Procédures modérées

Isolées socialement de façon chronique ou nourries d'un régime hyperlipidique, des souris reçoivent une fibre optique implantée dans le cerveau par une chirurgie stéréotaxique d'une heure trente, parfois une pompe sous la peau, et des injections abdominales de tamoxifène cinq jours de suite. 1 040 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à la fin de chaque procédure pour des analyses histologiques. Le projet teste si des métabolites bactériens, moins abondants chez des personnes atteintes de troubles psychiatriques, atténuent les effets de l'isolement et de l'obésité sur la neurotransmission dopaminergique. Hormis un conditionnement opérant, qui maintient les souris à 90 % de leur poids par restriction alimentaire, les tests comportementaux ne sont pas nommés, alors que le porteur indique que certains provoquent un stress.

Objectifs

Les maladies psychiatriques sont un problème majeur de santé publique. A l’heure actuelle, la prise en charge de ces pathologies demeure incomplète puisqu’entre 30 et 50 % des patients souffrant de depression sont résistants aux traitements existants. Dès lors, la recherche de nouvelle piste thérapeutique est essentielle et urgente. La neuroinflammation est une composante essentielle des pathologies psychiatriques. Notamment l’activation des cellules microgliales, qui controle l'inflammation dans le cerveau, a été observé dans des pathologies comme la dépression. Notre projet a débuté par une partie clinique qui a permis d’identifier différents métabolites d’intérêt dans la circulation sanguine chez des sujets atteints de troubles psychiatriques. Notre objectif est donc de tester si l’administration de ces métabolites a des effets sur le fonctionnement cérébral, la neuroinflammation et le comportement. L’objectif final du projet sera de mettre en évidence les mécanismes par lesquels les métabolites influencent le cerveau afin de pouvoir proposer de nouvelles stratégies dans la prise en charge des pathologies psychiatriques. Parmi les facteurs de risques des maladies psychiatriques l'isolation sociale chronique AINSI QUE L’OBESITE ONT été démontréS comme délétère pour la santé mentale que soit dans des études chez l'animal ou l'humain. L'objectif est donc de tester si les métabolites bactériens sélectionnés pourraient diminuer les effets délétères de l'isolation sociale ET DE L’OBESITE sur la neurotransmission dopaminergique et le comportement chez la souris.

Bénéfices attendus

Ces études permettront de comprendre comment les métabolites bactériens qui sont diminués chez les sujets atteints de maladies psychiatriques pourraient protéger des altérations comportementales et de neurotransmission dans un modèle validé de pathologies psychiatriques chez la souris.

Procédures

Les animaux subiront des interventions chirurgicales visant à implanter des fibres optiques dans le cerveau et potentiellement des pompes sous cutanées. La chirurgie stéréotaxique dure 1h30 avec une phase de réveil de 2 heures. L'implantation de pompes sous cutanée quant à elle dure au maximum 15 minutes. Cette dernière sera réalisée en même temps que l'implantation pour les souris concernées. MODIFICATION 2: "DES INJECTIONS ABDOMINALES SERONT REALISEES SUR ANIMAL VIGILES UNE FOIS PAR JOUR PENDANT 5 JOURS POUR L'ADMINISTRATION DU TAMOXIFENE."

Impact sur les animaux

Les procédures de conditionnement opérant nécessitent une déprivation alimentaire légère (maintien à 90% du poids ad libitum). Les chirurgies stéréotaxiques présentent un degré de sévérité modéré durant la période entourant l'opération. Le modèle de pathologie psychiatrique reposant sur l'isolation sociale qui induira, d'après la littérature scientifique un phénotype anxieux chez les souris. LA CONSOMMATION DU REGIME HYPERLIPIDIQUE INDUIRA UN GAIN DE POIDS QUI PEUT ETRE ASSOCIE A DES TROUBLES METABOLIQUES (DIABETE) ET UN PHENOTYPE ANXIEUX CHEZ LES SOURIS. Pour les injections ou les tests comportementaux, les animaux subiront des préhensions et contentions. Les souris de la procédure 1 réaliserons des tests comportementaux dont certains induisent un stress de courte durée. Enfin dans le cas ou les métabolites ne pourraient être administrés par l'eau de boisson ou la nourriture (pour des raisons organoleptiques conduisant à la non consommation par la souris), une chirurgie visant à implanter des pompes osmotiques sous-cutanées sera réalisée. MODIFICATION 2: L'INJECTION ABDOMINALES DE TAMOXIFENE INDUIT AUSSI DES EFFETS DE DOULEURS LEGERES A MODEREES CHEZ L'ANIMAL. LA DUREE DANS LE TEMPS SERA LIMITEE A QUELQUES MINUTES APRES CHAQUE INJECTION A RAISON D'UNE PAR JOUR PENDANT 5 JOURS.

Devenir

Tous les animaux expérimentaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure pour procéder à des analyses histologiques (1040).

Remplacement

Ce projet ne peut être réalisé sans l'utilisation de modèles animaux puisqu'il s'intéresse à des dimensions comportementales, non modélisables sur des modèles in vitro ou in silico.

Réduction

Tous les efforts seront faits pour réduire le nombre d'animaux utilisés. En particulier, nous utiliserons des mâles et des femelles. Le nombre d'animaux (1040) nécessaires est basé sur des expériences précédemment effectuées au laboratoire permettant de révéler des différences statistiques entre groupes ayant subis un stress chronique.

