Procédures modérées

1 800 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une partie reçoit une injection destinée à déclencher une inflammation de la moelle épinière, l'autre subit en plus une chirurgie de 45 minutes reproduisant un traumatisme cervical, suivie d'une paralysie transitoire, d'une perte allant jusqu'à 20 % du poids et, pour 1 % des animaux, d'une automutilation de la patte. Le projet veut savoir si une inflammation préalable modifie la récupération après un tel traumatisme. Toutes sont tuées pour prélever la moelle épinière et l'analyser.

Objectifs

Les lésions de la moelle épinière au niveau cervical sont relativement fréquentes chez l’homme, entrainant des problèmes au niveau locomoteur ainsi qu’au niveau du contrôle neural de l’activité respiratoire et cardio-vasculaire, représentant ainsi la première cause de mortalité chez les patients. Une restauration partielle spontanée de l’activité respiratoire, cardiovasculaire ainsi que locomotrice peut être observée après lésion incomplète au niveau cervical, principalement due à une réorganisation des connexions nerveuses restantes. Cette récupération reste modeste et peut être fortement influencée par l’état médical antérieur des individus, notamment lorsqu’une maladie ou un épisode inflammatoire a déjà sollicité le système immunitaire de la moelle épinière. Dans ce cas, la réponse immunitaire à un traumatisme ultérieur ne sera pas la même que chez un individu dont le système immunitaire spinal est sollicité pour la première fois. Il est donc nécessaire d’identifier l’impact d’une atteinte inflammatoire préalable de la moelle épinière sur les processus inflammatoires et plastiques déclenchés à la suite d’un traumatisme de la moelle épinière.

Bénéfices attendus

Les traumatismes cervicaux de la moelle épinière entraînent des déficits respiratoires et cardiovasculaires majeurs, altérant fortement la qualité de vie des patients. Les résultats attendus de ce projet se situent à l’interface entre recherche fondamentale, recherche préclinique et applications cliniques, et visent à améliorer la compréhension des mécanismes qui limitent la réparation du système nerveux après un traumatisme de la moelle épinière. L’identification de ces processus permettra d’approfondir nos connaissances de la physiopathologie des lésions de la moelle épinière et d’orienter le développement de nouvelles approches thérapeutiques ciblant spécifiquement les mécanismes neuroinflammatoires et neuroplastiques impliqués dans la récupération. Un apport majeur de ce projet réside dans la comparaison entre les animaux présentant une neuroinflammation de la moelle épinière préalable et ceux subissant uniquement le traumatisme de la moelle épinière. Les différences attendues dans la réponse inflammatoire et dans les capacités de réparation entre ces groupes mettront en évidence l’importance de l’état immunitaire initial de la moelle épinière. Ces résultats soutiendront l’idée que le passif inflammatoire d’un patient constitue un déterminant crucial de sa trajectoire de récupération et qu’il doit être pris en compte pour optimiser les interventions thérapeutiques. À terme, ce projet contribuera ainsi à promouvoir des stratégies de médecine de précision, mieux adaptées au profil de chaque patient et potentiellement plus efficaces pour améliorer les fonctions perdues.

Procédures

Les animaux seront soumis à l’une des deux procédures. Une partie des animaux recevront une injection d’un composé permettant d’induire une neuroinflammation. Différentes concentrations de ce composé seront testés afin de déterminer la concentration permettant d’induire une neuroinflammation spinale significative chez nos animaux, sans induire de phénotype pathologique délétère. Cette concentration sera déterminée dans cette procédure grâce à des tests comportementaux (maximum 2 par animal, d’une dizaine de minutes chacun), ainsi que des évaluations fonctionnelles neuromusculaires (force de contraction et excitabilité neuromusculaire, durant une dizaine de minutes chacune). L'autre partie des animaux seront injectés avec le composé à la concentration déterminée précedemment, puis recevront une chirurgie sous anesthésie générale (chirurgie durant environ 45 minutes), permettant de créer le modèle préclinique de trauma de la moelle épinière cervicale, afin de mimer la pathologie humaine. Ces animaux seront ensuite eux aussi soumis à des tests comportementaux et fonctionnels.

Impact sur les animaux

Les nuisances attendues ou effets indésirables pouvant être attendus sur les animaux sont : - Stress et douleur potentiellement induits par l’administration en intra-péritonéal du composé testé sur souris vigile en contention. - Paralysie transitoire des pattes avant et arrière du côté lésé suite à la lésion de la moelle épinière cervicale. Cette paralysie est transitoire et disparaît en l’espace d’une semaine, permettant à l’animal de retrouver une locomotion comparable à celle observée avant la lésion spinale. - Perte de poids jusqu’à 20% du poids initial durant la première semaine après lésion de la moelle épinière cervicale. - Autophagie de la patte arrière contralatérale à la lésion spinale (1% des animaux).

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin du protocole, et les tissus récupérés pour être utilisés dans des analyses tissulaires, cellulaires et moléculaires

Remplacement

À l’heure actuelle, il n’existe aucun modèle expérimental permettant d’étudier de manière pertinente et intégrée les réponses physiologiques complexes autrement qu’à travers des organismes vivants. Les connectivités neuronales et les interactions neuro-immunitaires impliquées dans ces processus ne peuvent être reproduites ni par des modèles in vitro, ni par des approches in silico. De plus, les manipulations nécessaires à l’étude de ces mécanismes, telles que l’intervention sur certains systèmes de neurotransmission ou les analyses neurochimiques en conditions physiologiques, ne peuvent pas être réalisées chez l’être humain. En l’absence d’alternative scientifiquement valable, l’utilisation de modèles animaux demeure indispensable pour répondre aux objectifs du projet.

