Procédures modérées

Vaccinées par le nez sous anesthésie ou par injection dans le muscle, puis infectées par la grippe pour une partie, 984 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue pour le prélèvement de leurs organes. Elles reçoivent deux ou trois administrations à quinze jours d'intervalle, et certaines passent des séances d'imagerie sous anesthésie. Il s'agit de tester une formulation de vaccin antigrippal sans injection, l'infection pouvant provoquer perte de poids, baisse d'appétit et pelage ébouriffé, des signes que le porteur qualifie de "transitoires". Il écrit que la souris est "nécessaire" pour étudier la réponse immunitaire, et qu'elle a été choisie parce qu'elle est "largement utilisée en recherche".

Objectifs

Le virus de la grippe évolue régulièrement, ce qui réduit l’efficacité des vaccins actuels et nécessite une vaccination annuelle. De plus, ces vaccins sont le plus souvent administrés par injection intramusculaire et protègent principalement l’ensemble de l’organisme, mais moins efficacement les voies respiratoires, qui constituent pourtant la principale porte d’entrée du virus. L’objectif de ce projet est de développer un nouveau vaccin contre la grippe qui serait administré par voie nasale. Cette approche vise à stimuler plus efficacement les défenses immunitaires directement dans les voies respiratoires, afin de mieux empêcher le virus de s’y installer et d’offrir une protection plus durable. Dans ce projet, une nouvelle formulation vaccinale sera testée afin de déclencher une réponse immunitaire efficace contre le virus de la grippe. Le vaccin sera évalué chez la souris, un modèle couramment utilisé pour l’étude des infections respiratoires. Le projet permettra d’analyser la capacité du vaccin à activer le système immunitaire, à induire une protection durable dans les voies respiratoires et à protéger contre différentes formes du virus de la grippe. Ce projet sera réalisé dans deux établissements utilisateurs. Les études d’imagerie visant à analyser la distribution du vaccin seront menées dans le second établissement.

Bénéfices attendus

Ce projet a pour objectif de développer un vaccin contre la grippe administré par voie respiratoire (sans injection), capable d’induire une mémoire immunitaire au niveau des poumons et de protéger contre différentes souches du virus. La stratégie vaccinale mise en place pourrait également être appliquée à la conception de nouveaux vaccins ciblant d’autres agents pathogènes respiratoires.

Procédures

Certaines souris recevront des administrations de substances sous anesthésie générale, afin d’éviter toute douleur. Chaque administration durera environ 2 à 3 minutes et sera réalisée deux fois à 15 jours d’intervalle. Pour certaines souris, une troisième administration pourra être réalisée. D’autres souris recevront des injections sur animaux vigiles. Chaque injection durera moins d’une minute et sera réalisée deux fois à 15 jours d’intervalle. Certaines souris recevront une injection supplémentaire. Cette injection sera réalisée une ou deux fois à 15 jours d’intervalle et durera moins d’une minute. Un prélèvement sanguin sera effectué chez certaines souris vigiles. Cet acte durera environ une minute et sera réalisé une seule fois. Enfin, certaines souris participeront à des séances d’imagerie sous anesthésie générale. Chaque séance durera moins de 25 minutes.

Impact sur les animaux

Certaines souris recevront des injections dans le muscle, qui peuvent provoquer une douleur brève au moment de l’injection ainsi qu’une légère inflammation locale. Dans de rares cas, une irritation du tissu musculaire peut survenir. D’autres souris recevront des administrations de substances par le nez, réalisées sous anesthésie générale. Cette procédure peut entraîner une gêne respiratoire passagère après le réveil. Une partie des animaux recevra également, par cette même voie, le virus de la grippe afin d’évaluer l’efficacité du vaccin. L’utilisation de l’anesthésie générale peut être source de stress temporaire pour les animaux. Les injections nécessaires à l’anesthésie ou à certaines analyses peuvent provoquer une légère douleur au point d’injection. Chez certains animaux, un prélèvement sanguin sera effectué avant la fin de l’étude, ce qui entraînera une douleur locale modérée et de courte durée. L’infection par le virus de la grippe peut provoquer des signes cliniques transitoires tels qu’une diminution de l’activité, un aspect ébouriffé du pelage, une perte de poids et une baisse de l’appétit.

Devenir

Tous les animaux sont mis à mort à l’issue des interventions, car il est nécessaire d’analyser la réponse immunitaire dans plusieurs organes, à l’aide de techniques nécessitant le prélèvement précis de ces organes

Remplacement

La réponse immunitaire après une vaccination est très complexe et implique de nombreuses cellules et molécules. Les méthodes en laboratoire utilisant des cellules ne permettent pas de la reproduire correctement. La souris est donc nécessaire pour étudier la production d’anticorps, l’activation des cellules immunitaires et les interactions entre organes. De plus, l’infection respiratoire par le virus de la grippe chez la souris reproduit des mécanismes importants observés chez l’humain, impossibles à modéliser en laboratoire ou sur ordinateur.

Réduction

Le nombre de souris a été calculé à partir de données existantes et d’analyses statistiques. Avant de les utiliser, les formulations vaccinales seront testés en laboratoire pour ne garder que les plus prometteurs. Chaque souris sera exploitée au maximum : plusieurs analyses seront faites sur les mêmes tissus, et certains échantillons seront conservés pour des études futures.

Raffinement

La santé des souris sera suivie régulièrement (chaque semaine, et quotidiennement si leur état de santé se dégrade). Des critères précis permettront d’interrompre l’expérience si un animal présente un état critique. À la fin de l’étude, les souris seront mises à mort afin d’analyser la réponse immunitaire. Certaines souris recevront des injections dans le muscle sur des animaux vigiles. Elles seront surveillées afin de détecter d’éventuelles lésions ou signes de douleur et, si nécessaire, une analgésie sera mise en place par administration de buprénorphine. Les administrations par voie respiratoire ainsi que les mesures de bioluminescence seront réalisées sous anesthésie générale. Un tapis chauffant sera utilisé afin de maintenir les animaux au chaud pendant les procédures.

Choix des espèces

La souris a été choisie car elle est largement utilisée en recherche et que son système immunitaire est bien connu. Elle permet d’obtenir des résultats fiables grâce à des méthodes d’analyse déjà disponibles et maîtrisées. Les animaux utilisés sont de jeunes adultes, un âge auquel leur système immunitaire est suffisamment développé pour garantir des observations pertinentes dès le début des interventions.

Deux périodes de rationnement alimentaire, l'une de 19 jours, l'autre de 14 ou 28 jours, précèdent les tests cognitifs. 560 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue pour l'analyse de leur cerveau, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacun subit une chirurgie de deux heures sous anesthésie générale, une partie développe des troubles moteurs induits pour reproduire la maladie de Parkinson, et certains reçoivent du pramipexole par injection quotidienne pendant 17 jours. Les tests visent la motricité, l'apprentissage moteur et l'apprentissage cognitif, sans que les tâches elles-mêmes soient nommées. Pour justifier l'espèce, le porteur décrit le rat comme "clairement le plus adapté" à son projet et cite les outils technologiques développés autour de lui.

Objectifs

Le projet vise à étudier l’implication du cervelet dans l’apprentissage moteur et cognitif en conditions physiologique et pathologique, dans le cadre de la maladie de Parkinson. La maladie de Parkinson est une maladie neurodégénérative qui entraîne d’importants troubles moteurs mais aussi cognitifs. Les traitements de la maladie de Parkinson peuvent également amener des effets secondaires cognitifs, appelés troubles du contrôle des impulsions, qui se manifestent par des addictions comportementales (jeu pathologique, achats compulsifs, consommation compulsive de nourriture) et qui affectent jusqu’à un tiers des patients. Les réseaux neuronaux impliquant le striatum, le cervelet, le thalamus et le cortex sont fortement impactés par la maladie de Parkinson et participent à l’émergence des troubles moteurs et potentiellement cognitifs associés à la maladie de Parkinson. Dans un premier temps, nous allons caractériser le rôle de ce réseau dans des tâches d’apprentissage moteur et cognitif et dans un second temps, utiliser un modèle de rats de la maladie de Parkinson impactant une zone clé pour la régulation des mouvements. L’étude du réseau du cervelet et du cerveau (striatum, thalamus, cortex) s’effectuera par des enregistrements de l’activité neuronale. L’apprentissage moteur et cognitif seront ensuite mesurés. L’activité neuronale de nos régions d’intérêt sera enregistrée pendant les tâches comportementales afin de comprendre comment ces réseaux sont impliqués et impactés dans le développement de la maladie de Parkinson. Puis, dans le cadre des troubles du contrôle des impulsions, un traitement au pramipexole, molécule régulièrement prescrite aux patients parkinsoniens, sera adminsitré et nous étudierons le rôle du réseau dans le développement de ces troubles. Ce projet pourra aboutir à une meilleure compréhension des mécanismes neurobiologiques des fonctions et dysfonctions cognitives liés à la maladie de Parkinson et pourrait aider à développer de nouvelles stratégies thérapeutiques.

Bénéfices attendus

Ce projet s’intéresse à une problématique majeure de santé publique, la maladie de Parkison qui enregistre, en France, environ 27 000 nouveaux par an (France Parkinson). Nous cherchons ici à mieux comprendre l’implication du cervelet dans les fonctions et dysfonctions motrices et cognitives liées à cette maladie. Cette approche permettra de caractériser les modifications neurobiologiques induites par le modèle de la maladie de Parkison et par le traitement au pramipexole sur l’ensemble du réseau du cervelet et leur rôle dans le développement des troubles de l’apprentissage moteur et cognitif. Ces expérimentations permettront d’établir un lien direct entre dysfonctionnements neuronaux et déficits moteurs ou cognitifs. Connaitre les mécanismes neurobiologiques associés aux troubles comportementaux dans la maladie de Parkinson pourra permettre de développer des stratégies thérapeutiques plus adaptées et spécifiques de ces symptômes.

