Procédures modérées

224 chiens adultes vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, puis réintroduits dans le "stock des animaux hébergés" de l'établissement pour être réutilisés. Leur peau est tondue, abrasée au ruban adhésif puis au dermaroller et infectée par des bactéries, ce qui provoque rougeurs, pustules, croûtes et démangeaisons, avec port d'une collerette, isolement en box individuel jusqu'à vingt jours et prélèvements tous les deux à quatre jours jusqu'à la guérison. Il s'agit de tester des traitements vétérinaires de la pyodermite, une infection cutanée fréquente chez le chien, présentés comme des alternatives aux antibiotiques. Chaque chien peut repasser dans une nouvelle étude après six semaines de repos, et le porteur conclut que "l'absence d'alternative à l'utilisation d'animaux justifie l'utilisation des chiens dans ce projet".

Objectifs

La pyodermite canine représente l'un des motifs de consultation les plus fréquents en médecine vétérinaire. C’est une infection bactérienne cutanée généralement causée par des bactéries. Lorsque la barrière cutanée est altérée, les bactéries commensales de la peau peuvent proliférer de manière excessive, entraînant un déséquilibre bactérien et une réponse inflammatoire locale. La pyodermite peut être classée en plusieurs catégories selon la profondeur de l’infection et les couches de peau affectées (de surface, superficielle ou profonde). Les chiens atteints de pyodermite présentent une barrière cutanée altérée avec la présence de croûtes, de pustules, de papules et des zones d’alopécie. La qualité de vie de l’animal est affectée, il se gratte et se lèche, ce qui peut augmenter l’infection.Les traitements classiques actuels reposent l'utilisation de topiques antiseptiques et l'utilisation d'antibiotiques par voie systémique. Cependant, l'augmentation de l’émergence de la résistance aux antimicrobiens des bactéries limite considérablement les options thérapeutiques et le traitement de la pyodermite devient alors un défi. Ce projet s’inscrit dans une démarche de développement de nouveaux traitements vétérinaires, pharmaceutiques ou non. Il se décomposera en 2 procédures: mise en place d’un modèle expérimental de pyodermite superficielle imitant étroitement la maladie naturelle et évaluation de l’efficacité de nouveaux traitements de la pyodermite en vue d’optimiser et de réduire l’utilisation des antibiotiques lorsqu'ils s'avèrent nécessaires. Ces nouveaux traitements permettront également de limiter les conséquences de la maladie et amélioreront de façon notable le bien-être de l’animal. Le modèle de pyodermite sera mis en place d’après des modèles décrits dans la littérature. Les traitements seront testés chez l’espèce de destination et de ce fait une sélection préalable de solutions de traitement ne présentant pas de risque pour l’animal sera réalisée (excipient, volume à administrer…). Les traitements pourront être administrés par voie topique (sprays, mousses, gels, shampooings) ou par voie systémique (alternatives aux antibiotiques ou complémentaires aux antibiotiques)dans le strict respect des bonnes pratiques vétérinaires d’administration.

Bénéfices attendus

La pyodermite canine est due à la prolifération opportuniste de bactéries. Les traitements classiques actuels reposent sur l'administration d'antibiotiques systémiques et l'utilisation de topiques antiseptiques. Cependant, l'augmentation de l’émergence de la résistance aux antimicrobiens des bactéries limite considérablement les options thérapeutiques et le traitement de la pyodermite devient alors un défi. L’objectif de ce projet est de répondre à cette problématique d’antibiorésistance avec des solutions alternatives et/ou complémentaires aux traitements antibiotiques limitant ainsi leur utilisation tout en préservant l’environnement et la santé humaine. La recherche de nouveaux traitements pour un contrôle efficace et sûr de la pyodermite doit être évaluée sur l’espèce cible présentant les caractéristiques de la maladie. La mise en place et la maitrise d’un modèle de pyodermite superficielle induisant des signes cliniques similaires aux lésions cutanées observés chez les chiens souffrant de pyodermite spontanée, permettront d’évaluer l’efficacité d’un traitement dans des conditions contrôlées, d’améliorer les phases de screening de nouvelles solutions alternatives aux antibiotiques et ainsi de sélectionner plus rapidement et de façon plus sûre, des solutions présentant une probabilité importante de succès de guérison sur un nombre optimisé d’animaux. Ainsi, ces traitements permettront d’améliorer l’état et le bien-être du chien (plus de grattage, ni léchage) tout en préservant son microbiome cutané. Ces nouveaux traitements participeront à améliorer le confort d'application et d'utilisation par rapport à l'existant (spot on, durée de traitement réduit...).

Procédures

- Préparation des zones de peau à infecter, tonte et légère abrasion avec une bande adhésive (« tape stripping ») puis au dermaroller - 1x par procédure – quelques minutes - Administration du (des) traitements : • Par voie topique par spray, shampooing - 1 à plusieurs applications par semaines pendant 1 à 4 semaines selon le traitement – maximum 5 mn • Par voie générale - 1 administration unique – 1 mn - Prélèvements • Microbiologiques – 1 prélèvement/zone testée - 1 fois durant la phase d’acclimatation, à J0, les 5 jours suivants la phase d’induction, puis tous les 2 à 4 jours jusqu’à la guérison spontanée (maximum 20 jours) - 2 mn par prélèvement. • Cytologiques, – 1 prélèvement/zone testée - 1 fois durant la phase d’acclimatation, à J0, les 5 jours suivants la phase d’induction, puis tous les 2 à 4 jours jusqu’à la guérison spontanée (maximum 20 jours) - 2 mn par prélèvement.