Réduction

L’étude repose sur l’analyse de l’influence d’un état inflammatoire spinal préexistant sur la récupération fonctionnelle après une lésion cervicale incomplète de la moelle épinière, un concept encore peu exploré nécessitant une approche intégrative in vivo. Le protocole expérimental a été spécifiquement conçu afin de limiter le nombre d’animaux au strict nécessaire, en s’appuyant sur les données déjà disponibles dans la littérature et sur l’expertise du laboratoire concernant la physiopathologie des lésions de la moelle épinière cervicales. Ces connaissances ont permis de définir précisément le niveau et la sévérité de la lésion, ainsi que les fenêtres temporelles d’analyse, afin de réduire la variabilité interindividuelle et d’éviter toute répétition expérimentale non justifiée. Par ailleurs, les mêmes animaux sont suivis longitudinalement pour l’évaluation des paramètres comportementaux et respiratoires, ce qui permet de maximiser la quantité de données obtenues par individu et de réduire le nombre total d’animaux requis tout en garantissant la robustesse statistique de l’étude.

Raffinement

L’ensemble des procédures expérimentales a été élaboré afin de minimiser la contrainte imposée aux animaux et de préserver leur bien-être tout au long de l’étude. Le choix d’un modèle de lésion cervicale incomplète de la moelle épinière permet d’induire des déficits fonctionnels pouvant être compensés physiologiquement chez les animaux, évitant ainsi des atteintes sévères et prolongées. Les interventions chirurgicales sont réalisées sous anesthésie générale, associée à une analgésie péri- et post-opératoire adaptée, et les paramètres opératoires ont été optimisés sur la base de l’expérience du laboratoire afin de limiter la durée de la chirurgie et les manipulations. Le suivi fonctionnel repose majoritairement sur des évaluations comportementales et respiratoires non-invasives, réalisées chez les mêmes animaux au cours du temps, ce qui permet de limiter les manipulations et d’éviter des procédures supplémentaires. Enfin, l’état clinique des animaux est surveillé quotidiennement après la lésion de la moelle épinière, et les conditions d’hébergement et de manipulation sont adaptées afin de réduire le stress, favoriser la récupération fonctionnelle et assurer une prise en charge individualisée, conformément aux principes de raffinement. Des tissus de moelle épinière seront de plus récupéré après mise à mort des animaux afin poursuivre en profondeur cette étude par des expérimentations moléculaires et cellulaires.

Choix des espèces

Nous utilisons cette espèce pour plusieurs raisons : 1) Plusieurs élevages de souris de laboratoires sont disponibles 2) Grâce à leur petite taille et leur cycle de vie court, les conditions environnementales peuvent être contrôlées de la naissance à l’âge adulte 3) Les souris constituent un modèle reproductible d’étude de la neurobiologie respiratoire et cardiovasculaire 4) Les souris ont un taux de mortalité faible (moins de 2%) suite à une lésion médullaire cervicale 5) Les souris présentent une récupération motrice très rapide suite à une lésion médullaire cervicale 6) Un des aspects clés du programme de recherche concerne les voies nerveuses phréniques croisées (voies respiratoires), données publiées dans la littérature 7) Les souris et les humains partagent plusieurs caractéristiques communes dans le contrôle du système respiratoire et cardiovasculaire, ce qui en fait un bon modèle préclinique. Les animaux utilisés seront des souris jeunes adultes (âgées de 8-12 semaines) afin de s’affranchir de toutes incidences liées au développement de l’individu. La nécessité d’avoir un sujet adulte s’avère indispensable afin d’étudier de manière précise les effets de potentielles futures stratégies réparatrices qui pourront être appliquées sur des patients humains adultes.

Immunisées puis prélevées à répétition, 372 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. Chaque animal reçoit jusqu'à douze injections et subit jusqu'à quatre prises de sang et dix-sept prélèvements d'urine sous contention, au risque de douleurs, d'infections et, dans les formes sévères, d'une rétention d'eau. Le projet vise à comprendre les mécanismes d'une maladie rénale auto-immune et le porteur justifie l'espèce par sa proximité physiologique avec l'humain. L'objectif tient toutefois en une phrase et ne nomme ni le modèle précis ni les substances injectées.

Objectifs

Notre projet vise à améliorer la compréhension des mécanismes immunologiques responsables de l'apparition d'une maladie rénale auto-immune dans un modèle de souris.

Bénéfices attendus

Ce projet contribuera à améliorer la compréhension des mécanismes physiopathologique impliqués dans l'apparition et la progression d'une maladie rénale auto-immune. Ces connaissances fondamentales pourraient ouvrir la voie à de nouvelles stratégies thérapeutique plus personnalisées, visant à contrôler plus efficacement l’activité de la maladie et à limiter les rechutes chez l'Homme.

Procédures

1 à 12 injections sur animaux vigiles 30 secondes par injection; 1 à 4 prélèvements sanguins sur animaux vigiles, 30 secondes par prélèvement. 4 à 17 prélèvements d’urine à partir de miction spontanée pendant une contention manuelle, 20 secondes par prélèvement. Lorsqu'il y aura des prélèvements sanguins, ceux-ci seront réalisés le même jour que les prélèvements d'urine. 1 prélèvement sanguin terminal,30 secondes par prélèvement.

Impact sur les animaux

Lors des manipulations, peuvent être sujettes à stress et angoisse voire des douleurs modérées liées aux contentions multiples auxquelles s’additionnent les d’injections, prélèvements d’urine et de sang. Des complications peuvent survenir au cours de la procédure d’immunisation, d’injection ou du prélèvement sanguin, notamment une mauvaise cicatrisation, un léger saignement, une infection du site de l'injection/prélèvement ou stress lié à la contention. Une rétention d'eau modérée peut survenir dans les formes sévères de la maladie. Une immunodéficience peut être présente.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort en fin de procédure pour prélèvement et analyse histologique et biochimique

Remplacement

Le modèle de souirs permet une étude sur l'être vivant et permet de se rapprocher de la physiologie humaine. La souris est adaptée à notre étude car sa proximité avec l’être humain se traduit par la présence chez cette espèce d’homologies physiologiques très étroites avec notre espèce, notamment en ce qui concerne le système immunitaire et le système rénal auxquels nous nous intéressons.

