Procédures modérées

360 souris génétiquement modifiées pour reproduire le syndrome de Wolfram vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Anesthésiées à plusieurs reprises pour des examens du fond d'œil, de la rétine et des électrorétinogrammes, une partie reçoit à la naissance une injection dans la veine temporale. Le porteur décrit des effets possibles du modèle, démarche instable, tremblements, désorientation et comportement anxieux. Il affirme que ce modèle est le "seul moyen" d'explorer les mécanismes de la maladie et le seul à pouvoir tester des traitements sur la rétine, présentant cette irremplaçabilité comme un fait acquis.

Objectifs

Le projet porte sur le Syndrome de Wolfram, une maladie qui entraine une perte de la vision progressive due à une perte de la fonction du nerf optique qui permet de relier l’œil au cerveau. Il n’existe actuellement pas de traitement pour traiter cette maladie. Nous avons donc généré un modèle animal pour reproduire la maladie et tester des traitements. Ce modèle animal reproduit fidèlement les atteintes retrouvées chez les patients. Il est important de noter que ce modèle représente le seul moyen d'explorer les mécanismes responsables de la maladie. Ce modèle est également le seul modèle qui puisse être utilisé pour tester des traitements sur la rétine. Nous développerons 2 approches : 1) une étude sur les cellules de la rétine qui sont défectueuses que nous mettrons en culture afin d’étudier leur croissance en réponse à plusieurs traitements. 2) Nous développerons un axe de recherche sur les animaux vivants, auxquels nous injecterons une forme fonctionnelle de la protéine défectueuse afin de protéger leur rétine. Nous mesurerons le bénéfice de cette thérapie sur la fonction visuelle des animaux au cours du temps.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de mettre en évidence si notre traitement est capable de protéger la vision des animaux. A long terme, ce projet permettra de proposer un traitement de thérapie génique chez les patients atteints de perte de fonction du nerf optique.

Procédures

90 animaux seront anesthésiés pendant 30 minutes, deux fois, avec une semaine d’intervalle, lorsqu’ils auront 1 mois. Pendant l’anesthésie, ils passeront : • un examen du fond d’œil (10 min), • une analyse des couches de la rétine (10 min), • un électrorétinogramme (10 min). Parmi eux, 60 auront reçu une injection dans la veine temporale à la naissance. 90 autres animaux seront anesthésiés pendant 30 minutes, quatre fois en tout : deux fois à 1 mois (à une semaine d’intervalle) et deux fois à 3 mois (à une semaine d’intervalle). Ils passeront les mêmes examens que ci-dessus. Parmi eux, 60 auront reçu une injection dans la veine temporale à la naissance. 180 animaux seront anesthésiés pendant 30 minutes, six fois en tout : deux fois à 1 mois, deux fois à 3 mois et deux fois à 6 mois (toujours à une semaine d’intervalle à chaque âge). Ils passeront les mêmes examens que ci-dessus. Parmi eux, 120 auront reçu une injection dans la veine temporale à la naissance.

Impact sur les animaux

Les tests fonctionnels pour mesurer la vision sont indolores et pratiqués couramment en ophtalmologie humaine. L’injection des virus peut induire une courte douleur (moins de 2 min). Une partie des tests se fera sous anesthésie générale. Lors du réveil les souris peuvent être désorientées et stressées. Après chaque exploration (test), les souris seront observées quotidiennement. Les effets indésirables liés au modèle de souris peuvent être une démarche instable, des tremblements, une incapacité à grimper, une désorientation, un comportement anxieux.

Devenir

Les animaux seront tous euthanasiés pour prélèvement de tissus post-mortem. De plus, la plupart des animaux utilisés étants génétiquement modifiés et/ou infectés par des virus génétiquement modifiés eux aussi, il nous est impossible de replacer ou de faire adopter ces animaux. Ils seront donc euthanasiés à la fin de chaque procédure.

Remplacement

Nous avons généré une souris reproduisant une maladie qui entraine une baisse progressive de l’acuité visuelle due à la perte du nerf optique. Il n’y a pas de traitement. Il est important de noter que ce modèle représente le seul moyen d'explorer les mécanismes responsables de la maladie et de tester des traitements. Dans le cadre d'essais cliniques de thérapie génique, le recours à la souris est nécessaire et permet d’apporter une indication de l’efficacité du traitement.

Réduction

Notre projet étudie toutes les souris qu’elles soient porteuses de mutation ou non. Nous avons également constaté une différence d’atteinte chez les mâles et les femelles, de ce fait notre étude prend en compte mâles et femelles. Les mêmes animaux seront étudiés à 1, 3 et 6 mois avant leur euthanasie. Les effectifs ont été ramenés au minimum permettant d’avoir un effet statistique significatif.