Impact sur les animaux

1/L’induction du modèle de pyodermite, la collecte d’échantillons et les études d’efficacité pharmacologique requièrent une contention légère et de très courte durée des animaux, pouvant induire un stress léger. 2/L’induction d’une pyodermite superficielle induira des lésions cutanées attendues au niveau des zones testées (ex: érythème, papules/pustules, croûtes). Ces lésions pourront entrainer du prurit et donc être source d'inconfort pour le chien. 3/Prélèvements cytologiques: certains prélèvements pourront se faire par aspiration, c'est-à-dire via l'introduction d'une aiguille dans la lésion cutanée observée, pouvant induire une légère douleur pour l'animal au moment de la ponction. 4/Mobilité réduite: pour éviter le léchage qui pourrait aggraver les symptômes infectieux, les chiens devront porter une collerette pouvant générer un léger stress et inconfort. 5/Afin d’éviter toute contamination croisée entre les chiens (contamination de la zone inoculée par la flore buccale et/ou par les germes de différentes souches qui pourront être appliqués sur les différents chiens), ils seront hébergés en box individuel au maximum 20 jours ce qui pourra induire du stress pour l'animal. L’hébergement collectif sera privilégié pour chaque étude qui le permettra.

Devenir

Tous les animaux utilisés dans le projet seront réintroduits dans le stock des animaux hébergés dans les locaux de l’EU. Les études de ce projet seront conduites séquentiellement afin d’obtenir les informations scientifiques nécessaires tout en minimisant le nombre d’animaux utilisés. Les animaux pourront être réutilisés dans chaque étude du projet après totale guérison et une période de repos de 6 semaines minimum. L’effet cumulatif est évalué par le vétérinaire de l’EU en collaboration avec le(s) directeurs(s) d’étude(s) selon le type de produits administrés. Les animaux peuvent être réutilisés après une période de repos suffisante entre 2 études pour s’assurer de l’élimination totale de l’organisme du dernier traitement administré ; cette durée ne peut être inférieure à 10 fois la demi-vie du produit si celle-ci est connue ou 1 mois si celle-ci n’est pas connue. De plus, tout animal réutilisé fait l’objet d’une visite du vétérinaire de l’EU qui certifie que l’animal a pleinement recouvré son état de santé et de bien-être général et peut être ré-inclus dans une nouvelle étude sans dommage pour lui.

Remplacement

Conformément au principe de remplacement, des modèles non animaux (cultures cellulaires, peau reconstruite, systèmes ex vivo) ont été évalués. Toutefois, ces approches ne permettent pas de reproduire la physiopathologie de la pyodermite superficielle canine, reposant sur l’altération de la barrière cutanée, sa colonisation par une bactérie et la réponse immunitaire cutanée de l’hôte. Seul un modèle in vivo permettra d’analyser simultanément et de façon standardisée, l’induction des lésions, la dynamique infectieuse, l’inflammation et la cicatrisation, ainsi que l’évaluation clinique des stratégies thérapeutiques. Des études in vitro pourront être réalisées en amont de chacune des études de cette procédure, comme : - Des études de microbiologie permettront de caractériser les agents infectieux utilisés lors du modèle et de sélectionner des souches adaptées en évaluant leur pathogénicité et leur sensibilité aux solutions de traitement à évaluer. - Des études de toxicité des solutions de traitement à évaluer permettront d’écarter les produits toxiques ou mal tolérés.

Réduction

Dans la mesure du possible, des approches in vitro seront réalisées préalablement afin de sélectionner les meilleurs candidats de traitement pour un passage in vivo et limiter le nombre d’animaux inclus dans la procédure. Les études réalisées dans le cadre de ce projet seront conduites séquentiellement afin d’obtenir les informations scientifiques nécessaires tout en minimisant le nombre d’animaux utilisés et en préservant leur bien-être autant que possible. Dans chaque plan d’étude, le nombre d’animaux par groupe sera toujours argumenté et justifié de manière à optimiser leur utilisation et à en réduire leur nombre tout en s’assurant que ce nombre permettra d’atteindre l’objectif de l’étude, c'est-à-dire que les résultats de l’étude permettront de prendre une décision sur l’induction de la pyodermite et /ou le niveau d’efficacité de la/des solutions de traitement évaluées. Chaque animal sera son propre témoin. La littérature nous montre que pour ce modèle, un minimum de 6 chiens est nécessaire pour garantir des résultats exploitables. Les études de mise au point seront réalisées sur 6 à 8 chiens (dans le cas où différentes conditions devraient être étudiées, telles que l'application de germes différents). Lors des études d’évaluation de produits, 3 à 4 groupes de 6 à 8 chiens seront nécessaires (2 groupes contrôles, négatif et positif, 2 groupes traités). Les différentes études seront réalisées successivement, et les animaux pourront être réutilisés dans les études suivantes après totale guérison et une période de repos de 6 semaines minimum.

Raffinement

L’induction du modèle de pyodermite, la collecte d’échantillons et les études d’efficacité pharmacologique, requièrent une contention légère des animaux. Les animaux sont habitués à la contention et au contact des expérimentateurs en étant régulièrement manipulés. Depuis leur inclusion dans l’étude jusqu’à la dernière observation, l’état de santé général des animaux sera observé a minima 2 fois par jour pour s’assurer qu’aucune réaction non attendue est observée. Des observations locales seront également prévues a minima une fois durant la phase d’acclimatation, à J0, les 5 jours suivants la phase d’induction puis tous les 2 à 4 jours jusqu’à guérison du chien. Les examens cliniques locaux pourront cependant être plus fréquents si les besoins de l’étude le justifient, par exemple, réalisés quotidiennement tout au long de la phase expérimentale. Le personnel de l’EU en charge des observations est expérimenté et formé à reconnaitre un état de santé ou comportement anormal devant être signalé au vétérinaire de l'étude. Des points limites seront définis et précisés dans chaque plan d'étude. Si un des points limites est atteint, le chien sera immédiatement retiré de la phase expérimentale et traité. Les chiens devant être hébergés en box individuel durant la phase expérimentale (maximum 20 jours), un enrichissement compensatoire avec des jeux spécifiques (tapis de léchage) leur sera fourni. Deux à trois jours après l’induction du modèle, les chiens pourront sortir faire de l’exercice, 2 à 3 fois par semaine, en individuel et sous surveillance. Les interactions avec le personnel qualifié de l’EU seront plus fréquentes qu’en hébergement collectif. Le temps en box individuel sera ajusté à chaque étude de mise en place afin de le réduire au maximum. Il sera discuté pour chaque étude avec la SBEA. L’hébergement collectif sera privilégié pour chaque étude qui le permettra. Dès qu’un animal sera guéri, il pourra de nouveau être placé en box collectif.

