Procédures modérées

Tous tués pour que leur cerveau soit disséqué, 2 040 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils reçoivent jusqu'à neuf injections de cocaïne, de morphine, de MDPV ou de sérum physiologique, puis passent un test de préférence de place conditionnée, un labyrinthe en Y, une croix surélevée, et un test de préférence au sucrose qui les isole 48 heures. Mâles et femelles sont comparés dans leur réponse à ces drogues et dans la rechute. Le porteur justifie le choix du rat par sa docilité, une espèce "bien adaptée aux manipulations répétées", et par un cerveau plus gros que celui de la souris, qui facilite les dissections.

Objectifs

L’addiction aux drogues représente un problème important de santé publique. Certaines substances, comme la cocaïne ou la morphine, peuvent entraîner une dépendance et avoir des conséquences graves sur la santé, la vie sociale et le bien-être des personnes concernées. Malgré les traitements existants, de nombreuses personnes rechutent après avoir arrêté leur consommation. Les drogues modifient durablement le fonctionnement du cerveau, en particulier dans les régions impliquées dans le plaisir, la motivation, l’apprentissage et la mémoire. Ces modifications favorisent la poursuite de la consommation et augmentent le risque de rechute. Des différences ont également été observées entre les hommes et les femmes dans leur sensibilité aux effets des drogues et dans leur risque de rechute, mais les mécanismes responsables de ces différences restent encore mal connus. Afin de mieux comprendre ces phénomènes, ce projet utilisera un modèle animal largement reconnu dans la recherche sur l’addiction. Sur une durée de cinq ans, il permettra d’étudier chez le rat comment la cocaïne, la morphine et la MDPV modifient le comportement et le fonctionnement du cerveau, d’identifier les mécanismes impliqués dans la rechute après l’arrêt de la consommation, et de mieux comprendre les différences observées entre mâles et femelles face aux drogues.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus de ce projet concernent une meilleure compréhension des mécanismes impliqués dans l’addiction aux drogues. Les substances étudiées, notamment la cocaïne, la MDPV et la morphine, sont associées à des conséquences importantes sur la santé et à un risque élevé de rechute après l’arrêt de la consommation. À court terme, ce projet permettra de mieux comprendre comment ces substances modifient le fonctionnement du cerveau et influencent les comportements liés à la recherche et à la consommation de drogue. Il permettra également d’étudier les conséquences de ces substances sur certaines fonctions telles que la mémoire, les émotions et les comportements associés à l’anxiété, ainsi que les différences observées entre mâles et femelles. À plus long terme, les connaissances acquises pourraient contribuer à une meilleure compréhension des mécanismes responsables du développement et du maintien des addictions chez l’être humain. Ces résultats pourraient participer à l’identification de nouvelles pistes thérapeutiques et au développement de stratégies visant à prévenir les rechutes et à améliorer la prise en charge des personnes souffrant de troubles liés à l’usage de substances psychoactives.

Procédures

Les animaux seront soumis à des administrations répétées de substances. Les interventions prévues sont : 8 injections de sérum physiologique ou de drogue au cours de la phase de conditionnement ; 1 injection supplémentaire pour les animaux participant à la phase de rechute ; test de préférence de place conditionnée : prétest, test, séances de retrait et test de rechute (18 à 30 minutes par session) ; tests comportementaux complémentaires : labyrinthe en Y (10 minutes ou 2 × 5 minutes), croix surélevée (5 minutes) ; test de préférence au sucrose avec hébergement individuel temporaire pendant 48 heures.

Impact sur les animaux

Les nuisances attendues dans ce projet sont principalement liées aux injections répétées de substances psychoactives ainsi qu’aux procédures comportementales réalisées chez les animaux vigiles. Les injections peuvent entraîner un stress léger ainsi qu’une douleur légère et transitoire de quelques secondes au moment de l’injection. L’administration des psychostimulants peut induire une augmentation transitoire de l’activité locomotrice, de la température corporelle ainsi qu’une augmentation du rythme cardiaque. L’administration de morphine peut entraîner une diminution transitoire de l’activité locomotrice, une légère hypothermie ainsi qu’une faible dépression respiratoire. L’intensité et la durée de ces effets varient selon la substance administrée et la sensibilité des animaux. Pour une partie des animaux, une phase de retrait puis une phase de rappel seront réalisées après arrêt du traitement. La phase de retrait peut être associée à un stress léger lié à l’arrêt de l’exposition à la substance. La phase de rappel nécessitera une administration supplémentaire de drogue ou de sérum physiologique pouvant entraîner un stress léger et une douleur transitoire liée à l’injection. Les tests comportementaux sont non invasifs et peuvent induire un stress léger à modéré lié à la manipulation des animaux, à leur exposition à un nouvel environnement ainsi qu’à un isolement temporaire lors de certaines évaluations comportementales. Dans le cadre des procédures terminales, les animaux seront anesthésiés profondément avant la mise à mort conformément à la réglementation en vigueur. L’administration des anesthésiques entraînera une perte progressive de conscience et l’abolition des réflexes nociceptifs avant la mise à mort.

Devenir

La réutilisation des animaux est impossible en raison de la récupération post-mortem de certaines régions cérébrales.

Remplacement

Les mécanismes impliqués dans l’addiction reposent sur des interactions complexes entre le comportement, l’environnement et le fonctionnement du cerveau. Ces phénomènes ne peuvent pas être reproduits de façon satisfaisante uniquement à l’aide de cellules cultivées en laboratoire ou de modèles informatiques. Ces méthodes permettent d’étudier certains mécanismes biologiques, mais elles ne permettent pas d’observer des comportements complexes tels que la recherche de drogue, la motivation à consommer ou la rechute. L’utilisation d’un animal vivant est donc nécessaire pour étudier simultanément les effets des drogues sur le comportement, la mémoire, les émotions et le fonctionnement du cerveau. Le rat est un modèle couramment utilisé dans la recherche sur les addictions car certains circuits cérébraux impliqués dans la récompense et la motivation fonctionnent de manière comparable à ceux de l’être humain. Les rats Sprague-Dawley ont été choisis car ils sont largement utilisés dans ce type d’étude, sont faciles à manipuler et présentent une bonne adaptation aux tests comportementaux. Leur utilisation fréquente dans la littérature permet également de comparer plus facilement les résultats obtenus avec ceux d’autres études.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisé dans ce projet a été réduit au minimum nécessaire afin d’obtenir des résultats statistiquement interprétables tout en respectant le principe de réduction des 3R. Les effectifs expérimentaux ont été déterminés à partir des données de la littérature scientifique, des expériences précédemment réalisées au sein du laboratoire ainsi que de calculs de puissance statistique lorsque cela était nécessaire. Pour les différents tests comportementaux et prélèvements à réaliser dans les procédures expérimentales, les effectifs ont été déterminés et les résultats analysés à l’aide de tests statistiques adaptés. De plus, certaines évaluations comportementales ne seront pas reproduites pour l'étude comportementale, des données équivalentes ayant déjà été obtenues précédemment au laboratoire, permettant ainsi de réduire le nombre total d’animaux utilisés.

Raffinement

Dans le but d’appliquer le principe de raffinement, une surveillance régulière des animaux ainsi que des visites quotidiennes au sein de l’animalerie seront mises en place afin d’identifier rapidement toute situation de douleur, de souffrance ou d’altération du bien-être animal. Des points limites adaptés seront appliqués tout au long des procédures expérimentales. Afin de limiter le stress lié aux manipulations et aux conditions expérimentales, les animaux bénéficieront d’une période d’acclimatation à l’animalerie ainsi que d’une habituation progressive à l’expérimentateur. Les rats, espèce sociale, seront hébergés par deux afin de limiter le stress lié à l’isolement. Les cages comprendront une litière adaptée à base de copeaux de bois assurant le confort des animaux. Dans le cadre de ce projet portant sur les comportements addictifs, les conditions d’hébergement seront standardisées entre les groupes expérimentaux afin de limiter l’influence de facteurs environnementaux sur les paramètres comportementaux étudiés.