Procédures

Tous les animaux auront une chirurgie sous anesthésie générale et analgésie (1 fois, durée de 2h). Tous les animaux suivront des tests comportementaux (animal vigile) : fonctions motrices (quelques minutes sur 3 jours, répété toutes les semaines) apprentissage moteur (1h par jours sur 5 jours), apprentissage cognitf (45 minutes par jour sur 7 jours répété 2 à 3 fois). Les tests cognitifs nécessitent deux périodes de rationnement alimentaire (la première dure 19 jours et la deuxième 14 ou 28 jours, selon la procédure). Certains animaux recevront un traitement par injection (1 fois par jour pendant 17 jours). L’ensemble des animaux seront euthanasiés par une méthode réglementaire sous anesthésie et analgésie générale en vue des prélèvements et analyses.

Impact sur les animaux

Les tests comportementaux induisent un léger stress de quelques minutes du au changement d’environnement au cours de la réalisation du test. Un léger stress et une sensation de faim des animaux sont attendus durant le rationnement alimentaire durant les jours précédant le test comportemental. Pendant la chirurgie, le risque de douleurs et d’hypothermie n’est pas à entièrement exclure. Le réveil peut causer un stress pendant plusieurs minutes et une perte de poids peut être observé dans les jours suivant la chirurgie. L’induction de la maladie de parkinson va induire un ralentissement global de l’activité locomotrice et des difficultés de motricité fine. Une contention de quelques secondes, nécessaire pour les enregistrements électrophysiologiques, induit un léger stress en début de session. L’administration du traitement induit également une douleur de courte durée suite à l’injection de l’animal.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés afin de récupérer les cerveaux pour analyse histologique.

Remplacement

Nous nous intéressons à l’intégration et aux modifications de réseaux neuronaux et de systémes entiers sur le comportement, ce qui ne peut pas être étudié en l'état actuel des technologies et techniques, par des approches de modélisations informatiques in silico ou basées sur des cultures cellulaires in vitro. Nous réalisons donc exclusivement des approches in vivo sur l’animal en comportement.

Réduction

Nos expérimentations nécessitent l’utilisation d’un total de 560 rats mâles et femelles. La taille des échantillons a été établie grâce à un calcul de puisssance et prend en compte des marges liés à des problèmes de chirurgie et de fonctionnement des systèmes d’enregistrement, estimées par nos précédentes expériences. Cet effectif nous permettra de procéder aux tests statistiques nécessaires et d’acquérir des résultats fiables.

Raffinement

Les expérimentations sont réfléchies de façon à minimiser au maximum l’inconfort, la douleur, la détresse ou l’angoisse des animaux au cours des différentes procédures de ce projet. Après leur arrivée, les animaux sont aclimatés pendant jours à leur nouvel environnement. Les animaux sont hébergés avec eau et nourriture ad libitum (en dehors des périodes de rationnement alimentaire) et par 2. Un enrichissement avec des bâtons de bois et des matériaux pour la construction de nid ainsi que pour le rongeage, est mis dans les cages d'hébergement. Les animaux sont manipulés au minimum de façon hebdomadaire tout au long du projet permettant une habituation aux expérimentateurs. Lors de la chirurgie nous aurons recours à l’anesthésie générale, avec régulation de la température corporelle par tapis chauffant, additionnée d’une anesthésie locale en présence d’antalgique. Des points limites gradés, précis et adaptés ont été définis de façon à obtenir un arbre décisionnel en fonction des observations faites et aboutir à une gestion de ceux-ci.

Choix des espèces

L’espèce animale utilisée est le rat (Rattus norvegicus). C’est un modèle très largement utilisé en neurophysiologie et est clairement le plus adapté à notre projet. Ces rats permettent de réaliser des analyses physio-anatomiques poussées (jusqu’à l’échelle du neurone unique) tout en restant pertinent du point de vue de la neurophysiologie humaine (la grande majorité des structures cérébrales de ces animaux ont un équivalent chez l’homme). Ils permettent d’étudier des fonctions de haut niveau au cœur de ce projet, en particulier la cognition. Les outils technologiques développés autour de ces animaux nous offrent également un contexte optimal pour réaliser des expériences à fort rendement scientifique tout en limitant le nombre d’animaux utilisés. Les animaux seront utilisés à l'âge adulte (8 semaines au moment des premiers tests comportementaux) puisque nous avons besoin d'avoir des circuits et systèmes entièrement développés.

Toutes tuées en fin de procédure pour des prélèvements de tissus et de sang, 2 160 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Sans anesthésie, chacune reçoit jusqu'à quatre injections intraveineuses ou sous-cutanées, jusqu'à quatre prises de sang et dix à quinze prises de température rectale sur trois à cinq heures, avec une hypothermie induite qui peut descendre à 32 °C. Il s'agit de tester des vecteurs-médicaments conçus comme un "cheval de Troie" pour franchir la barrière du cerveau, sur des lignées de souris génétiquement modifiées porteuses de cibles humaines. Le porteur affirme que la souris reste le "seul système physiologique" capable d'intégrer ces paramètres, et renvoie les "avancées majeures" pour les patients au conditionnel et au long terme.

Objectifs

Les maladies et troubles neurologiques sont la première cause mondiale de handicap. À l'heure actuelle, les besoins médicaux restent malheureusement très insatisfaits, sans aucun traitement curatif, ou palliatif. Une des raisons majeures réside dans l’inefficacité de nombreux médicaments à passer la barrière protectrice du cerveau et ainsi à accéder aux régions à traiter. Dans ce contexte, nous avons développé un savoir-faire qui consiste en l’association de molécules à des pro-drogues ou médicaments, capables de passer les barrières biologiques protectrices de l’organisme et ainsi atteindre plus efficacement les tissus cibles (cerveau, muscles…). Notre technologie repose sur une stratégie de cheval de Troie : Nos médicaments sont capables de reconnaître des partenaires spécifiques, au niveau des barrières protectrices de l'organisme et utilisent leurs mécanismes naturels de passage cellulaire pour atteindre le tissu cible. À travers cette demande de projet, nous souhaitons développer et optimiser de nouveaux médicaments afin d’améliorer la délivrance d’agents au fort potentiel thérapeutique. Par différentes voies d'administration, nous tenterons de potentialiser l’effet de nos médicaments sur des modèles murins humanisés pour des récepteurs et ou transporteurs d’intérêt.

Bénéfices attendus

La transposition de nos recherches sur un modèle murin humanisé pour notre cible permet d’appréhender les futurs développements pré-cliniques de nos molécules et les possibles effets secondaires ou toxicités associées. De plus, elle assure de développer au maximum les études sur le modèle souris avant la phase préclinique et la transposition à l’homme, qui aurait nécessité des séries de tests sur divers modèles animaux. D'un point de vue médical, sur du plus long terme, le potentiel de ciblage thérapeutique de nos vecteurs-médicaments constitue l'objectif majeur de nos recherches, avec à terme, un bénéfice attendu qui pourrait permettre des avancées majeures dans le milieu médical et sur le quotidien des patients.

Procédures

Les manipulations expérimentales seront réalisées sur animaux vigiles et de manière précises et rapides (≤ 2min). Elles incluent : - L’annotation des queues au moyen d’un marqueur spécifique permettant l’identification des individus (1 fois /semaine). - Les pesées : Une pesée sera réalisée avant chaque administration et une, avant l’euthanasie des animaux. - La prise de température rectale (10 à 15 prises espacées de 15 à 30 minutes sur une durée de 3 à 5 h). - La mise en contention avant toutes administrations intraveineuses (1 à maximum 4) ou prélèvements intermédiaires (maximum 4). - Les administration(s) intraveineuse(s) ou sous-cutanée(s) : 1 à maximum 4. A noter : Dans le cas d’administration répétées, un délai de minimum 24 à 48h sera respecté entre deux administrations. - Les administrations intrapéritonéales : 1 seul/individu (euthanasie). - Les prélèvements intermédiaires : Des prélèvements sanguins intermédiaires seront réalisés en cours de cinétique (maximum de 4 prélèvements de 50μl/semaine, ≤10% de la volémie sur 14 jours). Cette procédure ne présente pas d’anesthésie, pas d’analgésie, ni de chirurgie avec réveil.

Impact sur les animaux

Les nuisances ou effets indésirables sont les suivants : Un stress physique peut être induit lors de la mise en contention des animaux, la réalisation des différentes administrations intraveineuses, sous-cutanées (deux à quatre maximum par individu à une dose de 5.5ml/Kg ou 10ml/Kg respectivement) ou intrapéritonéale (dose unique de 0.1 ml de mélange d’anesthésiques/10g de souris), l’introduction d’une sonde rectale (prise discontinue sur 5h maximum) lors du monitoring de la température et lors de la réalisation de prélèvements sanguins intermédiaires (au maximum 4 prélèvements (≤50µl) /individus, n’excédant pas 10% de la volémie sur 14 jours). Un stress thermique peut quant à lui être généré par l’hypothermie induite (jusqu’à 32°C).

Devenir

En fin de procédure, les animaux seront mis à mort pour réaliser les prélèvements tissulaires et sanguins finaux. Si, en cours de cinétique, un individu atteint un point limite, l'animal sera également mis à mort en urgence après validation du vétérinaire et porteur de projet.

Remplacement

Pour mener à bien nos projets, nous réalisons en amont de nos procédures toute une série de tests in silico et in vitro. Cette première série de tests permet notamment de vérifier le maintien des interactions avec les récepteurs cellulaires mais en aucun cas de prendre en compte l'intégralité des paramètres physiologiques (mécanistiques, immunitaires, métaboliques et d'éliminations) qui conditionnent le succès de nos vecteurs médicaments. Pour faire face à cette sélection physiologique, nous envisagerons donc de réaliser nos expériences sur le petit animal de laboratoire, ici la souris, 1er modèle animal disponible se rapprochant de l’homme pour l’étude des mécanismes physiologiques in vivo. Il n'existe à l'heure actuelle aucun modèle prédictif de bio-informatique capable d'apporter toutes les réponses aux problématiques de la pharmacocinétique. Le modèle vivant, ici la souris, reste pour l'instant le seul système physiologique qui intègre la complexité de l'ensemble des paramètres mécanistiques et homéostasiques précédemment cités, indispensables à l’étude d’une efficacité pharmacologique chez les mammifères.