Choix des espèces

Les produits vétérinaires doivent obligatoirement être testés dans l’espèce de destination. L’espèce de destination des traitements contre la pyodermite étant le chien et l’absence d’alternative à l’utilisation d’animaux justifie l’utilisation des chiens dans ce projet. Les modèles seront à mettre en place chez des chiens adultes sains avec un système immunitaire mature soit des animaux de plus de 10 mois.

Reçus à l'âge d'un jour, 672 poulets de chair sont élevés jusqu'à 35 jours et, à partir du 21e jour, 576 d'entre eux sont exposés à un stress thermique contrôlé, pour tester des produits à base d'épices ajoutés à leur aliment. Les pesées à J0, J10, J21 et J35 imposent une contention manuelle, et les poulets exposés à la chaleur peuvent présenter une respiration accélérée, moins d'activité et une baisse d'alimentation, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. À J34, 288 poulets subissent deux prises de sang et un test d'immobilité tonique, qui consiste à les maintenir sur le dos et que le porteur décrit comme générant "un stress aigu de courte durée". L'objectif affiché porte sur la "robustesse" et les "performances zootechniques" des volailles d'élevage. À l'issue, 144 poulets sont tués par électronarcose pour des mesures de qualité de viande, et les 528 autres partent vers "la filière de production standard", celle des poulets de chair.

Objectifs

L'augmentation des températures environnementales constitue un défi majeur pour les productions animales et le bien-être des volailles. Le stress thermique est reconnu comme un facteur important de dégradation des performances zootechniques ainsi que des fonctions physiologiques et immunitaires. Dans un contexte marqué par la hausse des températures et la fréquence accrue des vagues de chaleur, il est nécessaire de mieux caractériser les réponses des animaux au stress thermique et d'identifier des solutions permettant d'en limiter les conséquences. Ce projet vise à évaluer les effets d'un stress thermique contrôlé sur les réponses zootechniques, physiologiques et comportementales des poulets de chair, ainsi que l'efficacité de plusieurs produits à base d'épices incorporés dans l'alimentation. Ces produits ont déjà montré des effets favorables sur la réponse au stress dans d'autres modèles expérimentaux. Les résultats obtenus pourront contribuer au développement de stratégies nutritionnelles visant à améliorer la robustesse et le bien-être des volailles dans un contexte de hausse des températures environnementales.

Bénéfices attendus

Ce projet vise à améliorer les connaissances sur les effets du stress thermique chez le poulet de chair, en évaluant ses conséquences sur les performances zootechniques, les réponses physiologiques et le comportement des animaux. Il permettra également d'évaluer l'intérêt de plusieurs produits à base d'épices comme solution nutritionnelle pour limiter les effets du stress thermique. À terme, les résultats pourraient contribuer au développement de stratégies favorisant la robustesse, le bien-être et les performances des volailles dans un contexte d'augmentation des températures environnementales.

Procédures

Les animaux seront soumis à une exposition à un stress thermique contrôlé. Cette exposition est susceptible d'entraîner un inconfort transitoire caractérisé notamment par une augmentation de la fréquence respiratoire, une diminution de l'activité et une baisse de la consommation alimentaire. Des pesées seront réalisées à plusieurs reprises au cours du projet et nécessiteront des manipulations de courte durée. Un sous-groupe d'animaux fera également l'objet d'évaluations physiologiques et comportementales comprenant des prélèvements sanguins réalisés sur animaux vigiles et un test d'immobilité tonique. Ces procédures nécessiteront une contention manuelle temporaire et pourront être à l'origine d'un stress léger à modéré de courte durée ainsi que d'une douleur légère au site de prélèvement. Chaque animal concerné par ces évaluations sera soumis à deux prélèvements sanguins et à un test d'immobilité tonique au cours du projet.

Impact sur les animaux

Les principales nuisances attendues au cours du projet sont liées à l'application du stress thermique contrôlé ainsi qu'aux procédures de prélèvement et d'évaluation comportementale. Les animaux élevés dans la salle soumise au stress thermique pourront présenter des signes transitoires d'inconfort liés à l'augmentation de la température ambiante, tels qu'une augmentation de la fréquence respiratoire, une diminution de l'activité ou une baisse de la consommation alimentaire. Les pesées réalisées à J0, J10, J21 et J35 nécessiteront une contention manuelle de courte durée susceptible de provoquer un stress léger et temporaire. Les prélèvements sanguins réalisés à J34 pourront entraîner un stress ponctuel lié à la manipulation et à la contention des animaux, ainsi qu'une gêne légère et de courte durée au niveau du site de ponction. Un risque limité d'apparition d'un hématome local peut également être observé. Le test d'immobilité tonique constitue une procédure générant un stress aigu de courte durée associé à la contention et au maintien temporaire de l'animal en position dorsale. Au total, les effets indésirables attendus sont principalement des manifestations transitoires de stress et d'inconfort, d'intensité légère à modérée, associées aux conditions de stress thermique, aux manipulations et aux procédures expérimentales réalisées.

Devenir

Une partie des animaux (2 poulets par module parmi les 4 utilisés dans le cadre des prélèvements de sang et tests d’immobilité tonique soit 144 poulets au total) sera mise à mort par électronarcose à l’issue de l’essai afin de réaliser des analyses scientifiques complémentaires, telles que des mesures de qualité de viande. La mise à mort est réalisée selon des méthodes réglementaires approuvées, par du personnel formé. Les animaux ne faisant pas l’objet de prélèvements nécessitant leur mise à mort sont maintenus en vie à l’issue de l’essai. Ces animaux sont ensuite orientés vers la filière de production standard.