Choix des espèces

Le rat constitue un modèle de référence dans le domaine des neurosciences et de l’étude des troubles psychiatriques, notamment des addictions. En tant que mammifère vertébré, il possède des circuits cérébraux impliqués dans la récompense, la motivation et les comportements liés à la recherche de drogue présentant une forte proximité fonctionnelle avec ceux de l’humain. Le rat est également une espèce docile et sociable, bien adaptée aux manipulations répétées et aux études comportementales. Les modèles d’addiction chez le rat, notamment les paradigmes de préférence de place conditionnée, sont largement validés et utilisés dans la littérature scientifique. Enfin, comparativement à d’autres modèles comme la souris, le rat possède un volume cérébral plus important facilitant les dissections de structures cérébrales spécifiques et les analyses moléculaires prévues dans ce projet. Nous utiliserons des rats jeunes adultes, âgés de 8 à 9 semaines au début des expérimentations. Ce stade de développement a été choisi car il correspond à une période de maturation cérébrale et comportementale stable, largement utilisée dans les études précliniques portant sur les drogues d’abus et les comportements addictifs. L’utilisation de jeunes adultes permet de limiter les variations physiologiques liées au développement ou au vieillissement pouvant influencer les réponses comportementales et neurobiologiques étudiées. Ce choix est également fondé sur les données de la littérature scientifique ainsi que sur les expériences précédemment réalisées au sein du laboratoire dans des paradigmes similaires de préférence de place conditionnée et d’étude des phénomènes de rechute. L’utilisation d’animaux du même âge permet ainsi de garantir la comparabilité, la reproductibilité et la robustesse des résultats obtenus. Par ailleurs, les rats jeunes adultes présentent une bonne tolérance aux manipulations expérimentales répétées et sont particulièrement adaptés aux études comportementales réalisées dans ce projet.

Ovariectomisées, opérées deux à quatre fois, soumises à jusqu'à trois distensions vaginales de quatre heures sous anesthésie, 720 rates et 720 souris seront toutes tuées, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le laboratoire teste pour des clients des candidats médicaments contre les symptômes de la ménopause, dont il dit ne connaître "ni la nature ni les effets secondaires possibles", à raison de trois études par an et par espèce. Les 1 440 rongeurs passent aussi jusqu'à deux sessions de 24 heures par semaine seuls en cage à métabolisme, pendant six mois au plus. Le porteur qualifie la distension vaginale de geste non douloureux, sans analgésique, alors qu'elle sert à provoquer des traumatismes des tissus pelviens et peut laisser une incontinence. Il fixe huit rongeurs par groupe sans aucun test statistique.

Objectifs

L’objectif de ce projet est d’évaluer les effets fonctionnels et morphologiques de candidats médicament sur l’appareil urinaire dans un modèle mimant la ménopause. Nous pensons réaliser 3 études par an et par espèce, soit sur 5 ans 30 études.

Bénéfices attendus

Le projet permettra de tester de nouveaux candidats médicaments pour trouver de nouvelles molécules plus efficaces et avec moins d’effets secondaires que les molécules utilisées actuellement pour traiter les symptômes de la ménopause.

Procédures

Les animaux vont recevoir des traitements pharmacologiques ou hormonaux (fréquence dépendante de chaque protocole expérimental pouvant aller de quelques jours à 6 mois selon les procédures) donc vont être manipulés régulièrement. Chaque administration classique durera 30 sec – 1 min en moyenne. DES ADMINISTRATIONS PARTICULIERES SOUS ANESTHESIE POURRONT DURER JUSQU’A 3H MAXIMUM. Ils pourront également subir plusieurs chirurgies allant de 10 à 30 minutes environ. Au maximum, les animaux auront 4 chirurgies et 2 au minimum. LES ANIMAUX SUBIRONT 3 DISTENSIONS VAGINALES MAXIMUM DE 4H AU MAXIMUM AVEC AU MOINS 1 SEMAINE ENTRE CHAQUE (SOUS ANESTHESIE). Les animaux iront dans des cages à métabolisme pour la collecte d’urine où ils seront en cage individuelle pendant 24H. Selon le protocole expérimental, plusieurs sessions de cages à métabolisme pourront être réalisées mais pas plus de deux par semaine sur une période de 6 mois maximum. Des prélèvements sanguins sur animal vigile pourront être réalisés à la queue ou à la veine saphène (1 prélèvement maximum par semaine sur un suivi total de 6 mois d’expérimentation). Sur animal anesthésié, des prélèvements terminaux pourront être réalisés. La fréquence des prélèvements est dépendante de chaque protocole expérimental et peut aller de 1 à 24 (1 prélèvement par semaine pendant 6 mois). Ces gestes étant réalisés par du personnel qualifié seront rapides (5 min max).

Impact sur les animaux

Nous testons des molécules clients dont nous ne connaissons ni la nature ni les effets secondaires possibles, il nous est, pour cette raison, difficile d’anticiper les nuisances pour les animaux dues aux candidats médicaments. Cependant, nos clients ont déjà des données sur l’innocuité des doses utilisées et les doses testées n’engendrent pas d’effets toxiques. Toutefois, des manipulations, administrations répétées, prélèvements de sang, anesthésies sur les animaux peuvent provoquer du stress, une légère douleur (douleur de l’aiguille). Les animaux auront des chirurgies pour mimer la ménopause ou pour les traitements hormonaux, par conséquent, les animaux pourront avoir les mêmes symptômes cliniques que chez l’homme (humeur et comportement changeants notamment avec les hormones). De plus, toute chirurgie peut provoquer des douleurs, des saignements, un certain mal-être. L’AJOUT D’UNE DISTENSION VAGINALE POUR INDUIRE DES TRAUMATISMES TISSULAIRES PELVIENS IMPLIQUE UNE PROCEDURE EXPERIMENTALE NON DOULOUREUSE MAIS LONGUE SOUS ANESTHESIE, CE QUI PEUT PROVOQUER UN MAL-ETRE A L’ANIMAL ET DES TROUBLES URINAIRES PAR LA SUITE (AUGMENTATION DE LA FREQUENCE DES MICTIONS, INCONTINENCE). L’AJOUT D’UNE VOIE D’ADMINISTRATION NON DOULOUREUSE SOUS ANESTHESIE PEUT PROVOQUER UN MAL-ETRE A L’ANIMAL, NOTAMMENT LORS DE SON REVEIL. De plus, les animaux vont être mis dans des cages à métabolisme donc isolés de leurs congénères pendant un certain temps pouvant induire un état de stress. Le modèle utilisé ici est un modèle mimant « la ménopause » et plus particulièrement son influence sur la fonction vésicale. Les animaux pourront avoir les mêmes symptômes que ceux rencontrés chez l’Homme à savoir une augmentation des mictions par jour avec de faible volume urinaire voir une incontinence.

Devenir

Tous les animaux de l’expérience seront mis à mort car la dernière intervention de cette procédure se réalise sous anesthésie sans réveil et des organes seront collectés pour des analyses histologiques.

Remplacement

Aujourd’hui il n’existe pas de thérapie pharmacologique efficace pour le traitement des symptômes de la ménopause. Actuellement, aucun modèle in silico, in vitro ou ex vivo ne peuvent mimer les symptômes dans son ensemble et dans sa complexité. Ces limitations rendent incontournables le recours à l’expérimentation animale pour tester l’efficacité de nouveaux candidats médicaments ou nouvelles hormonothérapies.

Réduction

Nous avons établi une stratégie d’expérimentation nous permettant dans la mesure du possible, de mesurer la valeur basale de chaque animal (l’animal est son propre contrôle) pour certains paramètres. Pour mesurer certains paramètres, nous utilisons des méthodes non invasives telles que des cages métaboliques. Cette stratégie permet donc de réduire sensiblement le nombre d’animaux par groupe. La méthode nous permettant d’analyser la fonction vésicale et principalement la fuite urinaire se réalise sur des animaux anesthésiés (anesthésie sans réveil), ne provoquant pas de douleur aux animaux. Aucun test statistique pour déterminer la taille des lots n’a été fait mais en considérant la variabilité interindividuelle des animaux (et en accord avec ce qui a déjà été publié par des équipes scientifiques et leurs résultats obtenus et notre expérience sur ce modèle) nous conduit à dimensionner les groupes de traitement avec des effectifs de 8 animaux par groupe afin d’envisager des différences statistiquement significatives entre les groupes de traitement.

