Procédures modérées

À partir de six semaines, les souris reçoivent deux injections par semaine, un prélèvement sanguin toutes les quatre semaines, une mesure de pression artérielle au brassard de queue de vingt minutes, et quatre échographies cardiaques sous anesthésie, jusqu'à l'âge de neuf ou dix mois. 2 880 souris porteuses d'un syndrome de Noonan vont ainsi être utilisées, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le porteur indique que ces souris présentent un retard de croissance, des dysmorphies du crâne et des troubles cardiaques reproduisant les manifestations humaines, et qu'elles restent "globalement en bonne santé" jusqu'à dix mois. Toutes sont tuées à l'issue pour prélever leurs organes et conduire des analyses biochimiques, histologiques et métaboliques.

Objectifs

Ce projet s’inscrit dans la continuité de recherches précédentes portant sur des approches innovantes pour traiter certaines maladies génétiques rares. Le syndrome de Noonan est une maladie héréditaire qui se manifeste dès la naissance par des traits du visage particuliers, une petite taille, des malformations cardiaques et un retard du développement. Il existe une forme apparentée de ce syndrome, caractérisée par des taches pigmentaires sur la peau et un épaississement du muscle cardiaque. Ces maladies sont liées à des anomalies du fonctionnement cellulaire, qui perturbent la croissance et le développement de l’organisme. À ce jour, il n'existe pas de traitement spécifique pour ces troubles. Nous souhaitons explorer une piste thérapeutique originale fondée sur la stimulation des mécanismes naturels de protection et de renouvellement des cellules. Ces mécanismes permettent notamment de préserver l’équilibre interne des cellules et de limiter les effets du vieillissement prématuré ou des défauts liés à la maladie. Le but de notre projet est de tester, dans un modèle animal adapté, si l’activation de ces processus naturels permet de réduire les signes cliniques associés à la maladie. Pour cela, nous utiliserons différentes méthodes, comme l’administration de substances actives ou la stimulation des défenses internes, et nous observerons leur effet sur la croissance, le fonctionnement du cœur et l’état général des animaux. À terme, ce projet pourrait déboucher sur de nouvelles stratégies de traitement visant à améliorer la qualité de vie des personnes atteintes par ce syndrome.

Bénéfices attendus

Ce projet a pour objectif de valider, dans plusieurs modèles précliniques, une nouvelle stratégie thérapeutique ciblant les mécanismes moléculaires du syndrome de Noonan (SN) et de ses variantes. Le syndrome de Noonan, une maladie génétique autosomique dominante, touche environ 1 naissance sur 1 000 à 2 500 et se caractérise par des malformations cardiaques, un retard de croissance, des anomalies crâniofaciales et des complications hématologiques et lymphatiques. Une thérapie capable de corriger ces altérations pourrait améliorer la qualité de vie des patients, prolonger leur espérance de vie et réduire les complications graves associées à cette pathologie. En validant cette approche, ce projet pourrait non seulement transformer la prise en charge des patients atteints de SN, mais aussi ouvrir des perspectives pour le traitement d’autres pathologies similaires.

Procédures

À partir de l’âge de six semaines, les animaux recevront des injections sur animal vigile deux fois par semaine. Chaque injection durera environ cinq secondes, et ces traitements seront poursuivis jusqu’à 9–10 mois d’âge maximum. Des prélèvements sanguins seront réalisés toutes les quatre semaines sur animal vigile, sous contention manuelle brève. Chaque prélèvement durera environ dix secondes et sera jusqu’à 9–10 mois d’âge maximum. Les animaux vigiles seront également soumis à des mesures de la pression artérielle toutes les quatre semaines, à l’aide d’un système non invasif utilisant un brassard de queue. Chaque session de mesure durera environ vingt minutes par animal, secondes et sera jusqu’à 9–10 mois d’âge maximum. Enfin, 4 échographies cardiaques seront réalisées sous anesthésie légère générale afin d’évaluer la morphologie et la fonction cardiaque. Chaque séance d’échographie durera environ 30 minutes par animal, soit sur une durée totale d’environ 3 mois.