Remplacement

Aucune méthode substitutive ne permet actuellement de reproduire la complexité de la thermorégulation chez les volailles, en intégrant les interactions comportementales et métaboliques intervenant dans ce processus, et les liens avec la nutrition.

Réduction

Le nombre d'animaux inclus dans ce projet a été déterminé de manière à garantir une puissance statistique suffisante pour mettre en évidence les effets des différentes stratégies nutritionnelles sur les paramètres zootechniques, comportementaux et physiologiques étudiés, tout en limitant au strict nécessaire le nombre d'animaux utilisés. La procédure de stress thermique contrôlé concernera 576 poulets. Afin de réduire le nombre d'animaux soumis aux procédures les plus contraignantes, les prélèvements sanguins et le test d'immobilité tonique seront réalisés uniquement sur un sous-échantillon représentatif d'animaux. Ainsi, 192 animaux parmi ceux soumis au stress thermique feront également l'objet de ces évaluations physiologiques et comportementales. Afin de disposer d'un groupe de comparaison non exposé au stress thermique, ces mêmes évaluations seront également réalisées sur 96 animaux supplémentaires. Au total, 672 animaux seront inclus dans une procédure expérimentale au cours du projet. Ce dimensionnement expérimental a été défini de manière à répondre aux objectifs scientifiques du projet tout en respectant le principe de réduction du nombre d'animaux utilisés.

Raffinement

Le bien-être des animaux repose sur une surveillance quotidienne assurée par un personnel qualifié et spécialement formé à l’élevage et à la manipulation des volailles. Les animaux sont élevés en case collective (12 animaux). La durée et la période d’augmentation de la température est adaptée à la thématique d’essai et réduite au maximum (uniquement sur la période de finition). Les manipulations sont réduites, peu invasives et courtes dans le temps. Elles se limitent principalement à des pesées (J10, J21, J35), ainsi qu’à un test d’immobilité tonique et prélèvements de sang uniquement pour certains animaux. L’eau et les aliments sont distribués à volonté. L’air est ventilé, les conditions d’ambiance (température et hygrométrie) sont contrôlées via un boitier de commande. Un sur-grillage plastique est placé au sol des modules afin d’améliorer le confort pour les pattes des volailles. Un papier de démarrage (papier absorbant) est placé au sol les premiers jours après l’arrivée des poussins. Il permet de déposer un peu d’aliment directement à leur portée et d’améliorer le démarrage alimentaire, tout en limitant le contact avec le sol grillagé. Il est retiré après quelques jours.

Choix des espèces

Il s’agit de l’espèce cible. Les poussins sont reçus, âgés d’un jour, comme dans les conditions d’élevage habituelles. Ils sont élevés jusqu’à 35 jours d’âge. Lors des phases de démarrage et de croissance (jusqu’à 21 jours d’âge), les volailles seront élevées avec des conditions d’ambiances (température et hygrométrie) conformes au cahier des charges standard leur assurant un bien-être optimal. Cela permet une meilleure adaptation des animaux à leur environnement, et de limiter les potentielles nuisances sur les animaux en réduisant la durée d’exposition. La modification des consignes de condition d’ambiance n’interviendra que sur la phase de finition (après 21 jours d’âge et jusqu’à 35 jours d’âge) . Les mesures comportementales et physiologiques seront réalisées à J34 juste avant la fin de l’essai et à la fin de la période d’élevation des températures, afin d’évaluer l’impact de cette dernière sur ces paramètres.

Les 680 souris de ce projet sont immunodéficientes, sans système immunitaire fonctionnel, pour accepter des greffes de cellules souches sanguines humaines porteuses d'un gène lié à une leucémie de l'enfant. Elles sont utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré : deux injections de cellules sous anesthésie, puis vingt injections sur souris éveillées, dont le contenu n'est pas précisé. Si la leucémie se développe, le porteur décrit perte de poids, dos courbé, yeux rétrécis et moindre exploration, et il évoque la gêne de mini-os humanisés dont la pose ne figure pas parmi les procédures. Toutes sont tuées à l'issue pour prélever moelle osseuse, rate et mini-os, et y compter les cellules pré-leucémiques.

Objectifs

L’hématopoïèse est le processus par lequel notre corps fabrique toutes les cellules du sang. Après la naissance, ce phénomène a lieu dans la moëlle osseuse, à partir de cellules souches et de cellules directement issues des cellules souches appelées progéniteurs hématopoïétiques. Si une étape est modifiée dans ce processus ou si l’environnement de la moëlle osseuse est perturbé, cela peut entraîner des maladies du sang, comme les leucémies. La leucémie aiguë lymphoblastique B (LAL-B) de l’enfant est liée à un gène anormal. Elle représente une part importante des cas de leucémie pédiatrique. Ce gène anormal s’exprime dans une cellule dont on ne connaît pas encore l’origine, déclenchant des changements précoces pouvant mener aux symptômes cliniques de la leucémie. Actuellement, nos connaissances sur les modifications cellulaires précoces induites par ce gène anormal sont limitées, car la plupart des études sur ce sujet se concentrent sur des jeunes patients déjà diagnostiqués pour cette LAL-B. Nous pensons qu’au cours du développement, certaines cellules spécifiques du tissu hématopoïétique pourraient être particulièrement sensibles à ce gène anormal. Nous utiliserons des cellules souches et progéniteurs hématopoïétiques humains sur lesquels nous travaillons depuis de nombreuses années, dans lesquels sera exprimé le gène anormal, et nous suivrons le devenir des cellules modifiées après leur transplantation dans des modèles de souris immunodéficientes permissives aux greffes d’origine humaine. Notre projet a deux objectifs principaux : 1) Identifier les cellules à l’origine des changements pré-leucémiques (modifications cellulaires précoces), afin de mieux comprendre comment la maladie est initiée. 2) Étudier l’influence d’un environnement de moëlle osseuse humanisée (mini-os humanisés), sur le développement des étapes pré-leucémiques induites par l’anomalie génétique.

