effet, l'identification de marqueurs visibles à l'IRM pourrait faciliter le diagnostic et le suivi de la maladie chez l'Homme, mais aussi servir à évaluer l'efficacité de futurs traitements lors d'essais précliniques. Enfin, ce travail contribuera à développer et standardiser l'utilisation de la méthode GluCEST chez la souris pour l'étude des maladies neurodéveloppementales, le système glutamatergique étant impacté dans un grand nombre de ces pathologies..

Procédures

Les souris ne reçoivent aucun traitement pharmacologique dans le cadre de ce projet (en dehors des anesthésiques et de l'analgésie locale liés aux procédures elles-mêmes). Les interventions sont les suivantes : Dans le premier établissement utilisateur : 3 tests comportementaux passifs permettant d’évaluer la mémoire à court terme, les souvenirs d'événements vécus et l'orientation dans l'espace: 1 fois par animal et par test, durée maximale 20 min/test. Transfert entre les établissements utilisateurs (1 fois). Dans le deuxième établissement utilisateur : Anesthésie gazeuse pour l'IRM : Durée totale environ 2h30. • pour une partie des animaux : une chirurgie terminale sous anesthésie profonde sans réveil d’une durée de 20 minutes et résulte en la mort des animaux

Impact sur les animaux

Nuisances liées au phénotype dommageable : la lignée génétiquement modifiée présente une susceptibilité accrue à l'épilepsie, congénitales et stables. Une surveillance dédiée est mise en place. Nuisances liées aux procédures : • L'IRM sous anesthésie entraîne une diminution de la température corporelle et un risque de dépression respiratoire, gérés par le chauffage et le monitorage en continu. • Le transfert entre sites engendre un stress, atténué par les cages sécurisées et l’acclimatation de 2 semaines. • La chirurgie terminale est réalisée sous anesthésie profonde sans réveil. Elle induit un stress et une douleur de courte durée au moment de l’anesthésie, ainsi qu’une hypothermie et une dépression cardiorespiratoire.

Devenir

Tous les animaux sont mis à mort à l'issue des procédures afin d’effectuer des prélèvements d’organes d’intérêt (cerveaux).

Remplacement

La compréhension des mécanismes physiopathologiques et des altérations cérébrales associées au syndrome de déficience intellectuelle étudié nécessite l'étude d'un organisme entier. La caractérisation in vivo de la connectivité cérébrale, de la microstructure tissulaire et des mécanismes chimiques impliquant le glutamate nécessite l’utilisation d’animaux vivants et de techniques d’imagerie comme l’IRM. De même, l’évaluation comportementale ne peut être réalisée que sur un organisme entier. À l’heure actuelle, les méthodes alternatives telles que les cultures de cellules, les organoïdes ou les simulations informatiques ne sont pas capables de reproduire toute la complexité du cerveau adulte et de son fonctionnement. La souris est l'espèce mammifère la plus proche de l'Homme dans laquelle nous disposons d'un modèle génétique reproduisant fidèlement la pathologie humaine.

Réduction

Les groupes expérimentaux ont été dimensionnés sur la base de nos études IRM antérieures permettant de déterminer le minimum d'animaux pour une analyse statistique de puissance suffisante. L'utilisation des animaux issus de l'élevage existant et la mutualisation des animaux entre modalités (comportement → IRM → prélèvements terminaux sur le même animal) permettent de réduire le nombre à 130 animaux expérimentaux (146 total).

Raffinement

Compte tenu du phénotype dommageable de la lignée étudiée, une surveillance dédiée est mise en place, intégrant la grille faciale de douleur de la souris et un suivi spécifique des crises épileptiques spontanées. Les conditions d'élevage sont enrichies (nidification doublée, tunnel) et l'hébergement en groupes assure une vie sociale, particulièrement importante pour cette lignée présentant des phénotypes de type Trouble du Spectre Autistique. Une semaine avant les tests de comportement les animaux sont habitués à être manipulés par l’expérimentateur. Le transport entre les 2 établissements utilisateurs se fait dans des cages spécialisées avec nourriture et eau gélifiée. Une période d’acclimatation de 2 semaines est respectée avant les examens IRM. L'anesthésie IRM est optimisée sur des animaux indépendants ; le monitorage continu (respiration, température) et le maintien thermique limitent les complications anesthésiques. Les yeux des animaux sont protégés à l’aide d’un gel ophtalmique et ils sont réhydratés à l'issue des IRM. Les prélèvements terminaux sont réalisés lors de la chirurgie terminale sous anesthésie profonde sans réveil. Des points limites ont été établis afin de soustraire les animaux à la douleur.