Réduction

Le nombre d’animaux a été établi grâce à l’utilisation de tests statistiques permettant de calculer le nombre minimal d’animaux nécessaire pour obtenir des résultats fiables et robustes. Le nombre d’animaux a également été fixé qu'à partir des données de la littérature.

Raffinement

Les animaux seront hébergés en groupe dans un environnement enrichi. Les souris immunodéprimées seront séparéées et hébergées dans un milieu protecteur adapté à leur statut immunitaire. Les animaux feront l’objet d’une surveillance quotidienne (comportement, apparence générale, signes cliniques) par le personnel animalier ainsi que par les personnes en charge de l’expérimentation. Toute apparition de signes de douleur ou de souffrance, tels que la prostration, le dos voûté, l’isolement ou le poil hérissé, entraînera l’ouverture d’une fiche de score comportant des points limites clairement définis, pouvant conduire, le cas échéant, à l’euthanasie de l’animal. Une attention particulière sera portée au site d’injection abdominale (recherche de rougeur ou de signes inflammatoires) ainsi qu’au suivi du poids.

Choix des espèces

Le modèle murin permet une étude in vivo et permet de se rapprocher de la physiologie humaine. De plus, ce modèle murin est déjà publié et développé. Les souris seront âgées de 12 semaines, soit à un stade de développement adulte (système immunitaire mature). C'est également l'age des souris dans les articles publiés.

1 440 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des molécules candidates par voie orale, sanguine, cutanée, musculaire ou abdominale pendant six semaines, avec des prélèvements de sang répétés, sans qu'aucun analgésique ne puisse leur être administré car il fausserait les mesures immunitaires. Ces essais sont menés à façon pour des laboratoires publics et privés, chaque protocole étant fixé par le partenaire. Le porteur qualifie l'ensemble de "recherche responsable" respectant les 3R, alors que le service consiste à tester en série des composés pour des tiers.

Objectifs

Ce projet vise à évaluer la tolérance et l’efficacité de nouvelles molécules thérapeutiques chez la souris, dans le cadre d’études réalisées pour des laboratoires publics et privés. Ces molécules peuvent cibler différentes maladies, comme les maladies auto-immunes ou inflammatoires, ou agir sur certaines fonctions précises du système immunitaire. Les expériences consistent à administrer ces molécules à des souris saines ou présentant un modèle de maladie, afin d’étudier les effets sur leur organisme et d’identifier les réponses immunitaires associées. Les modèles utilisés sont choisis en accord avec les partenaires, selon la nature du traitement et les objectifs scientifiques recherchés. Ce projet s’inscrit dans une démarche de recherche responsable : toutes les procédures sont standardisées et encadrées par des protocoles validés, dans le respect de la réglementation et du bien-être animal. Le personnel impliqué est spécifiquement formé et qualifié pour garantir des manipulations sûres, des résultats fiables et la prise en compte des principes des 3R (Remplacement, Réduction, Raffinement). En centralisant et en harmonisant ces études, notre unité contribue à la production de données scientifiques robustes tout en réduisant le nombre d’animaux utilisés et en assurant la qualité éthique et technique des expérimentations.

Bénéfices attendus

Ce projet a pour finalité d’évaluer la tolérance et l’efficacité de composés thérapeutiques développés par différents partenaires académiques et industriels. Ces études précliniques constituent une étape essentielle dans le développement de nouveaux médicaments, avant toute évaluation chez l’être humain. L’objectif scientifique est de déterminer si les molécules testées présentent une activité biologique mesurable et compatible avec une utilisation thérapeutique potentielle. Les données obtenues permettront d’orienter la poursuite du développement de ces candidats, soit vers des études complémentaires, soit vers des essais cliniques lorsqu’ils démontrent un profil de sécurité et d’efficacité satisfaisant. La mise en œuvre de ces expérimentations chez la souris se justifie par la pertinence de ce modèle dans l’étude du système immunitaire et des mécanismes inflammatoires, ainsi que par la possibilité de transposer certaines réponses physiologiques à l’humain. En standardisant ces études au sein d’une même structure d’appui, le projet garantit la fiabilité des résultats, la reproductibilité des analyses et le respect rigoureux du bien-être animal. Il contribue ainsi à la qualité scientifique et éthique des recherches précliniques et à la réduction du nombre global d’expérimentations nécessaires pour valider les candidats thérapeutiques.