Raffinement

Toutes les mesures biologiques pour étudier la vision et l’audition sont effectuées sur l’animal sous anesthésie. Les animaux sont placés sur une couverture chauffante (37°C) jusqu'au réveil. Après toutes analyses, les souris seront observées quotidiennement. Si des animaux montrent des signes de douleurs ou de souffrances, nous évaluerons cette souffrance et nous prendrons les décisions nécessaires afin de réduire la durée et l’intensité de la souffrance pour y mettre fin.

Choix des espèces

Le projet utilise la souris, car c’est le modèle mammifère de référence pour étudier l’impact d’une mutation d’un gène sur l’organisme. Les souris modèles que nous utilisons portent des mutations retrouvées chez les patients atteints de Syndrome de Wolfram et reproduisent les caractéristiques cliniques de la maladie chez l’homme. Ces souris sont donc de très bons modèles animaux pour tester des traitements. Les animaux utilisés pour faire des cultures de cellules rétiniennes seront des animaux de 3 jours après la naissance. Ce stade est le stade utilisé pour avoir les meilleurs résultats (rendement en quantité de cellules). Des traitements seront testés sur ces cellules afin d’identifier des molécules protectrices des cellules ganglionnaires de la rétine. Les animaux génétiquement modifiés reproduisant la maladie seront traités par thérapie génique à la naissance et leur vision sera explorée au cours du temps (à 1,3 et 6 mois) afin d’évaluer le bénéfice thérapeutique de l’approche de thérapie génique. Des prélèvements de rétines seront réalisés sur les animaux de 1,3 et 6 mois après euthanasie afin d’évaluer l’effet du traitement sur la morphologie de la rétine.

Pour servir de groupe témoin à des travaux sur l'accident vasculaire cérébral, 220 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une injection unique dans l'abdomen d'une suspension bactérienne qui déclenche une inflammation de l'"organisme entier", puis une prise de température rectale sur animal éveillé. Le porteur décrit une possible hypothermie, des diarrhées et des modifications de la respiration et de la motricité dans les heures qui suivent. Ces 220 individus ne servent pas à tester un traitement mais à caler un modèle d'inflammation destiné à d'autres expériences du laboratoire.

Objectifs

L’inflammation est une réaction de défense immunitaire du corps à une agression : infection, brûlure, allergie… Dans ce projet, nous portons un intérêt particulier aux cellules sentinelles du système immunitaire au niveau cérébral, en contact avec l’environnement, rapidement mobilisées en cas d’inflammation. Les cellules immunitaires sont présentes dans différentes régions cérébrales où elles sont capables d’interagir avec les vaisseaux sanguins, les neurones ainsi que d’autres types cellulaires présents. Elles ont été décrites dans la littérature comme étant impliquées dans de l’inflammation au niveau cérébral observée dans diverses pathologies du système nerveux central (SNC) telles que les accidents vasculaires cérébraux (AVC). L’objectif de ce projet est d’utiliser l’injection d’une suspension de bactéries (bactéries Escherichia Coli) appelées lipopolysaccharides (LPS) chez la souris pour induire une inflammation générale conduisant à l’activation du système immunitaire au niveau du SNC. Ce modèle d’inflammation constituera un contrôle positif pour l’étude de la réponse inflammatoire dans les AVC étudiés au sein de notre laboratoire et pour lesquels nous disposons d’ores et déjà de saisines dédiées. Ainsi, les animaux constituant ce groupe contrôle recevront le LPS et seront suivis pendant 24 heures (observation de leur comportement général). A l’issue des 24 heures, sous anesthésie générale, les animaux seront mis à mort et les organes seront prélevés pour la réalisation d’analyses diverses. Les données générées par les analyses qui seront effectuées permettront d’évaluer l’efficacité potentielle des molécules testées dans le cadre du développement de thérapies novatrices visant l’inflammation dans le domaine de l’AVC.

Bénéfices attendus

Le groupe d’animaux concerné par cette procédure constitue un groupe contrôle positif permettant de valider la présence au niveau cérébral des cellules immunitaires qui sont impliquées dans la réponse inflammatoire déclenchée en cas d’AVC. Cette réponse inflammatoire étant à l’origine d’une cascade d’évènements délétères dans l’AVC, elle représente une cible de choix dans le développement de stratégies thérapeutiques. Ainsi, grâce à ce groupe d’animaux, le partenaire industriel sera en mesure d’évaluer l’intérêt du développement de cette stratégie et pourrait à terme proposer de nouvelles solutions thérapeutiques pour le traitement des AVC.