Bénéfices attendus

Les leucémies pédiatriques liées à une anomalie génétique spécifique touchent surtout les très jeunes patients. Dans le cas de leucémies lymphoblastiques pédiatriques de type B, les premières cellules sensibles à la transformation pathologique ne sont pas connues. De plus l'environnement autour de ces cellules jouerait un rôle important dans ce processus. Ainsi, de nombreuses questions sur la manière dont cette transformation se produit restent encore sans réponse. Le projet que nous souhaitons développer vise à mieux comprendre cette maladie. Les modèles que nous proposons sont essentiels pour découvrir comment la leucémie se développe à partir de cellules humaines et permettront de mieux refléter la complexité de cette maladie dans un organisme vivant. Dans le cas de la leucémie associée à l’anomalie génétique étudiée, notre projet pourrait également aider à mettre au point et tester de nouveaux traitements spécifiques qui doivent d'abord être validés sur des modèles précliniques avant de pouvoir être proposés aux patients. À plus long terme, ces modèles pourraient également être adaptés pour étudier d'autres maladies infantiles, notamment des leucémies liées à d'autres anomalies génétiques. Cela permettrait de proposer de nouveaux protocoles de traitement, essentiels pour ces différentes maladies de l’enfant.

Procédures

- 2 injections de cellules sous anesthésie, avec analgésie, 5 minutes, 680 animaux - 20 injections sur animaux vigiles, 30 secondes, 680 animaux

Impact sur les animaux

Toutefois, si le développement d’une leucémie se produit, la souris peut avoir des comportements évocateurs d’une souffrance, d’une douleur, d’un mal-être tels que : une perte d’appétit, une perte de poids, une négligence d’entretien du poil et de son hygiène, une courbure au niveau du dos, une perte d’intérêt à l’exploration et la découverte de son environnement, un rétrécissement des yeux, une réduction des mouvements.Les injections en vigile peuvent entrainer une douleur ; d’autre part la présence des mini-os humanisés peut être source de gêne, ou d’inconfort pour l’animal.

Devenir

Toutes les souris seront euthanasiées en fin de procédure. Les tissus/organes hématopoïétiques (moëlle osseuse, rate, mini-os) seront prélevés et les cellules qui y sont contenues seront analysées pour identifier la quantité et la qualité des cellules pré-leucémiques (modifiées) présentes dans les organes en question.

Remplacement

Dans le cadre de l’étude des leucémies, l’expérimentation sur des animaux, comme les rongeurs, est essentielle pour comprendre comment la maladie se développe dans un organisme entier. Les méthodes de culture cellulaire (in vitro) ne permettent pas de reproduire fidèlement tous les mécanismes qui ont lieu dans un corps entier vivant. Les modèles animaux, et notamment les souris, sont les seuls à pouvoir mimer fidèlement les processus complexes comme la migration et le développement des cellules sanguines, qu’elles soient saines ou malades. Bien que nous utilisions des systèmes de culture en laboratoire aussi souvent que possible, ils ne reproduisent pas toutes les étapes du développement de la leucémie, que ce soit dans la moëlle osseuse ou dans d'autres organes. Par ailleurs, ces modèles de culture ne démontrent pas le processus complet de transformation en leucémie, contrairement aux modèles vivants (in vivo). C'est pourquoi les expériences sur les rongeurs sont indispensables et complètent les stratégies de culture en laboratoire.

Réduction

Les groupes d’étude comprendront 20 souris. Ce nombre de 20 souris correspond au nombre de répétitions de manipulations intégrant le nombre d’expériences prévues et le nombre de souris par expérience ; ceci permettra d’obtenir des résultats fiables d’un point de vue statistique.

Raffinement

Les animaux utilisés seront régulièrement surveillés par l’équipe et le personnel animalier afin de repérer tout changement de comportement et éviter autant que possible toute douleur, souffrance ou stress inutile. Afin d’améliorer le bien-être des souris vis-à-vis des potentiels souffrances et angoisses liées aux manipulations expérimentales, elles seront supplémentées avec de l’hydrogel et de la nourriture humidifiée déposée directement dans la cage en plus de leurs nids en coton et des maisons en cartons pour plus de confort. Les injections de cellules seront réalisées sous anesthésie générale gazeuse. Des critères, appelés points limites, seront définis pour assurer le bien-être des animaux et limiter leurs souffrances en cas de progression irréversible de la maladie.

Choix des espèces

La génétique et le comportement des souris étant bien connus, il est facile de mesurer leur bien-être, souffrance et stress et d’y remédier rapidement. Cela en fait un excellent modèle pour atteindre les objectifs scientifiques de ce projet. De plus, la souris partage 99% de ses gènes avec l’être humain, ce qui permet de transposer plus facilement les résultats obtenus chez la souris aux pathologies humaines, aidant ainsi à améliorer leur compréhension et leur traitement. Enfin, les souris reproduisent les étapes principales du développement des leucémies, ce qui en font de bons modèles d’étude, en particulier de traitements. Les souris que nous utiliserons dans ce projet sont des souris immunodéficientes (qui n’ont pas de système immunitaire fonctionnel), qui peuvent recevoir des greffes de cellules sanguines humaines, qu’elles soient normales ou leucémiques. Ces souris, élevées dans des conditions spécifiques, ne présentent pas les défauts associés à leur immunodéficience. Dans ce projet, nous utiliserons des souris adultes âgées de 8 à 12 semaines, qui montrent une excellente capacité à accepter des greffes après injection, que ce soit pour des cellules normales ou malades.