Raffinement

Dès leur arrivée dans la zone d’exploration fonctionnelle, les animaux seront hébergés dans des conditions définies par la directive européenne 2010/63/UE et auront une phase d’acclimatation de 3-4 jours minimum avant d’être manipulés. Un enrichissement (type tunnel, igloo, aspen brick, carré de coton) sera introduit dans l’hébergement des animaux. L’état des animaux sera suivi quotidiennement par du personnel compétent afin de s’assurer de leur bien-être et de l’absence de symptômes tels que prostration, perte de poids, difficulté à se mouvoir, s’alimenter, boire, piloérection, présence de blessure avant d’atteindre des points limites… En accord avec la règle de raffinement, les procédures chirurgicales seront réalisées sous anesthésie générale avec maintien de la température corporelle via l’utilisation de plaque chauffante thermo-régulée afin d’éviter toute hypothermie. Après chaque intervention chirurgicale, une attention particulière sera apportée sur le réveil des animaux et l’absence d’agressivité vis-à-vis de ses congénères. Des antalgiques seront administrés lors des chirurgies afin de limiter la douleur des animaux. LES ACTES EXPERIMENTAUX AJOUTES SE FERONT SOUS ANESTHESIE EN UTILISANT DES PLAQUES CHAUFFANTES THERMOREGULEES POUR EVITER TOUTE HYPOTHERMIE ET UTILISATION DE GEL OCCULAIRE POUR EVITER LA DESHYDRATATION DES YEUX LORS DE L’ANESTHESIE. LES ACTES EXPERIMENTAUX AJOUTES NE NECESSITENT PAS L’UTILISATION D’ANALGESIQUE (GESTES NON DOULOUREUX).

Choix des espèces

Ces procédures seront effectuées chez l’animal sauvage et chez des animaux transgéniques avec inactivation du récepteur aux œstrogènes. Le modèle d’ovariectomie et d’effet sur l’appareil urinaire est bien décrit dans la littérature chez le rongeur. Les femelles seront ovariectomisées à 4 semaines afin d’éviter une ‘imprégnation hormonale’ MAIS POURRONT EGALEMENT AVOIR 10-12 SEMAINES LORS DE CETTE CHIRURGIE SELON LES DEMANDES CLIENTS (DEMANDE D’UN DE NOS CLIENT).. Le traitement hormonal sera administré vers semaines et ce pendant 6 mois maximum. Les expérimentations de mesure de point de fuite et les administrations de candidats médicaments seront de ce fait réalisées sur des animaux matures afin de miner la condition humaine.

Pour chercher dans le sang des marqueurs qui prédiraient l'efficacité d'un traitement contre le cancer du sein, 264 souris femelles immunodéficientes vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. Elles reçoivent des cellules de cancer du sein humain, dont certaines rendues résistantes aux traitements, puis des anticancéreux par voie orale ou par injection, et subissent quatre prises de sang. La tumeur peut réduire leur activité et altérer leur état général, les traitements leur faire perdre du poids. Chacune est tuée après un dernier prélèvement de sang et de tumeur, à une date prévue ou plus tôt si elle atteint un point limite, que le résumé ne définit pas.

Objectifs

L’objectif de ce projet est de mieux comprendre comment certaines tumeurs du sein réagissent aux traitements anticancéreux et pourquoi certaines ne répondent pas ou deviennent résistantes. Pour cela, des cellules de cancer du sein humain, dont certaines ont été rendues résistantes aux traitements après exposition prolongée in vitro, sont implantées chez la souris afin de reproduire le développement de la tumeur dans un organisme vivant. Les animaux sont ensuite traités avec des médicaments anticancéreux, et l’évolution des tumeurs est suivie au cours du temps. Des prélèvements de sang et de tumeurs sont réalisés à différents moments afin d’analyser des marqueurs biologiques. Ce projet vise à identifier des signes précoces permettant de prévoir si un traitement sera efficace ou non.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de mieux comprendre les mécanismes de réponse et de résistance des tumeurs du sein aux traitements. Les résultats obtenus pourraient aider à identifier des marqueurs mesurables dans le sang permettant de suivre l’évolution de la maladie et d’évaluer l’efficacité des traitements plus rapidement. À terme, ces travaux pourraient contribuer à améliorer la prise en charge des patientes en permettant d’adapter les traitements de manière plus précoce et plus personnalisée.

Procédures

Les animaux reçoivent une injection de cellules tumorales afin de provoquer le développement d’une tumeur ; cette injection dure moins d’une minute. Une fois la tumeur formée, les animaux sont traités avec des médicaments anticancéreux administrés régulièrement par voie orale ou par injection ; chaque administration dure environ une minute. Quatre prélèvements sanguins sont réalisés au cours de l’étude afin de suivre l’évolution des biomarqueurs circulants ; chaque prélèvement dure environ 3 minutes. À différents moments de l’étude, les animaux concernés sont anesthésiés pour un dernier prélèvement de sang, suivi de leur mise à mort et du prélèvement de la tumeur ; l’ensemble de cette intervention dure au maximum 10 à 15 minutes.

Impact sur les animaux

Les animaux peuvent présenter une gêne liée au développement de la tumeur, pouvant entraîner une diminution de l’activité ou une altération de l’état général. Les traitements administrés peuvent également entraîner des effets secondaires tels qu’une perte de poids ou une fatigue. Les manipulations répétées, comme les prélèvements sanguins, peuvent être sources de stress, bien que celles-ci soient réalisées sous anesthésie afin de limiter la douleur. Un suivi quotidien est mis en place afin de détecter rapidement tout signe de souffrance et d’adapter la prise en charge des animaux.

Devenir

À l’issue de l’étude, les animaux sont mis à mort lorsque les prélèvements biologiques nécessaires ont été réalisés, lors de l’atteinte des points limites définis dans le projet ou en fin de suivi expérimental. La mise à mort est réalisée sous anesthésie générale profonde conformément aux recommandations réglementaires afin d’éviter toute douleur ou détresse. Les prélèvements sanguins terminaux et tumoraux réalisés dans ce cadre sont indispensables aux analyses moléculaires prévues dans le projet.

Remplacement

Des approches in vitro ont été utilisées en amont afin de caractériser les lignées cellulaires et sélectionner les conditions expérimentales pertinentes. Cependant, l’étude de l’évolution tumorale dans un organisme vivant et l’analyse de biomarqueurs circulants nécessitent l’utilisation d’un modèle animal, aucune méthode alternative ne permettant actuellement de reproduire ces phénomènes de manière fiable.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisé dans ce projet a été strictement limité au minimum nécessaire pour répondre aux objectifs scientifiques, conformément au principe de réduction. Les effectifs ont été définis afin de permettre des comparaisons fiables entre les groupes d’animaux recevant différents traitements, tout en évitant l’utilisation d’animaux en excès. Cette estimation repose sur des données issues d’études préliminaires et de la littérature scientifique, qui ont permis d’anticiper la variabilité des réponses tumorales. Afin de limiter le nombre total d’animaux, les prélèvements biologiques sont réalisés à différents moments clés du suivi sur des sous-groupes distincts d’animaux, ce qui évite la répétition inutile des expériences. De plus, les pertes potentielles liées à l’absence de développement tumoral après injection ou à une croissance tumorale inadaptée sont anticipées dès la conception de l’étude, permettant d’obtenir les effectifs nécessaires sans recourir ultérieurement à des animaux supplémentaires.