Réduction

L'optimisation de nos molécules permet d'améliorer leur efficacité tout en réduisant les doses administrées. Cette approche contribue à limiter les effets indésirables potentiels pour les animaux (raffinement) et à réduire le nombre d'animaux nécessaires pour obtenir des résultats fiables (réduction). Les animaux seront répartis en groupes de 6 (3 mâles et 3 femelles), correspondant au plus faible effectif permettant d'obtenir des résultats scientifiquement valides et robustes. Au total, jusqu'à 2160 souris pourraient être utilisées sur la durée de l'autorisation (5 ans). Ce nombre correspond au scénario maximal envisagé et tient compte de l'évaluation de plusieurs molécules dans différentes lignées de souris génétiquement modifiées nécessaires pour répondre aux objectifs du projet. Les tissus prélevés en fin d'étude seront sélectionnés de manière à maximiser les informations obtenues à partir de chaque animal et à éviter l'utilisation d'animaux supplémentaires. De plus, de très petits prélèvements sanguins réalisés au cours de l'étude permettront de suivre la présence des molécules dans l'organisme sans nécessiter de nouveaux animaux. Plusieurs analyses pourront ainsi être réalisées à partir d'un même animal. Cette stratégie contribue à réduire le nombre total d'animaux utilisés tout en garantissant la qualité scientifique des résultats.

Raffinement

Les animaux sont répartis à raison de 4 individus maximum par cage (de même sexe) et maintenus dans un environnement familier (même cage pour les odeurs, taille standard pour portoir ventilé + couvercle filtrant), litières (copeaux de bois) avec un triple enrichissement. Toutes les administrations sont réalisées par un personnel formé, expérimenté et pratiquant en routine les études de biodistribution chez la souris, tout en respectant les recommandations de volume injecté en fonction des voies d’administration. Les prélèvements intermédiaires de sang sont réalisés après asepsie de l’extrémité de la queue. Une compresse de gaz imbibée d’eau oxygénée est appliquée immédiatement après le prélèvement. Les prélèvements terminaux sont réalisés sur des souris sous anesthésie générale profonde et ayant préalablement étaient analgésiées.

Choix des espèces

Des études in silico et in vitro sont réalisées en amont afin de sélectionner les candidats les plus prometteurs. Toutefois, ces approches ne permettent pas de reproduire la complexité du fonctionnement d'un organisme vivant, indispensable pour évaluer le devenir et l'efficacité d'un candidat thérapeutique. À ce jour, aucun modèle alternatif ne permet de reproduire l'ensemble de ces mécanismes. La souris est un modèle de référence pour l'étude des mécanismes physiologiques in vivo. Elle permet d'évaluer les interactions complexes entre les différents systèmes de l'organisme, indispensables à l'étude de l'efficacité d'un candidat thérapeutique. L'utilisation de souris humanisées est particulièrement pertinente dans ce projet, car elles permettent d'étudier des mécanismes impliquant des protéines humaines et d'obtenir des résultats plus représentatifs de la physiologie humaine. Les lignées utilisées seront constituées de souris jeunes adultes âgées de 8 à 12 semaines (27 à 30 g). Ce stade de développement correspond à une maturité physiologique permettant de limiter la variabilité entre les animaux et d'obtenir des résultats plus homogènes.

À deux mois, une partie des souris passe à un régime riche en graisse, d'autres appartiennent à une lignée qui devient obèse d'elle-même, et les souris concernées peuvent développer une obésité et un diabète qui gênent leurs déplacements. Elles passent quatre fois 24 heures en pléthysmographie, quatre échocardiographies sous anesthésie, des mesures de pression et des prises de sang, puis vers quatre mois et demi une chirurgie pour implanter dans les voies aériennes un dispositif contre l'apnée du sommeil. 160 souris mâles vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Toutes subissent en dernier une seconde chirurgie, sans réveil, avant d'être tuées pour l'analyse de leurs tissus.

Objectifs

Le syndrome d’apnées obstructives du sommeil (SAOS) est une maladie fréquente touchant près d’un milliard de personnes dans le monde. Il se caractérise par une occlusion répétée au cours du sommeil des voies aériennes supérieures entraînant une chute du taux d’oxygène, une augmentation du dioxyde de carbone ainsi qu'une fragmentation du sommeil. Le SAOS est associé à une importante morbi-mortalité d’origine cardiovasculaire. En effet, il favorise la survenue de maladies comme l’hypertension artérielle, l’insuffisance cardiaque ou encore l’accident vasculaire cérébral. Le traitement de cette pathologie représente donc un véritable enjeu de santé publique. Si des traitements efficaces du SAOS existent (traitement de référence : pression positive continue), leur utilisation au long cours est limitée. Ainsi, en France, à 3 ans de l’initiation du traitement du SAOS, plus de la moitié des patients ont arrêté son utilisation en raison des effets secondaires trop fréquents. Les principales raisons d’abandon sont : des douleurs liées au port du masque ou à l’orthèse d’avancée mandibulaire, une sécheresse buccale, une obstruction nasale, ou encore des déplacements dentaires. Des approches médicamenteuses sont également en cours d’évaluation mais sont associés à des effets secondaires importants et à une efficacité moindre. Ces effets secondaires comprennent des sensations de nausées ainsi que des difficultés d’endormissement particulièrement délétères dans les maladies du sommeil. Une des limites des approches médicamenteuses est le fait qu’elles visent à traiter une maladie localisée (aux voies aériennes supérieures) par un traitement systémique. Au regard de ces éléments, il existe un besoin important d’alternatives thérapeutiques pour favoriser l’adhésion des patients aux traitements. Une approche localisée, dépourvue d’effets secondaires est donc nécessaire pour répondre aux besoins de santé des 1,5 millions de français diagnostiqués d’un SAOS et sans traitement. Ce projet vise à proposer une alternative à la pression positive continue au travers de l’insertion d’un dispositif médical dans les tissus des voies aériennes supérieures.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus reposent sur le traitement du SAOS (syndrome d’apnées obstructives du sommeil) et donc les patients atteints d’un tel syndrome dont le nombre est actuellement estimé à près d’un milliard dans le monde. Dans un premier temps, le produit développé et validé sera proposé en seconde ligne thérapeutique. En effet, la pression positive continue est une thérapeutique éprouvée et installée de longue date et restera l’indication première dans le traitement des apnées hypopnée obstructives du sommeil. Mais, en France, 50 pour cent des patients l’interrompent soit près d’un million cinq cents milles patients. Les raisons de cette interruption sont les contraintes liées au port d’un masque chaque nuit et l’entretien du matériel ainsi que les effets secondaires ressentis par les patients. Aussi, ce dispositif pourrait être proposé aux patients réfractaires en premier lieu. D’autre part, une première étude auprès d’une cohorte de patients atteints de SAOS a montré qu’y compris chez les patients ayant maintenu leurs traitements, la quasi-totalité serait volontaire pour avoir une alternative thérapeutique aussi efficace mais moins contraignante. En effet, notre solution permettrait de s’affranchir des contraintes inhérentes au traitement actuel, cette dernière ne nécessitant l’application d’aucun masque sur le visage, d’aucun matériel lourd difficile à transporter, et de source d’énergie pour fonctionner. Dans un second temps, le traitement pourra être proposé en première intention, initialement dans les formes modérées puis, dans les formes sévères du syndrome d’apnées obstructives du sommeil. Il existe ensuite des perspectives de traitement chez les patients ayant des formes légères de SAOS avec un traitement précoce de prévention du risque cardiovasculaire. Enfin, la technologie développée pourra trouver d’autres champs d’application médical dans les pathologies respiratoires ayant des mécanismes physiopathologiques similaires : trachéobronchomalacie ou dans d’autres pathologies d’organes caractérisées par des occlusions intermittentes de structures anatomiques.

Procédures

Certains animaux auront un phénotype dommageable pendant toute la durée du projet (obésité, diabète). Certains animaux auront ce phénotype suite à la mise en place d'un régime alimentaire riche en gras (à partir de 2 mois de vie et pendant toute la procédure). La composition corporelle sera évaluée au début de la procédure (animal vigile, 3 fois, 3 minutes). Des prélèvements sanguins seront réalisés (animal vigile, 4 fois, 1 minute). Plusieurs enregistrements seront effectués au cours du projet : 1)mesure de la pression artérielle (animal vigile, 4 fois, 10 minutes), 2)mesure respiratoire par pléthysmographie (mesure des paramètres respiratoires) (animal vigile, 4 fois, 24h), 3)mesure de la saturation en oxygène (animal vigile, 4 fois, 1h) et 4)echocardiographie (animal sous anesthésie générale, 4 fois, 20 minutes). Tous les animaux auront une chirurgie pour l'implantation du dispositif médical à évaluer (animal sous analgésie et anesthésie locale et générale, 1 fois, 30 minutes). Enfin les animaux auront un prélèvement sanguin sans réveil (animal sous analgésie et anesthésie générale, 1 fois, 2 minutes) et une chirurgie sans réveil avant l'euthanasie (animal analgésié et anesthésié, 1 fois, 30 minutes).

Impact sur les animaux

Certains animaux inclus dans ce projet auront un phénotype dommageable et pourront développer un diabète et une obésité pouvant altérer leur déplacement. La mise en place d'un aliment mou pourra provoquer une pousse excessive des incisives. Les mesures de la composition corporelle ainsi que les différents enregistrements réalisés (mesure de la pression artérielle, mesure du volume pulmonaire, mesure de la saturation en oxygène) pourront engendrer un stress chez les animaux. Les prélèvements sanguins pourront provoquer un hématome et un rare risque d'infection. Les échographies cardiaques seront réalisées sous anesthésie générale ce qui peut provoquer une hypothermie et une détresse cardiorespiratoire dans de très rares cas. Une chirurgie implantatoire et une chirurgie sans réveil seront réalisées sur tous les animaux, en plus des nuisances liées à l'anesthésie, les animaux pourront également ressentir de la douleur modérée en péri-opératoire ainsi qu'un risque d'infection ou de cicatrisation au niveau de l'incision.