Raffinement

Les animaux seront hébergés dans un environnement ultra-enrichi (carré de coton, maison en carton, pièce en plastique pour se cacher et jouer) même en cas d'isolation sociale. Ce stress chronique a été sélectioné par rapport au stress chronique de défaite sociale, modèle de référence en psychiatrie, car il induit des altérations comportementales similaires sans induire de potentielles blessures à l'animal. Du fait de la déprivation alimentaire durant les expériences de conditionnement opérant, les animaux seront observés et pesés tous les jours de la semaine. Concernant la chirurgie stéréotaxique, des analgésiques et anesthésiques seront administrés. Les animaux seront observés jusqu'au réveil puis 2 fois par jour pendant 3 jours. Les points limites seront évalués à l'aide d'une grille basée sur des scores de 0 à 3 et seront consignés sur une fiche de scorage (en annexe): - Perte de poids anormale (10-20% score 1, score 3 si supérieur à 20%) - état du pelage - site de chirurgie - Comportements anormaux (poil hérissé, prostration,...). Si le score est supérieur ou égal à 3 une mise à mort immédiate aura lieu. Un suivi du bien être animal sera effectué sur tous les animaux de manière quotidienne pendant le protocole de stress et l'étude comportementale en utilisant une fiche de suivi du bien être (en annexe). Le poids, le comportement général, l'apparence et les signes neurologiques seront scorés. Si un animal présente un score supérieur à 3 dans une des 4 rubriques il sera mis a mort. Sinon si un mal être est détecté il sera immédiatement isolé et surveillé. Si l'animal ne montre pas d'amélioration significative il sera mis à mort dans les 48h. Dans tous les cas, si des blessures apparaissent, elles seront immédiatement soignées (Dakin) et les animaux seront surveillés 2 fois par jour. Concernant l’administration des métabolites d’intérêt, nous priviligérons l’utilisation de l’eau de boisson, la nourriture ou l'implantation d'une mini pompe sous cutanée par rapport à des méthodes plus traumatisantes comme les injections intrapéritonéales répétées ou le gavage. Pour limiter le stress lié au tests comportementaux les souris seront manipulées régulièrement en amont afin de limiter le stress induit par l’expérimentateur.

Choix des espèces

Ce modèle d'étude chez la souris âgée de 8 semaines (jeune adulte) est la référence dans les pathologies psychiatriques et les métabolites d'intérêt dans ce projet sont naturellement présent chez la souris.

Pris à l'hameçon, posés sur une toile au bord du bateau, puis incisés sous anesthésie locale pour l'implantation d'un émetteur acoustique et d'une marque externe, 120 poissons pélagiques adultes vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. L'intervention dure moins de cinq minutes avant leur remise à l'eau, et plus de 400 hydrophones suivent ensuite leurs déplacements dans le canal du Mozambique, pour orienter la gestion d'aires marines protégées. Le porteur prévoit le stress de la capture et d'éventuelles blessures dues à l'engin de pêche, et n'attend aucun effet indésirable de l'incision suturée. Les 120 poissons sont tous relâchés, et le résumé ne nomme aucune des quatre espèces.

Objectifs

Les écosystèmes marins sont soumis à une pression toujours croissante en raison des impacts directs et indirects des activités humaines, entraînant un déclin global des espèces marines et une érosion de la santé des écosystèmes. Cette érosion entraine un impact clair sur la capacité des océans à fournir de nombreux services dont dépendent les sociétés. Le rôle des aires marines protégées surtout quand elles englobent des îles entières est primordial pour protéger les ressources, mais également pour comprendre le fonctionnement à fine échelle de sa biodiversité et sa connectivité à de plus grande échelle. Basé sur des modèles biologiques aux traits de vie différents, mais présentant tous des capacités migratoires à grande échelle, quatre espèces de poissons pélagiques seront étudiées pour mieux comprendre (1) l’utilisation des différents habitats à fine (local) et large (régional) échelles par l’exploitation d’une technologie de télémétrie acoustique et en s’appuyant sur un réseau d’écoute existant dans le canal du Mozambique de plus de 400 hydrophones, (2) la structure et/ou la stabilité des populations locales et leur lien avec d’autres populations régionales par la génétique des populations, (3) la connectivité existante au niveau régionale avec les aires marines protégées (AMP) et l’identification de zones non protégées d’importance régionale.

Bénéfices attendus

L’analyse spatiale des données acoustiques des déplacements des individus, issues de l’important réseau d’écoute en place, couplées aux analyses génétiques déjà disponibles ou en cours d’acquisition sur ces espèces, permettront en fonction de l’espèce cible de confirmer les zones et périodes de migration, leur niveau de fidélité aux différents habitats et la dynamique spatiale qu'il existe au sein d’une île isolée et entre les aires marines protégées adjacentes. Les résultats seront directement exploités par les gestionnaires partenaires du projet pour proposer des mesures de gestion locale et régionale afin d'optimiser la préservation de ces ressources.

Procédures

L'ensemble des individus sera soumis à une phase de captures par un hameçon, une phase d'implantation d'une marque acoustique en interne et d'une marque externe pour son identification ultérieure. L'ensemble de la procédure dure moins de 5 mn avant le relâché de l’individu dans son milieu naturel.

Impact sur les animaux

Les nuisances attendues sont essentiellement le stress lié à la capture et d’éventuelles blessures liées à l’engin de pêche. Des mesures particulières seront prises pour limiter les nuisances à la capture, avec le positionnement du poisson dès sa sortie de l’eau dans un hamac constitué d’une toile souple non abrasive, et une attention particulière lors du retrait du leurre. Le marquage externe est équivalent à la piqûre d’une aiguille. Le marquage intracorporel sera réalisé sous anesthésie locale, et implique une incision suturée suite à laquelle il n’est pas attendu d’effets indésirables compte tenu des conditions d’asepsie et de la durée réduite du protocole (durée totale de l’intervention

Devenir

Les individus utilisés (soit N=120) dans le cadre de ce projet seront replacés dans leur milieu naturel, l’objectif de l’étude étant de caractériser leur cycle de vie dans le milieu marin.

Remplacement

L'intérêt du projet étant d’étudier le comportement spatial des espèces sauvages dans leur milieu naturel, il n’est pas possible de les remplacer. De plus la domestication de ces espèces n’est pas possible.