Impact sur les animaux

Les animaux transgéniques porteurs d’un syndrome de Noonan présentent un phénotype clinique progressif, qui peut entraîner un certain inconfort au fil du temps, notamment des anomalies de croissance, des troubles cardiaques et une altération de l’état général. Ces animaux restent globalement en bonne santé jusqu’à 10 mois. À partir de l’âge de 6 semaines, les souris sont soumises à différentes manipulations expérimentales répétées, susceptibles d’occasionner du stress ou une douleur transitoire. Les injections bihebdomadaires peuvent induire une douleur brève au point d’injection. Les prélèvements sanguins réalisés sur animal vigile sont générateurs de stress, avec un risque modéré d’hématome ou d’inflammation locale. Les mesures de pression artérielle, bien que non invasives, nécessitent une contention prolongée dans un environnement spécifique, ce qui peut engendrer un stress. Enfin, les échocardiographies réalisées sous anesthésie légère exposent les animaux à un inconfort temporaire lié à la contention, à la tonte et à la procédure elle-même.

Devenir

Tous les animaux du projet seront euthanasiés afin de prélever les différents organes pour analyses biochimiques, histologiques, métaboliques.

Remplacement

Avant d’engager des expérimentations in vivo, des étapes préalables ont été réalisées sur modèles non animaux : études bio-informatiques et analyses in silico pour identifier les voies moléculaires d’intérêt ; expérimentations in vitro sur lignées cellulaires et cultures primaires. C’est pourquoi, les études in vivo chez la souris sont indispensables pour étudier les mécanismes systémiques complexes impliqués dans le syndrome de Noonan et ses variantes. Cette pathologie affecte simultanément plusieurs organes (cœur, tissu adipeux, système squelettique, système immunitaire), et repose sur des interactions dynamiques entre différents tissus et compartiments physiologiques. Ces interactions ne peuvent être correctement modélisées ni reproduites dans des systèmes in vitro, même complexes, comme les cultures organotypiques ou les organoïdes. À ce jour, aucun modèle cellulaire, informatique ou ex vivo ne permet d’évaluer les effets systémiques, chroniques et multifactoriels des traitements envisagés dans ce projet. Avant d’engager des expérimentations in vivo, des étapes préalables ont été réalisées sur modèles non animaux : études bioinformatiques et analyses in silico pour identifier les voies moléculaires d’intérêt ; expérimentations in vitro sur lignées cellulaires et cultures primaires afin d’évaluer la faisabilité des approches et affiner les doses de traitement.

Réduction

Ce projet implique l’utilisation d’un maximum de 2880 souris, réparties entre les phases d’élevage, de traitement expérimental et d’analyses biologiques. Le nombre d’animaux a été rigoureusement estimé à l’aide d’un calcul de puissance statistique, afin de garantir que les résultats obtenus soient fiables tout en limitant au strict nécessaire le recours aux animaux. Les expériences seront organisées de manière à regrouper les groupes témoins, et chaque animal contribuera à plusieurs types d’analyses (immunologiques, histologiques, moléculaires, métaboliques), permettant ainsi d’extraire un maximum de données de chaque individu. Certaines analyses seront également réalisées en collaboration avec d’autres équipes, ce qui contribuera à réduire globalement le nombre d’animaux utilisés. Enfin, des tests statistiques appropriés seront réalisés afin d’assurer une interprétation rigoureuse des résultats obtenus dans les différents groupes expérimentaux.

Raffinement

Les conditions d’hébergement respecteront les normes réglementaires et seront adaptées avec le personnel de l’animalerie. Les animaux auront un accès ad libitum à une alimentation standard et à de l’eau. L’environnement sera enrichi (coton de nidification, objets manipulables) pour favoriser l’exploration et limiter le stress. Une surveillance quotidienne permettra de détecter précocement tout signe de mal-être : yeux mi-clos, baisse d’activité, altération du pelage, posture anormale, respiration difficile, comportements stéréotypés. La douleur sera évaluée notamment à l’aide de la grille de score reconnue basée sur les expressions faciales des animaux, outil validé de reconnaissance faciale. Le poids sera contrôlé au moins une fois par semaine. Une perte supérieure à vingt pour cent du poids maximal ou une diarrhée persistante pendant plus de quatre jours sera considérée comme un point limite. Les sites d’injection seront régulièrement inspectés pour détecter toute inflammation ou infection; des soins locaux seront administrés si nécessaire (antiseptique). Les signes de douleur justifieront l’administration d’un traitement analgésique adapté au cas par cas. En cas de faiblesse ou de réduction de la prise alimentaire, un gel nutritionnel sera ajouté dans la cage. Toutes les manipulations seront réalisées par un personnel qualifié, formé aux bonnes pratiques. Les procédures expérimentales seront réalisées sous anesthésie ou analgésie lorsqu’elles sont indiquées (échocardiographie, gestes potentiellement douloureux). Des lampes chauffantes seront utilisées pendant l’anesthésie et la phase de réveil pour maintenir la température corporelle. En cas de comportement agressif, les mâles seront hébergés individuellement afin de prévenir les blessures, qui seront immédiatement soignées. Des ajustements seront effectués en temps réel si une souffrance imprévue est observée. Toutes les interventions seront réalisées par du personnel spécifiquement formé aux bonnes pratiques d’expérimentation animale, en veillant à limiter au maximum le stress et l’inconfort des animaux.