Choix des espèces

La souris (Mus musculus) est l'espèce de choix pour générer des modèles de maladies génétiques humaines : sa physiologie et sa génétique sont bien connues, et les méthodes de manipulation génétique y sont les plus développées. La nécessité d'utiliser une lignée transgénique est liée à l'absence de modèle spontané de la lignée génétiquement modifiée. Le modèle utilisé dans ce projet reproduit fidèlement les phénotypes clés observés chez les patients. Les animaux seront utilisés à l'âge adulte (à partir de 2 mois). À cet âge, le développement cérébral est complet, le comportement exploratoire et les aptitudes de mémorisation sont stables, et les phénotypes neuroanatomiques de la lignée génétiquement modifiée (microcéphalie, microstructure tissulaire) sont pleinement exprimés.

Infectées sous anesthésie par voie orale, nasale et intrapéritonéale avec un virus de la famille des Paramyxoviridae, des chauves-souris frugivores subissent ensuite écouvillonnages oraux, nasaux et rectaux, prises de sang, pesées et prises de température, à J0, J3, J6, puis chaque semaine jusqu'à J21 et toutes les deux semaines jusqu'à J91. Au total, 7 chauves-souris adultes, déclarées dans la catégorie "Autres mammifères", vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour des analyses immunologiques, virologiques et histologiques, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Trois d'entre elles, suivies plus longtemps, reçoivent en plus trois doses de dexaméthasone, qui provoque une immunosuppression, et le porteur reconnaît que les nuisances viennent surtout des "anesthésies répétées". Le projet sert à mettre au point un protocole d'infection pour des études futures, mais le résumé ne nomme pas l'espèce de chauve-souris et ne dit pas si les individus sont capturés ou élevés.

Objectifs

Le projet vise à développer et caractériser un modèle d'infection virale expérimentale chez des chauves-souris frugivore. Cette étude permettra d'établir les conditions expérimentales nécessaires à la réalisation d'études futures portant sur les interactions entre les chauves-souris et les virus dont elles constituent des réservoirs naturels ou potentiels. Le virus de la même famille (Paramyxoviridae), connu pour induire une infection asymptomatique ou faiblement pathogène chez les chauves-souris, sera utilisé comme modèle d'infection. Les objectifs spécifiques du projet sont : 1. mettre en place et valider un protocole d'infection expérimentale chez les chauves-souris ; 2. caractériser la cinétique de l'infection par le suivi de la virémie, de l'excrétion virale et de la distribution tissulaire du virus ; 3. évaluer l'évolution clinique de l'infection au cours du temps ; 4. caractériser les réponses immunitaires humorales et cellulaires induites par l'infection ; 5. générer les données de référence nécessaires au développement d'études visant à comprendre les mécanismes de contrôle des infections virales chez les chauves-souris.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de développer et de valider un modèle d'infection virale expérimentale chez les chauves-souris. Les données obtenues permettront de mieux décrire la cinétique de l'infection, la distribution du virus dans les tissus ainsi que les réponses immunitaires induites chez cette espèce. Les résultats générés constitueront des données de référence indispensables pour la mise en place d'études visant à comprendre les mécanismes impliqués dans les interactions entre les chauves-souris et les virus dont elles sont réservoirs. À plus long terme, ces travaux pourraient participer à une meilleure compréhension des facteurs impliqués dans l'émergence et la transmission de certains virus d'intérêt en santé animale et en santé publique.

Procédures

Les animaux seront soumis aux interventions suivantes : infection expérimentale - réalisée une seule fois à J0 sous anesthésie par voies orale, nasale et intrapéritonéale, sous anesthésie avec une durée environ 10 minutes par animal. Prélèvements répétés : écouvillonnages oral, nasal et rectal, prélèvement urinaire si disponible, prélèvement sanguin, mesure du poids et de la température. Ces prélèvements seront réalisés à J0, J3, J6, puis une fois par semaine jusqu’à J21, puis toutes les deux semaines jusqu’à J91. Des prélèvements complémentaires seront réalisés à J94, J97 et J100 selon les animaux avec une durée estimée : environ 10 à 15 minutes par animal et par temps de prélèvement. Administration de dexaméthasone : réalisée chez les trois animaux suivis à long terme, avec une durée de quelques minutes par animal et par administration (3 fois durant l'étude).

Impact sur les animaux

Les nuisances attendues au cours de cette étude sont principalement liées aux anesthésies répétées nécessaires à la réalisation des différentes procédures expérimentales. Bien que de courte durée, ces anesthésies peuvent entraîner un stress transitoire lors de l'induction et du réveil ainsi qu'un risque faible de complications anesthésiques. L'infection pourrait induire des modifications de l'état général telles qu'une baisse transitoire d'activité, une diminution de la prise alimentaire, une perte de poids ou une modification de la température corporelle. Cependant, le virus utilisé est décrit comme peu ou pas pathogène chez les chauves-souris. Les animaux suivis à long terme recevront un traitement à la dexaméthasone. Ce traitement est susceptible d'entraîner une immunosuppression transitoire ainsi qu'un inconfort léger et temporaire lié à son administration.