Réduction

Le nombre d’échantillons est conditionné par la puissance statistique recherchée et surtout par l’accessibilité aux individus ciblés. Il est difficile en écologie spatiale de déterminer le nombre d’individus nécessaire pour obtenir la variabilité acceptable de l’utilisation de l’espace par une population donnée. Ce nombre est variable en fonction des objectifs, des caractéristiques écologiques de l’espèce concernée et des modèles utilisés. Sur la base (1) d’études sur l’effet de l’échantillonnage sur la qualité des résultats, (2) du nombre minimum d’individus suivis par télémétrie pour capturer l’essentiel de la variabilité, le nombre d'individus testés dans les différents lots et procédures est minimal compte tenu de la dispersion de ces espèces (ouest océan Indien), leur nombre en milieu naturel et la nécessité de capturer la variabilité du comportement de ces espèces de grands migrateurs. Les poissons pélagiques ciblés sont communément présents et abondants dans les eaux de la région. En l’absence actuelle de connaissances sur leur déplacement dans la zone d’étude, il est prévu de cibler un maximum de 30 individus de chaque espèce en mer pour obtenir une première estimation des niveaux de déplacement local et régional. Les données acquises permettront de mieux évaluer le nombre cible pour une étude plus globale a posteriori.

Raffinement

La capture sera réalisée à l’hameçon avec des leurres de forme et de taille appropriées pour limiter les blessures et éviter l’ingestion par le poisson. Le protocole prend en compte le moins de manipulation directe, et le moins d’exondation (sortie de l’eau) possible des individus. Des épuisettes en silicone limiteront l’abrasion au contact des poissons qui seront positionnés dans un brancard en voile de voilier maintenue sur le franc-bord du bateau. Cette approche limitera la manipulation de ces animaux de très grande taille et les risques de blessures. Les marquages interne et externe seront réalisés sans exondation du poisson, en position décubitus dorsal induisant un état d'immobilité tonique et permettant la réalisation rapide sous anesthésie locale. Le comportement de chaque individu sera observé durant tout l’intervention et jusqu’au relâché. L'ensemble du protocole, de l’arrivée dans le brancard jusqu’à la remise en liberté dure moins de 5 mn.

Choix des espèces

Le cycle de vie des espèces de grands pélagique ciblés reste méconnu, limitant la capacité des scientifiques à fournir un appui aux gestionnaires. Ces espèces étant de grands migrateurs océaniques ciblées par les pêcheries artisanales de tous les pays de la région, une gestion locale et régionale passe par une meilleure connaissance de l’utilisation de l’espace et des mouvements migratoires de ces espèces. Tous les individus seront des adultes (ciblage des adultes par la taille des leurres utilisés pour la capture).

Rendues immunodéficientes pour qu'une tumeur humaine de cancer du sein triple négatif prenne chez elles, 132 souris de cinq à six semaines vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Après l'injection des cellules tumorales, elles sont opérées pour retirer la tumeur et recevoir sous la peau une puce microfluidique, le dispositif testé, puis mesurées au pied à coulisse et pesées trois fois par semaine pendant six semaines, avec une imagerie hebdomadaire et une prise de sang toutes les deux semaines. Les métastases peuvent provoquer perte de poids, détresse respiratoire et troubles de la mobilité, et la peau sur la tumeur peut s'ulcérer ou se nécroser. Toutes sont tuées à la fin pour prélever leurs poumons et leurs ganglions. Pour la première procédure, le porteur indique n'avoir pas pu justifier statistiquement l'effectif de 36 souris.

Objectifs

Le cancer du sein triple négatif est un sous-type particulièrement agressif du cancer du sein. Représentant environ 10 à 15 % de l’ensemble des cancers du sein, le cancer du sein triple négatif touche plus fréquemment des patientes jeunes et présente une forte propension à métastaser précocement, en particulier vers les poumons, le cerveau et les os. Malgré les avancées réalisées en oncologie, ce cancer demeure l’un des sous-types les plus difficiles à traiter en raison de sa grande hétérogénéité, du nombre limité d’options thérapeutiques ciblées et de l’apparition fréquente de résistances aux chimiothérapies conventionnelles. Au cours de la dernière décennie, de nombreux efforts ont été consacrés au développement de nouvelles stratégies thérapeutiques, afin d’améliorer le pronostic des patientes. Parallèlement, les progrès réalisés dans les modèles précliniques, notamment grâce a de nouveaux modèles et à l’imagerie en temps réel, ont permis d’évaluer l’efficacité de traitements expérimentaux dans des contextes biologiquement pertinents. Dans ce contexte, le présent projet vise à explorer une nouvelle approche thérapeutique ciblant ce type de cancer. L’objectif de cette étude est de déterminer l’efficacité thérapeutique d’un nouveau dispositif médical implantable sous-cutané (puce microfluidique) dans un modèle xénogreffe de cancer du sein métastatique triple négatif. Le modèle sera suivi à l’aide d’un système d’imagerie afin d’évaluer la réponse globale au dispositif.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus concernent la santé humaine. Ce projet permettra d’obtenir des informations sur l’efficacité d’un potentiel nouveau traitement anticancéreux plus efficace chez des patientes atteintes de cancer du sein triple négatif, étant peu ou non réceptives aux traitements de référence.

Procédures

Implantation de cellules tumorales par injection (1min). Chirurgie de résection et implantation de la puce microfluidique (10min) Mesures tumorales au pied à coulisse 3x/sem et pesées 3x/semaine (quelques secondes) jusqu’à 6 semaines après implantation. Imagerie par fluorescence (10min, 1x/semaine) Administration d’analgésique pendant quelques secondes pouvant être réalisée jusqu’à 4 fois. Prélèvements sanguins une fois toutes les deux semaines (3min).

Impact sur les animaux

Une perte de poids, une détresse respiratoire et une altération de la mobilité peuvent être envisagés suite au développement des métastases, mais les animaux seront surveillés de manière adéquate. Les animaux vont subir une intervention chirurgicale sous anesthésie afin de réséquer la tumeur et d’implanter la puce microfluidique en sous-cutané qui peut entrainer un stress. La tumeur peut à un certain volume gêner à la locomotion, et la peau au niveau de la tumeur peut potentiellement ulcérer voire nécroser. Les pesées et mesures de tumeurs génèrent un stress pendant plusieurs semaines lors de la contention et éventuellement une gêne, sensibilité au niveau de la tumeur pendant la mesure avec le pied à coulisse.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure afin de prélever en post-mortem les poumons et les ganglions lymphatiques pour les analyser.