Devenir

Les animaux seront euthanasiés selon les méthodes réglementaires en vigueur afin de réaliser les prélèvements tissulaires nécessaires aux analyses histologiques et biologiques. Ces analyses permettront d’évaluer l’intégration du dispositif implanté, la tolérance tissulaire et les mécanismes associés aux effets observés lors du suivi respiratoire.

Remplacement

Le développement du dispositif médical est réalisé en plusieurs étapes. Une version adaptée aux essais sur souris est conçue en parallèle d'une version destinée aux essais sur banc. Les essais sur banc permettent de vérifier le bon fonctionnement du dispositif, notamment sa réponse à une activation magnétique, et d'ajuster sa conception avant son utilisation chez l'animal. Cette phase d'optimisation permet de limiter les essais in vivo en validant au préalable les principales caractéristiques techniques du dispositif. Ensuite, un organisme vivant est nécessaire pour évaluer la faisabilité, la tolérance, la stabilité et l'efficacité du dispositif implantable. Il n'est pas possible de reproduire in vitro la complexité des interactions entre le dispositif, les tissus cervicaux, les mouvements respiratoires et les voies aériennes supérieures. L'évaluation de l'implantation, de son intégration tissulaire, de son activation et de son effet sur la perméabilité des voies aériennes nécessite l'utilisation d'un modèle murin in vivo. Ces paramètres ne peuvent être étudiés de manière pertinente que chez un organisme vivant, dans lequel les interactions anatomiques et physiologiques sont préservées.

Réduction

Le nombre d'animaux a été déterminé afin d'obtenir des résultats statistiquement exploitables tout en limitant leur utilisation. Une étude pilote sera d'abord réalisée sur un nombre restreint de souris (groupes de 5 souris) ne présentant pas de phénotype dommageable afin d'optimiser et de maîtriser la technique chirurgicale d'implantation. Une seconde étude pilote sera réalisée sur des animaux avec un phénotype induit similaire. La taille des groupes expérimentaux a été calculée à l'aide d'un logiciel avec des critères prédéfinis afin de déterminer la taille finale de l'échantillon nécessaire pour détecter des différences statistiquement significatives. L'effectif minimal est donc de 8 animaux par groupe. Cet effectif a été porté à 10 animaux par groupe afin de tenir compte des pertes potentielles liées à la zootechnie, aux complications chirurgicales ou à d'autres aléas expérimentaux, tout en garantissant une puissance statistique suffisante. Au total, 160 souris seront utilisées pour l'ensemble du projet.

Raffinement

Les conditions d’hébergement sont conformes à la réglementation. Les animaux sont hébergés avec leurs congénères (l’hébergement individuel est limité au maximum) en portoirs ventilés avec un système d’abreuvement automatique et un accès ad libitum à la nourriture et l’eau. Le milieu est enrichi avec deux enrichissements minimum et les animaux sont vérifiés quotidiennement. Le projet a été mis au point afin de permettre une interprétation fiable des résultats dans le respect du bien-être animal. Tout d'abord, le diabète des animaux sera contrôlé hedomadairement afin de le déceler précocement, le change des cages pourra également être augmenté en cas d'augmentation de la miction. Un bâton à ronger sera disponible dans les cages des animaux sous régime alimentaire mou. Pour limiter le stress des animaux, ils seront habitués aux différents tests réalisés et quand cela est nécessaire, ils seront sous anesthésie. Pour les chirurgies, les animaux seront sous analgésie et anesthésie afin de prévenir stress et douleur. Les animaux sous anesthésie seront maintenus sur tapis chauffant pour limiter l'hypothermie et un gel ophtalmique sera déposé sur les yeux pour limiter l'assèchement occulaire. Pour une meilleure récupération post-opératoire, les animaux seront placés sur litière douce et un gel appétant sera disposé dans leur cage. Ainsi, la douleur et le stress sont limités en apportant des soins adaptés ainsi qu’une surveillance attentive accompagnée de points limites suffisamment prédictifs et précoces.

Choix des espèces

Des souris sans mutation seront utilisées pour réaliser les études préliminaires permettant la mise au point et la validation de la chirurgie d'implantation. Ces souris ont une bonne sensibilité aux effets des régimes riche en gras (prise de poids et modifications métaboliques reproductibles). Le modèle obèse de souris utilisé ensuite est un modèle pertinent pour l'étude du syndrome d'apnées obstructives du sommeil (SAOS) associé à l'obésité. Contrairement aux modèles reposant sur une obstruction artificielle des voies aériennes, elle développe spontanément une obésité polygénique, un syndrome métabolique et des altérations anatomiques des voies aériennes supérieures proches de celles observées chez l'Homme. Elle présente également des caractéristiques cliniques du SAOS, telles qu'une augmentation des épisodes d'apnée-hypopnée, une fragmentation du sommeil et des désaturations en oxygène. Ces similitudes physiopathologiques et anatomiques font de cette souris un modèle translationnel particulièrement adapté pour évaluer l'efficacité de nouvelles approches thérapeutiques visant à maintenir la perméabilité des voies aériennes supérieures. Des animaux adultes seront utilisés car le SAOS augmente avec l’âge, nous avons caractérisé notre modèle préclinique avec des animaux mâles de 5-6 mois donc les animaux entreront en procédure à 2 mois de vie et la chirurgie aura lieu à 4 mois et demi de vie.

2 500 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour récupérer leurs organes et "de grands volumes de sang", dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune reçoit par chirurgie un fragment d'endomètre greffé dans l'abdomen, qui peut provoquer pertes de poids, douleurs abdominales et léthargie, puis subit des lavages vaginaux, des prélèvements sanguins et des traitements candidats contre l'endométriose. Jusqu'à 30 % de souris en surnombre sont incluses au départ pour former des groupes homogènes, sans que le résumé dise ce qu'il advient de celles qui ne sont pas retenues. Le porteur justifie le choix de souris adultes : elles "pourront ainsi mieux supporter la chirurgie d'induction et les effets secondaires liés à la procédure et aux composés à tester".

Objectifs

L’endométriose est une maladie touchant environ 10% des femmes en âge de procréer. En France, il est estimé que 2.5 millions de femmes sont touchées. Il s’agit d’une maladie inflammatoire chronique de l’appareil génital féminin se caractérisant par une dissémination et un développement de muqueuse utérine (endomètre) en dehors de l’utérus. Les lésions peuvent se situer au niveau de la paroi musculaire de l’utérus (myomètre), des ovaires, ou dans la paroi abdominale sur le péritoine. Ces lésions sont associées à de la fibrose. Cette maladie entraîne des douleurs cataméniales importantes (dysménorrhée), des douleurs pelviennes, abdominales, ombilicales, lombaires chroniques, et une infertilité. Il n’existe pas à ce jour de traitement de l’endométriose, d’où l’importance de développer de nouvelles stratégies thérapeutiques. Ce projet a pour but développer des modèles d’endométriose par la greffe de tissus endométriales en intrapéritonéal chez des souris receveuses. L’objectif est d’obtenir des lésions d’origine endométriale mimant le plus possible la pathologie humaine. Après un entrainement à la technique de greffe sur animaux morts, une première étude sera réalisée afin de vérifier l’induction d’endométriose. Des candidats de traitement de l’endométriose seront également administrés aux animaux afin de tester leur efficacité. Après cette première étude, une analyse rétrospective sera réalisée afin d’évaluer les modèles et apporter le raffinement nécessaire avant de lancer les études suivantes.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de tester de nouvelles molécules candidates pour une utilisation en préventif ou en thérapeutique sur l’endométriose. A terme, cela permettra l’introduction en clinique de nouvelles stratégies thérapeutiques pour cette maladie, pour lesquelles les options sont pour le moment limitées.

Procédures

La chirurgie d’induction de l’endométriose par la greffe de fragment dans le péritoine sera réalisée 1 fois au cours de l’étude (inférieur à 1 heure). Avant les traitements, les animaux sont sélectionnés pour former des groupes homogènes (stress légers durant quelques heures). Des lavages vaginaux seront réalisés afin de suivre le cycle oestral de la souris ce qui engendrera un léger inconfort. Au cours de l’étude, le développement de l’endométriose pourra engendrer chez les animaux des signes cliniques comme des pertes de poids transitoires et/ou des douleurs abdominales et une forme de léthargie. Le suivi rapproché des animaux permettra de limiter ces signes cliniques à un niveau modéré. Dans le cas d’administrations de traitements par injections ou dans le cas de prélèvements sanguins, ceux-ci génèreront une douleur limitée à celle d’une piqûre d’aiguille (inférieur à 5 min). L’administration de composés par voie orale induira un stress léger inférieur à 5 min. Une session d’imagerie non invasives type IRM induira un stress léger (inférieur à 1 heure).

Impact sur les animaux

La chirurgie d’induction de l’endométriose par la greffe de fragment dans le péritoine pourra engendrer une douleur modérée sur 1-2j et un stress modéré. Au cours de l’étude, le développement de l’endométriose pourra engendrer chez les animaux des signes cliniques comme des pertes de poids transitoires et/ou des douleurs abdominales et une forme de léthargie. Le suivi rapproché des animaux permettra de limiter ces signes cliniques à un niveau modéré. Dans le cas d’administrations par injections ou dans le cas de prélèvements sanguins, ceux-ci génèreront une douleur limitée à celle d’une piqûre d’aiguille. L’imagerie IRM ou bioluminescence induira un stress léger. Au cours d’une étude, les animaux seront manipulés. Les mesures de poids entraînent un stress que l’on peut considérer comme faible, et qui diminue avec l’habituation.

Devenir

Après les procédures, les animaux seront mis à mort afin de pouvoir procéder à la récupération des organes et de grands volumes de sang, nécessaires pour évaluer l’efficacité des composés testés sur la maladie d’intérêt.