Pour mettre au point l'administration de molécules marquées par un régime liquide, à la place d'une perfusion par cathéter posé chirurgicalement, 60 souris sont utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Toutes subissent deux prises de sang à la queue, 24 d'entre elles une échographie sous anesthésie, et 12 sont hébergées deux mois à 30 °C pour rendre leur graisse brune dysfonctionnelle. Toutes sont tuées à l'issue pour prélever leurs tissus, leurs organes et leur plasma. Un avis vétérinaire est prévu à partir de 10 % de perte de poids, et la mise à mort au-delà de 20 %.

Objectifs

Avec le fait que les gens vivent de plus en plus longtemps, il devient très important de garder les personnes âgées en bonne santé, autonomes et avec une bonne qualité de vie. En vieillissant, le corps devient moins efficace pour faire face aux stress et pour maintenir un bon équilibre énergétique. Cet équilibre correspond au fait que ce que l’on mange (apports) et ce que le corps dépense restent en balance. Normalement, plusieurs organes travaillent ensemble pour maintenir cet équilibre et s’adapter aux changements. Mais avec l’âge, cette coopération fonctionne moins bien, ce qui peut favoriser des problèmes métaboliques (comme le diabète ou l’obésité). Parmi les organes importants, il y a les tissus adipeux (les graisses du corps) avec la graisse blanche (stockage d’énergie) et la graisse brune et beige (qui brûle l’énergie sous forme de chaleur). Avec le vieillissement, ces tissus (surtout les graisses brunes et beiges) fonctionnent moins bien. Cela peut perturber la manière dont le corps utilise et distribue l’énergie, ce qui impacte le fonctionnement global de l’organisme. Pour étudier comment l’énergie circule dans le corps, les chercheurs utilisent des approches spéciales : ils donnent à des souris des molécules “marquées” (repérables) pour suivre leur transformation dans le corps. Ces approches nécessitent souvent une chirurgie pour réaliser une perfusion intraveineuse via un cathéter. De plus, elles sont très compliquées et ne sont pas toujours adaptées pour étudier certains types de molécules comme les lipides (graisses). Ce projet a donc pour objectif de développer une méthode plus simple et plus efficace (avec l’utilisation d’un régime liquide spécial au lieu d’une chirurgie) pour suivre ces molécules dans le corps et de valider une technique d’analyse qui va permettre d'étudier tous les types de molécules en même temps (au lieu de l'utilisation de deux techniques auparavant). Une fois ces méthodes validées, elles permettront de mieux comprendre comment le métabolisme change quand certaines graisses (brunes et beiges) ne fonctionnent plus correctement au cours de l’âge. Ce projet sera réalisé sur deux établissements utilisateurs.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de continuer d'étudier comment certaines graisses du corps (les tissus adipeux) en particulier brunes et beiges influencent le métabolisme, en particulier la gestion des lipides (les graisses), lorsqu'elles ne fonctionnent plus correctement. Si cette perte d’activité observée au cours de l'âge joue un rôle dans les problèmes du métabolisme, alors ces tissus pourraient devenir des cibles importantes pour maintenir un bon équilibre énergétique, favoriser un vieillissement en meilleure santé et diminuer la dépendance des personnes âgées. Par ailleurs, ce projet permettra grâce à l'utilisation d'un régime liquide de diminuer la souffrance des animaux en évitant une chirurgie. De plus grâce à la validation de cette technique d'analyse qui permettra d'étudier tous les types de molécules en même temps (au lieu de l'utilisation de deux techniques) nous pourrons réaliser l'analyse sur une seule et même souris au lieu de deux. Ceci pourra optimiser et réduire le nombre d’animaux utilisé dans de futurs projets.

Procédures

Pour la totalité des souris, une prise de sang à la queue sera réalisée juste avant le changement de régime puis juste avant la mise à mort. Vingt-quatre animaux subiront une seule échographie, qui durera 30 minutes environ, sous anesthésie gazeuse pour mesurer leur debit sanguin. Douze animaux seront hébergés pendant deux mois à une température de 30°C (température dite de thermoneutralité). Toutes ces interventions seront réalisées dans un service de zootechnie.

Impact sur les animaux

Certaines nuisances ou effets indésirables sont attendus au cours de ce projet : - le stress des animaux au moment de leur réception, - le stress lié à l’individualisation des animaux en cas d’agressivité, - le stress lié aux prélèvements sanguins en raison de la contention nécessaire à la prise de sang, - le stress possible lié à la température d’hébergement de 30°C (30°C étant la température de thermoneutralité pour la souris c'est à dire température à laquelle la souris ne met pas en jeu le frisson et/ou l'augmentation du métabolisme énergétique pour réguler sa température corporelle)(par expérience cette température de 30°C n'engendre généralement pas de stress particulier), - le stress possible liè au changement de régime (toutefois ce régime liquide à été décrit comme sans stress).

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort pour pouvoir prélever leurs tissus et organes ainsi que du plasma pour réaliser l'analyse des molécules du corps et étudier le devenir de ces molécules.

Remplacement

Notre projet consiste à mettre au point une méthode d'administration de molécules marqués et d'extraction de ces molécules afin d'étudier la distribution et le devenir de ces molécules dans l'organisme en entier dans un contexte d'inactivation des tissus adipeux. Il s'agit d'une étude intégrée à l'échelle de l'organisme impliquant des échanges de molécules entre différents tissus. Le recours à l’animal est donc indispensable pour ce projet de recherche. Les approches in vitro ne peuvant pas être envisagées car elles ne permettent pas d'avoir cet aspect intégré d'échanges de molécules. De même les approches in silico ne peuvent pas être utilisées car elles ne sont pas en capacité de modéliser la complexité du métabolisme de chacun des organes d'un idividu et les échanges de molécules qui ont lieu entre ces différents organes. Nous avons décidé de travailler sur la souris puisque cette espèce est un modèle bien établi pour l’analyse du métabolisme et dans lequel la biologie des tissus adipeux, en particulier les tissus adipeux bruns et beiges, a été bien étudiée.