Procédures

Les 220 souris de cette procédure seront soumises à l’induction d’une inflammation générale par injection dans le bas de la cavité abdominale d’une suspension d’origine bactérienne. L’injection est effectuée 1 seule fois sans anesthésie, le geste étant très rapide, quelques secondes, et effectué par du personnel qualifié. Les souris seront observées 6 heures après l’injection et une prise de température corporelle au niveau rectal sera effectuée et comparée à la mesure prise en amont de l’injection. Ces prises de température et observations de l’état général des animaux se feront sur animal éveillé et prendront au total moins d’une minute.

Impact sur les animaux

L’induction d’une inflammation générale affectant l’organisme entier pourra entrainer des variations de la température corporelle (hypothermie dans les premières heures), se traduisant par des modifications du comportement des animaux. L’apparence, la respiration et la motricité des animaux pourraient aussi être modifiés. L’apparition de diarrhées pourrait survenir.

Devenir

A l’issue de la procédure, tous les animaux seront mis à mort.

Remplacement

Ce projet correspond aux étapes des tests d’innocuité et d’efficacité de thérapeutiques in vivo faisant suite aux nombreuses expérimentations et validations réalisées in vitro par les industriels financeurs. Actuellement il n’existe aucune méthode alternative à l’expérimentation animale nous permettant d’obtenir le même niveau d’information obtenue avec l’expérimentation animale. L’ensemble des connaissances et des acquis dont nous disposons dans la littérature et au sein de notre laboratoire font de la souris le modèle préférentiel pour mener à bien ce projet. En effet, mus musculus est l’une des espèces animales la plus étudiée dans le domaine de l’AVC hémorragique, permettant une analyse comparative et critique des résultats obtenus.

Réduction

Ces groupes contrôles devrons être composés du même nombre d’animaux que les groupes de nos modèles d’AVC. Ainsi, pour ces modèles d’AVC, les données extraites de la littérature scientifique préclinique, combinées à une étude de détermination de la puissance statistique régulièrement mise à jour avec nos données permettent de définir un nombre minimal d’animaux de 18 par groupes dans nos conditions protocolaires. Cette approche nous offre la capacité de visualiser des différences réelles de manière statistiquement significative entre les groupes étudiés. Afin d’anticiper les exclusions d’animaux dues à des erreurs techniques ou à de la mortalité, l’augmentation de l’effectif de 22 par groupes expérimentaux est obligatoire pour atteindre un effectif final satisfaisant de 18 animaux par groupe. Maintenir cette marge de sécurité contribue à assurer la validité scientifique de notre projet tout en respectant les normes éthiques et les principes de réduction du nombre d'animaux utilisés en recherche. Ainsi, en optimisant le nombre d'animaux utilisés, nous parvenons à concilier l'efficacité de notre projet avec sa valeur scientifique, conformément aux principes de réduction du nombre d'animaux utilisés en recherche.

Raffinement

Afin de détecter de potentielle variations de la température corporelle, des mesures de températures rectales seront effectuées à l’aide d’un thermomètre adapté, en amont de l’injection de LPS puis 6 heures après. Du coton sera ajouté à l’enrichissement habituel pour limiter la déperdition de chaleur au sein des cages. Les animaux présentant des modifications de leur température, de leur apparence, de la respiration et de la motricité se verront attribuer un score qui sera établi à partir de la grille de score rédigée et jointe à la présente demande d’autorisation. Ainsi, leur score permettra de déterminer la prise en charge la plus adaptée à leur état. En cas de constatation de dépassement des points limites fixés et détaillés plus bas dans cette DAP, l’animal sera mis à mort.

Choix des espèces

La souris (Mus musculus) occupe une place prépondérante dans la recherche médicale, particulièrement dans le développement de stratégies thérapeutiques. Cette prééminence découle de divers facteurs, notamment les homologies vasculaires et génétiques entre l’Homme et la souris, ainsi que la facilité de manipulation génétique, le coût relativement bas, et la logistique aisée associée à l'élevage et la stabulation de ces rongeurs. Ces caractéristiques (entre autres) font de la souris un modèle animal privilégié pour la recherche préclinique. Elle offre la possibilité d'une analyse comparative et critique des résultats obtenus avec ceux de la littérature, renforçant ainsi la fiabilité des conclusions et leur applicabilité potentielle chez l'Homme. Les animaux utilisés seront adultes le jour de l’induction de l’inflammation (entre 8 et 14 semaines). Nous induirons ce modèle sur des adultes afin de pouvoir comparer ce groupe contrôle aux animaux de l’étude chez qui l’AVC sera induit.

45 moutons vont être utilisés dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, gardés en vie durant toute leur existence, jusqu'à environ huit ans. Chaque animal reçoit six à huit injections d'antigènes bactériens avec un adjuvant huileux qui peut enflammer le point d'injection, puis des prélèvements de sang répétés, jusqu'à six par an. Le sérum récolté sert à fabriquer des tests industriels de détection de Listeria, de salmonelles ou d'Escherichia coli dans l'alimentation. Le porteur indique que la plupart de ces moutons proviennent d'élevages classiques et ont été reclassés parce que jugés inaptes à leur production initiale.