Remplacement

Les méthodes alternatives ne permettent pas, à ce jour, de prévoir l’efficacité in vivo de potentiels candidats-médicaments dans ce type de pathologie, car les étapes nécessaires au développement d’un médicament pour lesquelles il est nécessaire d’étudier les interactions du médicament dans un contexte global ne peuvent pas être étudiées dans un système alternatif (in vitro par exemple). Des méthodes alternatives de reconstruction d’organes en 3D sont utilisées mais sont toutefois marginales et ne présentent pas dans le cas présent une alternative robuste et envisageable.

Réduction

Dans chaque étude, les animaux seront répartis en groupes expérimentaux selon le(s) critère(s) défini(s) (poids, stade d’évolution de la maladie). Le nombre de groupes contrôles sera ajusté à la question scientifique posée et des paramètres étudiés. Les variations de ces paramètres et de la mortalité entre les groupes contrôles et traités seront comparées pour évaluer les composés testés. La validité scientifique nécessite d’utiliser un nombre minimum d’animaux par groupe pour que les tests statistiques soient valides et représentatifs d’éventuelles variations inter-individus. L’analyse statistique sera effectuée au moyen d’un test d'analyse de la variance (ANOVA). Une étude peut être composée de 2 à 10 groupes (au minimum un groupe controle, non traité et un groupe avec induction de l’endométriose et un groupe induit et traité ; plusieurs groupes traités possibles pour évaluer différents traitements, doses etc). Le nombre d’animaux par groupe variera généralement entre 3 (biodistribution) à 15 (dans le cas de multiples paramètres d’efficacité à évaluer) par dose de produit. Jusqu’à 30% d’animaux excédentaires pourront être inclus initialement (avant sélection) afin de plus facilement constituer des groupes homogènes (possibilité de sélectionner les animaux par imagerie en fonction du développement de la maladie). Pour réduire le nombre d’animaux utilisés dans ces procédures, il sera toujours proposé d’utiliser des biomarqueurs et des techniques faiblement invasives d’imagerie chez le petit animal.

Raffinement

La chirurgie d’induction est réalisée après administration d’anesthésique local, sous anesthésie générale avec couverture analgésique durant 48h post chirurgie. La couverture analgésique pourra être prolongée de 24 à 48h si nécessaire. La chirurgie sera réalisée de façon aseptique, avec maintien de la température corporelle et surveillance jusqu’au réveil puis toutes les 2h sur 6h au total. Suite à la chirurgie les animaux seront suivis quotidiennement durant 4 jours (pesée et observation quotidienne). Si nécessaire des soins seront prodigués aux animaux par le vétérinaire. Les prélèvements seront effectués suivant les recommandations de la SBEA (anesthésie, volume, fréquence, antalgie). Les expérimentateurs sont formés pour reconnaître les signes de souffrances et les points limites. Les personnes en charge du bien-être et du soin des animaux veillent au respect des points limites. De l’enrichissement sera utilisé. Des animaux adultes seront utilisés. Dans toutes les cages, un gel nutritif et de l’eau gélifiée seront rajoutés, la quantité de nourriture en fond de cage sera augmentée en pré et post chirurgie et en cas de perte de poids supérieur à 10% en cours d’étude. Les scores cliniques les plus élevés et les pertes de poids élevées ou prolongées constitueront des points limites.

Choix des espèces

Les modèles d’endométriose sont bien documentés chez la souris. Les petits rongeurs, outre l’avantage lié à leurs caractéristiques physiologiques, sont les seules espèces animales disponibles pour l’expérimentation présentant un statut immunodéprimé (avec des mutations spontanées ou génétiquement modifiées) indispensable à l’implantation de cellules ou de tissus humaines dans le cadre de la recherche. De plus, l’évaluation de l’efficacité prè clinique des nouvelles molécules chimiques ou biologiques doivent être réalisées a minima sur une espèce rongeur (par exemple la souris), la connaissance de la dose active dans un modèle rongeur (par exemple la souris) est une donnée critique qui permet de calculer la fenêtre thérapeutique entre la dose active sur la pathologie et la dose toxique dans la même espèce. Les animaux seront utilisés à l’âge adulte (7-8 semaines lors de leur première manipulation). Des animaux adultes sont utilisés afin qu’ils aient leur poids et leur morphologie adulte, ils pourront ainsi mieux supporter la chirurgie d’induction et les effets secondaires liés à la procédure et aux composés à tester.

Ce projet mesure comment un candidat médicament passe dans l'organisme puis en est éliminé, dernière étape avant les premiers essais chez l'être humain. Au total, 890 rongeurs, 630 souris et 260 rats, vont être utilisés, tous tués à l'issue pour prélever leurs tissus, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Certains sont génétiquement modifiés pour ne pas produire une protéine de transport, d'autres reçoivent de l'Elacridar pour la bloquer quand les lignées modifiées sont indisponibles ou "trop coûteux", puis le produit leur est donné jusqu'à une fois par jour pendant un mois, avec jusqu'à sept microprélèvements de sang. Le porteur mentionne des "effets indésirables du produit" parmi les nuisances, sans dire lesquels.

Objectifs

Le projet a pour objectif de mieux comprendre comment un futur médicament est absorbé par l'organisme, distribué dans les différents organes, transformé, puis éliminé. Ces étapes sont essentielles pour s'assurer qu'un médicament est efficace et qu'il peut être utilisé en toute sécurité. Une attention particulière sera portée à certaines protéines présentes dans l'organisme qui agissent comme des « portes d'entrée » ou des « pompes » pour les médicaments. Elles contrôlent leur passage dans des organes tels que l'intestin, le foie, les reins ou le cerveau et peuvent influencer leur efficacité ou leurs effets indésirables. L'objectif est de déterminer le rôle de ces protéines dans le devenir des médicaments, d'identifier d'éventuelles interactions avec d'autres traitements et de mieux anticiper les situations où l'utilisation d'un médicament pourrait nécessiter des précautions particulières, par exemple chez des personnes souffrant de maladies du foie ou des reins. Pour cela, nous comparerons le comportement du médicament chez des animaux présentant naturellement ces protéines et chez des animaux spécialement développés pour ne pas produire l'une d'elles. Dans certains cas, lorsque ces modèles ne sont pas disponibles, une substance permettant de bloquer temporairement l'action de cette protéine sera utilisée. Après l'administration du médicament, une ou plusieurs fois selon les besoins de l'étude (jusqu'à une administration par jour pendant un mois maximum), des prélèvements de sang et d'autres tissus seront réalisés à différents moments afin de mesurer la quantité de médicament présente dans l'organisme. Ce projet s'inscrit dans les dernières étapes de la recherche avant les essais chez l'être humain. Les résultats permettront de compléter les études déjà réalisées en laboratoire et d'améliorer les connaissances sur l'utilisation future de ces médicaments chez les patients.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus de ce projet sont de mieux comprendre comment les futurs médicaments se comportent dans l’organisme et quels facteurs peuvent influencer leur efficacité ou leur sécurité. Cette étude permettra notamment d’identifier le rôle de certaines protéines naturelles de l’organisme qui peuvent modifier le passage et l’élimination des médicaments. Ces informations aideront à prévoir d’éventuelles interactions avec d’autres traitements et à mieux adapter l’utilisation des médicaments chez certains patients, notamment ceux présentant des problèmes de fonctionnement du foie ou des reins. Les résultats obtenus apporteront des données scientifiques importantes pour préparer les futures étapes du développement des médicaments, avant leur évaluation chez l’être humain. Ces études chez l’animal permettent d’obtenir une vision globale du fonctionnement d’un organisme vivant, avec l’ensemble des interactions entre les différents organes, ce qui ne peut pas être reproduit totalement par des modèles réalisés uniquement en laboratoire sur des cellules. Enfin, les données recueillies permettront de comparer plusieurs molécules en développement afin d’identifier celles qui présentent le meilleur potentiel pour poursuivre leur développement en tant que futurs traitements.

Procédures

Le médicament étudié pourra être administré soit par voie orale, soit par injection. L’administration sera réalisée sur une courte durée (environ 1 à 3 minutes). Dans le cas d’administrations répétées par voie orale, le traitement pourra être donné une fois par jour pendant une durée maximale d’un mois. Les administrations par voie intraveineuse seront effectuées sous anesthésie générale profonde, pour une durée limitée (maximum 5 minutes), afin de réduire l’inconfort de l’animal. Les animaux pourront faire l’objet de prélèvements sanguins de courte durée (environ 2 minutes). Lorsque plusieurs prélèvements seront nécessaires, ceux-ci seront espacés et réalisés dans une limite maximale de 7 microprélèvements par animal. À la fin de l’étude, les prélèvements nécessaires à l’analyse pourront être réalisés sous anesthésie générale profonde.

Impact sur les animaux

Les nuisances attendues lors de ce protocole sont celles liées à la contention, l'administration du produit à tester, aux prélèvements sanguins, à la mise en boite pour l'anesthésie gazeuse et dans la boite chauffante (avant les injections intravéneuses) pouvant induire un stress chez l'animal et aux effets indésirables du produit.

Devenir

Différent tissus étant récupérés pour analyse, chaque animal sera donc mis à mort.