Remplacement

Plusieurs études préliminaires ont été menées in vitro pour s’assurer de l’efficacité prometteuse du traitement sur des lignées cancéreuses en culture ainsi que plusieurs étapes de vérification de caractéristiques valides pour un candidat médicament, cependant les interactions entre le métabolisme, les cellules du système immunitaire et le microenvironnement tumoral sont complexes et impactées par différents organes, ainsi que par différents paramètres de la tumeur (structure cellulaire, rigidité etc). Même si nous cherchons à développer nos modèles en impression 3D, tout ceci n’étant encore qu’à un stade très précoce et ne représentant pas totalement le microenvironnement tumoral et sa complexité, l’étude de l’efficacité de potentielles molécules anticancéreuses sur cette tumeur métastatique ne peut, pour le moment, se faire que sur organisme entier.

Réduction

Les procédures seront faites sur le nombre minimal d’animaux nécessaires afin de mener le but de la procédure à bien. Pour la première procédure, il n’a pas été possible de justifier statistiquement les effectifs au vu de la portée exploratoire de ce développement, cependant nous nous sommes appuyés sur une revue extensive de la littérature et notre expérience pour déterminer que nous aurions besoin de 36 souris. Dans la 2e procédure, pour la comparaison des volumes tumoraux, nous utiliserons un test statistique approprié et nous avons donc besoin de 96 animaux, ce qui fait un total de 132 animaux pour les deux procédures.

Raffinement

Pendant 7 jours avant la mise en place du protocole les souris seront acclimatées aux expérimentateurs du projet qui les pèseront plusieurs fois afin de limiter leur stress. Les souris seront observées quotidiennement par le personnel de l’animalerie qui remplit une fiche de suivi de l’état général des souris afin de détecter rapidement une souffrance, et par les expérimentateurs qui remplissent un scoring plus détaillé si nécessaire afin d’identifier l’atteinte d’un point limite. L’état général des souris sera ainsi suivi et annoté dans le cadre de l’expérimentation grâce à une grille de scoring détaillée. Les expérimentateurs sont formés et expérimentés, ils sont donc à même de détecter très rapidement le moindre signe de douleur afin d’appliquer les meilleures mesures.

Choix des espèces

Nous souhaitons travailler avec la souris car c’est une espèce sur laquelle de nombreux modèles de cancer ont été développés, et qui permet de manipuler facilement le système immunitaire en induisant une déficience pour une meilleure prise de nos tumeurs humaines. Les animaux seront utilisés à l’âge de 5 à 6 semaines afin de favoriser la prise tumorale.

Une injection d'agent mutagène, une greffe de cellules cancéreuses dans la rate ou dans la paroi du tube digestif, cinq prises de sang en 42 jours : 2 481 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue pour des prélèvements. Une partie boit un produit qui enflamme le côlon et provoque diarrhées et perte de poids d'environ 10 %, d'autres portent des tumeurs greffées sous la peau qui, selon le porteur, "généralement ne gênent pas les animaux". Le projet étudie une protéine nucléaire, Ki-67, dans les cancers du sein, colorectal et le mélanome, et renvoie d'éventuelles thérapies "à terme". Pour l'espèce, le porteur invoque des lignées génétiquement modifiées pour ce gène qui "existent uniquement chez la souris".

Objectifs

Malgré des avancées dans la prise en charge des patients, les cancers restent la première cause de mortalité prématurée. Ce projet a pour but de décrypter les rôles dans les cancers d’une protéine et à apporter une preuve de concept pour son ciblage thérapeutique. Les cellules cancéreuses doivent s’adapter pour survivre dans un environnement en dehors de leur tissu d’origine. Interférer avec leur capacité d’adaptation, présente une opportunité thérapeutique potentielle. Ceci repose sur la compréhension des mécanismes moléculaires sous-jacents. Nos travaux récents suggèrent que notre protéine d’intérêt en est un élément clé. Nos études précédentes ont démontré qu’elle facilite plusieurs étapes de la carcinogénèse, et pourrait représenter une nouvelle classe de cible thérapeutique. Il est nécessaire de mieux comprendre ses fonctions normales et son rôle dans des cancers différents, et tester les effets de son élimination. Notre projet, qui sera réalisé chez la souris, comporte 4 volets. Nous allons : 1) Déterminer si l’élimination du gène chez la souris interfère avec (a) l’équilibre du système immunitaire, comme suggéré dans la littérature scientifique; (b) le vieillissement (un facteur de risque dans les cancers); (c) la tumorigénèse intestinale, induite de différentes façons. 2) Déterminer si l’ablation du gène directement dans les cellules cancéreuses affecte la tumorigénèse et les réponses aux traitements (chimiothérapie ou immunothérapie) dans trois modèles de cancers différents: mélanome, cancers du sein et colorectal. 3) Identifier des protéines partenaires qui affectent aussi la tumorigénèse. 4) Apporter une preuve de concept thérapeutique via une molécule qui permet d’induire la destruction d’une protéine génétiquement modifiée. A terme, ce projet pourrait permettre de développer des nouvelles stratégies thérapeutiques contre les cancers.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de mieux comprendre comment les cellules cancéreuses s’adaptent à leur environnement, aux réponses immunitaires anti-tumorales et aux traitements, et pourrait à terme permettre le développement de nouvelles thérapies.