Devenir

Les animaux seront euthanasiés afin de réaliser des analyses immunologiques, virologiques et histologiques.

Remplacement

Des travaux préalables ont été réalisés à l'aide de modèles in vitro afin d'étudier certaines interactions entre le virus et les cellules de chauve-souris. Ces approches ont permis d'acquérir des données et de répondre à plusieurs questions mécanistiques. Cependant, elles ne permettent pas d'évaluer les interactions complexes se produisant à l'échelle de l'organisme entier. À l'heure actuelle, il n'existe pas de méthode alternative permettant de reproduire l'ensemble des mécanismes impliqués dans la réponse immunitaire d'un animal vivant après infection. L'utilisation de chauves souris est donc nécessaire pour répondre aux objectifs du projet..

Réduction

Le nombre d'animaux a été limité au strict nécessaire pour répondre aux objectifs du projet. Chaque animal fera l'objet de plusieurs prélèvements au cours du suivi expérimental, permettant d'obtenir un maximum d'informations à partir d'un même individu. De plus, les prélèvements réalisés à l'euthanasie seront utilisés pour différentes analyses (virologiques, immunologiques et histologiques), limitant ainsi le recours à des animaux supplémentaires.

Raffinement

Les animaux disposeront d'une période d'acclimatation de 14 jours avant le début de l'étude. Les procédures seront réalisées par du personnel formé à la manipulation des chauves-souris. Les anesthésies utilisées pour les différentes interventions permettront de limiter le stress et l'inconfort des animaux. Les animaux seront suivis régulièrement tout au long de l'étude et toute modification de leur état général fera l'objet d'une prise en charge adaptée. Un suivi clinique rapproché sera assuré après chaque procédure, avec mise en place de critères d’arrêt si nécessaire, afin de garantir le bien-être des animaux tout au long du projet. Des points limites ont été définis afin de garantir le bien-être des animaux. De plus, les conditions d’hébergement seront adaptées à l’espèce, avec des volières spacieuses permettant aux chauves-souris de se déplacer librement, de se suspendre la tête en bas et de déployer leurs ailes. Bien qu’il n’existe pas de cadre réglementaire spécifique pour l’hébergement de ces animaux, les installations ont été définies sur la base des retours d’expérience de structures spécialisées et des recommandations issues de la littérature, afin d’assurer des conditions adéquates et conformes aux besoins biologiques de l’espèce.

Choix des espèces

Les chauves-souris ont été choisies car elles constituent des hôtes naturels de nombreux virus d'intérêt en santé animale et en santé publique. Elles présentent la particularité d'héberger ces agents infectieux sans développer les formes cliniques sévères observées chez d'autres espèces de mammifères. L'objectif du projet étant de caractériser l'évolution d'une infection virale et les réponses de l'hôte dans une espèce réservoir, il n'est pas possible de remplacer la chauve-souris par une autre espèce animale. Les animaux utilisés seront des chauves-souris adultes. Ce choix se justifie par le fait que la procédure prévue nécessite des animaux ayant atteint un développement physique complet et une taille suffisante pour permettre une manipulation sûre.

60 souris âgées de quatre semaines vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Sous anesthésie, une dent leur est extraite puis réimplantée, avec ou sans une molécule censée régénérer le ligament qui la relie à l'os, et elles peuvent ensuite avoir du mal à se nourrir, d'où une alimentation molle. Les analyses ont lieu quatre semaines après l'opération, sur la mâchoire supérieure prélevée après la mise à mort, et les applications annoncées en dentisterie restent au conditionnel. Parmi les bénéfices, le porteur affirme que sa molécule pourrait remplacer le traitement de référence, un produit d'origine animale, pour "réduire l'utilisation de produits d'origine animal".