Réduction

Compte tenu de la variabilité interindividuelle observée concernant le métabolisme, pour chacune des conditions, 8 souris seront utlisées (4 souris supplémentaires seront utilisées comme contrôles non marquées). Ce nombre d'animaux est necessaire pour avoir 90% de chance de voir une différence significative sur la quantité de molécules marquées. Pour déterminer ce nombre de souris le logiciel EDA a été utilisé (outil d'analyse permettant de déterminer le nombre d'animaux en se basant sur le plan expérimental et les statistiques). De plus grâce à la validation de cette technique d'analyse qui permettra d'étudier tous les types de molécules en même temps (au lieu de l'utilisation de deux techniques) nous pourrons réaliser l'analyse sur une seule et même souris au lieu de deux. Ceci pourra optimiser et réduire le nombre d’animaux utilisé dans de futurs projets.

Raffinement

Les procédures seront réalisées dans le respect du bien-être animal pour diminuer la souffrance, la douleur ou l’angoisse des animaux, en respectant les points limites préalablement définis. Les animaux seront placés en zone d’acclimatation lors de leur arrivée à la zootechnie. Ils seront pris en charge par le personnel compétent de la zootechnie qui vérifie leur état et place de l’enrichissement dans les cages pour diminuer le stress du transport et permettre aux animaux de faire un nid. Les animaux mâles issus de différents cartons de transport ne seront jamais mélangés lors de la répartition dans les cages d’hébergement. Le caractère grégaire des souris sera respecté puisqu’elles ne seront jamais seules en cage (sauf si un isolement est nécessaire pour cause d’agressivité et de bagarres). Pour le transport entre les deux bâtiments, les animaux seront tranportés, à pieds, dans leur cages d'origines (pour diminuer le stress) placées dans un système de transport de type sac isotherme opaque fermé. Dix minutes plus tard à l'arrivée au second bâtiment, les animaux seront directement placés soit sur un portoir ventilé identique au premier bâtiment pour les souris hébergées à 21°C, soit dans une armoire à thermoneutralité similaire au premier bâtiment pour les souris hébérgées à 30°C afin de diminuer le stress. Les souris seront surveillées quotidiennement par le personnel de la zootechnie pour repérer des problèmes éventuels (comportement anormal, blessure, maigreur, problème de dentition, …). Elles seront également surveillées et pesées (par une personne impliquée dans le projet) tous les 15 jours pendant les deux mois d'hébergement à 30°C, en début et fin d'acclimatation au régime liquide puis toutes les 24h pendant l'exposition au régime liquide supplémenté avec le glucose marqué. La vétérinaire référente et/ou le zootechnicien expérimenté seront contactés pour avis lorsque une souris présentera une perte de poids supérieure à 10% par rapport au poids initial et/ou sera prostrée, aura le poil hirsute, le dos rond, des signes de diarrhée (postérieur sale, souillé). Toute souris sera mis à mort quand elle présentera une perte de poids supérieure à 20% par rapport au poids initial et/ou après avis de la vétérinaire référente et/ou le zootechnicien expérimenté.

Choix des espèces

Nous avons décidé de travailler sur la souris puisque cette espèce est un modèle bien établi pour l’analyse du métabolisme et dans lequel la biologie des tissus adipeux, en particulier les graisses brunes et beiges, a été bien étudiée. Nous utiliserons des souris âgées de 3 à 4 mois et des souris âgées de 5 semaines afin que ces dernières aient environ 3 mois après les deux mois d'hébergement à 30°C. A cet âge les souris sont de jeunes adultes avec une graisse brune bien développée sur lequel nous pouvons induire un dysfonctionnement suite à l'hébergement à thermoneutralité (30°C).

La moitié des 2 064 souris passent jusqu'à 24 semaines seules en cage, toutes subissent une chirurgie et développent une douleur chronique, puis un jeûne de 24 heures et un isolement de 24 à 72 heures pour certains tests. Elles sont utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré et toutes tuées à l'issue, après une chirurgie terminale de prélèvement de tissus. Le porteur écrit que la douleur et le phénotype anxio-dépressif "sont inévitables et ne peuvent pas être soulagées car c'est l'objet de l'étude", qui cherche comment l'isolement aggrave la douleur chronique chez les patients. Il annonce quatre tests de douleur et sept tests comportementaux d'anxiété et de dépression sans en nommer aucun, ni dire comment la douleur chronique est provoquée.

Objectifs

La douleur chronique affecte environ 7 à 10 % de la population mondiale et demeure, dans de nombreux cas, réfractaire aux approches thérapeutiques actuellement disponibles. Elle représente ainsi un enjeu majeur de santé publique en raison de son impact considérable sur la qualité de vie des patients, mais également sur les systèmes de soins et les coûts socio-économiques qui lui sont associés. Par ailleurs, cette pathologie est fréquemment accompagnée de troubles affectifs, notamment l’anxiété et la dépression, avec un taux de comorbidité supérieur à 50 %. Il apparaît donc essentiel de mieux comprendre les mécanismes sous-jacents de cette comorbidité ainsi que les facteurs susceptibles de l’exacerber. Un nombre croissant d’études suggère que le stress chronique joue un rôle déterminant dans l’aggravation de la douleur et des troubles émotionnels associés. Sur la base d’observations cliniques rapportées par nos collaborateurs, l’isolement social a été identifié comme un facteur susceptible d’influencer l’intensité de la douleur, sa chronicisation ainsi que la durée de récupération. En effet, les patients souffrant de douleurs chroniques présentent fréquemment une tendance au retrait social, phénomène qui peut être à la fois une conséquence et un facteur aggravant de leur état. De plus, plusieurs études ont mis en évidence une augmentation des comportements d’isolement social au sein de la population générale, associée à une prévalence accrue des troubles anxieux et dépressifs. Dans ce contexte, le présent projet vise à approfondir la compréhension des mécanismes sous-jacents de l'impact de l'isolement sur la comorbidité de la douleur chronique et des troubles émotionnels. Cette étude s’inscrit dans une démarche translationnelle multicentrique réunissant plusieurs équipes de recherche précliniques et cliniques en Europe avec pour objectif de mieux appréhender la complexité de cette comorbidité et de favoriser le transfert des connaissances entre la recherche fondamentale et la pratique clinique.