Choix des espèces

Le choix de la souris comme modèle expérimental s’explique par des raisons scientifiques et pratiques. La souris est largement utilisée en recherche, techniques expérimentales et suivi vétérinaire. Les lignées transgéniques disponibles permettent d’étudier des modèles spécifiques, comme les souris développant un syndrome de Noonan, présentant un phénotype clinique similaire à celui des patients humains. Ces souris affichent un retard de croissance (taille réduite, masse corporelle moindre), des anomalies corporelles (dysmorphies du crâne et traits du visage, cou court) et des troubles cardiaques. Ces caractéristiques reproduisent fidèlement les manifestations humaines, rendant ce modèle particulièrement pertinent pour l’étude des pathologies liées. Bien que leur viabilité soit réduite pendant la gestation, ces souris survivent généralement jusqu’à 10 mois, permettant des études approfondies tout en maintenant leur état de santé global. Les animaux seront inclus dans les procédures expérimentales à partir de 7 semaines, âge correspondant à un stade de développement physiologique complet, garantissant la fiabilité des résultats expérimentaux.

Faire valider par les autorités de santé le nouveau design d'un dispositif oculaire destiné à l'être humain : 48 lapins vont être utilisés pour cela, tous tués, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Vingt-huit d'entre eux reçoivent un prototype posé sur l'œil pendant cinq minutes sous anesthésie générale, les vingt autres le dispositif final, activé par des impulsions électriques qui percent transitoirement la membrane des cellules pour y faire entrer du matériel génétique. Le porteur ne retient comme effets indésirables qu'une sécheresse oculaire, une rougeur de la conjonctive et une réaction mortelle à l'anesthésie qu'il qualifie de très rare. Il justifie le choix du lapin par la taille de son œil, proche de celle de l'œil humain, et utilise les deux yeux de chaque animal pour réduire l'effectif.

Objectifs

Une technique de thérapie génique oculaire n’impliquant pas l’utilisation de virus, basée sur le transfert de gènes dans un tissu ciblé de l’œil en appliquant des impulsions électriques contrôlées a été développée. Ce procédé permet de générer, grâce à des impulsions de courte durée et de faible intensité, des « trous » transitoires dans la membrane des cellules favorisant ainsi l’entrée dans la cellule de matériel génétique permettant la synthèse de protéines thérapeutiques. Grâce à l’utilisation d’un dispositif oculaire dédié, il est possible de cibler spécifiquement l’injection du matériel génétique dans un tissu cible de l’œil et d’appliquer des impulsions électriques par le biais des électrodes du dispositif oculaire. Le tissu-cible assure ensuite la production des protéines thérapeutiques dans l’œil. Divers paramètres influencent l’étendue mais aussi l’efficacité d’entrée du matériel génétique dans les cellules cibles, dont notamment le positionnement des deux électrodes. En raison des similarités d’anatomie et de taille, l’œil du lapin est le mieux adapté pour ces travaux de conception et d’optimisation du dispositif oculaire. Un dispositif oculaire destiné à l’homme a donc été conçu sur la base d’un dispositif oculaire développé au préalable chez le lapin. Ce dispositif permet ainsi de standardiser les étapes d’injection et d’entrée du matériel génétique dans le tissu cible de l’œil et donc d’assurer ainsi une reproductibilité optimale. Les données d’utilisation et d’ergonomie du dispositif oculaire de première génération collectées lors de précédentes études cliniques ont conduit au développement d’un nouveau design du dispositif favorisant la stabilisation du globe oculaire lors de la procédure d’administration. Les objectifs du projet sont : (i) d’évaluer la sécurité des modifications du nouveau design du dispositif oculaire en testant différents prototypes chez le lapin et (ii) de démontrer l’efficacité de transfert du matériel génétique dans le tissu cible de l’œil en utilisant le dispositif de seconde génération.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de générer des données précliniques nécessaires pour démontrer aux autorités de santé la sécurité et l’efficacité du dispositif en développement et permettre ainsi la poursuite des essais cliniques chez l’homme en développant un dispositif adapté à l‘homme. Les bénéfices attendus du projet sont le développement d’un nouveau design de dispositif oculaire permettant une administration dans le tissu cible de l’œil sûre, efficace et reproductible. Ces différents éléments seront ensuite transposés chez l’homme pour la production d’un dispositif de seconde génération qui sera utilisé lors de prochaines études cliniques.