Procédures

Les interventions sur animaux vigiles prévues sont : 1) des injections . Celles-ci seront uniques, pour injecter un agent mutagène afin d’initier la tumorigénèse, un médicament qui agit sur des cellules cancéreuses, ou un agent qui induit la perte transitoire des cellules immunitaires. Elles durent environ 5 secondes. 2) des piqûres pour prélèvement sanguins. Celles-ci seront effectuées un total de 5 fois sur 42 jours, espacés d’au moins une semaine. Elles durent environ 1 seconde. Les procédures chirurgicales prévues sont uniques, et se font sous anesthésie général. Elles consistent en la greffe des cellules soit dans la rate, soit dans la paroi du tube digestif. La procédure dure environ un quart d’heure.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables attendus sont: 1) L’inflammation intestinale provoquée par la prise dans l’eau de boisson d’un produit qui induit une inflammation transitoire dans le colon. Ceci peut provoquer des diarrhées et induit également une perte de poids d’environ 10% entre les jours 6 et 9 de la procédure. Ensuite les souris reprennent très vite du poids pour revenir à leur poids initial en 3-4 jours. 2) La greffe de cellules sous la peau. Il est possible que les tumeurs, qui généralement ne gênent pas les animaux, deviennent irritantes. Si c’est le cas nous appliquerons des crèmes cicatrisantes et anti-douleur aux animaux concernés. 3) Pour les animaux greffés dans la rate ou dans la paroi du tube digestif, la chirurgie peut entraîner de la douleur ou de l’inconfort liés à l’incision et à la manipulation des organes internes, ainsi que des complications possibles telles qu’une infection, un saignement ou une inflammation locale. Les injections dans la rate peuvent parfois provoquer des lésions ou hémorragies internes, tandis que les injections dans le tube digestif peuvent fragiliser l’intestin et entraîner une infection abdominale ou des troubles digestifs. Enfin, si la suture est arrachée avant cicatrisation, il pourrait y avoir une plaie non-fermée et/ou infectée. Ces souris seront surveillées quotidiennement pour détecter des signes précoces de mal être (pelage non nettoyé, manque de vivacité, perte de poids supérieure à 10%, sur-vascularisation des tumeurs, mauvaise cicatrisation des sutures). Les animaux montrant l’un de ces signes seront suivis quotidiennement et évalués selon une échelle standard de la nuisance afin de prévoir des adaptations, et la mise à mort de l’animal sera effectuée si la nuisance est excessive.

Devenir

Tous les animaux utilisés dans le projet seront mis à mort pour prélèvement d’échantillons.

Remplacement

Un large travail en amont pour étudier les rôles cellulaires de la protéine d’intérêt a préalablement été réalisé dans les cellules en culture. Il n’existe aucune méthode alternative au recours aux animaux pour suivre son éventuel rôle dans la production cellules sanguines, le vieillissement et la tumorigénèse.

Réduction

Nos études précédentes permettent d’estimer avec précision le nombre de souris nécessaires pour générer des données statistiquement robustes. Pour chaque procédure, une étude statistique préalable a été réalisée afin de réduire le nombre d’animaux utilisés.

Raffinement

Notre pratique régulière nous permet de réduire au maximum le temps de contention et d’injection. Pour minimiser la douleur de la piqûre, l’aiguille utilisée sera très fine. Pour les prélèvements sanguins, nous utiliserons des lancettes qui possèdent une pointe fine pour une pénétration sans douleur et permettent une collecte de sang facilitée et une cicatrisation rapide. Les cages restent sous surveillance 20 minutes après toute injection pour détecter les éventuels signes de douleurs. Les animaux seront pesés une fois par semaine. Un anesthésique et un analgésique seront utilisées lors des chirurgies pour réduire la douleur. En post-chirurgie de la nourriture et de l'eau gélifiée seront posé à même le sol afin de leur permettre de se nourrir facilement. LA PRODUCTION DE MEF NÉCESSITE L'ISOLEMENT DES SOURIS MÂLES AU MAXIMUM UNE SEMAINE AVANT UN ACCOUPLEMENT. ET LES FEMELLES GESTANTES SERONT ALORS MAINTENUES SÉPARÉMENT JUSQU'AU STADE 13,5J. UN SUR-ENRICHISSEMENT EST PRÉVU POUR CES ANAIMAUX AVEC DU COTON, UN IGLOO EN CARTON ET UN BOUT DE BOIS PERMETTANT UNE MEILLEURE NIDIFICATION POUR LES FEMELLES ET EN EVITANT L'ENNUI POUR DES MÂLES. L'ENRICHISSEMENT SERA COMPLÉTÉ EN AJOUTANT DES ODEURS D'AUTRES CONGÉNÈRES (LITIÈRE LÉGÈREMENT SOUILLÉE) DANS LES CAGES DES ANIMAUX ISOLÉS. Enfin, la comparaison des observations quotidiennes des animaux avec une échelle de nuisance pré-établie permettra de prendre des décisions objectives pour soigner les animaux ou, le cas échéant, leur euthanasie si la souffrance est excessive.

Choix des espèces

Les lignées cellulaires de cancer de souris que nous avons choisi reproduisent au mieux les cancers humains. Les animaux génétiquement modifiés pour le gène de Ki-existent uniquement chez la souris, et permettent d’analyser les rôles physio-pathologiques de Ki-67. Les animaux seront utilisés à partir de 2 mois d'âge selon les protocoles établis dans la littérature, lorsqu’ils auront atteint un poids minimum de 20g. Cet âge tient compte de la maturité sexuelle nettement dépassée pour les animaux, compatible avec la description des âges des patients atteints de cancer du sein, colorectal ou mélanome.

44 animaux non-humains, 40 souris et 4 lapins, vont être utilisés, tous tués une fois la quantité d'anticorps jugée suffisante, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Les souris reçoivent jusqu'à deux injections dans l'abdomen et quatre prises de sang sous anesthésie gazeuse, les lapins jusqu'à quatre injections intradermiques et quatre prises de sang sous crème anesthésiante, avant un prélèvement de sang final. Leur sérum sert à des travaux pratiques d'immunologie en licence, les étudiants ne manipulant que les sérums. Il s'agit de "tests classiques" d'enseignement : selon le porteur, les quatre lapins fournissent environ huit ans de travaux pratiques, les quarante souris environ cinq ans.

Objectifs

Mise en œuvre de tests classiques comparatifs pour mettre en évidence la spécificité des anticorps et les éventuelles réactions croisées à l’aide des sérums de lapin ainsi que des tests d’hémagglutination en utilisant les sérums de souris immunisées.

Bénéfices attendus

Ce projet entre dans le cadre de la formation des étudiants en immunologie, durant les secondes et troisièmes années de leur cursus. Les étudiants travailleront uniquement avec les sérums. La préparation des sérums sera réalisée au préalable par du personnel compétent. Les travaux pratiques visent à une meilleure compréhension de la spécificité des anticorps (L2, tests sur sérums de lapin) et à la mise en évidence de la cinétique de la réponse immunitaire (L3 sur sérums de souris).