Remplacement

Dans le cadre de la mise au point de nouveaux médicaments, ce projet nécessite l’utilisation de rongeurs (rats ou souris), car il n’existe actuellement pas de méthode alternative suffisamment fiable permettant de reproduire le fonctionnement complet d’un organisme vivant. Les études réalisées uniquement en laboratoire sur des cellules ne permettent pas de comprendre pleinement comment un médicament se comporte dans un organisme entier, avec les interactions entre les différents organes et et les mécanismes biologiques complexes qui peuvent influencer son efficacité, son absorption et son élimination. Avant une éventuelle utilisation chez l’être humain, les études chez l’animal constituent une étape importante pour évaluer le comportement du médicament dans l’organisme, notamment sa distribution dans les différents organes et son élimination. Les modèles de rats ou de souris utilisés dans ce projet sont actuellement les modèles les plus adaptés et bien décrits scientifiquement pour étudier le rôle de certaines protéines de transport impliquées dans le devenir des médicaments. Lorsque certains modèles génétiquement modifiés ne sont pas disponibles ou trop coûteux, une substance capable de bloquer temporairement l’action de ces protéines pourra être utilisée. Cette même substance sera également utilisé plus tard pour des tests chez l'homme afin d'évaluer l'implication de ce transporteur. Les molécules étudiées auront déjà fait l’objet de nombreuses évaluations en laboratoire avant cette étape afin de sélectionner les candidats les plus prometteurs et présentant le meilleur profil de sécurité. Ainsi, ce projet ne sera pas utilisé pour tester un grand nombre de nouvelles molécules au hasard, mais interviendra uniquement à une étape avancée du développement, après l’identification d’un ou des candidats médicaments présentant un potentiel thérapeutique intéressant pour l'homme. Les résultats obtenus permettront d’accompagner son développement avant les premières évaluations chez l'homme.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés dans chaque groupe sera limité au strict nécessaire afin d’obtenir des résultats fiables tout en évitant l’utilisation d’animaux supplémentaires. Le nombre d’animaux choisi permet de tenir compte des différences naturelles entre les individus et de réaliser des analyses scientifiques permettant de vérifier que les résultats obtenus sont fiables et interprétables. D’après l’expérience acquise au laboratoire sur plus de 20 ans, l’utilisation de 3 à 5 animaux par groupe permet généralement d’obtenir des résultats suffisamment précis et reproductibles. Plusieurs prélèvements à différents moments seront réalisés afin de suivre l’évolution du médicament dans l’organisme au cours du temps. Ces mesures permettent de mieux comprendre son absorption, sa diffusion dans le corps et son élimination. Les résultats obtenus feront l’objet d’analyses statistiques adaptées afin de comparer les différents groupes d’animaux et de déterminer si les différences observées sont liées au traitement étudié ou simplement aux variations naturelles entre les individus.

Raffinement

Les animaux sont hébergés en animalerie et sont acclimatés au minimum 5 jours avant l'expérimentation pour s'habituer à leur nouvel environnement et diminuer le stress. Chaque cage dispose d'un bloc de lanières de papier pour aider à la nidation et d'un enrichissement (tunnel pour se cacher). Tout mal être identifié aboutira à une surveillance accrue de l'animal et à des soins si besoin. Le personnel zootechnicien est sensibilisé pour remonter tout comportement suspect d'un animal soit durant le temps d'acclimatation, soit durant l'expérimentation. Les traitements se feront par du personnel formé et avec du matériel adéquat pour chaque espèce (canule pour gavage, taille cage, nombre d'animaux dans chaque cage,...). Des récompenses (ex : graînes de tournesol) pourront également être proposés lors des traitements répétés.

Choix des espèces

Les espèces animales utilisées dans ce projet seront uniquement des rongeurs adultes de petite taille (rats ou souris) présentant les caractéristiques recherchées pour l’étude. Ces modèles sont privilégiés car ils permettent d’obtenir des résultats fiables avec un nombre limité d’animaux et de réduire les quantités de médicament nécessaires. Ces animaux sont également des modèles bien étudiés et présentent des similitudes avec l’être humain, ce qui permet de mieux comprendre le comportement des futurs médicaments avant leur éventuelle utilisation chez les patients. Les résultats obtenus pourront être comparés à ceux issus d’autres études réalisées chez des animaux ne présentant pas cette modification génétique, afin de mieux identifier l’influence du transporteur étudié sur le devenir du médicament dans l’organisme. Lorsque l’utilisation d’animaux génétiquement modifiés n’est pas possible, une substance appelée Elacridar pourra être utilisée pour bloquer temporairement l’action d’une protéine de transport spécifique. L’utilisation de cette approche est bien documentée dans la littérature scientifique chez le rat et la souris depuis plusieurs années.

Sur un tapis de course dont la vitesse augmente progressivement, des souris courent jusqu'à montrer des signes de fatigue, 166 d'entre elles ayant été nourries d'un régime riche en graisse. 286 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré : tests de préhension, tests de tolérance au glucose avec mise à jeun et queue incisée, échocardiographie sans anesthésie. Le porteur parle d'une "activité volontaire", alors que la vitesse est imposée et que le test s'arrête aux signes de fatigue. Les souris, âgées de 6 à 21 mois, sont mises à mort pour prélever leurs organes, et le porteur dit avoir aussi retenu l'espèce parce que sa petite taille permet de "réduire les coûts".

Objectifs

Dans un contexte de vieillissement de la population mondiale, vieillir en bonne santé est un enjeu majeur de santé publique. Parmi les pathologies gériatriques, la sarcopénie, caractérisée par une diminution de la masse et de la fonction musculaires, est particulièrement associée aux risques de chutes et de fractures, à une perte d’autonomie et à une plus grande vulnérabilité. En parallèle du vieillissement de la population, la prévalence de l’obésité accélère le vieillissement et exacerbe la sarcopénie (obésité sarcopénique) par des mécanismes biologiques encore mal connus. Ce projet vise donc à développer de nouvelles voies thérapeutiques permettant de prévenir, de freiner ou d’améliorer la sarcopénie et l‘obésité sarcopénique; il s’inscrit donc dans une stratégie globale d’amélioration de l‘autonomie et de la qualité de vie des personnes âgées. La sarcopénie est une pathologie multifactorielle, impliquant de nombreux mécanismes biologiques. Des études préliminaires sur des modèles in vitro et chez le ver C. elegans ont montré que l’inhibition de l’expression de certains gènes améliore la structure et la fonction musculaire. Dans le cadre d’une approche de recherche scientifique translationnelle, il est désormais question de tester et de valider ces résultats dans un modèle murin plus proche de l’humain.

Bénéfices attendus

Prévenir et/ou réduire la sarcopénie et l’obésité sarcopénique augmenterait le bien-être et l’autonomie des personnes âgées. Des études déjà réalisées in vitro et sur le ver C. elegans ont permis d’identifier des pistes thérapeutiques prometteuses. Dans une démarche de recherche translationnelle, il est désormais question de tester ces pistes chez la souris car elles pourraient ouvrir la voie vers de nouvelles thérapies envisageables chez l’homme.

Procédures

Intervention nutritionnelle : le régime enrichi en graisse entraîne une prise de poids et peut conduire à des troubles métaboliques. Une surveillance régulière permettra d’intervenir si nécessaire. 166 animaux concernés. Injections (1/souris) : aucun effet indésirable majeur n’est attendu à la suite des injections qui seront réalisées sous anesthésie de courte durée. L’intervention a déjà été testée in vitro et chez le ver C elegans et des effets bénéfiques pour la santé musculaire ont été observés. Les mêmes bénéfices sont attendus chez la souris. 286 animaux concernés. Mesures physiologiques Grip tests (2/souris) : Test de préhension non-invasif qui permet d’évaluer la force musculaire. Pas d’effet indésirable attendu hormis un stress léger de contention de courte durée. 240 animaux concernés. Exercice sur tapis de course (1/souris) : Après acclimatation, on procède à une augmentation progressive de la vitesse et on mesure le temps de course maximal. Le test est arrêté lorsque l‘animal montre des signes de fatigue. Il s’agit donc d’une activité volontaire donc pas d‘effet délétère envisagé. 240 animaux concernés. Mesures métaboliques Test de tolérance au glucose (2/souris) : sur les souris mises à jeun, on réalise une injection de glucose et on suit la glycémie à T=0, 15min, 30 min, 60 min, 90 min et 120 min après prélèvement d’une goutte de sang au niveau de la queue incisée. Aucun effet indésirable n’est attendu hormis un stress de courte durée lors des prélèvements. 240 animaux concernés. Echocardiographie : réalisée par un opérateur expérimenté ; nécéssite une contention minimale, donc un stress minimal, 1 à 2 min maximum, sans anesthésie car cela impacte directement le rythme cardiaque. 240 animaux concernés.

Impact sur les animaux

Les animaux sont alimentés avec un régime riche en graisse pour imiter l'obésité humaine. Aucun effet douloureux n’est prévu. Nous vérifions quotidiennement leur santé et leur bien-être (poids, comportement). Lors des suivis métaboliques et physiologiques, le moindre signe de malaise (ex. polyurie associée à un diabète sévère) entraîne un arrêt immédiat de l'analyse et exclut l'animal du protocole. Aucun effet délétère n‘est attendu des tests physiologiques, métaboliques et échographiques. Les injections visant à améliorer la fonction musculaire ont déjà montré des effets bénéfiques in vitro et chez le ver C. elegans. Les mêmes bénéfices sont attendus chez la souris.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort pour permettre le prélèvement post mortem de plusieurs organes nécessaires à l’analyse des effets du traitement thérapeutique.

Remplacement

Ce projet s’inscrit dans une démarche de recherche scientifique translationnelle, en continuité avec des études exploratrices déjà réalisées in vitro et chez le ver C. elegans. L’objectif est de pouvoir proposer de nouvelles stratégies thérapeutiques applicables chez l’homme. Il est donc indispensable de passer à un modèle mammifère murin, physiologiquement plus proche de l’homme, afin d’étudier des processus biologiques qui reposent sur l’interaction entre de nombreux organes, tissus et types cellulaires. Même si les stratégies thérapeutiques ont déjà été étudiées in vitro et chez C. elegans, on ne peut préfigurer des effets physiologiques qu'en les testant dans un mammifère vivant.

Réduction

Dans un but de réduire l’utilisation excessive d’animaux, le nombre d’animaux a été calculé sur la base de protocoles déjà publiés et de données préliminaires. 8 à 10 animaux par groupe, est le minimum pour obtenir suffisamment de matériel biologique afin de réaliser l’ensemble des analyses nécessaires, ainsi que de tests statistiques permettant de tirer des conclusions solides et fiables.