Objectifs

L’objectif du projet est l’obtention d’anticorps polyclonaux de mouton, dirigés contre les antigènes spécifiques des bactéries pathogènes, recherchées dans les industries alimentaires : Listeria, Salmonelles, Escherichia Coli, Toxines de Staphylocoques Ces anticorps polyclonaux sont utilisés pour la réalisation de tests de détection, ou d’enrichissement préalable à la détection, des bactéries ou de leurs entérotoxines, à l'aide d'automates par l’industrie alimentaire. Un animal immunisé, permet de produire à chaque série de prélèvement 2 000 000 à 3 000 000 tests selon l’antigène, sachant qu’il peut réaliser jusqu’à 4 séries de prélèvement durant toute sa vie soit environ 8 ans.

Bénéfices attendus

Les anticorps produits, une fois purifiés, entrent dans la composition de tests d’immunocapture (Escherichia Coli,) ou de détection via la technique ELISA(Listeria, Salmonelles, Toxines de Staphylocoques), automatisés, destinés à la sécurité alimentaire. Les Listeria, cause de contamination de divers produits alimentaires, ainsi que dans des échantillons environnementaux prélevés, en particulier, dans des usines de transformation des aliments. Chez l'homme, Listeria monocytogenes peut provoquer une méningite, une septicémie, une encéphalite et des avortements. Les groupes les plus exposés sont les femmes enceintes, les nouveau-nés, les patients immunodéprimés et les personnes âgées. Des Salmonella, qui sont l’une des principales causes d’intoxication alimentaire. Lorsque des protocoles longs et fastidieux sont utilisés, la recherche des Salmonella peut nécessiter jusqu’à cinq jours pour confirmer qu’un échantillon est négatif. Des Escherichia coli O157 (H7) est une cause reconnue de colite hémorragique qui a été impliquée dans de nombreuses épidémies au Japon, aux États-Unis, au Canada, au Royaume-Uni et en Belgique. Dans près de 10 % des cas, l’infection conduit à des problèmes rénaux aigus (syndrome urémique hémolytique). Les enfants de moins de cinq ans et les personnes âgées y sont le plus sensibles. Des entérotoxines staphylococciques, qui comptent parmi les causes les plus courantes d'intoxication alimentaire.

Procédures

Tous les gestes sont réalisés sur animal vigile. 6 à 8 injections durant toute la vie de l’animal (1 minute 30 par injection). Prélèvement de sang pour contrôle du titre : 15 secondes 4 fois par an. Prélèvement de sang pour la production de sérum : 5 minutes par prélèvement – contention 15 minutes à raison de maximum de 6 prélèvements par an.

Impact sur les animaux

Un stress de courte durée correspondant à la contention pour les injections (environ 3 minutes) Une douleur d’une courte durée liée à la première injection de l’émulsion de l’antigène avec de l’adjuvant huileux peut apparaitre chez l’animal, car cet adjuvant peut entrainer des inflammations locales au point d’injection. Si présence, elles sont suivies quotidiennement et traitées si besoin par un protocole de traitement adapté. Un stress de courte durée correspondant à la durée du prélèvement et de la contention (environ 15 minutes) est possible. Néanmoins, la fréquence des prélèvements entraine une certaine habituation des animaux permettant une diminution du stress.

Devenir

A l’issue de la procédure, tous les animaux sont gardés jusqu’à la fin de leur vie.

Remplacement

Indisponibilité de modèle in vitro performant pour la production d’anticorps contre les antigènes bactériens considérés ayant les caractéristiques nécessaires (spécificité, avidité, affinité) pour un dosage ELISA ou un enrichissement par immunocapture sur automate.

Réduction

L'effectif des animaux est adapté au plus juste pour répondre aux prévisions de production. La plupart de ces animaux sont issus de l’élevage classique et reclassés car inaptes à la production initiale à laquelle ils étaient destinés dans leur élevage d’origine.

Raffinement

Les moutons sont hébergés en groupe de 4 à 6 animaux, sur litière, ceci leur assurant une vie sociale adaptée à l'espèce et garantissant un enrichissement efficace. Les conditions d’hébergement des animaux sont définies pour favoriser la réduction du stress. Le foin est accessible à volonté via un râtelier leur permettant d’avoir des moyens de grimper. Un granulé spécifique supplémenté leur est administré, et des cures d’aliments supplémentés leur est apporté durant le protocole. Une surveillance renforcée de l’état général des animaux est réalisée durant les jours suivant l’injection dont l’alimentation, la locomotion, l’isolement vis-à-vis de ses congénères. Si besoin une prise de température est réalisée et un traitement anti-douleur est administré. Toute dégradation de l’état général de l’animal déclenche la mise en place d’un protocole de soin adapté.