Bénéfices attendus

Ce projet vise à mieux comprendre les mécanismes neurobiologiques et les circuits cérébraux impliqués dans la douleur chronique ainsi que dans les troubles anxio-dépressifs qui lui sont associés. Il permettra également d’évaluer l’impact de l’isolement social en tant que facteur susceptible d’aggraver cette comorbidité. Les connaissances acquises contribueront à une meilleure compréhension des interactions entre douleur chronique, environnement social et santé mentale, et pourraient, à terme, favoriser l’identification de nouvelles cibles thérapeutiques et le développement de stratégies de prise en charge plus efficaces.

Procédures

- la moitié des animaux est soumise à un isolement social inévitable, qui constitue l’objet de notre étude pour une durée maximale de 24 semaines. - Les animaux développent une douleur chronique associée à l’apparition de troubles de type anxieux et dépressif. - Les interventions chirurgicales sont réalisées sous anesthésie générale et durent au maximum 45 minutes. - Les animaux sont soumis à quatre tests d’évaluation de la douleur (durée moyenne de 15 minutes, avec une stimulation brève n’excédant pas 60 secondes) ainsi qu’à sept tests comportementaux destinés à évaluer les troubles anxio-dépressifs (environ 5 minutes par test), avec un intervalle de 24-48 entre chaque test dans la limite de 3 tests par semaine. - Les animaux sont soumis à un unique épisode de jeûne de 24 heures dans le cadre d’un test comportemental, ainsi qu’à une période unique d’isolement de 24 à 72 heures pour la réalisation de deux autres tests. - À l’issue de l’étude, les animaux font l’objet d’une chirurgie terminale de prélèvement tissulaire réalisée sous anesthésie profonde, d’une durée d’environ 10 minutes.

Impact sur les animaux

- La moitié des animaux seront hébergés dans des cages individuelles nous permettant de mieux comprendre l’effet de l’isolement social sur la comorbidité de la douleur et de ses conséquences émotionnelles. - la présence de la douleur et l’apparition du phénotype anxio-dépressif chez le modèle animal sont inévitables et ne peuvent pas être soulagées car c'est l'objet de l'étude. - Suite à la chirurgie, une légère difficulté dans les déplacements des animaux est attendue mais qui disparaît rapidement dans les 24 à 48h. - La douleur post-chirurgicale est aigue, transitoire et inflammatoire. - Les animaux subissent un stress aigu ainsi qu’une douleur transitoire et de faible intensité lors des tests de comportement.

Devenir

A la fin des procédures, les animaux sont mis à mort pour des analyses post-mortem.

Remplacement

l’objectif de cette étude est d’élucider les mécanismes sous-jacents par lesquels l’isolement social influence la comorbidité de la douleur et les troubles anxio-dépressifs qui y sont associés. À ce jour, aucun modèle in vitro ou in silico ne permet de reproduire ces interactions physiopathologiques ni d’étudier les conséquences comportementales de cette comorbidité. Le recours à un modèle in vivo est donc indispensable pour répondre aux objectifs scientifiques de cette étude.

Réduction

Les expériences seront réalisées avec la volonté de réduire autant que possible le nombre d’animaux par condition expérimentale, mais toujours dans l’optique d’obtenir le maximum d’information scientifique. Le nombre d'animaux a été déterminé pour obtenir des résultats statistiquement valides tout en se basant sur des données de la littérature, de notre expérience et de la variabilité phénotypique interindividuelle.

Raffinement

Les animaux sont hébergés en groupe sociaux pour respecter leurs besoins sociaux. Des carrés de coton seront placés dans la cage pour favoriser la nidation, et des barreaux de bois à ronger pour limiter les comportements d’agressivité. Avant le début des procédures et sur une période d’une semaine, les animaux sont manipulés quotidiennement par l’expérimentateur et acclimatés à l'environnement où les tests se dérouleront afin de réduire l'état de stress et d'angoisse chez l'animal. Les animaux seront observés tous les jours et leur comportement sera suivi afin de déceler tout signe d’inconfort ou de stress. Les animaux en condition d’isolement social sont hébergés dans des cages individuelles transparentes permettant de limiter le stress en maintenant un contact sensoriel minimal (olfactif, auditif et visuel) avec les congénères. Les cages seront enrichies (carrés de coton, frisures, bâtons en bois à ronger, tunnel) afin de favoriser le bien-être animal. Durant les chirurgies, des méthodes d’anesthésie et d’analgésie sont systématiquement utilisées. Un suivi post-chirurgical rapproché sera réalisé. Des points limites sont mis en place pour l’ensemble des procédures expérimentales. Si de nouvelles approches moins stressantes ou douloureuses pour l’animal venaient à être mises au point après le début de ce projet, une concertation avec la SBEA (structure chargée du bien-être des animaux) pourra être réalisée afin d’intégrer ces nouvelles pratiques dans nos procédures.

Choix des espèces

Ce projet sera réalisé sur le modèle animal - Souris adulte (à partir de l'âge de 8 semaines). Il nous est indispensable de travailler sur un modèle animal, social, entier avec un système neurobiologique mature afin d’être dans les conditions les plus proches de la complexité humaine. Le modèle murin adulte présente une forte homologie structurale du cerveau avec l’Homme le rendant incontournable dans la recherche en neurosciences