Raffinement

Des points limites ont été définis pour chacune des procédures. Tout signe témoignant d’une mauvaise tolérance du régime hypercalorique (par exemple perte de poids, souffrance, apathie) conduira à l’interruption de la procédure. Les animaux seront maintenus en groupes sociaux leur permettant d’exprimer leurs comportements naturels avec leurs congénères et les cages seront enrichies (par exemple : maison en carton, papier kraft) pour leur permettre de nicher. Un examen clinique des animaux sera effectué quotidiennement. De plus, les procédures que nous utiliserons ont été optimisées et standardisées, ce qui permet de limiter la répétition des procédures.

Choix des espèces

La souris a été choisie pour de multiples raisons. D’abord, la souris est un animal de petite taille, ce qui permet de réduire les coûts et son élevage est simple et rapide. Nous disposons également de nombreux outils moléculaires pour faciliter les études biologiques dans le muscle squelettique post-mortem. Par ailleurs, ce projet s’inscrit dans une démarche de recherche scientifique translationnelle, en continuité avec des études déjà réalisées in vitro et chez C. elegans. Comme l’humain, la souris est aussi un mammifère. Donc si l’intervention thérapeutique testée a un effet bénéfique in vitro, chez C. elegans (déjà étudié) puis chez la souris, il est probable que les bénéfices seront maintenus chez l’humain. Nous étudierons à la fois un stade juvénile (6-7 mois), un stade adulte (11-13 mois) et un stade âgé (18-21 mois) pour pouvoir mesurer l’efficacité du silençage (knock down) respectivement dans la prévention et l’amélioration de la sarcopénie (pathologie gériatrique).

104 souris vont être utilisées, chacune portant une tumeur greffée sous la peau du flanc ou une arthrite induite par injection de collagène, puis recevant un traceur radioactif et passant cinq séances d'imagerie sous anesthésie avec cinq prises de sang. Toutes sont tuées et disséquées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. L'arthrite provoque des douleurs articulaires qui peuvent limiter les déplacements, et les anti-inflammatoires ne sont donnés que si le porteur le juge "indispensable", car ils modifieraient l'inflammation étudiée. Le traceur doit servir à suivre des cellules thérapeutiques modifiées génétiquement, et le porteur dit vouloir d'abord démontrer "la faisabilité et la pertinence" de cette imagerie, des études chez des patients étant prévues à terme.

Objectifs

Les thérapies par cellules modifiées représentent une nouvelle approche très prometteuse pour traiter certaines maladies graves, notamment le cancer. Elles consistent à prélever des cellules immunitaires ou réparatrices chez un patient, puis à les modifier génétiquement afin qu’elles agissent plus efficacement contre la maladie. Les cellules modifiées, déjà utilisées avec succès contre certains cancers du sang, sont aujourd’hui étudiées pour traiter d’autres maladies, notamment les maladies auto-immunes. Dans ces maladies, le système immunitaire attaque par erreur les propres tissus de l’organisme. Les cellules modifiées pourraient permettre de mieux contrôler cette réponse anormale lorsque les traitements classiques sont inefficaces. Parallèlement, le laboratoire de recherche développe une autre approche basée sur des cellules réparatrices modifiées. Contrairement aux cellules modifiées précédentes qui détruisent leurs cibles, ces cellules réparatrices modifiées ont pour objectif de réguler et d’apaiser le système immunitaire afin de limiter l’activité des cellules responsables de la maladie, sans les éliminer directement. Malgré leur potentiel thérapeutique, il reste essentiel de mieux comprendre le comportement de ces cellules une fois administrées : où elles se déplacent dans l’organisme, combien de temps elles survivent, quand elles s’activent et si elles présentent des risques pour les patients. Pour répondre à ces questions, nous développons un traceur innovant permettant de suivre ces cellules dans l’organisme de manière non invasive et sur une longue durée en imagerie médicale. L’objectif de nos travaux est de créer un outil d’imagerie universel, applicable à différents types de cellules modifiées, permettant d’évaluer leur répartition dans l’organisme, leur activité, leur efficacité et leur sécurité. Des études chez l’animal puis, à terme, chez les patients sont prévues. Cette approche contribuera à accélérer le développement de nouvelles thérapies cellulaires pour les cancers et les maladies auto-immunes.

Bénéfices attendus

Ce projet vise à développer une nouvelle méthode d’imagerie permettant de suivre dans l’organisme des cellules génétiquement modifiées utilisées comme traitement. Pour cela, nous avons conçu un traceur capable de reconnaître spécifiquement les cellules modifiées. En l’associant à un marqueur radioactif utilisé en imagerie médicale, il deviendrait possible de visualiser et de suivre ces cellules directement dans le corps. Une telle innovation pourrait transformer le suivi des thérapies cellulaires en permettant d’observer où les cellules se déplacent, combien de temps elles restent présentes dans l’organisme et comment elles se comportent après leur administration. L’objectif principal du projet est de démontrer la faisabilité et la pertinence de cette approche d’imagerie. Les études réalisées chez l’animal permettront d’évaluer la capacité du traceur à détecter les cellules modifiées et d’améliorer la compréhension de leur fonctionnement dans l’organisme. À terme, ce traceur pourrait constituer un outil d’imagerie innovant et largement applicable à différents types de cellules modifiées. Il contribuerait ainsi à améliorer l’évaluation de l’efficacité et de la sécurité de ces thérapies, aussi bien dans la recherche que dans leur future utilisation chez les patients.

Procédures

Les animaux seront soumis à plusieurs interventions expérimentales visant à évaluer la distribution et la cinétique du radiopharmaceutique étudié. Au préalable, pour le modèle tumoral, une greffe tumorale sera réalisée afin d’établir le modèle tumoral nécessaire à l’étude. Cette greffe consistera en l’injection sous-cutanée de cellules tumorales dans le flanc de l’animal, réalisée sous conditions d’asepsie. Concernant le modèle d’arthrite, une injection de collagène en sous-cutanée dans la base de la queue de l’animal sera réalisé sous conditions d’asepsie pour développer chez la souris une arthrite. Les procédures sont rapides (quelques minutes) et l’apparition des premiers signes cliniques de tumeur ou d’arthrite (gonflement des pattes) surviennent en 2 à 3 semaines après injection. Chaque animal recevra ensuite soit une administration unique du radiopharmaceutique, soit une injection de cellules modifiées radiomarquées ou non et suivi d’une ou plusieurs administrations du radiopharmaceutique, toutes par voie intraveineuse. Ces administrations seront réalisées sur animaux vigiles, maintenus par contention douce, et dure généralement moins d’une minute par animal. Après administration, les animaux seront soumis à 5 sessions d’imagerie afin de suivre la distribution du radiopharmaceutique. Pour ces acquisitions, les animaux seront anesthésiés afin d’assurer leur immobilité et de limiter le stress pendant l’examen. Chaque imagerie dure en moyenne entre 30 et 40 minutes, incluant l’anesthésie et la phase de réveil. Cinq prélèvements sanguins de 0,02 ml seront également réalisés pendant l’anesthésie avant le passage sous caméra, pour limiter la douleur et le stress, au niveau de la veine caudale afin d’évaluer la cinétique sanguine du radiopharmaceutique et les paramètres hématologiques. Les volumes prélevés respecteront les recommandations afin de ne pas compromettre l’état physiologique des animaux. Après chaque intervention (imagerie et prélèvement), les animaux seront replacés dans leurs cages et feront l’objet d’une surveillance régulière de leur état général et de leur comportement par le personnel animalier. À l’issue du dernier point temporel, les animaux seront euthanasiés en s’assurant d’une perte de conscience rapide et de minimiser toute souffrance. Une dissection sera ensuite réalisée afin de prélever les organes d’intérêt (foie, rate, reins, cœur, poumons, cerveau et autres tissus pertinents).

Impact sur les animaux

Les effets indésirables attendus au cours de ces études concernent principalement la présence de la tumeur ou de l’arthrite induite, l'injection de cellules modifiées, l'utilisation de faibles quantités de substances radioactives pour l'imagerie médicale et les différentes manipulations réalisées sur les animaux. La croissance de la tumeur peut entraîner une dégradation de l'état général, une perte de poids, une douleur ou une gêne au niveau de la tumeur. Dans certains cas, une partie de la tumeur peut se détériorer (nécrose). Le modèle d'arthrite utilisé dans cette étude provoque également des douleurs au niveau des articulations, ce qui peut limiter les déplacements et le confort des animaux. Les cellules modifiées injectées peuvent provoquer une réaction inflammatoire temporaire, pouvant se traduire par une baisse d'activité, un hérissement des poils ou une légère variation de la température corporelle. Cette réaction est toutefois généralement absente chez les souris utilisées dans cette étude. Les substances radioactives utilisées servent uniquement à réaliser des images médicales et sont administrées à très faible dose. Aucune toxicité particulière n'est donc attendue. En revanche, des injections répétées peuvent entraîner une faible exposition cumulative aux rayonnements, susceptible de provoquer une fatigue modérée et une légère diminution de certains globules blancs. Les différentes manipulations (injections, anesthésie pour les examens d'imagerie et prises de sang) peuvent également être une source de stress ou provoquer une légère inflammation au point d'injection. Les animaux seront suivis régulièrement afin de détecter rapidement tout signe de souffrance ou de dégradation de leur état de santé. Si des signes importants apparaissent, comme une perte de poids importante, une grande faiblesse ou une douleur persistante, l'étude sera arrêtée pour l'animal concerné afin de préserver son bien-être.

Devenir

A l’issue de la procédure, les animaux seront euthanasiés puis disséqués afin d’étudier la répartition du traceur dans leur organisme. Leur euthanasie est nécessaire pour atteindre les objectifs scientifiques de l’étude, qui consistent à déterminer dans quels organes et tissus le produit se retrouve et en quelle quantité (foie, rate, reins, cœur, poumons, cerveau, etc…). L’analyse directe des organes après euthanasie permet d’obtenir des mesures précises qui ne peuvent pas être obtenues de manière suffisamment fiable par les seules méthodes d’imagerie réalisées sur l’animal vivant. La dissection permettra également d’analyser plusieurs organes et paramètres à partir d’un même animal et ainsi d’obtenir le maximum d’informations à partir de chaque animal utilisé. Elle contribue ainsi à limiter le nombre d’animaux nécessaires à l’étude, conformément au principe de réduction. Les animaux ne pourront donc pas être maintenus en vie ou réutilisés à l’issue de la procédure, la poursuite de leur utilisation n’étant pas compatible avec les prélèvements nécessaires à l’étude. L’euthanasie sera réalisée selon une méthode réglementaire appropriée, suivie des prélèvements prévus au protocole.