Raffinement

Tout au long du projet, des mesures de raffinement sont mises en place afin de réduire au maximum la douleur, la souffrance et le stress des animaux. Les injections, traitements et prélèvements sont réalisés sous anesthésie générale, associés à une prise en charge adaptée de la douleur avant, pendant et après les actes. Les animaux bénéficient d’une surveillance clinique quotidienne incluant l’observation du comportement, de l’état général, de la prise alimentaire et de l’hydratation. Le poids corporel est mesuré deux fois par semaine afin de détecter précocement toute altération de l’état de santé, indépendamment de la croissance tumorale. La progression tumorale est suivie de manière régulière afin d’anticiper toute gêne ou inconfort pour l’animal. Des critères précoces et prédictifs permettent d’interrompre l’expérimentation pour un animal donné dès qu’une altération de son bien-être est observée, sans attendre l’apparition de signes sévères. Des mesures de soutien, telles que l’administration d’antalgiques, une hydratation adaptée ou une alimentation plus appétente, sont mises en place dès que nécessaire. Les conditions d’hébergement sont enrichies afin de limiter le stress et de favoriser le bien-être des animaux tout au long de l’étude. Lorsque les objectifs scientifiques sont atteints, ou si l’état général d’un animal se dégrade, celui-ci est mis à mort selon une méthode réglementaire réalisée sous anesthésie profonde, afin d’éviter toute douleur ou détresse inutile.

Choix des espèces

Le projet utilise des souris immunodéficientes, permettant l’implantation et le développement de cellules tumorales humaines sans rejet par le système immunitaire. Ce modèle est largement utilisé en recherche sur le cancer du sein afin d’étudier l’évolution tumorale et la réponse aux traitements anticancéreux dans un organisme vivant. Seules des souris femelles adultes sont utilisées dans cette étude. Les animaux sont réceptionnés à l’âge de 7 semaines puis utilisés après une semaine d’acclimatation. Les injections de cellules tumorales sont donc réalisées sur des animaux âgés d’environ 8 semaines.

3 720 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Les souris reproductrices reçoivent l'un de cinq antiépileptiques dans leur eau de boisson, de deux semaines avant l'accouplement jusqu'à la fin de l'allaitement. Leurs descendants, suivis sur plusieurs générations, passent des tests d'anxiété et de motricité que le résumé ne nomme pas, et une partie subit une chirurgie sous anesthésie pour une échographie cérébrale d'une heure, sans réveil. Le porteur cite des études où l'acide valproïque a entraîné des "comportements autistiques" chez la souris sur trois générations, puis affirme que les caractéristiques de ses propres souris "ne sont pas jugées nocives ou préjudiciables pour leur bien-être".

Objectifs

Le VPA (acide valproïque), un médicament utilisé pour traiter l'épilepsie, présente des risques importants lorsqu'il est administré pendant la grossesse : son utilisation est en effet liée à des effets néfastes sur le développement du cerveau du fœtus. Certaines études soulèvent également la possibilité d'effets transgénérationnels, comme cela a été démontré chez la souris avec l'expression de comportements autistiques sur 3 générations suivant le traitement de femelles gestantes. Dans un tel contexte, il est essentiel de déterminer la toxicité prénatale éventuelle des différents traitements anti-épileptiques. L'objectif de notre projet est donc de caractériser les effets délétères et transgénérationnels potentiels des 4 molécules anti-épileptiques les plus prescrites durant la grossesse, ainsi que du VPA considéré comme le traitement de référence pour les effets toxiques attendus. La compréhension de ces mécanismes sera utile pour la sélection et le développement de traitements anti-épileptiques chez la femme enceinte.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus de notre projet sont une meilleure compréhension des effets délétères et transgénérationnels potentiels des molécules anti-épileptiques prescrites durant la grossesse. Ces connaissances favoriseront la sélection et le développement de traitements anti-épileptiques chez la femme enceinte, ainsi qu'une meilleure compréhension du fonctionnement cérébral et de ses pathologies, notamment neurodéveloppementales telles que retard mental et autisme, ce qui représente un intérêt sociétal considérable.

Procédures

Les animaux seront soumis à une seule procédure pour une durée totale de 6 semaines : traitement avec l'anti-épileptique dans l'eau de boisson, démarrage 2 semaines avant l'accouplement et jusqu'à la fin de l'allaitement. Pour l'échographie cérébrale une procédure chirurgicale sous anesthésie générale et analgésie permettra de réaliser des mesures d’imagerie cérébrale : durée 1 heure. Ces animaux seront euthanasiés sans réveil : lot 2= 360 animaux (animaux tests et non les génétrices). Des animaux seront euthanasiés par surdosage d’anesthésiant. Une fois l’anesthésie confirmée (absence de réaction au pincement), les cerveaux sont prélevés en vue des analyses : lot 1 et 3 = 1248 animaux.

Impact sur les animaux

Modèle expérimental : Le traitement pharmacologique (Traitement, gestation *) démarre 14j avant le premier accouplement) : • représente un stress physique et psychologique léger. Lors des tests de comportement : • Le stress de manipulation et la séparation temporaire du groupe peuvent induire une anxiété passagère ou une agitation motrice. • Fatigue transitoire lors du test du niveau d’anxiété ou l’évaluation motrice Imagerie cérébrale et analyse génétiques : • Une injection d’anesthésiant sera réalisée pour permettre ces deux tests. Les animaux ne ressentiront aucune souffrance supplémentaire, car toutes les analyses seront effectuées après leur euthanasie. • Les prélèvements seront réalisés après la mise à mort Migration cellulaire : • Douleur lors de l'injection dans l'abdomen (intra-péritonéale) chez la femelle gestante

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés. Les cerveaux seront prélevés post-mortem pour les différentes analyses qui permettront d’étudier de manière approfondie le tissus cérébral.

Remplacement

L'étude des propriétés des circuits neuronaux impliqués dans la cognition nécessite l'observation et la manipulation de systèmes neuronaux intacts, et ne peut donc se faire que sur le cerveau issu de l'animal vivant. Il est en effet, à l'état actuel de nos connaissances, impossible de modéliser de manière réaliste le fonctionnement cognitif en laboratoire (in vitro) ou par des simulations informatiques (in silico). Nous avons opté pour l’utilisation de la souris car elle présente le meilleur équilibre entre les bénéfices (accessibilité expérimentale et pertinence par rapport aux pathologies chez l'homme) et les dommages escomptés (souffrance liées aux conditions d'élevage ou d'expérimentation dont actes chirurgicaux, perfusion transcardiaque ou mise à mort en cas d'atteinte de point limite). Les modèles de cerveau en 3D cultivés en laboratoire (organoïdes cérébraux) offrent une approche tridimensionnelle plus proche de l’organisation du cerveau humain, mais ils ne permettent pas de modéliser des fonctions comportementales, les interactions sociales ou les réponses du cerveau à un traumatisme physique. Les modèles informatiques et les simulations sont utiles pour tester des hypothèses ou analyser des données, mais ils reposent sur des informations expérimentales obtenues sur des modèles animaux vivant et ne permettent pas de prédire de manière fiable l’impact d’un d'anti-épileptique sur le développement cérébral et comportemental.

Réduction

Seules les expériences absolument indispensables ont été prévues, nous avons évité la répétition inutile d'études antérieures, et le protocole expérimental est soigneusement préparé. Une difficulté notable dans le calcul a priori du nombre d'animaux nécessaire est que les variables étudiées sont nouvelles, et leurs paramètres statistiques par conséquent inconnus. Notre estimation du nombre d'animaux est basée sur la littérature du domaine. Le nombre d'animaux retenu dans notre protocole, nécessaire pour garantir un pouvoir statistique suffisant pour chacune de nos expériences réalisée avec un taux de succès de 50 pourcent. Toutefois, les générations seront analysés au fur et à mesure, ce qui permettra d'interrompre la procédure si aucun résultat n'est observé dès la première génération. Toutes les mesures seront mises en œuvre pour réduire au maximum l’utilisation d’animaux conformément aux principes éthiques de réduction. Grâce aux méthodes expérimentales régulièrement appliquées dans les laboratoires, nous disposons déjà de données préliminaires solides. Celles-ci nous permettent de calculer précisément le nombre minimal d’animaux nécessaires pour obtenir des résultats statistiquement significatifs entre les groupes. Les comparaisons entre groupes seront réalisées à l’aide de tests statistiques. Enfin, le plan expérimental a été optimisé afin de garantir la robustesse et la reproductibilité des résultats, tout en respectant strictement le principe de réduction, le nombre d’animaux étant limité au strict nécessaire pour répondre aux objectifs scientifiques du projet.