Objectifs

Le ligament parodontal est un tissu souple qui relie la dent à l’os de la mâchoire. Très fin (environ un quart de millimètre), il agit comme un véritable amortisseur et permet à la dent de résister aux forces exercées lors de la mastication. Grâce à un réseau de fibres et de cellules spécialisées, il joue un rôle essentiel dans le maintien de la dent et dans le renouvellement des tissus environnants, comme l’os et la surface de la racine dentaire. Il s’agit d’un tissu vivant, riche en nerfs et en vaisseaux sanguins, capable de s’adapter en permanence. Avec l’âge, les infections bactériennes ou certaines maladies chroniques inflammatoires, ce ligament s’amincit, se fragilise et perd progressivement ses fonctions. Cela peut conduire au déchaussement des dents. Dans certaines situations cliniques, notamment lors de la pose d’implants dentaires, ce ligament est totalement absent. Si les fibres et les cellules responsables de l’attachement de la dent et du renouvellement des tissus ont déjà été largement étudiées, les vaisseaux sanguins du ligament restent en revanche mal connus. Pourtant, ils sont indispensables à la vitalité du tissu : ils assurent l’apport de nutriments, le bon fonctionnement des nerfs, le renouvellement des cellules et le maintien de la structure du ligament. Il existe des molécules naturellement présentes dans ce tissu, qui jouent un rôle clé dans la formation et le maintien des vaisseaux sanguins. Lorsque ces molécules sont altérées, le ligament perd sa structure et sa capacité à fonctionner correctement. À partir de ces découvertes, nous avons développé une nouvelle molécule capable de stimuler la réparation des vaisseaux et de favoriser la régénération du tissu. L’objectif de ce projet est d’évaluer l’effet réparateur de cette molécule sur la régénération du ligament parodontal. Pour cela, nous utiliserons un modèle expérimental chez la souris, basé sur l’extraction puis la réimplantation d’une dent. Les résultats obtenus avec cette nouvelle approche seront comparés à ceux d’un traitement de référence déjà utilisé en dentisterie, ainsi qu’à un support neutre servant de contrôle [MAIS AUSSI UNE NOUVELLE MOLECULE PROMETTEUSE]. Nous analyserons différents paramètres, tels que l’épaisseur du ligament, la dégradation de la racine dentaire ou la fusion anormale entre la dent et l’os. Des analyses microscopiques permettront également de suivre l’évolution du tissu pendant un mois et d’évaluer la qualité de sa régénération.

Bénéfices attendus

L’ambition du projet est d’exploiter des propriétés nouvelles mise en évidence pour une molécule recombinante pour améliorer les performances du ligament parodontal. Cela pourrait permettre une meilleure prise en charge des traumatismes dentaires, le développement d’implants dentaires bio-intégrés, l’optimisation des traitements orthodontiques et le traitement des maladies du ligament parodontal. De plus, le traitement utilisé actuellement est un produit d’origine animale dont le mode d’action est peu connu. Notre molécule recombinante pourrait remplacer ce produit pour réduire l’utilisation de produits d’origine animal.

Procédures

Tous les animaux seront soumis à une procédure chirurgicale sous anesthésie avec extraction dentaire puis réimplantation avec ou sans la molécule d'intérêt. Cette intervention durera quelques minutes. Les analyses se feront 4 semaines après l'intervention chirurgicale.

Impact sur les animaux

Des douleurs d'intensités légères pourront être ressenties sur une durée limitée (quelques heures) lors des injections et après la chirurgie. Il y a également des risques d'infection ou de saignement du site opératoire au moment de l'extraction. Les souris pourront ensuite avoir des difficultés à se nourrir correctement.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés par du personnel formé afin que les prélèvements du maxillaire en vue des études histologiques prévues puissent être faits.

Remplacement

Ces expériences doivent être réalisées sur un modèle animal, car il n’est pas possible de reproduire en laboratoire toute la complexité d’un tissu vivant. Seules des études menées chez l’animal permettent d’observer des phénomènes essentiels comme la formation des vaisseaux sanguins et la cicatrisation, dans des conditions proches de celles du corps humain. Des tests en laboratoire ont déjà été réalisés pour mettre au point la molécule utilisée et définir la meilleure façon de l’employer. Toutefois, avant toute application chez l’humain, il est indispensable de passer par des études précliniques sur l’animal. Dans le cadre de ce projet, ces travaux seront menés chez le rongeur. Ces études permettent de vérifier si la molécule est efficace, si elle fonctionne correctement dans un organisme vivant et si elle favorise réellement la régénération du ligament qui maintient la dent. Les résultats obtenus chez l’animal constituent une étape clé avant toute évolution vers une application clinique.

Réduction

Le nombre d’animaux a été déterminé par un calcul de puissance statistique a priori. Des expérimentations in vitro ont déjà été menées sur cette nouvelle molécule pour déterminer la formulation optimale

Raffinement

Afin de limiter leur stress, une période d’adaptation est prévue pour les habituer progressivement aux déplacements vers la salle de chirurgie. Pendant l’intervention, les animaux seront endormis puis maintenus sous anesthésie de façon adaptée à la chirurgie réalisée dans la bouche. Des traitements contre la douleur seront administrés avant et après l’opération afin d’assurer leur confort. Un gel protecteur sera appliqué sur les yeux pendant l’intervention pour éviter toute sécheresse. À la fin de la chirurgie, une solution hydratante tiède sera administrée afin de prévenir la déshydratation. Le réveil se fera dans des conditions contrôlées, sur un support chauffant, et chaque animal sera placé temporairement dans une cage individuelle pour éviter tout risque lié au contact avec d’autres animaux encore éveillés. Une fois complètement réveillé, l’animal sera replacé dans sa cage habituelle. Après l’intervention, une alimentation molle sera proposée pour faciliter la prise de nourriture et éviter tout déplacement de la dent traitée. Une attention particulière sera également portée à une bonne hydratation. Les animaux seront surveillés quotidiennement pour veiller à ce que les points limites définis ne soient pas atteints. Une procédure précise de décisions sera mise en place par l'expérimentateur en collaboration avec le personnel de l'animalerie.