Choix des espèces

Le mouton est une espèce documentée et classiquement utilisée pour la production d'anticorps polyclonaux. Bien que présentant une grande hétérogénéité, les anticorps polyclonaux sont très spécifiques de l'antigène injecté et très sensibles en raison du nombre d’épitopes différents qu'ils reconnaissent. Les quantités de sérum obtenues avec les moutons sont importantes, présentent des taux élevés d’anticorps ayant une forte affinité vis à vis de l'antigène injecté et correspondent aux volumes souhaités. Les animaux utilisés sont des jeunes mâles adultes afin de permettre le prélèvement de volumes sanguins (donc de sérums hyper-immuns) suffisamment importants pour la réalisation des diagnostics visés par l’étude. Ces moutons sont castrés très jeunes afin de garantir une sociabilité optimale et d'éviter les problèmes comportementaux des mâles.

100 porcs et 100 brebis vont être utilisés dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, tous mis à mort pour une évaluation nécropsique et histologique. Les animaux subissent des prélèvements sanguins hebdomadaires puis des chirurgies sous anesthésie générale pouvant durer plusieurs heures, avec pose de dispositifs implantables et douleur postopératoire de plusieurs jours. Le projet teste des implants et des techniques chirurgicales pour la gynécologie et l'obstétrique, le porc servant de modèle pour la glande mammaire, la brebis pour l'appareil urogénital. Le porteur écrit avoir fixé les effectifs sans aucune analyse statistique, au "minimum nécessaire" selon sa propre estimation.

Objectifs

La Santé de la Femme regroupe l’ensemble des spécialités de la médecine s’intéressant à diagnostiquer et/ou soigner les pathologies et les affections gynécologiques, sénologiques, les troubles obstétricaux, les dysendocrinies, l’infertilité et les pathologies de la glande mammaire et du sein comme le cancer et ses conséquences, ce domaine de la santé s'interesse aussi au suivi des cycles hormonaux physiologiques, au diagnostic et au suivi du bon déroulé de la grossesse par exemple. Le développement des techniques et méthodes d’imagerie et de chirurgie interventionnelles, l’essor de la thérapie génique et cellulaire ou la découverte et l’amélioration des connaissances vis-à-vis de nouvelles entités pathologiques comme par exemple l’endométriose dont la lutte est une stratégie nationale depuis 2021, permettent d’envisager le développement de nouvelles techniques chirurgicales et dispositifs médicaux implantables pour améliorer la santé des patientes, et parfois aussi celle du fœtus ou du nourrisson. On entend par dispositif implantable tout dispositif destiné à être implanté de façon invasive en totalité dans le corps humain ou à remplacer une surface épithéliale grâce à une intervention chirurgicale et à demeurer en place après l'intervention. L'évaluation et le développement des nouveaux dispositifs, méthodes et techniques, pour le diagnostic et/ou le traitement des pathologies gynécologiques, obstétricales et sénologiques par des méthodes de chirurgie standard et mini-invasives requièrent une phase pré-clinique de recherche et de développement. La réponse tissulaire et les modifications anatomophysiologiques au cours des cycles ne peuvent être simulés à l’heure actuelle par des méthodes de remplacement. Durant ce projet le recours à l’animal vivant pour évaluer les différentes versions de prototypes pour reproduire fidèlement les contextes clinique, fonctionnel, anatomique et tissulaire qui seront visés par les applications chez les patientes est indispensable. Les objectifs du projet sont doubles : raffiner les prototypes pour en geler les versions jugées efficaces (efficacité) et sécuritaires (innocuité) dans sa phase initiale, puis ces versions entreront alors dans la phase règlementaire du projet pour valider les dispositifs/méthodes/techniques selon la règlementation en vigueur (ISO 10993, BPL OCDE, GLP FDA 21 CFR part 58).

Bénéfices attendus

L'avantage escompté et les bénéfices attendus sont une amélioration de la prise en charge des patientes, une amélioration de la durabilité, de l’efficacité et de la sécurité des implants pour améliorer leur tolérance et éviter leur rejet et ainsi les ré opérations parfois multiples des patientes, pour réduire les temps de cicatrisation et le traumatisme tissulaire, corollaires de ces interventions et qui handicapent les patientes, ainsi que l'occurrence d'effets indésirables comme les infections grâce au recours à des méthodes d'implantation mini-invasives. Un autre avantage important des techniques mini-invasives est de permettre une récupération plus rapide des patientes avec des durées d'hospitalisation et de convalescence réduites.