Procédures

Administration des traitements candidats : applications de crème et/ou administrations par différentes voie systémique (orale, sanguine, cutanée, musculaire, abdominale) selon le schéma défini avec le partenaire : pendant 6 semaines maximum (durée du geste : environ 0.5 à 3min selon le geste). Une anesthésie gazeuse ou chimique peut être nécessaire suivant la voie d’administration choisie. Prélèvements sanguins (sur animaux vigiles) : le nombre de prélèvement est établi par le partenaire, chaque prélèvement est espacé d’au moins 7 jours (durée : environ 2min) (à partir de J0), et le volume de sang prélevé respectera les limites recommandées pour éviter tout risque pour l’animal. Pesées : 2 fois par semaine, durée : 2 min (à partir de J0). Observation quotidienne (quelques dizaines de secondes par cage) (à partir de J-3). Mise à mort à la fin de l’étude ou plus tôt si un point limite (critère prédéfini indiquant que l’animal ne peut plus continuer l’expérience sans souffrance majeure) est atteint.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables seront principalement liés à l’administration des traitements, aux anesthésies et aux prélèvements sanguins. Anesthésies : -Isoflurane : Stress lié à la répétition et irritation respiratoire légère. -Anesthésie/analgésie chimique : Récupération lente, diminution transitoire de l’activité motrice, hypothermie, baisse d’appétit, parfois respiration ralentie. Une surveillance rapprochée et des mesures de confort (tapis chauffants, hydratation) seront mises en place. Prélèvements sanguins : Gêne transitoire au point de prélèvement, stress de contention Voies d’administration des composés (préalablement testés pour toxicité par les partenaires, sans effets indésirables attendus) : -Intramusculaire : Douleur locale, gêne musculaire, risque de nécrose. -Sous-cutanée/Intradermique : Douleur modérée, irritation locale, croûtes, réaction inflammatoire locale, persistant de quelques jours à plusieurs semaines. En phase avancée, une mobilité réduite peut survenir en cas de gêne mécanique. -Intraveineuse Rétro-orbitale : Douleur légère. -Intraveineuse Caudale/Intrapéritonéale : Douleur légère, stress de contention. -Voie orale (gavage) : Stress de contention, risque d’irritation œsophagienne. -Voie orale (eau de boisson) : Altération possible du goût, réduction de la consommation. -Topique : Irritation cutanée mineure. Impact global : Chaque intervention (anesthésie, injections, prélèvements, pesées) aura un impact léger à modéré sur le bien-être de l’animal. Cependant, leur répétition ou leur accumulation pourra entraîner un stress plus marqué. Par ailleurs, une réaction systémique exceptionnelle (réponse immunitaire et inflammatoire généralisée) pourrait provoquer une perte de poids ainsi que des signes cliniques généraux et comportementaux. L’ensemble de ces effets indésirables fera l’objet d’un suivi quotidien à l’aide d’une grille de score. Le respect strict des points limites permettra d’assurer l’arrêt ou l’adaptation des procédures avant toute atteinte majeure au bien-être animal.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à l’issue de l’expérimentation. Cette étape est indispensable pour permettre le prélèvement des tissus et organes nécessaires aux analyses histologiques, biochimiques et immunologiques.

Remplacement

Aucune méthode alternative ne permet aujourd’hui de reproduire de façon fiable le fonctionnement complet du système immunitaire. L’étude des effets des molécules thérapeutiques doit se faire dans un organisme vivant, où toutes les interactions biologiques et les mécanismes de régulation sont présents. Le modèle murin (la souris) est le plus adapté pour ces recherches, car son système immunitaire est bien connu et proche de celui de l’être humain. De plus, il existe de nombreux outils scientifiques validés permettant d’étudier avec précision les réponses immunitaires chez ce modèle.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés dans chaque expérience est déterminé à partir de données issues d’expériences précédentes. Cela permet de calculer le nombre minimal d’animaux nécessaires pour obtenir des résultats fiables sur le plan statistique, sans multiplier inutilement les essais. Avant toute expérimentation animale, des tests préliminaires réalisés in vitro (en laboratoire sur des cellules, sans animal) par nos partenaires permettent également de réduire le nombre de groupes à tester. En moyenne, chaque groupe comporte huit animaux, un nombre suffisant pour assurer la solidité des résultats tout en limitant le recours à l’animal. Le nombre total de groupes peut varier selon le type de molécule ou le nombre de doses à comparer. Les données recueillies sont ensuite analysées avec des outils statistiques adaptés, afin d’exploiter au mieux les résultats et d’éviter de répéter les expériences. Toutes les procédures sont conçues pour minimiser le nombre d’animaux utilisés et optimiser la qualité scientifique des études, dans le respect des principes des 3R (Remplacement, Réduction, Raffinement).

Raffinement

Les animaux sont observés chaque jour par un personnel formé et qualifié, afin de détecter rapidement tout signe de douleur ou de mal-être. Une grille de suivi, adaptée à chaque protocole, permet d’évaluer l’état général des souris (comportement, poids, apparence, activité). Si un seuil critique est atteint, l’animal est retiré de l’étude et mis à mort de manière éthique et respectueuse, selon des procédures validées. Les manipulations pouvant provoquer une gêne ou une douleur sont réalisées par du personnel formé et compétent sous anesthésie appropriée, généralement gazeuse, ou chimique pour les interventions plus douloureuses. Lorsqu’un traitement est administré dans l’eau, la consommation est contrôlée chaque jour. Si le goût modifié entraîne une baisse de consommation, un sirop sans sucre peut être ajouté pour garantir une bonne hydratation et un confort alimentaire suffisant. L’administration d’antalgiques ou d’anti-inflammatoires n’est pas possible dans ce projet, car ces produits modifieraient les paramètres immunitaires étudiés. Pour compenser cette contrainte, plusieurs mesures de confort sont mises en place : utilisation de tapis chauffants pendant les anesthésies, manipulation douce et calme pour limiter le stress, alimentation enrichie et hydratée après les interventions, surveillance renforcée durant les périodes sensibles. Toutes les décisions sont guidées par une grille de score et un arbre décisionnel garantissant une évaluation objective et rigoureuse du bien-être animal. Les euthanasies sont réalisées dans des conditions adaptées, à l’écart des autres animaux, afin d’éviter toute source de stress.

Choix des espèces

La souris a été choisie car il s’agit d’un mammifère dont le patrimoine génétique est très proche de celui de l’être humain (environ 99 % des gènes sont communs). C’est un animal de petite taille, facile à élever et à manipuler, avec un cycle de reproduction rapide, ce qui en fait un modèle de référence en recherche biomédicale. Le fonctionnement du système immunitaire de la souris est bien connu et présente de fortes similitudes avec celui de l’homme. Cela permet d’obtenir des informations utiles pour mieux comprendre les mécanismes immunitaires et évaluer le potentiel de nouvelles molécules thérapeutiques avant leur utilisation chez l’humain. Les souris seront utilisées à partir de l’âge de 6 semaines, moment où leur système immunitaire est complètement mature. L’utilisation d’animaux jeunes adultes (pesant environ 20 g) permet d’assurer des réponses immunitaires stables, de limiter les variations liées à la croissance et de garantir la reproductibilité et la fiabilité des résultats expérimentaux.