Choix des espèces

Le projet utilise un modèle murin déjà décrit. La molécule que nous voulons tester a déjà été utilisée dans le modèle de rétine postnatale de souris et s’est avéré fonctionnelle et sans effet délétère dans cette espèce. Les souris utilisées seront âgées de 4 semaines qui correspond à un âge ou le ligament parodontal est bien établi et fonctionnel.

Chaque souris subit une chirurgie du cerveau d'une trentaine de minutes, pour y injecter un virus ou y implanter des canules et des sondes de microdialyse. 630 souris mâles adultes vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, pour tester si le prucalopride, un médicament contre la constipation, réduit rapidement l'anxiété, en comparaison avec la fluoxétine et le diazépam. Le porteur affirme que "Les nuisances pour ces animaux sont faibles" et que l'implantation n'est qu'une "gène légère", au motif que le cerveau est dépourvu de fibres de la douleur, et il ne nomme pas le test comportemental que passe chaque souris. Toutes sont tuées à l'issue par perfusion d'un fixateur sous anesthésie, qui vide leur corps de leur sang, pour étudier leur cerveau.

Objectifs

Les troubles anxieux sont parmi les maladies psychiatriques les plus fréquentes dans le monde. Ils impactent de façon important la qualité de vie des personnes atteintes ainsi que leur capacité à travailler et à mener une vie normale. Aujourd’hui, les traitements disponibles ne sont pas efficaces pour tout le monde : environ 40 % des patients ne répondent pas suffisamment. Les médicaments les plus utilisés, appelés antidépresseurs, mettent plusieurs semaines avant d’agir. Pour soulager plus rapidement les symptômes, d’autres médicaments comme les benzodiazépines sont souvent prescrits, mais ils peuvent entraîner des effets secondaires importants comme une dépendance, une somnolence ou des troubles de la mémoire. Dans ce contexte, il est nécessaire de développer de nouvelles approches thérapeutiques, à la fois plus rapides et mieux tolérées. Une piste prometteuse serait de cibler des récepteurs à la sérotonine présent dans les régions du cerveau impliquées dans la régulation de l’humeur. Un médicament déjà utilisé chez l’Homme pourrait agir sur ces récepteurs et produire des effets bénéfiques sur l’anxiété et l’humeur. Des études chez l’animal ont déjà montré des résultats encourageants, notamment après des traitements prolongés. L’objectif de ce projet est d’évaluer si ce médicament peut également agir rapidement après une seule administration, et de comparer ses effets à ceux des traitements actuellement utilisés pour soulager rapidement les troubles anxieux. Le projet vise aussi à mieux comprendre les mécanismes dans le cerveau qui expliquent ces effets, en s’intéressant à des régions cérébrales impliquées dans les réponses au stress. Ces travaux pourraient contribuer à l’identification de nouvelles stratégies thérapeutiques pour une prise en charge plus rapide et plus sûre des troubles anxieux

Bénéfices attendus

Cette étude sera la première à examiner les effets anxiolytiques rapides après une administration unique du prucalopride, utilisé chez l’homme dans la prise en charge symptomatique de la constipation chronique idiopathique, dans le modèle de souris adultes mâles, comparé à un antidépresseur de référence, la fluoxétine et à une benzodiazépine de référence, le diazépam. Les résultats de cette étude fourniront des informations sur l’intérêt de repositionner le prucalopride en tant que nouvelle approche thérapeutique pour la prise en charge des troubles anxieux. Cette approche permettra de diminuer le recours aux benzodiazépines et donc d’offrir une alternative thérapeutique plus sécurisée pour les patients. Vu que le prucalopride est actuellement approuvé pour l’utilisation chez l’Homme il est réaliste d’envisager une future inclusion du prucalopride au sein de l’arsenal thérapeutique actuel pour la prise en charge des troubles anxieux. De plus nous serons les premiers à mettre en évidence les effets prosociaux du prucalopride, ce qui représente un intérêt certain dans la prise en charge du troubles anxieux et fournira également un point de départ pour des recherches concernant d’autres troubles impliquant une altération de la sociabilité. Enfin, cette étude s’inscrit dans la continuation des travaux explorant simultanément les dimensions comportementales et les circuits neuronaux, en lien avec la modulation des comportements de type anxieux. Les résultats de cette étude fourniront de nouvelles informations sur les mécanismes qui sous-tendent l'activité des anxiolytiques et pourraient conduire au développement de nouveaux traitements pour les troubles anxieux d’une façon plus ciblées.