Raffinement

Les animaux sont hébergés dans les conditions réglementaires. Leur environnement sera enrichi avec du papier doux absorbant permettant la fabrication de nids, reproduisant ainsi un comportement naturel de nidification. Les animaux utilisés sont des souris exposées directement pendant la gestation (in utero) ou indirectement (de parents ou grands-parents exposés in utero) à un traitement antiépileptique. Ce modèle a pour but de reproduire les altérations développementales des circuits neuronaux potentiellement exprimées chez l'homme de façon transgénérationnelle suite à un traitement anti-épileptique pendant la grossesse. Toutefois, à notre connaissance, aucune étude ne prouve que les troubles liés au développement des circuits neuronaux dans les modèles animaux que nous utilisons provoquent des douleurs chez l'animal. De plus, les caractéristiques observables (comportements, traits physiques ou biologiques, appelés "phénotype") de ces animaux ne sont pas jugées nocives ou préjudiciables pour leur bien-être. L’état général des animaux sera suivi quotidiennement à l’aide d’un arbre décisionnel, permettant une observation attentive des géniteurs ainsi que les petits au sein de la portée sans perturber la relation mère-petits, essentielle à leur développement. Principe de l’arbre décisionnel : Un animal en difficulté est rapidement repéré grâce à des signes cliniques caractéristiques. En cas de détresse physiologique (troubles respiratoires, hypothermie sévère, variation importante de la fréquence cardiaque), la procédure sera immédiatement arrêtée et l’animal euthanasié.

Choix des espèces

Nous avons opté pour l’utilisation de la souris car cette espèce présente des similitudes neuronales et cognitives suffisantes pour assurer la pertinence des investigations menées par rapport au cerveau humain. Le choix de la souris comme modèle expérimental est scientifiquement pertinent en raison de la reproductibilité des résultats, de la connaissance approfondie de sa biologie, et de son cycle de reproduction court, qui permet des études développementales efficaces, et l'observation générationnelle. Le modèle murin est ici particulièrement adapté : sa robustesse face aux manipulations, la richesse des données précliniques disponibles, et la possibilité d’explorer les effets des traitements anti-épileptiques sur plusieurs générations justifient pleinement son utilisation. En outre, une quantité de données considérable dans le domaine des Neurosciences Cognitives a été obtenue avec cette espèce, ce qui nous permet une comparaison des résultats obtenus et une minimisation du nombre d'animaux utilisés en s'appuyant sur des données publiées par d'autres équipes et obtenues à l'aide de protocoles expérimentaux similaires. Les animaux utilisés seront de façon générale de jeunes adultes (1 mois et 20 jours), car c'est la tranche d'âge qui donne les meilleurs résultats tout en permettant une expérimentation sur un système nerveux qu'on considère mature, et en minimisant autant que possible la durée d'élevage en condition d'animalerie de laboratoire. Mais dans la mesure où les conséquences attendues des traitements sont potentiellement liées au développement du système nerveux, un groupe d'animaux en cours de développement cérébral (à des stades embryonnaires) sera inclus dans la procédures.

5 000 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, chacune pouvant recevoir jusqu'à trois traitements par jour pendant deux mois, par voie orale ou par injection, après l'induction d'une tumeur sous anesthésie. La tumeur en grossissant distend la peau, une nécrose peut apparaître à sa surface, et la maladie peut entraîner une cachexie avec perte de poids. Toutes seront tuées à l'issue, au motif qu'elles portent des tumeurs. Le porteur se présente comme une société "prestataire de services en recherche préclinique", qui propose un "large panel de modèles in vivo" pour évaluer de nouveaux composés contre le cancer.

Objectifs

Au niveau mondial, il a été constaté une forte augmentation de l’incidence du cancer du fait du vieillissement de la population et de facteurs environnementaux qui se dégradent. En 2020, quelque 19,3 millions de nouveaux cas de cancers ont été diagnostiqués et 10 millions de décès sont à déplorer des suites de cette maladie, selon des données publiées par le Centre international de recherche contre le cancer (CIRC). Selon l’OMS, une personne sur cinq souffrira d’un cancer dans sa vie. Un homme sur huit et une femme sur onze en décèderont. Le cancer se caractérise par une dégradation pathologique des processus contrôlant la prolifération cellulaire, la différenciation et la mort programmée de certaines cellules. Tous les tissus ou organes peuvent être atteints. Bien que possédant des caractéristiques communes, différents types de cancers ont des causes très éloignées et répondent de façon extrêmement différente à un traitement. L’objectif de ce projet est d’utiliser des modèles déjà mis en place chez la souris, les plus prédictifs possible afin de refléter la pathologie cancéreuse et de pouvoir évaluer des nouveaux médicaments pour traiter le cancer. Cette évaluation chez l’animal permettra d’étudier ces nouveaux médicaments, seuls ou en combinaison, dans un contexte physiologique le plus proche possible de l’homme et d’arriver, avant les essais cliniques chez l’homme, à établir une réelle évaluation de l’efficacité des molécules destinées à traiter les cancers chez l’homme. Grace à ces modèles de cancer, de la pharmacocinétique et de la biodistribution des traitements pourra aussi être réalisée en plus de l’évaluation de l’efficacité antitumorale.

Bénéfices attendus

Notre société, prestataire de services en recherche préclinique propose un large panel de modèles in vivo nécessaires à l’évaluation de nouveau composés thérapeutiques pour la recherche contre le cancer. Ce projet a pour finalité de sélectionner des molécules thérapeutiques grâce à des modèles précliniques les plus prédictifs possibles afin de pouvoir transposer l’utilisation de ces molécules chez l’homme lors d’essais dans différentes phases cliniques. Pour cela, les expériences chez l’animal, qui représente un système d’essai physiologiquement proche de l’homme, permettent d’évaluer l’efficacité, la toxicité, la pharmacocinétique et la pharmacodynamique de nouveaux composés afin d’éviter ces essais directement chez l’homme. Au cours des expériences réalisées, il sera possible d’étudier les mécanismes de croissance d’une tumeur dans un environnement mimant la pathologie chez l’homme, d’étudier les mécanismes de résistance après des traitements avec de nouvelles molécules ou des molécules déjà utilisées en clinique, et les mécanismes de progression tels que la formation de métastases. Grâce à ces études dans un environnement adapté, il sera aussi par exemple possible de suivre la réaction du système immunitaire de l’hôte face à la progression de la maladie et suite au traitement thérapeutique, de moduler et/ou orienter le système immunitaire afin de donner à l’organisme les moyens de se défendre contre le cancer.

Procédures

Mise en place d’un système d’identification de l’animal, sous anesthésie générale (en conditions d’asepsie, réalisée entre 0 et 3 jours avant la greffe (1 fois,

Impact sur les animaux

L’évolution du volume tumoral entrainera une distension de la peau et une gêne légère à modérée. De plus, une nécrose en surface de la tumeur peut apparaitre. Il est aussi possible, que la progression tumorale entraîne une cachexie constatée par une perte de poids. Les traitements pourront induire un stress léger. - Les produits administrés pour la thérapie peuvent provoquer une perte de poids transitoire. Au cours d’une étude, les animaux seront manipulés. La contention des animaux vigiles lors des mesures de poids et de volume tumoral entraînent un stress que l’on peut considérer comme faible, et qui diminue avec l’habituation. Le jour de la randomisation, les animaux seront potentiellement mis avec de nouveaux congénères. Cette réorganisation sociale pourra engendrer un stress léger à modéré de 1-2j.