Toutes tuées après le suivi de leurs fonctions locomotrices, 530 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des injections de vecteurs viraux dans le liquide céphalorachidien ou les muscles des pattes arrière, puis passent des tests de démarche, de sensibilité et de force pendant plusieurs mois. Le projet teste des approches de thérapie génique contre deux formes de la maladie de Charcot-Marie-Tooth, sur des souris qui en reproduisent les atteintes nerveuses et musculaires. Le porteur présente une preuve de concept censée déboucher un jour sur des essais chez des patients, la mise à mort servant à examiner les tissus nerveux atteints.

Objectifs

Ce projet a pour but de tester des approches de thérapie génique "ciblant le gène et le type cellulaire atteint " sur des modèles souris de la maladie de Charcot marie tooth (CMT). Il s'agit notamment de déterminer l'effet bénéfique d'injections de vecteurs viraux médicament exprimant un gène thérapeutique.

Bénéfices attendus

L'ensemble de ce projet nous permettra de déterminer si les approches de thérapie génique proposées ont un effet bénéfique pour améliorer ces deux formes de Charcot Marie Tooth (CMT). Il s'agit d'une étude préclinique qui permettra, en cas de bénéfices thérapeutiques, d'établir la preuve de concept de l'efficacité de ce type d'approche de thérapie génique ciblée pour la maladie de Charcot marie tooth (CMT). A plus long terme ces approches pourront être mise en place pour d'autres formes de CMT et déboucher sur des essais cliniques pour les patients atteints de CMT.

Procédures

L'ensemble des animaux (n=530) subiront des injections de type intrathécales au niveau lombaire ou intramusculaires dans les pattes arrières. Ces interventions sont de courte durée (de l'ordre de 5 minutes).

Impact sur les animaux

Les deux types d’injections se feront sous courte anesthésie gazeuse. Ces injections seront réalisées au moyen de fines seringues à insuline et ne nécessite pas d’incision de la peau ou du muscle au préalable. En se basant sur notre expérience et celle de nos collaborateurs ,ces injections entrainent peu d'effets indésirables. Nous espérons notamment retarder voire prévenir l'apparition des symptômes grâce à l'approche thérapeutique que nous proposons. Néanmoins, elles peuvent occasionallement induire une inflammation locale ou légères irritations et ainsi un léger inconfort qui sera surveillé dans les jours suivants l’intervention. Par la suite, les fonctions locomotrices de ces souris seront évalués au cours du temps au moyen de 3 ou 4 tests permettant d'analyser la démarche de la souris, la sensibilité de ces pattes ou encore la force de ces muscles. Ces tests entrainent peu d’inconfort aux souris. L’ensemble de ces tests pour un stade donné, seront effectué sur 3 ou 4 semaines afin de ne réaliser qu’un test par semaine et assurer une récupération aux animaux. Une grille de score sera utilisée pour évaluer différents critères (poids, apparence, comportement général, blessure etc.) rendant compte de l'état de santé général de l'animal. La classification modérée des procédures prend en compte le cumul du phénotype de la souris CMT et des injections et tests effectués chez ces animaux.

Devenir

A l'issu des études comportementales l'ensemble des animaux seront euthanasiés afin de déterminer l'effet bénéfique des thérapies proposés au niveau cellulaire sur les tisssus atteints dans la pathologie de Charcot Marie Tooth (CMT) (diminution de la dégénérescence axonale, réduction des défauts de myéline, etc.).

Remplacement

Il est difficile d'accéder aux cellules de patients du système nerveux périphériques (neurones moteurs et sensitifs et cellules de Schwann) et particulièrement les cellules de Schwann qu'il est impossible de différentier à partir de cellules pluripotentes humaines. Ainsi seuls des modèles souris nous permettent à l'heure actuelle d'établir la preuve de concept des thérapies que nous proposons pour envisager par la suite un essai thérapeutique chez l'homme.

Réduction

Le nombre d'animaux a été limité au minimum nécessaire pour mettre en évidence un effet significatif sur des paramètres de locomotion, force musculaire et vitesse de conduction nerveuse. De plus il s'agit d'une étude longitudinale c'est-à-dire que les mêmes groupes d'animaux seront suivis à différents stades (3,6 et 12 mois) afin de suivre à long terme l'effet bénéfique des thérapies.

Raffinement

Afin d'améliorer le bien être animal au cours de notre étude, les besoins physiologiques des animaux seront respectés (nourriture à volonté, enrichissement, stabulation en petit groupe, analgésiques après injection). Des points limites seront définis et les animaux seront mis à mort lorsqu'ils atteindront le critères d'interruption.

Choix des espèces

La souris reste un des modèles les plus aisés à modifier génétiquement et proche de l'homme (99% des gènes sont homologues). Elle est l'espèce la plus utilisée pour modéliser des maladies neurodégénératives ou neuromusculaires telles que la CMT. Elles développent la plupart du temps des anomalies observées chez l'homme et ont permis de mieux comprendre les mécanismes cellulaires sous-jacents à ces pathologies. Dans notre cas, les lignées utilisées pour la CMT2A et la CMT4H reproduisent la majorité des anomalies cellulaires et comportementales àpartir de 3mois, observés chez ces patients telles qu' une dégénérescence axonale, des défauts locomoteurs et des anomalies de myéline.