Procédures

28 lapins auront un prototype de dispositif placé sur l’œil une seule fois pendant 5 min sous anesthésie générale. 20 lapins auront le dispositif final mis en place et activé, sous anesthésie générale d’une durée de 5 minutes, une seule fois.

Impact sur les animaux

En plus du stress initial de la contention, les effets indésirables identifiés sont : -sécheresse oculaire, rougeur de la conjonctive : peu fréquents et de courte durée (1 à 2 jours maximum) -réaction/mort à l’anesthésie : très rare

Devenir

La totalité des animaux seront mis à mort à l’issue des procédures pour collecte des tissus pour les études histologiques ou prélèvement des liquides oculaires pour le dosage du niveau d‘expression des protéines thérapeutiques.

Remplacement

Des études ex-vivo ont été réalisées sur explants (culture de cellules) d’œil de rat, de lapin ou de singe. Ces études ont permis de définir certains paramètres du transfert de gènes tels que la zone d’injection ou le seuil des impulsions électriques. L’utilisation de ce modèle ex-vivo reste limité car le niveau de production de la protéine diffusée dans le milieu de culture ainsi que sa durée d’expression ne sont pas représentatifs du fonctionnement du muscle cible de l'œil in vivo en raison de la dégradation rapide de ce tissu dans ces conditions de culture (2 jours de culture maximum). Par ailleurs, l’utilisation d’un œil isolé avant la mise en culture présente également des limites. La tonicité d’un œil isolé est différente de celle de l’œil d’un animal vivant et l’évaluation des inflammations oculaires liées à l’utilisation du dispositif ou à la production de la protéine thérapeutique au cours du temps est impossible. Le recours à un œil sur animal vivant, et plus particulièrement l’œil de lapin en raison de ses caractéristiques anatomiques et physiologiques est indispensable pour développer le dispositif oculaire et montrer que, via cette technologie, la protéine cible est efficacement produite et de façon sécurisée pour l’animal, et qu'elle diffuse depuis le muscle cible jusqu'aux tissus à traiter.

Réduction

Les procédures expérimentales standardisées ont été mises au point afin de pouvoir réduire le nombre d'animaux à utiliser et obtenir des résultats statistiquement exploitables. Nous avons également choisi d’utiliser les 2 yeux pour chaque animal et chaque animal sera utilisé pour tester un ou plusieurs prototypes (dans le respect des contraintes éthiques et de bien-être), lorsque cela est possible (par exemple, œil droit vs œil gauche), ce qui contribue à réduire le nombre total d’animaux requis. Le nombre d’animaux a été déterminé en fonction de la variabilité attendue sur la bases d’études précédentes et sur la nécessité d’avoir une représentativité suffisante. Le nombre d'animaux nécessaires a été déterminé grâce à un test statistique, tout en anticipant d’éventuelles pertes liées à l’expérimentation.

Raffinement

Les animaux seront hébergés dans les conditions standards (environnement contrôlé, présence systématique d’enrichissement du milieu) au minimum 1 semaine dans leur nouvel environnement avant toute manipulation afin d’éviter le stress. Sur toute la durée expérimentale, l’état de santé des animaux sera contrôlé deux fois par semaine par les expérimentateurs et une fois par jour par le personnel de l'animalerie. Les animaux seront anesthésiés et recevront un traitement anti-douleur adéquat lors des procédures mises en œuvre afin de limiter le stress de la manipulation et une meilleure prise en charge de la douleur. Ils seront maintenus sur un matelas chauffant durant les anesthésies. Des points limites suffisamment prédictifs et spécifiques au projet ont été définis et seront appliqués.