Procédures

Les chirurgies d'administration de virus et d'implantation des canules au niveau du cerveau seront réalisées par du personnel qualifié à ces techniques, une seul fois par animal, et durent environ 30 minutes par opération. Chaque animal ne subira qu’un seul test comportemental lors des procédures et ceux-ci durent moins de 30 minutes et n'impliquent pas de douleur. Après les expériences, les animaux seront perfusés sous anesthésie (sans réveil) par une solution de fixation pour permettre de préserver les cerveaux en vue de les étudier.

Impact sur les animaux

Les nuisances pour ces animaux sont faibles. Pour l'axe comportemental, les administrations intracérébrales seront réalisées par du personnel qualifié à ces techniques et les tests comportementaux n'impliquent pas de douleur ou de durée d'expérimentation déraisonnable, la dialyse a lieu pendant 3 à 4 heures sans manipulation de l'animal et les tests comportementaux effectués 30 minutes après administration locale ne durent que 5 minutes. Les implantations intracérébrales constituent une gène légère pour l'animal. En effet, le cerveau est dépourvu de fibres sensibles à la douleur, à titre d'exemple des chirurgies similaires sont réalisées chez l'humains sous simple anesthésie locale. La perfusion des animaux par la solution de fixation tissulaire implique d’extraire le sang de l’animal inconscient, sous anesthésie et antidouleur.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés à la fin des procédures expérimentales car nous souhaitons explorer différents paramètres neuronaux à partir de tissus cérébraux prélevés après euthanasie.

Remplacement

L'utilisation de souris est indispensable pour ce projet. L'évaluation de processus complexes qui induisent une réponse neurochimique ou comportementale n'est à ce jour pas modélisable. Ainsi seul un animal entier vivant et vigile permet d'appréhender ces éléments.

Réduction

Une étude statistique préalable nous a permis de déterminer le nombre minimal d’animaux nécessaires pour pouvoir mener cette étude. Cela a été fait grâce à un calcul de puissance effectué pour nos tests comportementaux dont les données présentent la plus grande variance.

Raffinement

Un anesthésique est utilisé pour effectuer l'implantation des sondes de microdialyse. Le cerveau est un organe dépourvu de fibres nerveuses libres dédiées à la nociception, bien qu'invasive cette chirurgie se révèle mineure pour les animaux. Par ailleurs un anti inflammatoire est utilise le jour de la chirurgie. Si l'animal présente un état physiologique anormal (immobilité, prostration, signes de souffrances, perte de poids supérieur à 20% par rapport au poids à 8-10 semaines), l'animal sera euthanasié.

Choix des espèces

À ce jour, les mécanismes impliqués dans les effets anxiolytiques restent mal compris et ne peuvent être reproduits ni simulés par des modèles in vitro. Des animaux adultes seront utilisés car nous nous intéressons à l’étude de l’effet anxiolytique chez l’adulte. De plus, l’espèce choisie permet de faire les modifications génétiques nécessaire pour étudier l’activités des circuits de neurones impliqués.

Les souris qui font plusieurs hypoglycémies avant la thérapie génique sont mises à mort. 66 souris mâles vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue pour prélever leur foie, et 50 d'entre elles, issues d'une lignée transgénique, sont rendues malades d'une glycogénose de type Ia par cinq jours d'injections. Après une biopsie à l'âge de 7 à 10 jours, elles reçoivent un virus modifié dans la circulation sanguine, puis des tests au glucose et à l'insuline avec jusqu'à six gouttes de sang prélevées à la queue par test, et un jeûne final de 6 ou 16 heures. Le porteur décrit des hypoglycémies sévères qui entraînent "un mal-être qui peut être important, voire le décès de l'animal s'il n'est pas pris en charge". Pendant ce jeûne, une souris en hypoglycémie est exclue du projet, l'injection de virus étant alors jugée inefficace.