Procédures

- Injections Intra péritonéales sous anesthésie gazeuse pour les souris (2 maximum pour une durée d’une minute), Intra dermiques sous crème anesthésiante pour les lapins (4 maximum pour une durée de 3 à 4 minute). - Prélèvements de sang sous anesthésie gazeuse pour les souris (4 maximum pour une durée de quelques secondes) , sous crème anesthésiante pour les lapins (4 maximum, pour une durée d’environ 1 minute). - Anesthésie gazeuse (souris) ou chimique (lapin) pour le prélèvement sanguin final

Impact sur les animaux

La contention lors des prélèvements et des injections peut causer un léger stress. Une inflammation au niveau des sites d’injections peut être observée. Il peut y avoir une légère douleur à l’injection. Nous resterons vigilants à tous autres effets imprévus qui pourraient survenir.

Devenir

Lorsque la quantité d'anticorps sera suffisante, tous les animaux seront mis à mort.

Remplacement

Le remplacement du modèle in-vivo ne peut être envisagé car la réponse immunitaire est un phénomène complexe impliquant des coopérations multiples entre différents types cellulaires, pour lequel il n’existe pas d’équivalent in-vitro. Les méthodes type phage display ne sont pas envisageables pour l’obtention de sérums polyclonaux.

Réduction

Un nombre minimal de 4 lapins permet d'obtenir un nombre suffisant d'anticorps pour assurer 8 ans de travaux pratiques environ. Ce nombre est réduit au minimum et est déterminé par a quantité d’anticorps nécessaires. Concernant les souris, un nombre minimal est également nécessaire pour suivre la cinétique de la réponse contre un Ag donné. Cette cinétique repose, ici, sur 5 points espacés dans le temps. Un minimum de 8 souris par point permet d’obtenir une quantité suffisante de sérums pour 5 ans de travaux pratiques environ.

Raffinement

Les animaux ont un enrichissement dans leur cage. Les animaux sont habitués au personnel pour réduire le stress. Le personnel est formé et sensibilisé à une manipulation douce des animaux. Si l’animal présente une souffrance qui ne diminue pas avec l’arrêt des injections et les soins apportés, et que les points limites sont atteints, alors l’animal sera mis à mort pour éviter des souffrances.

Choix des espèces

Le lapin et la souris sont les animaux de laboratoire les mieux adaptés au développement d’anticorps polyclonaux pour la recherche et l’enseignement. Ils montrent en effet une très bonne réponse immunitaire humorale. Par ailleurs, ils permettent de récolter une quantité de sérum conséquente pour les applications qui nous importent. Les animaux sont immunisés à l’âge adulte lorsque le système immunitaire est mature (15 semaines pour les lapins et 8 semaines pour les souris)

Élevés sur place et maintenus en réserve entre deux études, 200 bovins, des veaux dès la naissance aux vaches laitières de plus de deux ans, vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils restent attachés au cornadis parfois plusieurs heures, la tête immobilisée jusqu'à cinq minutes, pour des injections, des prélèvements de lait à chaque traite et jusqu'à douze prises de sang le jour du traitement, et le rythme des traites peut être augmenté. Le but est de mesurer le passage de médicaments vétérinaires dans leur sang et leur lait, pour des dossiers de mise sur le marché. Tous réintègrent ensuite le "stock des animaux hébergés" de l'établissement et peuvent être réutilisés après un repos d'au moins un mois ou de dix demi-vies du produit.

Objectifs

L’objectif du projet est d’évaluer chez le bovin le profil pharmacocinétique (absorption, distribution, métabolisme, élimination) dans le sang et ses dérivés (plasma ou sérum) et l’élimination dans le lait des composants d’un médicament vétérinaire. La pharmacocinétique est l’étude du devenir d’une molécule depuis son absorption dans l’animal jusqu’à son élimination de l’organisme. Les études de pharmacocinétique sont donc obligatoirement conduites chez les animaux de l’espèce de destination du médicament. Pour ce projet, des études de pharmacocinétique dans le sang ou ses dérivés (plasma ou sérum) pourront être réalisées chez le bovin (laitier ou non). Les études de pharmacocinétique dans le lait permettent de déterminer le devenir des molécules (résidus) et de déterminer les temps d’attente chez les animaux de rente destinés à la production laitière. Elles sont conduites pour démontrer que le produit administré passe dans le sang et atteint l’organe malade ainsi que les organes où elle sera transformée avant d’être éliminée. La pharmacocinétique d’une molécule est dépendante, entre autres, de la voie d’administration, la posologie du médicament, la dose administrée ou sa forme (injectable, pommade…). Des études de pharmacocinétique sont donc nécessaires dès lors qu’un nouveau médicament est en phase de développement ou que la voie d’administration ou la posologie d’un médicament existant est modifiée afin d’améliorer son efficacité. La pharmacocinétique d’une molécule est également utilisée pour démontrer la bioéquivalence c’est-à-dire le comportement identique de la molécule dans l’organisme de deux traitements différents. Les études de pharmacocinétique permettent d’apporter des informations aux autorités pour l’évaluation de la demande d’autorisation de mise sur le marché et justifier de la bonne connaissance du devenir du produit dans l’espèce de destination.

Bénéfices attendus

Les études de pharmacocinétiques permettent de documenter et comprendre le devenir du produit chez l’espèce de destination, d’affiner les doses à administrer et de documenter son élimination (sang et lait). Le développement des médicaments a pour objectif de soigner et/ou d’améliorer le bien-être des animaux. Les études de pharmacocinétique sont indispensables pour déterminer l’efficacité d’un produit (atteinte de concentrations thérapeutiques efficaces) et son innocuité pour le consommateur (détermination des résidus dans le lait).