Nées immunodéficientes, 360 souris reçoivent dans le cerveau, dès leurs premiers jours de vie, une greffe de cellules issues de tissus de patients épileptiques, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Certaines subissent ensuite l'implantation d'électrodes et un enregistrement cérébral prolongé en cage individuelle, avec un risque d'activité épileptique et de rejet maternel. Le projet veut savoir si des astrocytes humains issus de tissus malades peuvent déclencher une hyperexcitabilité une fois greffés dans un cerveau de souris. Toutes sont tuées à l'issue pour récupérer leurs tissus cérébraux.

Objectifs

Ce projet a pour objectif d’approcher les mécanismes à l’origine de l’épilepsie chez l’homme. Notre laboratoire utilise déjà des tissus réséqués chez des patients souffrant de tumeurs cérébrales ou de dysplasies épileptogéniques ou non, pour préparer des tranches aiguës utilisées en électrophysiologie. Malheureusement, la durée de vie de ces prélèvements n’est que de quelques heures. Nous proposons donc d’utiliser une partie de ces tissus pour isoler et mettre en culture des progéniteurs neuraux qui seront différenciés in vitro en astrocytes humains. Ces astrocytes différenciés ou les progéniteurs seront ensuite greffés dans le cerveau de souriceaux immunodéficients (lignée NOD SCID), où ils pourront s’intégrer dans l’environnement cérébral murin. Dans ce contexte, les cellules humaines pourraient induire localement certaines altérations fonctionnelles caractéristiques de l’épilepsie. Ce modèle permettra d’étudier le rôle spécifique des astrocytes humains dérivés de tissus épileptiques dans les mécanismes physiopathologiques de l’épilepsie sur une durée prolongée. Ce projet s’inscrit dans le cadre d’une collaboration avec les neurochirurgiens de l’AP-HP spécialistes de l’épilepsie.

Bénéfices attendus

Ce projet vise à mieux comprendre les mécanismes cellulaires et physiopathologiques impliqués dans la dysplasie corticale focale (FCD), une cause majeure d’épilepsie pharmacorésistante chez l’humain. En utilisant des cultures primaires dérivées de tissus humains post-chirurgicaux, ce travail permettra d’étudier de manière unique le comportement des astrocytes humains, dans un contexte épileptique. Les greffes intracérébrales réalisées chez des souriceaux immunodéficients permettront d’évaluer in vivo le potentiel épileptogène des astrocytes humains issus de tissus dysplasiques comparés à ceux issus de tissus non épileptiques. Ces modèles permettront de : déterminer si les astrocytes humains issus de tissus de FCD contribuent à la genèse ou au maintien de l’hyperexcitabilité neuronale ; explorer les mécanismes d’interaction entre astrocytes humains et circuits neuronaux murins ; fournir des données expérimentales inédites susceptibles d’orienter de nouvelles stratégies thérapeutiques, notamment dans les cas d’épilepsie résistante aux traitements médicamenteux ; développer un modèle préclinique pertinent pour tester à terme des approches de modulation cellulaire ou pharmacologique ciblée. Ainsi, les bénéfices scientifiques et médicaux attendus sont considérables, tant sur le plan de la compréhension fondamentale des épilepsies focales que sur le plan de la recherche de nouvelles pistes thérapeutiques.

Procédures

Les animaux (360 souris nouveau-nées immunodéficientes) seront soumis aux interventions suivantes : -Injection intracérébrale de cellules humaines chez le souriceau nouveau-né, réalisée sans ouverture du plan cutané. -Chirurgie cérébrale chez l’animal adulte, comprenant l’implantation d’électrodes intracérébrales. -Enregistrements EEG télémétriques réalisés sur une période prolongée, sans contention. -Procédure terminale permettant la récupération des tissus cérébraux nécessaires aux analyses prévues.

Impact sur les animaux

-Greffe intracérébrale néonatale : cette intervention peut entraîner un stress de manipulation et une douleur aiguë très brève au moment de l’injection, ainsi qu’un inconfort transitoire dans les heures qui suivent. Chez les souriceaux manipulés, il existe un risque de rejet maternel ou de difficultés de tétée dans les 12–24 h suivant la greffe, pouvant se traduire par un retard de croissance ou une altération de l’état général. -Phénotype lié à l’immunodéficience (NOD SCID) : le phénotype immunodéficient peut être associé à une fragilité accrue et à une sensibilité augmentée aux infections opportunistes, susceptible d’entraîner une altération progressive de l’état général (amaigrissement, baisse d’activité), de durée variable selon les individus. -Implantation d’électrodes EEG : cette chirurgie peut provoquer des douleurs post-opératoires modérées pendant quelques jours, ainsi qu’un inconfort local transitoire lié à la cicatrisation et au port de l’implant. Une irritation cutanée au niveau des sutures et/ou du site d’implantation peut également survenir, généralement de courte durée. -Hébergement individuel lié au dispositif télémétrique : l’hébergement en cage individuelle sur une période prolongée peut induire un stress lié à l’isolement social, d’intensité faible à modérée, pendant toute la durée concernée. -Effets biologiques potentiels liés à la greffe : dans certains cas, une activité épileptiforme peut apparaître, pouvant s’accompagner de modifications transitoires du comportement et/ou d’une altération de l’état général (baisse d’activité, amaigrissement), d’intensité variable et de durée variable selon les individus.

Devenir

À l’issue de chaque procédure, tous les animaux sont euthanasiés pour permettre la récupération des tissus nécessaires aux analyses fonctionnelles et histologiques.

Remplacement

L’étude porte sur les mécanismes cellulaires impliqués dans l’épilepsie humaine, et plus particulièrement sur le rôle des astrocytes dérivés de tissus post-opératoires. Ces phénomènes nécessitent un modèle biologique intégrant un réseau neuronal fonctionnel et un environnement cérébral vivant, ce qui ne peut être entièrement reproduit par des approches in vitro. Les cultures cellulaires humaines sont déjà utilisées pour les étapes préliminaires (isolement, différenciation, caractérisation des astrocytes), ce qui limite le recours aux animaux aux seules expériences indispensables pour étudier les interactions entre cellules humaines et tissu nerveux in vivo. Ainsi, le recours à l’animal est restreint à la validation physiologique du modèle.