Remplacement

Des méthodes permettant d’éviter ou de limiter l’utilisation d’animaux ont été prises en compte dès la conception du projet. Les différentes étapes de développement et de validation du traceur ont d’abord été réalisées en laboratoire, sur des cellules. Ces études ont permis notamment de vérifier que le traceur reconnaît bien sa cible, qu’il reste stable et qu’il conserve son activité biologique. Des cellules murines et humaines, exprimant ou non les cibles étudiées, ont été utilisées pour comparer ces différentes propriétés. Le marquage des cellules modifiées sera également étudié en laboratoire afin de vérifier qu’il n’altère ni leur survie ni leur fonctionnement. Cependant, ces méthodes ne permettent pas de reproduire l’ensemble des phénomènes qui se produisent dans un organisme vivant. Il est notamment nécessaire d’étudier la répartition du traceur dans l’organisme, son accumulation dans la tumeur et son évolution au cours du temps. Le comportement des cellules modifiées dans leur environnement tumoral ne peut pas non plus être reproduit de manière suffisamment fiable en laboratoire. L’utilisation d’animaux reste donc nécessaire pour répondre aux objectifs du projet.

Réduction

Les effectifs ont été définis sur la base de données préliminaires, de la littérature et d’analyses statistiques afin d’utiliser le nombre minimal d’animaux nécessaire à la démonstration des hypothèses. L’utilisation de techniques d’imagerie non invasive permet un suivi longitudinal des mêmes animaux, réduisant ainsi le nombre total de souris requises. Lorsque cela est possible, plusieurs paramètres biologiques (imagerie, prélèvements sanguins, distribution ex vivo) sont collectés sur un même animal. De plus, les modèles expérimentaux sont conçus pour mutualiser les groupes témoins entre les quatre études lorsque cela est scientifiquement pertinent, contribuant ainsi à une réduction globale du nombre d’animaux utilisés. Ces techniques d’imagerie permettent de réduire le nombre d’animaux utilisés dans les protocoles expérimentaux puisqu’il n’y a pas d’euthanasie à chaque temps d’imagerie.

Raffinement

Les souris seront hébergées dans des conditions adaptées et contrôlées afin de préserver leur santé. Elles seront maintenues dans des cages spécialement équipées permettant de limiter leur exposition aux microbes et aux infections. Des contrôles réguliers de l’environnement seront réalisés afin de garantir des conditions d’hébergement sûres et adaptées à leur fragilité. Un suivi attentif des animaux sera réalisé tout au long de l’étude. Leur état général, leur poids, leur comportement et l’apparition éventuelle de signes de douleur ou de malaise seront surveillés régulièrement. Des critères précis sont définis pour arrêter l’expérimentation avant son terme si un animal présente des signes de souffrance trop importants. Si nécessaire, des traitements contre la douleur ou l’inflammation pourront être administrés afin d’améliorer le confort des animaux, après évaluation par les personnes responsables du bien-être animal et le vétérinaire. Dans le modèle d’arthrite utilisé, les traitements anti-inflammatoires seront utilisés uniquement si cela est indispensable, car ils peuvent modifier l’inflammation étudiée. Leur objectif sera alors de limiter une inflammation excessive et d’améliorer le bien-être de l’animal, sans chercher à supprimer complètement la maladie étudiée. Les différentes manipulations (injections, prélèvements sanguins et examens d’imagerie) seront réalisées avec des méthodes adaptées à la taille et au poids des souris afin de limiter leur inconfort. Les examens d’imagerie seront effectués sous anesthésie, avec une surveillance continue de l’animal et un maintien de sa température corporelle. Après l’examen, les souris seront placées dans un espace de réveil adapté avant de retourner dans leur cage.

Choix des espèces

Des souris sont utilisées dans cette étude car il n'existe pas aujourd'hui de méthode permettant de remplacer complètement un organisme vivant. Les expériences réalisées sur des cellules en laboratoire ou les simulations informatiques ne permettent pas de reproduire toutes les interactions qui se produisent dans le corps, notamment la façon dont un médicament se répartit dans les différents organes, interagit avec les cellules immunitaires et la tumeur, puis est éliminé par l'organisme. Des souris adultes âgées de 6 à 8 semaines seront utilisées, car leur organisme et leur système immunitaire sont pleinement développés. Cet âge est celui le plus couramment utilisé dans ce type de recherche. Il permet d'obtenir des résultats fiables et comparables entre les animaux, tout en respectant les principes visant à remplacer, réduire et améliorer l'utilisation des animaux en recherche (principe des 3R).

Les souris utilisées appartiennent à une souche "fortement immunodéprimée", choisie pour que leur organisme ne rejette pas des cellules tumorales humaines. 206 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour le prélèvement des tumeurs, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune reçoit par chirurgie sous anesthésie générale un fragment de tumeur du sein sous la peau, puis 25 gavages en cinq semaines et des mesures de la tumeur deux fois par semaine pendant huit semaines, pour tester une combinaison de deux traitements. Le porteur annonce des douleurs post-chirurgicales et une gêne à la marche quand la tumeur atteint le point limite, dont il ne donne pas la taille.

Objectifs

Certains gènes peuvent être impliqués dans des fusions génétiques qui représentent 0,2 % des tumeurs solides. Les protéines qui en découlent viennent se lier à des récepteurs qui favorisent la survie et la croissance des cellules. Les patients atteints d'un cancer et concernés par cette fusion reçoivent des traitements avec une efficacité limitée. L’immunothérapie n’est pas une option pour eux, et les chimiothérapies sont rapidement inefficaces. Les thérapies ciblées n’atteignent pas des taux de réponses satisfaisants et les tumeurs développent rapidement des résistances, prouvant que la compréhension des tumeurs avec fusion est encore incomplète. Pour étudier les mécanismes de réponse aux thérapies ciblées, nous avons utilisé un modèle cellulaire de cancer du sein avec une fusion génétique. Les traiter avec certaines thérapies ciblées leur fait exprimer une nouvelle protéine. Nous voulons donc explorer le rôle de cette protéine dans les réponses aux traitements aux thérapies ciblées. L’objectif de notre projet in vivo ici présenté est d’évaluer l’efficacité du ciblage de cette protéine d'intérêt par un traitement novateur en combinaison avec une thérapie ciblée classique, afin d’améliorer la réponse.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus concernent la santé des patients atteints de cancer du sein. Ce projet permettra de tester l’efficacité antitumorale de la combinaison d’un traitement classique et d’un traitement novateur qui cible une protéine spécifique de la tumeur. Il servira de preuve de concept montrant une réduction de la progression tumorale, grâce à cette nouvelle combinaison de traitements.

Procédures

Pour chaque souris : une injection sous cutané d’un anti-douleur 30 mn avant la chirurgie, une injection d’un anesthésique local 5 mn avant la chirurgie, une implantation de la tumeur par chirurgie sous anesthésie générale, 5 gavages/semaine pendant 5 semaines (durée 30s), mesures de la tumeur et pesées (durée < 2 minutes) 2x/semaine pendant 8 semaines. Pour certaines souris, 2 injections intra-veineuse (durée < 2mn).

Impact sur les animaux

- Douleurs post-chirurgicales après implantation de fragments de tumeurs sous-cutanée et suture. - Douleur de courte durée lors des gavages ou de l’injection en intra-veineux (

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin des procédures pour réaliser le prélèvement des tumeurs.

Remplacement

Avant le passage sur l’animal, la sensibilité des cellules aux traitements a déjà été évalué in vitro en cultures 2D. Des tests de ces traitements sont nécessaires sur un organisme entier plus complexe pour évaluer au mieux leur efficacité. La sensibilité des cellules tumorales aux traitements anti-cancéreux dépend fortement du microenvironnement, ce qui nous manque en in vitro.

Réduction

Nous avons déterminé le nombre d’animaux nécessaire par groupe d'étude grâce à un logiciel de biostatistiques, ce qui nous permet de réduire au maximum le nombre d'animaux utilisés tout en restant statistiquement significatifs.

Raffinement

Avant toute manipulation, les animaux bénéficieront d’une période d’acclimatation et d’habituation au(x)manipulateur(s) pendant 7 jours. L’état général, le comportement (activité, isolement …), les critères physiques (poils hérissés, dos vouté) ou le moindre signe de douleur sera évalué et annoté sur une fiche de suivi, et comparé à la grille de score de référence (scoring de 0 à 8) pour prendre les mesures nécessaires afin que le bien-être animal soit respecté. Un analgésique sera administré au minimum 30 mn avant l’intervention chirurgicale afin de palier à la douleur, et chaque fois qu’un score de 3 sera atteint lors du suivi des animaux. Les souris seront anesthésiées avant la chirurgie et avant la mise à mort pour minimiser leur stress. Les animaux seront hébergés en groupe de 6 souris par cage et chaque cage présentera des enrichissements (coton de nidation, tunnels pour jeux) régulièrement renouvelés. Les copeaux de litière seront remplacés par de la cellulose afin d’être moins irritants pour les souris présentant des tumeurs et éviter les nécroses. Un test de prise de traitement spontanée sera réalisé pour remplacer la technique de gavage.

Choix des espèces

Les souches murines sont particulièrement adaptées pour l’étude de tumeurs. Afin d’éviter le rejet de la greffe des cellules tumorales humaines, l’utilisation d’une souche murine fortement immunodéprimée est requise. Les animaux seront utilisés à l’âge de 5 à 6 semaines afin de favoriser la prise tumorale.