Procédures

Toutes les interventions se font sur animaux vigiles. Préparation des zones de traitement ou prélèvement : tonte 1 fois à 2 fois par procédure, selon la durée de la procédure. Administration du traitement selon le type de produit en cours de développement. La fréquence peut varier selon les produits d’un seul traitement à des traitements répétés en général de 1 à 2 fois par jour ou sur plusieurs jours (7 jours consécutifs maximum). La durée des administrations sera de 1 à 3 mn environ et se fera conformément aux recommandations d'application de ce traitement vétérinaire. La fréquence et le type de prélèvement (sang ou de lait) peut varier selon les études et selon les produits en cours de développement. Pour les prélèvements sanguins (environ 3 min par prélèvement) : - produit éliminé rapidement : 10 à 12 le jour du traitement puis 1 à 3 par jour - produit éliminé lentement : 1 à 3 le jour du traitement puis 1 par jour, jusqu’à 1 par semaine ou mois pour des études longues. Pour les prélèvements de lait (environ 2min par prélèvement) : - Etude de résidus classique : 1 prélèvement à chaque traite - Etude de détermination des concentrations dans le lait : 1 prélèvement à chaque traite et 1 à 3 prélèvements supplémentaires entre les traites

Impact sur les animaux

Selon les produits évalués certains effets indésirables peuvent être observés : - les prélèvements sanguins répétés peuvent induire un hématome au site de prélèvement ainsi qu’une douleur et du stress lors de la piqure - l’administration d’un médicament par voie intraveineuse (IV), intramusculaire (IM) ou sous cutanée (SC) peut induire un gonflement ou une irritation au site d’injection, ainsi qu’une douleur ou gêne passagère lors de l’injection - l’administration par voie intramammaire peut occasionner une gêne à l’animal lors de l’introduction des injecteurs dans le canal du trayon - les traitements par injectables (IV, IM, SC), les prélèvements et la prise de température rectale (lors d’examens cliniques) sont réalisés avec une contention des animaux aux cornadis pouvant durer quelques heures (lors de temps de prélèvements rappropchés après administration de la molécule testée par exemple). Pour les traitements et prélèvements, en plus de la contention au cornadis, une immobilisation de la tête peut être réalisée (3-5 mn maxium). La contention au cornadis et l'immobilisation de la tête sont sources de stress pour l’animal - le changement de régime de traite (passage de deux traites quotidiennes à un nombre plus élevé par jour) peut induire un état de stress passager avec une baisse de production laitière. Ces effets indésirables sont généralement de quelques minutes/quelques heures (gêne, stress, douleur) à quelques jours (hématome, irritation, gonflement, baisse de production laitière).

Devenir

Tous les animaux utilisés dans le projet seront réintroduits dans le stock des animaux hébergés dans les locaux de l’établissement utilisateur. Les études de ce projet seront conduites séquentiellement (étude pilote puis étude principale si besoin) afin d’obtenir les informations scientifiques nécessaires tout en minimisant le nombre d’animaux utilisés. Les animaux pourront être réutilisés dans chaque étude du projet. L’effet cumulatif est évalué par le vétérinaire de l’établissement utilisateur en collaboration avec le(s) directeurs(s) d’étude(s) selon le type de produits administrés. Les animaux peuvent être réutilisés après une période de repos suffisante entre 2 études pour s’assurer de l’élimination totale de l’organisme du dernier traitement administré ; cette durée ne peut être inférieure à 10 fois la demi-vie du produit si celle-ci est connue ou 1 mois si celle-ci n’est pas connue. De plus, tout animal réutilisé fait l’objet d’une visite du vétérinaire de l’établissement utilisateur qui certifie que l’animal a un état de santé et de bien-être général compatible avec son inclusion dans une nouvelle étude sans dommage pour lui.

Remplacement

Il n’existe pas de méthode alternative pour évaluer le devenir d’une molécule dans un organisme vivant. Les études de pharmacocinétique sont donc obligatoirement conduites chez les animaux de l’espèce de destination du médicament.

Réduction

Un faible effectif peut être acceptable pour la méthodologie des études pilotes lorsque l’objectif est principalement exploratoire et centré sur la faisabilité de la procédure plutôt que sur la mise en évidence d’un effet statistiquement significatif. Pour les études pilotes, un effectif de 8 bovins par groupe de traitement est suffisant pour générer des données de pharmacocinétique suffisamment robustes et valider, par exemple, l’intérêt de la formulation d’un nouveau médicament vétérinaire, sa voie d’administration, ou l’intérêt d’un changement de posologie d’un médicament existant. Selon les résultats obtenus dans les études de mise au point (études pilotes) et la variabilité inter-individus, l’effectif pourra être recalculé pour les études principales (études pivots) devant être soumises aux autorités pour l’obtention de la mise sur le marché du médicament. En général, l’effectif pour une étude de pharmacocinétique d’une molécule dans le sang (sérum ou plasma) ne devrait pas dépasser 12 animaux par groupe de traitement Les études de résidus (pharmacocinétique d’élimination dans le lait) règlementaires incluront un minimum de 20 vaches laitières en accord avec les directives européennes en vigueur pour la détermination des temps d’attente..

Raffinement

Les bovins utilisés seront déjà présents sur le site. Si l’achat de bovins s'avérait nécessaire a minima 2 semaines d’adaptation seront observées avant le début de toute procédure. De plus, les animaux seront acclimatés aux conditions de l’étude pendant généralement une semaine précédant le traitement. L’observation de l’état général des animaux sera effectuée a minima deux fois par jour au cours de chaque étude pour détecter au plus tôt tout signe d’inconfort ou de douleur et prendre en charge les animaux le plus précocement possible. Si une contention de plusieurs heures au cornadis est nécessaire, un accès à l'eau sera mis en place au cornadis. Selon le type de produit et le volume à administrer, un cathéter périphérique pourra être posé uniquement les quelques minutes de l'injection par voie IV afin de s'assurer lors de l'injection de ne pas être en péri veineux et de créer une douleur potentielle. Dans le cas où les modalités de traite biquotidienne devront être modifiées, les vaches laitières seront acclimatées à des délais différents entre les traites lors d’une période de transition d’une à deux semaines. A la fin de la procédure, une nouvelle période de transition pour un retour aux modalités de traites classiques biquotidiennes sera de nouveau appliquée.

Choix des espèces

Le comportement d’une molécule dans l’organisme pouvant varier selon l’espèce animale, une étude de pharmacocinétique ne peut être réalisée que dans l’espèce de destination, en l’occurrence le bovin pour ce projet. Dans le cas de l’évaluation de la pharmacocinétique d’élimination des résidus dans le lait, des vaches laitières adultes de plus de 2 ans correspondant aux pratiques classiques d’élevage laitier seront utilisées. Les études de pharmacocinétique dans le sang (plasma ou sérum) pourront inclure des animaux en lactation ou hors lactation. Selon les médicaments en développement ces études pourront inclure des animaux de la naissance à l’âge adulte.