Devenir

Du fait que les animaux sont porteurs de tumeurs, ils seront tous mis à mort en fin de procédure

Remplacement

Les méthodes alternatives ne permettent pas, à ce jour, de prévoir l’efficacité in vivo de potentiels candidats-médicaments, car les étapes nécessaires au développement d’un médicament pour lesquelles il est nécessaire d’étudier les interactions du médicament dans un contexte globale ne peuvent pas être étudiées dans un système alternatif (in vitro par exemple). Des méthodes alternatives de reconstruction d’organes ou de tumeurs en 3D sont utilisées mais reste toutefois marginales et les résultats obtenus restent à ce jour difficilement transposables à l’homme

Réduction

Le nombre d’animaux par groupe ainsi que le nombre de groupe (et de groupe contrôle) sera ajusté à la question scientifique posée et des paramètres étudiés. La validité scientifique nécessite d’utiliser un nombre minimum d’animaux par groupe pour que les tests statistiques soient valides tout en prenant en compte d’éventuelles variations inter-individuelles. L’analyse statistique sera effectuée au moyen d’un test d'analyse de la variance (ANOVA). Une étude peut être composée de 2 à 20 groupes. Le nombre d’animaux par groupe varie généralement entre 5 et 15 par dose de produit, selon l’effet attendu et l’homogénéité de pousse du modèle tumoral. Pour des études de screening de différents composés sur un même modèle, ou d’un même composé sur différents modèles, il sera proposé de réduire le nombre d’animaux par groupe et d’utiliser 1 à 3 animaux par groupe (Single Mouse Trial). Pour réduire le nombre d’animaux utilisés dans ces procédures, il sera toujours proposé d’utiliser des biomarqueurs

Raffinement

Toutes les procédures sur les animaux seront réalisées selon les standards validés par le vétérinaire. L’impact de ces procédures sera toujours analysé par la structure chargée du bien-être des animaux. Toutes les procédures invasives et faiblement invasives, sont réalisées sous anesthésie générale. La fréquence de mesure des volumes tumoraux seront adaptée à la vitesse de croissance du modèle. La fréquence de pesée des animaux sera adaptée à leur état général. Les animaux sont observés quotidiennement. Dès l’apparition des premiers signes cliniques qui pourront amener aux points limites des antalgiques pourront être prescrits sous l’autorité du vétérinaire. Les chirurgies pratiquées dans ce projet sont des procédures de gravité modérée, réalisée sous anesthésie. les animaux reçoivent de l’antalgiques, avec surveillance post opératoire et soins post opératoires adaptés si nécessaires. Les injections/prélèvements seront effectués en suivant les recommandations vétérinaires. Un document de référence est à disposition des concepteurs et des techniciens. Les expérimentateurs sont formés pour reconnaître les signes de mal être des animaux. Les expérimentateurs et les personnes en charge du bien-être et du soin des animaux veillent au respect des points limites. En cas de suspicion de toxicité, un système d’alerte est mis en place pour statuer sur la mise à mort de l’animal ou sur l’arrêt des traitements. Les principaux points limites concernent l’état général de l’animal et sont listés en détail dans les procédures. Si l’un des signes cliniques liés aux points limites (mais sans dépassement du point limite) est observé, l’animal est mis en observation et un traitement de soins est mis en place. Par exemple, en cas de douleur constatée, le vétérinaire prescrira un traitement antalgique.

Choix des espèces

La souris constitue des modèles de choix en pharmacologie car leur génome est connu et leurs principales fonctions physiologiques (fonction rénale, hépatique) sont comparables à l’Homme. Du point de vue scientifique, les modèles utilisant des souris restent les modèles de choix dans les études d’oncologie. En effet, les petits rongeurs, outre l’avantage lié à leurs caractéristiques physiologiques, sont les seules espèces animales disponibles pour l’expérimentation présentant un statut immunodéficient (avec des mutations spontanées ou génétiquement modifiées) indispensable à l’implantation de cellules tumorales humaines dans le cadre de la recherche en oncologie. La prise de tumeurs humaines chez ces animaux immunodéficientes présentant un fond génétique stable est homogène, permettant ainsi une bonne reproductibilité des résultats. De plus, diverses souches de rongeurs immunocompétents sont également disponibles pour l’établissement de modèles tumoraux syngéniques. Enfin, les rongeurs autorisent une variété de techniques d’administration, de prélèvement et de chirurgie présentant des analogies avec ce qui peut être réalisé en sur l’homme, facilitant par là même le transfert à la clinique (recherche translationnelle). Les animaux seront utilisés à l’âge adulte (à partir de 7 semaines) lors de leur première manipulation). Ils pourront être reçus à partir de 5 semaines mais ne seront pas manipulés avant l’âge de 7 semaines. Des animaux adultes sont utilisés afin qu’ils aient leur poids et leur morphologie adulte pour faciliter l’injection des cellules tumorales. De plus, les molécules étudiées ont pour but d’aider le diagnostic ou le traitement de cancers retrouvés principalement chez les patients adultes. Il est donc justifié de traiter des animaux possédant les fonctions physiologiques correspondant au stade adulte.

Opérées sous anesthésie pendant 45 à 60 minutes, puis perfusées d'un fixateur par voie intracardiaque pour le prélèvement de leurs tissus, 64 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. L'équipe veut mesurer comment un récepteur à la sérotonine modifie la longueur du cil primaire, une petite structure présente à la surface des neurones. Elle affirme que ce récepteur est "une cible très prometteuse" contre les troubles de la mémoire liés à l'autisme ou à la maladie d'Alzheimer. Le résumé évoque des "molécules injectées" sans dire lesquelles ni où, et ne décrit ni trouble autistique chez ces souris ni aucun test comportemental, alors que l'autisme figure dans le titre.

Objectifs

Presque toutes les cellules de notre cerveau possèdent à leur surface une petite antenne appelée cil primaire. Cette structure est essentielle pour que les cellules puissent capter les signaux venant de l’environnement ou de leurs voisines. Nos travaux portent sur un récepteur spécifique situé sur cette antenne et activé par la sérotonine. La sérotonine est une molécule permettant aux neurones de communiquer, et elle est impliquée dans le stress, les émotions, les comportements sociaux et la mémoire. Ce récepteur est une cible très prometteuse pour soigner les troubles de la mémoire et de l'apprentissage que l'on retrouve dans les troubles du spectre autistique ou dans des maladies liées au vieillissement comme la maladie d'Alzheimer. Nous avons observé que dans ces troubles, le cil primaire change de taille : il devient trop court ou trop long, ce qui perturbe la communication entre les cellules. Nos premiers résultats suggèrent que notre récepteur d’intérêt contrôle la taille de cette antenne mais on ne connait pas encore par quels mécanismes. L'objectif de ce projet est d’étudier ces mécanismes, afin de comprendre comment "réparer" ces antennes cellulaires pour restaurer les capacités cognitives des patients.

Bénéfices attendus

Le projet présente des bénéfices majeurs tant sur le plan de la connaissance fondamentale que sur celui de la santé humaine : 1. Une avancée dans la compréhension du cerveau : Le cil primaire est présent sur presque toutes nos cellules cérébrales. Nous savons que sa taille est importante pour qu’il fonctionne correctement, mais nous ne savons pas comment cette taille est contrôlée. Ce projet permettra de comprendre comment notre récepteur d’interêt agit pour ajuster la longueur de cette antenne cellulaire et permettre son fonctionnement normal. 2. L'identification de nouvelles pistes thérapeutiques : De nombreux troubles du cerveau, comme la schizophrénie, l'autisme ou la maladie d'Alzheimer, sont associés à des anomalies de la taille de ces cils (antennes trop courtes ou trop longues), ce qui brouille la communication entre les neurones. Notre projet cherche à comprendre comment on pourrait redonner au cil primaire une taille normale grâce à notre récepteur d’intérêt, chez des patients souffrant de pathologies cérébrales. Notre récepteur est donc une cible prioritaire pour de futurs médicaments qui permettront de restaurer les fonctions de mémoire et d'apprentissage chez les patients atteints de ces pathologies. En étudiant plusieurs zones du cerveau, nous pourrons aussi déterminer si un futur traitement doit être global ou ciblé sur une région précise du cerveau pour être efficace, limitant ainsi les potentiels effets secondaires.

Procédures

Les souris seront soumises à une chirurgie avec anesthésie et analgésie (45-60 minutes) puis à une chirurgie permettant un prélèvement des tissus post-mortem, après injection de fixateur par perfusion intracardiaque.