Procédures

Les animaux seront soumis aux interventions suivantes : - Des prélèvements sanguins sur animaux vigiles ou légèrement sédatés, pour tous les animaux du projet. La fréquence des prélèvements pouvant être couramment d’un prélèvement par semaine et d'une durée de moins de cinq minutes - Des préparations à l’anesthésie pour les examens d'imagerie et d'implantation chirurgicale qui consistent en la pose d'un cathéter et en l'injection des produits utilisés pour la prémédication et l'anesthésie. Durée de moins de dix minutes. Comme pour les interventions chez l'Homme, les interventions chirurgicales et les examens d'imagerie sont toujours réalisés sous anesthésie générale (évitant tous stress et douleur pour les animaux) et pourront durer jusqu'à plusieurs heures en cas d’intervention chirurgicale complexe pour tous les animaux du projet.

Impact sur les animaux

Les nuisances ou effets indésirables attendus sur les animaux sont exactement les mêmes que ceux attendus sur un futur patient humain : - La faim ,lors de la mise à jeun (12 heures pour les porcs, 12 à 16 heures pour les ovins) de l’animal préalablement à l’anesthésie, - Le stress physique induit par la contention/manipulation/pose de cathéter au moment de la préparation de l’anesthésie, - En fonction des besoins et préalablement à la procédure d'évaluation du dispositif, l'induction d'une lésion à la faveur d'une intervention chirurgicale mini-invasive, - La douleur en phase postopératoire : jusqu'à plusieurs jours en fonction de l’invasivité de la technique, pour ces derniers points, des mesures de raffinement sont mises systématiquement en place pour minimiser ces effets (comme par exemple le recours systématique à l'anesthésie générale avec prise en charge multimodale de l'analgésie per, et post-opératoire avec l'usage systématique de traitements anti-inflammatoires et anti-douleur opiacés avec ajout d'anesthésique locaux pour certaines actes chirurgicaux, la protection et la surveillance des plaies, la surveillance du reveil d'anesthésie dans des espaces calmes et spécialement aménagés avec évaluation et scoring de la douleur réguliers, ou la mise en place d'un suivi clinique quotidien des animaux avec surveillance des signes de douleur par des Techniciens spécialement formés supervisés par des Véterinaires).

Devenir

Pour toutes les procédures du projet, la nécessité de collecter des données scientifiques se fera au niveau clinique, au niveau biologique (hématologie et biochimie par exemple), au niveau fonctionnel (données issues des scanners, IRM par exemple) et enfin au niveau tissulaire par la réalisation d'une évaluation nécropsique et d'une évaluation histopathologique après euthanasie des animaux qui déterminera la tolérance locale et générale ainsi que l’altération du dispositif (durabilité). La bonne réalisation de ce suivi règlementaire garantit donc une évaluation complète et des dispositifs testés dans le projet.

Remplacement

La validation des dispositifs médicaux implantables et des méthodes techniques innovantes dans ce projet requiert la vérification de la sécurité et de l’efficacité des implants. Le recours à l’animal vivant pour évaluer les différentes versions de prototypes afin de reproduire fidèlement les contextes clinique, fonctionnel, anatomique et tissulaire qui seront visés par les applications chez les patients est indispensable. En effet leur utilisation in fine chez les patients représente des procédures à haut risque létal et il est donc indispensable d’avoir recours à l’expérimentation animale au préalable afin de vérifier le bon fonctionnement des dispositifs et des méthodes d’implantation, leur innocuité et leur durabilité. L’expérimentation sur l’organisme entier, et donc sur l'animal vivant est incontournable, c’est une obligation règlementaire dans le cadre de l’évaluation des dispositifs médicaux implantables.

Réduction

Le nombre d’animaux a été évalué prospectivement et réduit au minimum nécessaire pour répondre aux besoins et objectifs scientifiques du projet, aucune approche statistique n'a été réalisée. Pour réduire le nombre d’animaux, des sélections par méthodes d’imagerie non invasives sont mises en place (IRM, Scanner, Echographie, RX …), permettant par exemple une reconstruction 3D des structures d’intérêt. Un bilan intermédiaire en cours de projet sera effectué pour s’assurer de la pertinence de cette estimation.