Objectifs

La glycogénose de type I est une maladie génétique rare causée par un défaut dans un gène qui joue un rôle clé dans la production de sucre (glucose) par le foie. Lorsqu'il ne fonctionne pas correctement, le corps ne peut pas produire de glucose en interne, ce qui entraîne de graves baisses de sucre dans le sang (hypoglycémies). De plus, des accumulations de glycogène (polymère de glucose) et de graisses se forment dans le foie, ce qui peut provoquer des problèmes hépatiques à long terme, allant jusqu’au développement de tumeurs pouvant nécessiter une greffe du foie. Actuellement, il n’existe pas de traitement curatif pour cette maladie. Les patients doivent suivre un régime alimentaire très strict pour éviter les hypoglycémies, en mangeant régulièrement des sucres lents (Maïzena crue). La thérapie génique est une piste prometteuse ; elle consiste à introduire un gène fonctionnel dans le foie à l’aide de virus modifiés qui servent de « transporteurs » du gène médicament. Une étude sur un modèle viable de souris atteintes de glycogénose de type I a montré que l’injection unique de ce traitement permettait de restaurer la production de glucose par le foie et d’éviter l’apparition de tumeurs. Deux types de vecteurs ont été testés. Mod le 5/09/26 Le premier semble plus efficace mais l’expression du gène médicament n’est pas régulée par l’insuline. Le deuxième, bien que moins efficace, est sensible aux régulations hormonales. Ces régulations sont importantes car l’insuline est une hormone qui contrôle le taux de sucre dans le sang. Elle est produite par le pancréas après un repas pour éviter que les taux de glucose dans le sang soient trop élevés. L’absence de régulation hormonale de l’expression du gène médicament pourrait dérégler l’équilibre de glucose dans le corps, et potentiellement favoriser une résistance à l’insuline, surtout en cas d'alimentation déséquilibrée, voire une hyperglycémie, qui sont les caractéristiques du diabète. Mod le 5/09/26 Les objectifs de ce projet seront 1) d’étudier l’impact de la thérapie génique sur l’équilibre du glucose et la réponse à l’insuline chez des souris atteintes de glycogénose, et 2) de comparer l’efficacité des deux vecteurs utilisés en analysant l’expression du gène médicament dans des conditions optimales, c’est-à-dire au cours du jeûne, lorsque l’organisme a besoin de produire du glucose pour maintenir sa glycémie.

Bénéfices attendus

Le taux de sucre dans le sang (glycémie) doit être très bien régulé. Si le foie produit trop de glucose, cela peut entraîner un risque de diabète, surtout chez les personnes ayant une alimentation déséquilibrée et un excès de poids. Les patients atteints de glycogénose de type I ne produisent pas de glucose eux-mêmes, donc ils doivent manger régulièrement des sucres lents tout au long de la journée et même la nuit. Ce régime constant peut les rendre moins sensibles à l'insuline, une hormone essentielle pour réguler le sucre dans le sang. La thérapie génique pourrait leur permettre de produire du glucose, mais selon la méthode utilisée, elle pourrait aussi modifier l’équilibre glycémique et, à long terme, augmenter le risque de diabète, surtout si leur alimentation n’est pas adaptée. Ce projet vise à mieux comprendre comment la thérapie génique influence la régulation du glucose chez des souris atteintes de glycogénose, en particulier après les repas et au cours du jeûne. L’objectif est de trouver la meilleure approche pour optimiser ce traitement et, si nécessaire, donner des recommandations alimentaires aux patients pour éviter d’éventuels effets secondaires.

Procédures

Afin de sélectionner les souris transgéniques nécessaires au projet, un morceau de tissu (biopsie) sera prélevé pour caractériser leurs gènes. La durée du geste est de quelques secondes. Toutes les souris subiront une injection tous les jours pendant 5 jours (quelques secondes/souris) pour induire la glycogénose. Toutes les souris transgéniques seront traitées par thérapie génique par une injection unique du vecteur dans la circulation sanguine. Pour cela, les souris seront immobilisées dans un tube de contention adapté à ce type de procédure de manière à la rendre rapide et limiter le stress de l’animal (durée d’environ 1 minute). Mod le 05/09/26 Toutes les souris seront nourries en régime standard. Pour analyser la régulation de leur glycémie, les souris recevront une injection de glucose ou d’insuline (quelques secondes) et leur glycémie sera mesurée régulièrement pendant 2 heures. Pour cela, une goutte de sang sera prélevée (au total 6 fois au cours de chaque test) à l’extrémité de la queue. Une seule incision initiale de l’extrémité de la queue sera réalisée après application d’une crème anesthésiante. Au total, 3 prises de sang (par massage de la queue pendant 30 secondes) seront aussi réalisées avant et après l’injection du glucose pour suivre la sécrétion d’insuline. Mod le 05/09/26 En fin de procédure, les souris seront mises à jeun, 6h ou 16h. Une prise de sang (durée quelques secondes) sera réalisée juste avant la mise à mort de l’animal.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables prévus sur les animaux sont : -l’induction de la glycogénose de type I qui est une maladie entrainant des hypoglycémies sévères quand les animaux ne mangent pas (entre les repas). Le développement des hypoglycémies entraine un mal-être qui peut être important, voire le décès de l’animal s’il n’est pas pris en charge. -la biopsie de tissu et les injections peuvent entrainer une légère douleur. L’immobilisation de la souris pour réaliser ces gestes induit un léger stress. -la prise de sang peut entrainer une légère douleur. Mod le 05/09/26- la période de jeûne de 16h qui peut rendre les animaux agités.