Impact sur les animaux

La séparation courte d’avec les congénères peut générer un stress léger, les injections d’anesthésiques peuvent entraîner une légère douleur de courte durée. Un inconfort au niveau du site d’intervention et de légères douleurs locales peuvent survenir après la chirurgie, normalement résolues sous 24 heures.

Devenir

Tous les animaux utilisés seront mis à mort pour permettre d’analyser leurs tissus. Cela nous permettra de mesurer et de comprendre l’impact des molécules injectées sur la taille du cil primaire .

Remplacement

Lors de projets précédents, nous avons prouvé qu’en cas de pathologie, la taille du cil primaire est altérée (trop courte ou trop longue). Nous avons mené des expériences in vitro en amont de ce projet, qui nous ont permis de montrer que notre récepteur d’intérêt et certains de ses partenaires sont capables de changer la longueur du cil primaire et pourraient donc participer au développement de nombreuses pathologies cérébrales. Il est maintenant nécessaire de confirmer in vivo les résultats obtenus précédemment afin de pouvoir envisager d’utiliser les nouvelles connaissances générées grâce à ce projet pour développer de nouvelles approches thérapeutiques.

Réduction

Chaque animal sera utilisé comme son propre contrôle, permettant d’utiliser deux fois moins d’animaux pour obtenir un même volume d’informations. Sur la base de nos expériences précédentes, un nombre d’animaux = 8 par groupe expérimental est suffisant pour obtenir des résultats statistiquement significatifs.

Raffinement

Nous raffinerons nos expériences en soulageant l’inconfort ou le stress potentiels subis par les animaux tout au long du protocole expérimental, en logeant les souris par groupe de 4, en mettant à disposition le nécessaire pour faire un nid (ouate et cabane en carton) et en manipulant les animaux par le même expérimentateur. Nous utiliserons les animaux des deux sexes. L'injection de petits volumes est largement documentée, et maitrisée dans notre équipe. Cette opération est conduite sous anesthésie générale de l'animal, et est suivie d'une observation accrue pendant la phase de réveil. La souris aura accès à une nourriture hydratée et un anti-inflammatoire non-stéroïdien sera utilisé pendant les 24 heures suivant l’acte chirurgical.

Choix des espèces

Les souris sont des animaux modèles pour l’étude des pathologies neurologiques et psychiatriques. Les altérations de la longueur du cil primaire observées chez des patients humains ont été retrouvées chez la souris. La souris est donc un modèle pertinent pour ces études morphologiques. Les maladies ciblées touchent aussi bien des hommes que des femmes, nous réaliserons donc notre étude sur des souris mâles et femelles indifféremment Les animaux seront utilisés à l’âge adulte (8-12 semaines), lorsque le développement neuronal est terminé et que le récepteur que nous étudions est exprimé dans le cil primaire.

Deux examens d'IRM de trois heures chacun sous anesthésie encadrent le protocole de chaque souris : 298 souris mâles vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées après le second examen pour prélever les muscles des pattes arrière. Entre les deux, chacune subit une seule de ces procédures : section totale ou partielle du nerf sciatique, patte immobilisée une ou deux semaines, huit à douze semaines d'entraînement intensif sur tapis roulant, ou injections répétées d'une molécule de croissance musculaire. Le porteur présente l'IRM comme une contribution au remplacement, tout en indiquant que la validation par histologie implique un "plus grand nombre" de souris dans un premier temps. Il réserve l'étude aux mâles, chez qui certaines réponses seraient "plus marquées", au nom de la réduction.

Objectifs

La résonance magnétique nucléaire (RMN) est à l’origine des techniques d’imagerie médicale comme l’IRM, utilisées depuis de nombreuses années pour observer l’intérieur du corps sans intervention chirurgicale. Ces techniques sont aujourd’hui très utiles pour étudier les maladies des muscles et du cœur. Elles permettent notamment de suivre l’apparition de graisse dans les muscles, l’inflammation, les œdèmes ou encore certaines anomalies du fonctionnement musculaire. Au sein du laboratoire, de nouvelles méthodes d’imagerie sont développées afin d’améliorer l’étude des muscles chez les animaux de laboratoire, avec l’objectif de pouvoir ensuite appliquer ces méthodes chez les patients. Pour vérifier la fiabilité des images obtenues, les chercheurs les comparent à l’histologie, une technique qui consiste à analyser les tissus musculaires au microscope. Cette méthode est très précise, mais elle nécessite un prélèvement de muscle et ne peut donc pas être utilisée facilement chez l’être humain, en particulier lorsque les muscles sont déjà très fragilisés. Le projet a pour objectif de créer une base de données reliant les résultats obtenus par imagerie RMN et par histologie pour différents types d’atteintes musculaires. Cette comparaison permettra de mieux interpréter les images obtenues par IRM et de développer de nouveaux indicateurs fiables, appelés biomarqueurs. Dans un premier temps, les chercheurs étudieront des modèles provoquant une augmentation (hypertrophie) ou une diminution (atrophie) de la taille des muscles. Ces modèles ont été choisis car ils modifient principalement la taille des fibres musculaires, sans entraîner beaucoup d’autres changements, ce qui facilite la comparaison entre les images RMN et les observations au microscope. L’objectif est d’identifier des biomarqueurs capables de détecter précisément l’atrophie ou l’hypertrophie musculaire grâce à l’IRM. À terme, ces outils pourront être utilisés dans des maladies neuromusculaires plus complexes afin de distinguer différents types d’atteintes musculaires sans avoir recours à des prélèvements invasifs. Enfin, lors d’une future utilisation en clinique, les médecins pourront comparer les résultats obtenus chez les patients avec cette base de données de référence associant imagerie et histologie, afin d’améliorer le diagnostic et le suivi des maladies musculaires.

Bénéfices attendus

Sur le plan des connaissances scientifiques, ce projet permettra de mieux caractériser les phénomènes d’hypertrophie (augmentation de la taille des muscles) et d’atrophie musculaire (diminution de la masse musculaire) grâce à deux approches complémentaires : l’histologie, qui permet d’observer les tissus au microscope, et la RMN (résonance magnétique nucléaire), utilisée en imagerie médicale. Sur le plan de la recherche préclinique, ce travail contribuera au développement de nouveaux biomarqueurs obtenus par RMN et validés par l’histologie. Ces biomarqueurs pourront ensuite être utilisés dans de futurs travaux de recherche sur les maladies neuromusculaires, avant une application potentielle chez les patients afin d’améliorer le diagnostic et le suivi des atteintes musculaires.

Procédures

Le présent projet comprend quatre procédures expérimentales distinctes et chaque animal participera à une seule de ces séries d'actes. Avant le début des expériences, les animaux bénéficieront d’un examen d'imagerie réalisé sous anesthésie générale. Cet examen permettra d’obtenir des images de référence des muscles avant traitement. Sa durée maximale sera de 3 heures. Chaque animal sera soumis à une seule des quatre séries d'actes suivantes : 1 - Dénervation de la patte. Cette intervention consiste à interrompre totalement ou partiellement l’activité d’un nerf contrôlant les muscles de la patte. Elle sera réalisée sous anesthésie générale et durera environ 10 minutes. Des traitements antidouleur seront administrés avant et après l’intervention. 2 - Immobilisation de la jambe. Une seule patte sera immobilisée pendant 1 ou 2 semaines afin d’étudier les effets du manque d’utilisation du muscle. La mise en place de l’immobilisation sera réalisée sous anesthésie générale et durera environ 5 minutes. Malgré cette immobilisation, les animaux pourront continuer à se déplacer librement dans leur cage puisque seule une patte sera concernée. 3 - Des animaux suivront un programme d’entraînement physique de type HIIT (High Intensity Interval Training), 8 ou 12 semaines ,à raison de 3 à 4 fois par semaine pendant 20 minutes par séance. 4 - Injections répétées (2 à 4 fois par semaine pendant 4 semaines) d’une molécule stimulant la croissance musculaire. Les injections sont réalisées par voie sous-cutanée sur animal anesthésié. À la fin des procédures expérimentales, un second examen d'imagerie sera réalisé sous anesthésie générale afin d’évaluer les modifications musculaires provoquées par les traitements. Cet examen durera au maximum 3 heures. À l’issue du dernier examen d'imagerie, les animaux seront euthanasiés sous anesthésie profonde afin de permettre l’analyse des tissus musculaires.