Réduction

Le nombre d’animaux a été déterminé a priori à partir de calculs de puissance statistique, afin d’obtenir un effectif minimal compatible avec des résultats robustes. Les effectifs par groupe ont été estimés à l’aide du logiciel G*Power, sur la base de : (i) test statistique prévu (comparaisons multiples/ANOVA selon les paramètres analysés), (ii) risque de première espèce α = 0,05, (iii) puissance cible 1−β = 0,90, et (iv) taille d’effet attendue estimée à partir de la littérature et/ou de données antérieures du laboratoire. Ces calculs conduisent à un effectif de 20 animaux par groupe pour les analyses principales. Afin de limiter le nombre total d’animaux, plusieurs mesures de réduction sont mises en place : les mêmes animaux sont utilisés pour collecter plusieurs types de données (EEG in vivo, puis analyses histologiques et/ou fonctionnelles ex vivo selon les cohortes), ce qui évite la duplication d’expériences ; les procédures chirurgicales et les acquisitions sont standardisées entre expérimentateurs pour réduire la variabilité interindividuelle ; enfin, l’organisation en lots expérimentaux est planifiée de manière à maximiser les données obtenues par animal.

Raffinement

Toutes les interventions chirurgicales seront réalisées sous anesthésie générale appropriée et associées à une analgésie systématique. Pour les chirurgies d’implantation d’électrodes EEG, l’anesthésie est réalisée par injection intrapéritonéale de kétamine (95 mg/kg)/xylazine (12 mg/kg), et une analgésie pré-opératoire est administrée par buprénorphine (0,1 mg/kg, S.C.). Une anesthésie locale (pommade EMLA / lidocaïne) est appliquée sur la zone d’incision. La température corporelle est maintenue à 37 °C pendant l’intervention et au réveil à l’aide d’un tapis/couveuse chauffant(e), et les yeux sont protégés par un gel ophtalmique. Après chirurgie, les animaux font l’objet d’une surveillance quotidienne pendant 7 jours permettant de détecter précocement tout signe de douleur, de détresse ou d’altération de l’état général. Les critères d’arrêt (points limites) incluent notamment : perte de poids significative ou retard de croissance, prostration ou baisse marquée d’activité, troubles moteurs persistants, automutilation/grattage au niveau de l’implant ou plaies, signes de déshydratation, ou tout comportement anormal durable. En cas d’atteinte d’un point limite, l’animal est retiré du protocole et euthanasié sans délai conformément aux modalités décrites dans l’item relatif à la mise à mort. Le raffinement de l’environnement repose sur un hébergement adapté avec enrichissement (matériel de nidification) et accès ad libitum à l’eau et à la nourriture. Lorsque l’implantation EEG impose une protection du dispositif et la qualité des enregistrements, un hébergement individuel temporaire est mis en place ; il est limité au strict nécessaire et s’accompagne d’un enrichissement maintenu. Les manipulations sont réalisées par du personnel formé, en limitant la durée de contention et le nombre d’interventions, afin de réduire le stress et l’impact sur le bien-être des animaux.

Choix des espèces

La souris est l’espèce la plus appropriée pour ce projet car elle permet d’utiliser des lignées immunodéficientes compatibles avec la greffe de cellules humaines. Les souris NOD SCID présentent un phénotype immunodéficient caractérisé par l’absence de lymphocytes T et B fonctionnels, sans phénotype dommageable spontané sur le plan moteur ou comportemental dans les conditions d’élevage et d’expérimentation prévues. L’absence de cellules immunitaires limite le risque de rejet des cellules humaines greffées et permet un suivi stable de leur intégration dans un cerveau vivant. Des travaux pionniers utilisant ce type de matériel cérébral humain ont été réalisés par des équipes internationales de recherche, validant ainsi ce choix. Les greffes seront réalisées chez des souriceaux âgés de 1 à 2 jours (P1–P2), car cette fenêtre développementale favorise la survie et l’intégration des cellules greffées dans le tissu cérébral, tout en permettant un suivi prolongé de leur maturation et de leurs effets fonctionnels au cours du développement postnatal.

Pour comparer deux régimes d'entraînement sur tapis roulant chez des rats vieillissants, 98 rats âgés de 12 à 15 mois vont être utilisés, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, tous tués à l'issue. Chaque animal court trois fois par semaine pendant huit semaines, passe trois séances d'imagerie cérébrale sous anesthésie et subit jusqu'à quatre prélèvements de sang par incision de la queue. À la fin, ils sont tués pour prélever leur cerveau et leurs muscles, que le porteur juge exploitables seulement frais et intacts. Les retombées annoncées, mieux calibrer l'exercice contre le déclin cognitif des personnes âgées, sont renvoyées à moyen terme, alors que le porteur affirme qu'aucun modèle sans animaux ne peut relier muscle et cerveau.

Objectifs

Dans ce projet, nous étudions l’efficacité de deux types de programmes d’entraînement physique, un à intensité modérée et un autre à haute intensité, sur des rats adultes. Nous observons comment ces entraînements influencent leurs capacités physiques, leur motricité, leur mémoire ainsi que les changements dans leurs muscles et leur cerveau. Pour cela, les animaux passeront des tests de comportement et d’endurance sur un tapis roulant, ainsi que des examens d’imagerie cérébrale. Des prélèvements sanguins seront réalisés plusieurs fois au cours de l’étude pour analyser certains paramètres biologiques. Enfin, à la fin du protocole, des analyses seront faites sur les tissus musculaires et cérébraux pour mieux comprendre les effets des entraînements.