Raffinement

Les modèles animaux suivront exactement le cheminement d’un futur patient avec les mêmes exigences et techniques médicales mises en oeuvre pour la réalisation des interventions (personnel hautement qualifié, plateaux techniques opératoires et d’imagerie de pointe). L’ensemble des procédures est conçu pour réduire au maximum le stress, l’angoisse et les contraintes sur les animaux comme le recours systématique à l’anesthésie générale durant les interventions d’imagerie et les procédures chirurgicales. La localisation de la plateforme d'imagerie sur le site même des animaleries permet de réaliser ces examens sur place, réduisant ainsi le recours aux transports pour les animaux et le stress associé. Les paramètres vitaux sont enregistrés et contrôlés par des techniciens spécialisés en anesthésie afin d’adapter les perfusions, l’assistance respiratoire et les dosages d’anesthésiques et d’antalgiques. Un suivi de la température est réalisé pendant toute la procédure d'implantation chirurgicale et des dispositifs de maintien de la normothermie tels que le système de couverture de réchauffement Bair Hugger© ou des tapis chauffants sont utilisés. Les protocoles de réanimation sont standardisés et réalisés par des vétérinaires chirurgiens spécialisés. Pendant et après ces procédures, des protocoles de prise en charge mult imodale de la douleur sont systématiquement appliqués. Les animaux sont hébergés systématiquement en groupe sociaux ou individuellement pour les besoins de l'étude, ils ont accès à un enrichissement environnemental multimodal (social, alimentaire, manipulatoire et physique) et dans des conditions environnementales d'hébergement contrôlées et maîtrisées (température et ventilation). Des points limites stricts et spécifiques sont appliqués tout au long du projet. Les transports d'animaux réalisés entre les 2 EU (35 km) seront réalisés à l'aide de véhicules de types camionnettes fermées ayant reçu une autorisation AT1 délivrée par la DDPP, ventilés, climatisés et spécialement équipés pour le transport des animaux vivants (dispositifs d'abreuvement, tapis antidérapants ou cages de transport, suivi et enregistrement des températures lors des trajets, système de surveillance vidéo des animaux). Les personnels en charge sont formés et titulaires du certificat de convoyeur (CCTROV) et le transport est validé par un Vétérinaire. Un bilan intermédiaire en cours de projet sera effectué pour évaluer les dommages réellement subis par les animaux.

Choix des espèces

Les dispositifs testés dans ce projet doivent l’être sur une anatomie semblable à celle de l’Homme avec les mêmes dimensions. Le porc est par son nombre de mammelles le modèle de choix pour l'évaluation de dispositifs interessant la glande mammaire, le modèle brebis possède une anatomie de la sphère urogénitale et de son appareil suspenseur plus proche de ceux de la Femme. Les modèles utilisés ont fait l'objet d'études similaires et sont considérés comme appropriés à cette fin. - La taille relative de ces modèles animaux permet une visualisation à l'aide d'équipements de chirurgie interventionnelle et d'imagerie standards utilisés chez l'Homme. - L'ovin est le modèle pertinent pour l'évaluation de la durabilité des dispositifs chez l'Homme. Les animaux utilisés pourront être des juvéniles ou adultes. L’objectif scientifique est d’avoir une anatomie de taille ou une situation clinique comparable à celle observée chez la Femme.

Opérées pour une dénervation musculaire, parfois alors qu'elles sont gestantes, 1 048 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, toutes mises à mort pour l'analyse de leurs tissus. Les animaux subissent des injections, des chirurgies sous anesthésie, des tests comportementaux d'une heure, un électromyogramme et une mesure de force, la chirurgie pouvant provoquer douleurs, infection et boiterie. Le projet étudie la jonction entre le nerf et le muscle, en vue de comprendre des maladies neuromusculaires rares comme les syndromes myasthéniques congénitaux. Le porteur décrit ces syndromes comme touchant une personne sur 250 000, situant le bénéfice attendu à distance de l'atteinte infligée.

Objectifs

La jonction neuromusculaire (JNM) est la zone de contact entre les neurones moteurs et les muscles striés squelettiques qu'ils innervent. Cette synapse est responsable de l'initiation et du contrôle du mouvement. Le dysfonctionnement de cette synapse entraîne un défaut de la transmission nerf muscle, avec des conséquences dramatiques sur notre capacité à contracter nos muscles, à nous mouvoir ou tout simplement à respirer. Décrypter comment la JNM acquiert sa morphologie complexe et régule sa communication nerf/muscle au cours du développement embryonnaire et tout au long de la vie est essentiel pour comprendre comment le système nerveux fournit le lien entre les pensées et les actions, en relayant des messages qui voyagent si vite que nous ne les remarquons même pas. Compte tenu de la complexité de ces connexions spécifiques, même des défauts subtils dans les événements moléculaires entraînant l'attachement nerf muscle sont à la base d'un large éventail de troubles neurodéveloppementaux affectant en particulier le système neuromusculaire. Par conséquent, l'étude des mécanismes moléculaires qui sous-tendent la formation et la maintenance de la JNM est essentielle pour comprendre les mécanismes impliqués et restaurer une connectivité synaptique appropriée dans les pathologies de la JNM.