Impact sur les animaux

L’immobilisation d’une jambe n’empêchera pas les animaux de se déplacer normalement et d’interagir entre eux de manière normale. Les doigts resteront visibles dans le but de voir d'éventuelles lésions, dans ce cas le dispositif sera immédiatement retiré. La dénervation partielle ou définitive du nerf sciatique entrainera un inconfort plus important, les animaux pourront toujours se déplacer car la dénervation sera effectuée de manière unilatérale. D’autre part les animaux subissant une dénervation seront soumis à des actes chirurgicaux aseptiques, et à la pose de sutures chirugicales pour éviter tout risque d'infection. Le geste chirurgical peut induire une inflammation et éventuellement une infection locale. Le geste chirurgical est associé à une douleur locale. L’hypertrophie musculaire sera obtenue par des protocoles d’entrainement des animaux sur tapis roulant, ce qui entrainera seulement un léger inconfort. L’hypertrophie obtenue par l’entrainement devrait être modérée. Dans le but d’obtenir une hypertrophie musculaire plus importante, l’hypertrophie sera induite pharmacologiquement. Les injections sous cutanées répétées pourront également provoquer un léger inconfort. Une des nuisances attendues du projet sont liés aux anesthésies pouvant induire une détresse respiratoire et une hypothermie si le système de maintien de la température corporelle présente un défaut.

Devenir

Les animaux seront euthanasiés après l’examen RMN en fin de procédure, l’euthanasie permettra le prélèvement de tissus musculaires des membres postérieurs en vue d’analyses histologiques.

Remplacement

La résonance magnétique nucléaire (RMN) contribue au principe de Remplacement des 3R en permettant d’étudier de nombreux paramètres du tissu musculaire directement chez l’animal vivant. Cette approche réduit le recours à des méthodes plus invasives, comme l’histologie ou les analyses biochimiques, qui nécessitent généralement un prélèvement de tissu et donc l’euthanasie de l’animal. Dans le cadre de ce projet, des analyses histologiques restent toutefois nécessaires afin de valider les biomarqueurs obtenus par RMN. Cette étape implique l’utilisation d’un plus grand nombre d’animaux dans un premier temps. Cependant, les résultats attendus permettront ensuite de développer des biomarqueurs fiables capables de limiter, voire d’éviter, le recours à l’histologie dans les études futures. À ce jour, il n’existe pas de modèle in vitro capable de reproduire fidèlement la complexité du muscle, notamment son organisation, son fonctionnement mécanique et son métabolisme énergétique. L’utilisation de modèles animaux reste donc indispensable pour étudier les muscles squelettiques et cardiaques dans des conditions proches de la réalité physiologique. Plusieurs modèles animaux de maladies neuromusculaires existent, notamment chez les rongeurs, les chiens ou les chats. Les modèles murins sont particulièrement utilisés en recherche fondamentale et préclinique car ils sont faciles à manipuler, nécessitent moins de ressources et permettent de reproduire de nombreuses caractéristiques observées dans les maladies humaines.

Réduction

La mise en place des modèles expérimentaux nécessitera également l’utilisation d’animaux. Dans cette première étape, le nombre d’animaux sera volontairement limité à 4 par groupe expérimental. Cette phase permettra de vérifier que les procédures sont fiables, reproductibles et adaptées, tout en testant les nouvelles techniques de RMN développées dans le cadre du projet. Afin de limiter le nombre d’animaux utilisés, les groupes de la phase comparative comprendront entre 10 et 12 animaux selon les procédures étudiées. Ce nombre a été choisi pour être suffisamment élevé afin de garantir la fiabilité des analyses statistiques, tout en restant aussi réduit que possible conformément aux principes de réduction du nombre d’animaux utilisés en recherche. Au total, 298 animaux seront inclus dans le projet.

Raffinement

La RMN contribue également au troisième principe de la règle des 3R, appelé Raffinement, qui vise à améliorer les conditions expérimentales afin de réduire au maximum la douleur, le stress et l’inconfort des animaux. Les progrès technologiques constants en imagerie RMN permettent aujourd’hui d’obtenir, en recherche préclinique, des images extrêmement précises, avec une résolution bien supérieure à celle utilisée en pratique clinique chez l’être humain. Ces avancées permettent d’obtenir davantage d’informations tout en limitant le recours à des méthodes invasives. Le raffinement concerne également les conditions d’hébergement des animaux. Les animaux seront maintenus en groupe dans des cages adaptées et ventilées, avec un environnement enrichi comprenant notamment des tubes en carton et des matériaux permettant la fabrication de nids, afin de favoriser leur bien-être. Tous les examens RMN seront réalisés sous anesthésie gazeuse afin d’éviter les mouvements pendant l’acquisition des images et de limiter le stress des animaux durant les examens. Les procédures de dénervation seront réalisées uniquement par du personnel qualifié et formé aux techniques chirurgicales. Des traitements antidouleur seront administrés avant et après l’intervention afin de réduire la douleur liée à la chirurgie. Si des signes de douleur apparaissent au cours de l’étude, des traitements complémentaires seront immédiatement mis en place. L’état de santé des animaux sera surveillé quotidiennement par du personnel compétent, conformément à la réglementation en vigueur. Les animaux seront également pesés régulièrement afin de détecter rapidement toute perte de poids anormale ou tout signe de souffrance. Enfin, des critères d’arrêt précis seront appliqués tout au long du projet. Ceux-ci prendront en compte l’état général des animaux, leur âge ainsi que le nombre d’examens réalisés, afin de garantir leur bien-être pendant toute la durée de l’étude.

Choix des espèces

Les souris constituent un modèle expérimental de référence en recherche biomédicale, en raison de leur petite taille, de la maîtrise de leurs conditions d’hébergement et de la disponibilité de nombreux outils expérimentaux validés. Le présent projet sera conduit exclusivement sur des animaux sans pathologie préexistante. Les modèles murins sont largement utilisés pour l’étude de nombreuses pathologies humaines, notamment dans le domaine des maladies neuromusculaires, pour lesquelles ils présentent une forte pertinence translationnelle. Le laboratoire dispose d’une expertise établie dans le développement et l’utilisation de techniques d’imagerie et de spectroscopie par résonance magnétique nucléaire appliquées à l’étude du muscle squelettique chez la souris. Afin d’assurer la robustesse, la comparabilité et la reproductibilité des données, ce modèle animal sera maintenu. À terme, ces approches ont vocation à être transposées à des modèles de pathologies musculaires plus complexes, reposant fréquemment sur l’utilisation de lignées transgéniques majoritairement développées chez la souris. Le développement et la validation de ces méthodes dans ce modèle sont donc nécessaires en amont. Toutes les procédures expérimentales seront réalisées sur des animaux ayant atteint l’âge adulte, défini comme un âge minimal de deux mois. Les souris incluses dans l’étude seront âgées de 8 à 14 semaines, afin de garantir une homogénéité des groupes expérimentaux. Cette stratégie vise à limiter les variations interindividuelles liées à la croissance, susceptibles d’altérer la répétabilité et la reproductibilité des mesures. Les modèles murins d’atrophie et d’hypertrophie du muscle squelettique, ainsi que les procédures de validation de nouveaux biomarqueurs par imagerie par résonance magnétique nucléaire et analyses histologiques associées, peuvent être réalisés indifféremment chez des animaux mâles ou femelles. Toutefois, certaines réponses physiologiques, en particulier dans les modèles d’hypertrophie musculaire, sont rapportées comme étant plus marquées chez les mâles. Dans un objectif de réduction du nombre total d’animaux utilisés, conformément au principe des 3R, il a été décidé de limiter cette étude à l’utilisation exclusive de souris mâles.