Opérées deux fois à deux semaines d'intervalle pour déclencher une douleur chronique, 1 620 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue pour des analyses post-mortem. Elles passent ensuite quatre tests de douleur et cinq tests d'anxiété et de dépression, l'un après 24 heures de jeûne, un autre après 24 heures d'isolement. Le porteur écrit que la douleur et le phénotype anxio-dépressif "ne peuvent pas être soulagées car c'est l'objet de l'étude", pour chercher des mécanismes épigénétiques et, au conditionnel, de nouvelles cibles thérapeutiques. Il ne nomme aucun des neuf tests, ni la technique chirurgicale employée pour provoquer la douleur.

Objectifs

La douleur chronique touche environ 7 à 10 % de la population. Elle est souvent résistante aux traitements actuellement disponibles et a un impact important sur la qualité de vie des personnes concernées. Elle est fréquemment associée à des troubles émotionnels, notamment l’anxiété et la dépression. Des données scientifiques récentes suggèrent que des mécanismes dits « épigénétiques », qui régulent l’expression des gènes, pourraient contribuer au développement et au maintien de la douleur chronique ainsi qu’à ses conséquences émotionnelles. Toutefois, ces mécanismes restent encore insuffisamment caractérisés. L’objectif de ce projet est d’étudier ces mécanismes dans un modèle murin de douleur chronique associé à des troubles émotionnels. Une meilleure compréhension de ces processus pourrait permettre d’identifier de nouvelles cibles et stratégies thérapeutiques afin d’améliorer la prise en charge de cette comorbidité.

Bénéfices attendus

Les résultats attendus permettront de mieux comprendre les mécanismes épigénétiques impliqués dans cette comorbidité. Une meilleure compréhension de ces mécanismes pourrait conduire à l'identification de nouvelles cibles thérapeutiques, contribuant ainsi à améliorer la prise en charge de la douleur neuropathique chronique ainsi que de ses conséquences émotionnelles.

Procédures

- Les animaux sont soumis à une douleur chronique avec développement de troubles anxio-dépressifs. -les animaux subissent deux chirurgies espacées de 2 semaines. - Les chirurgies se déroulent sous anesthésie générale pour une durée maximale de 45 minutes - Les animaux subissent 4 tests évaluant la douleur (15-30 minutes en moyenne - stimulation courte de maximum 20 secondes) et 5 tests évaluant l'anxio-dépression (durée de 5 minutes par test) , avec un délai minimal de 48h entre chaque test . - Les animaux subissent un jeûne unique de 24h pour un test comportemental et un isolement unique de 24h pour un autre test. - Les animaux subissent une chirurgie terminale pour prélèvement de tissus sous anesthésie profonde pour une durée de 10 minutes.

Impact sur les animaux

- la présence de la douleur et l’apparition du phénotype anxio-dépressif chez le modèle animal sont inévitables et ne peuvent pas être soulagées car c'est l'objet de l'étude. - Suite à la chirurgie, une légère difficulté dans les déplacements des animaux est attendue mais qui disparaît rapidement dans les 24 à 48h. - La douleur post-chirurgicale est aigue, transitoire et inflammatoire. - Les animaux subissent un stress aigu ainsi qu’une douleur transitoire et de faible intensité lors des tests de comportement.

Devenir

A la fin des procédures, les animaux sont mis à mort pour des analyses post-mortem.

Remplacement

Au regard des objectifs de cette étude, il nous est impossible de remplacer le modèle animal par une approche in vitro ou in silico. En effet, l'étude de la douleur et de sa comorbidité anxio-dépressive nécessite l'évaluation intégrée de réponses sensorielles, émotionnelles et comportementales, qui ne peut être réalisée que chez un animal vivant et vigile. Les modèles in vitro et in silico ne permettent pas de reproduire la complexité des interactions entre les différents systèmes biologiques et les circuits neuronaux impliqués dans ces processus, ni d'évaluer les manifestations comportementales associées.

Réduction

Les expériences seront réalisées avec la volonté de réduire autant que possible le nombre d’animaux par condition expérimentale, mais toujours dans l’optique d’obtenir le maximum d’information scientifique par test. Le nombre d'animaux a été déterminé pour obtenir des résultats statistiquement valides tout en se basant sur des données de la littérature, de notre expérience et de la variabilité phénotypique interindividuelle.

Raffinement

Les animaux sont hébergés en groupe sociaux pour respecter leurs besoins sociaux. Des carrés de coton seront placés dans la cage pour favoriser la nidation, et des barreaux de bois à ronger pour limiter les comportements d’agressivité. Avant le début des procédures et sur une période d’une semaine, les animaux sont manipulés quotidiennement par l’expérimentateur et acclimatés à l'environnement où les tests se dérouleront afin de réduire l'état de stress et d'angoisse chez l'animal. Les animaux seront observés tous les jours et leur comportement sera suivi afin de déceler tout signe d’inconfort ou de stress. Durant les chirurgies, des méthodes d’anesthésie et d’analgésie sont systématiquement utilisées. Un suivi post-chirurgical rapproché sera réalisé. Des points limites sont mis en place pour l’ensemble des procédures expérimentales. Si de nouvelles approches moins stressantes ou douloureuses pour l’animal venaient à être mises au point après le début de ce projet, une concertation avec la SBEA (structure chargée du bien-être des animaux) pourra être réalisée afin d’intégrer ces nouvelles pratiques dans nos procédures.

Choix des espèces

Ce projet sera réalisé sur le modèle animal - Souris adulte (à partir de l'âge de 8 semaines post-naissance). Il nous est indispensable de travailler sur un modèle animal, social, entier avec un système neurobiologique mature afin d’être dans les conditions les plus proches de la complexité humaine. Le modèle murin adulte présente une forte homologie structurale du cerveau avec l’Homme le rendant incontournable dans la recherche en neurosciences.