Bénéfices attendus

Les bénéfices de ce projet vont de l’élucidation, in vivo, des mécanismes moléculaires physiopathologiques qui sous-tendent la formation et la maintenance de la jonction neuromusculaire (JNM) chez les mammifères, jusqu’à la création d’une base solide pour le développement d’essais cliniques chez des patients atteints de certaines pathologies neuromusculaires comme par exemple les syndromes myasthéniques congénitaux (SMC). Les SMC sont des maladies rares (1 personne sur 250 000) causées par la mutation d'un ou plusieurs gènes impliqués dans la formation et la maintenance de la jonction neuromusculaire.

Procédures

Au cours du projet, une partie des animaux recevront des injections non répétées apres anesthésie (générale et locale) et analgésie. Des femelles gestantes subiront une procédure chirurgicale anesthésie et analgésie (générale et locale) suivie d'une injection non répétée pour une durée de 10 minutes par animal. L'ensemble des animaux du projet effectueront tests comportementaux totalisant une durée d'une heure de tests par animal. De plus, un électromyogramme unique d'une durée de 10 minutes sera réalisé sur animaux anesthésiés et analgésiés. Enfin l'ensemble des animaux du projet subiront un test de mesure de force (10 minutes) apres anesthésie et analgésie de l'animal et sera ensuite euthanasié. Une autre parti des animaux subira une procédure chirurgicale apres anesthésie et analgésie (générale et locale) d'une durée de 20 minutes maximum par animal. A la fin de le période de maintien, les animaux seront euthanasiés pour des prévelement tissulaires suivis d'analyses cellulaires et moléculaires.

Impact sur les animaux

Les expérimentations réalisées sur les animaux nécessitent leur manipulation (injections, tests comportementaux), ce qui engendre un stress de courte durée pour l’animal. Les injections et éléctromyogrammes peuvent induire une douleur locale également de courte durée. Les différentes anesthésies réalisées peuvent entraîner une baisse de la thermorégulation et, dans de rares cas, une détresse cardiorespiratoire. La chirurgie visant une dénervation musculaire peut engendrer des douleurs, des risques d’infection postopératoire ainsi qu’une boiterie.

Devenir

L'euthanasie est, dans ce projet, strictement nécessaire pour l'analyse phénotypique au niveau cellulaire et moléculaire des animaux impliqués et est réalisée selon des méthodes réglementaires.

Remplacement

L'étude de la formation et de la maintenance de la jonction neuromusculaire (JNM) est un processus complexe incluant pléthore d'acteurs cellulaires et moléculaires ne pouvant pas être modélisés in vitro. La qualité de la mise en place de la jonction neuromusculaire et de sa maintenance a des conséquences physiologiques qui nécessitent l’analyse de paramètres physiques, moteurs, propres aux animaux vivants. Cependant, une partie des études in vivo est complétée par des méthodes de (co-)culture cellulaire cherchant à mimer le développement de la JNM dans le but d'évaluer le rôle d'acteurs moléculaires sur celui-ci.

Réduction

Au total, 1048 animaux sont impliqués. Ce nombre est calculé et strictement limité afin d'avoir une puissance statistique suffisante permettant de montrer la significativité d'une différence lorsque celle-ci existe et d'obtenir des résultats fiables. Le calcul de puissance est réalisé avec un logiciel statistique dédié à cet effet. Par ailleurs, diverses cultures et co-cultures cellulaires sont mises en œuvre afin de limiter au maximum l’utilisation d’animaux.

Raffinement

Les conditions d’hébergement sont conformes à la réglementation. Les animaux sont hébergés avec leurs congénères (l’hébergement individuel étant limité au maximum) en portoirs ventilés, avec un système d’abreuvement automatique et un accès ilimité à la nourriture et à l’eau. Le milieu est enrichi avec au moins deux enrichissements, et les animaux sont vérifiés quotidiennement. Le projet a été conçu de manière à permettre une interprétation fiable des résultats dans le respect du bien-être animal. Les études comportementales reposent sur les comportements spontanés propres aux animaux. L’évaluation motrice est réalisée après différentes phases d’habituation (à l’expérimentateur et aux tests), permettant de minimiser le stress associé aux manipulations répétées. La majorité des actes techniques sont réalisés sous anesthésie et analgésie. Pour les chirurgies, une analgésie post opératoire sera également mise en place. Ainsi, la douleur et le stress sont limités grâce à des soins adaptés et une surveillance attentive, accompagnée de points limites suffisamment prédictifs et précoces. Le protocole mis en place est optimisé pour respecter le bien-être des animaux et pour réduire la durée de l’expérimentation au minimum.

Choix des espèces

Le développement des techniques d’imagerie et de transgénèse chez la souris rend cet animal le plus adapté à l’identification et à l’étude de nouvelles molécules impliquées dans la formation et la maintenance de la jonction neuromusculaire (JNM). Les animaux sont des souris agées de 20 à 180 jours pour les études comportementales et l’analyse des étapes de maintenance de la JNM.