Devenir

Mod le 5/09/26- Afin de caractériser l’effet des traitements sur le métabolisme hépatique et déterminer le pourcentage de cellules du foie guéries et le nombre de particules virales, le foie sera prélevé en fin d’expérience. Pour cela, tous les animaux devront être mis à mort à la fin du projet.

Remplacement

Aujourd’hui, on sait fabriquer en laboratoire de mini-foies appelés organoïdes, qui contiennent différents types de cellules du foie (comme les hépatocytes, les cellules biliaires ou encore les cellules immunitaires). Cependant, la thérapie génique ne peut pas être testée uniquement sur ces mini-foies, car elle repose sur l’injection de virus modifiés dans le sang pour transporter le gène médicament. Pour fonctionner, ces vecteurs doivent atteindre les cellules du foie (hépatocytes) en traversant les petits vaisseaux sanguins. Or, toutes les cellules du foie ne seront pas forcément corrigées. L’efficacité du traitement dépend donc de la quantité de cellules qui reçoivent le gène. C'est pourquoi il est essentiel de tester cette thérapie dans un organisme entier, où la circulation sanguine et le fonctionnement du foie sont aussi proches que possible de la réalité.

Réduction

Le nombre de souris utilisées pour cette étude a été calculé avec précision, en tenant compte des connaissances actuelles sur la maladie, du modèle animal choisi, du fonctionnement du métabolisme du sucre et de l’énergie, des résultats d’expériences précédentes et d’une approche statistique. Au total, ce projet réalisé sur 2 ans nécessitera 66 (mod le 5/09/26) souris mâles, dont 50 souris atteintes de la maladie et traitées par thérapie génique et 16 souris saines servant de groupe témoin.

Raffinement

-Pour éviter les inflammations des organes causées par les injections dans l’abdomen, l’induction de la maladie sera réalisée par une injection d’un produit sous la peau à différents endroits. -La maladie étudiée ne se développe que dans le foie des souris adultes, ce qui évite des complications comme des hypoglycémies graves et protège les souris pendant leur développement. - Avant que la maladie n’apparaisse, les souris seront habituées à boire du glucose à la pipette. Ainsi, si leur taux de sucre baisse légèrement, elles accepteront plus facilement cette solution. - Pour éviter les hypoglycémies, les souris auront un accès facile à la nourriture (croquettes dans la cage, biberons adaptés). En cas d’hypoglycémie sévère, une injection de glucose sera réalisée, et une partie de la cage sera placée sur une plaque chauffante pour maintenir leur température. Une grille d’évaluation permettra de surveiller les signes d’hypoglycémie. L’apparition de plusieurs hypoglycémies avant la thérapie génique constitue un point limite nécessitant l’euthanasie de la souris pour raison éthique. Mod le 5/09/26- lors de mises à jeu, les souris seront hébergées dans des grandes cages, en conservant un enrichissement, ainsi que l’accès à l’eau; et les cages seront mises en partie sur une plaque chauffante pour maintenir la température corporelle de l’animal. Nous nous assurerons de l’efficacité de la thérapie génique au cours de ce test par mesure de la glycémie. En cas d’hypoglycémie, la souris sera exclue du projet puisque l’injection de virus n’aura pas été efficace. -Les souris seront manipulées avec un tunnel pour limiter leur stress. -Pour réduire la douleur, une crème anesthésiante sera appliquée sur les zones de ponction du sang et d’incision. -Une grille de score aidera à prendre des décisions en cas d’observation d’un mal-être et décrit les points limites au-delà desquels les souris seront mises à mort.

Choix des espèces

Le choix de l’espèce s’est orienté vers la souris car les études réalisées sur des vertébrés inférieurs tels que le poisson, montrent que les régulations de la production de glucose par l’organisme ne sont pas les mêmes que chez les mammifères. De plus, le modèle de souris transgéniques utilisé n’a été réalisé que dans cette espèce grâce à la transgenèse ciblée. Enfin, les outils d’analyses moléculaires, comme des anticorps, spécifiques de la souris sont disponibles en laboratoire. La biopsie de tissu pour caractériser les gènes des souris sera réalisée chez les nouveau-nés âgés de 7-10 jours. La maladie sera induite à l’âge de à 5 semaines. Une période de 5 semaines suivant ces injections permet la disparition des effets potentiels sur le métabolisme du produit injecté lors de l’induction de la maladie. Les souris seront traitées par thérapie génique à l’âge de 10 semaines. Les souris saines témoins seront commandées dès l’âge de 4 semaines.