Bénéfices attendus

Ce projet vise à mieux comprendre comment différents types d’exercices physiques influencent le cerveau, la mémoire et la motricité chez les individus âgés, chez qui des troubles liés à l’âge sont fréquents. En adaptant les entraînements à chaque individu grâce à des mesures physiologiques précises, les résultats pourront être plus facilement appliqués chez l’humain. Les bénéfices attendus sont les suivants : Pour la santé humaine : améliorer les recommandations d’exercices pour prévenir ou ralentir les troubles cognitifs et moteurs liés au vieillissement. Pour la santé animale : mieux comprendre les effets de l’exercice sur le vieillissement animal, ce qui peut aider à améliorer le bien-être des animaux dans divers contextes. Pour l’environnement : indirectement, en favorisant des approches non médicamenteuses pour la santé, ce projet peut contribuer à réduire l’utilisation de traitements chimiques. Les résultats devraient être accessibles à moyen terme (quelques années) et pourront être appliqués à grande échelle, notamment dans les domaines de la santé publique, de la rééducation et du bien-être des personnes âgées.

Procédures

Les exercices physiques sont adaptés individuellement à chaque animal afin d’éviter des efforts trop intenses qui pourraient les stresser. Chaque séance dure environ 30 minutes et est réalisée trois fois par semaine pendant la durée du protocole (jusqu’à 8 semaines selon les groupes). Pour le prélèvement des tissus cérébraux et musculaires à la fin de l’étude, les animaux reçoivent un traitement contre la douleur environ 30 minutes avant la procédure. Ils sont ensuite profondément anesthésiés afin que le prélèvement se fasse dans les meilleures conditions possibles, garantissant un état optimal des tissus. Les examens d’imagerie cérébrale sont réalisés à trois reprises (environ aux semaines 2, 4 et 8). Chaque examen dure moins de 45 minutes et se fait sous anesthésie gazeuse pour minimiser le stress et les mouvements de l’animal. Des prélèvements sanguins sont effectués à la base de la queue sous anesthésie légère pour limiter le stress et les mouvements. Au maximum, quatre prélèvements sont réalisés sur les 8 semaines d’étude, avec un volume total de sang prélevé qui reste inférieur à 20 % du volume sanguin total sur une semaine, garantissant la sécurité des animaux.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables susceptibles d’apparaître dans ce protocole sont les suivants : Des blessures cutanées légères peuvent survenir occasionnellement lors des entraînements sur tapis roulant, notamment à cause des frottements contre la bande roulante. Lors des tests d’effort, une petite incision partielle est réalisée à la pointe de la queue pour permettre les prélèvements sanguins, ce qui peut entraîner une douleur légère. Les anesthésies nécessaires aux examens d’imagerie cérébrale peuvent provoquer une détresse cardiaque ou respiratoire, liée à la sensibilité variable des animaux aux produits anesthésiques. Une anesthésie prolongée peut également entraîner une déshydratation des animaux. Aucun effet indésirable n’est attendu lors des tests de comportement, les animaux étant préalablement habitués aux procédures pour limiter le stress.

Devenir

Les animaux seront euthanasiés à la fin du protocole afin de pouvoir prélever rapidement et dans de bonnes conditions des tissus essentiels (cerveau, muscles) nécessaires pour réaliser des analyses scientifiques précises. Ces analyses permettront d’étudier les effets des programmes d’entraînement sur les fonctions musculaires et cérébrales, ce qui ne peut être fait qu’avec des échantillons frais et intacts. Cette étape est indispensable pour répondre aux objectifs de la recherche.

Remplacement

Il n’existe à l’heure actuelle aucun modèle de substitution in vitro pour étudier l’impact d’un entrainement d'endurance au niveau musculaire et cérébral et qui puisse faire le lien entre ces 2 systèmes. Le rat est considéré comme un modèle de choix car les adaptations musculaires et cérébrales induites par l'entrainement sont proches de celles observées chez l’Homme.

Réduction

Un unique groupe contrôle est prévu sur l'ensemble de la durée du projet. Nous utiliserons le nombre minimum d’animaux mâles et femelles pour chaque groupe, nécessaire à la réalisation d’un test statistique paramétrique.

Raffinement

Les méthodes utilisées sont soit non invasives, soit très peu invasives (prise de sang) soit sans réveil. Les expérimentations seront optimisées dans l’optique de réduire, supprimer ou soulager l'inconfort, la douleur ou l'angoisse subie par les rats afin d'obtenir des données qui soient le moins biaisées possible en assurant le bien- être de l'animal. Par exemple, l’environnement des cages sera enrichi par la présence d'objets afin de réduire l'ennui des animaux. L’environnement enrichi comprend des igloos cartonnés, des tunnels en Carton 5 mm et en polycarbonate ainsi que des mini-rouleaux de papier. L’enrichissement est renouvelé toutes les semaines. Les mêmes expérimentateurs restent en contact avec les animaux tous les jours afin qu'ils s'habituent à eux.

Choix des espèces

Le rat est une espèce couramment utilisée en recherche car sa réponse à l’exercice physique présente de nombreuses similarités avec celle de l’être humain. Par exemple, on observe chez le rat des changements dans la manière dont ses muscles produisent et utilisent l’énergie, une amélioration de l’endurance et une augmentation de la force musculaire, comme chez l’humain. Le rat permet également d’évaluer les effets de l’exercice sur la mémoire, la motricité et le fonctionnement du cerveau à l’aide de tests de comportement et d’analyses en laboratoire. Les animaux seront inclus à un stade adulte avancé (entre 12 et 15 mois), ce qui correspond à un début de vieillissement. À cet âge, les rats ont un bon taux de survie et restent capables de réaliser les exercices physiques demandés. Ce modèle est souvent utilisé pour étudier les effets du vieillissement sur le cerveau et les capacités physiques.