Choix des espèces

Le lapin s'avère être le modèle animal le plus adapté pour le développement de notre système d’administration et plus particulièrement l’optimisation de notre dispositif oculaire : - La taille de l’œil de lapin est similaire à celle de l’œil humain, il est donc facile de transposer le design du dispositif oculaire du lapin à l’homme. - Il n’existe pas de modèle in vitro représentatif du transfert de matériel génétique par impulsion électrique contrôlée. - Les caractéristiques physiologiques du lapin sont bien connues et documentée dans la littérature scientifique. Les animaux utilisés seront des jeunes adultes âgés de 3 à 5 mois avec un poids moyen de 3,5 kg. La taille de l’œil du lapin varie en fonction de l’âge et du poids de l’animal et les données anatomiques de l’œil de lapin d’environ 3,5 kg sont les plus proches de celles de l’œil humain adulte. Les modélisations du dispositif oculaire adapté à l’œil du lapin ont été réalisées sur des données anatomiques de lapin de cet âge et cette fourchette de poids.

631 souris vont être utilisées, toutes tuées, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Toutes subissent une neurochirurgie de 45 minutes à une heure trente, puis un branchement quotidien de leurs implants à électrodes, certaines recevant quatre injections intrapéritonéales sous contention. L'optogénétique employée peut déclencher des mouvements incontrôlables, lever une patte ou tourner la tête, que le porteur décrit comme non douloureux. Il présente les tests comportementaux, des "jeux de décisions" fondés sur la récompense, comme "positifs pour le bien-être animal", et écrit que ce protocole augmente le bien-être des souris.

Objectifs

En temps normal, les synapses (les espaces de contact et de communication entre neurones) présentent un équilibre entre stabilité et plasticité qui permet à un individu d'être "flexible" sur le plan comportemental : il a un schéma de fonctionnement stable dans son environnement (croyances, habitudes) mais il peut s'adapter à un changement d'environnement. La flexibilité comportementale est un processus central au développement social et cognitif typique des individus. Les troubles du spectre autistique (TSA) sont caractérisés par une forte altération de cette flexibilité comportementale. Les TSA résultent parfois d'une variation sur un gène qui maintient l'équilibre entre plasticité et stabilité synaptique, car ce gène permet de fabriquer les protéines de "charpente" pour les synapses . Nous testerons donc le lien entre les protéines de "charpente" liées aux TSA, la plasticité neuronale et la flexibilité dans un contexte d'apprentissage. Notre hypothèse est que le lien entre protéines synaptiques et flexibilité comportemental est fait dans les différentes aires du cortex préfrontal, nous cherchons donc à comprendre comment.

Bénéfices attendus

Précisément, nous déterminerons: - le rôle causal des aires du cortex préfrontal dans la flexibilité - le codage au niveau neuronal de la flexibilité dans les différentes aires préfrontales - le rôle des protéines de "charpente" dans ces processus.

Procédures

Tous les animaux seront soumis à des neurochirurgies. La durée de l'opération est de 45 minutes à 1h30, avec toutes les précautions possibles pour éviter la douleur (anesthésie gazeuse, anesthéisques locaux, morphiniques en péri-opératoire). Les seules manipulations quotidiennes consisteront en un branchement des implants à électrodes (geste non douloureux). Des injections intra-péritonéales seront réalisées pour certains animaux (4 injections par animal sur la totalité de l'expérience). Le reste des procédures implique des tests comportementaux de type "jeux de décisions", basés sur des récompenses, et décrits comme positifs pour le bien-être animal dans la littérature

Impact sur les animaux

Les animaux qui subiront des neurochirurgies peuvent éventuellement avoir des douleurs associées aux interventions effectuées sur l'os mais aussi au niveau des sutures. Certains effets indésirables peuvent être causés par une technique ("optogénétique") qui permet d’allumer ou d’éteindre des neurones grâce à la lumière comme troubler l'activité locomotrice (le mouvement est incontrôlable mais non douloureux, comme lever une patte ou tourner un peu la tête). Les animaux d'une des procédures auront des contentions (pour lesquelles ils seront habitués en douceur) en vue d'injections intrapéritonéales sur quatre jours.

Devenir

Les animaux sont tous mis à mort après les procédures pour vérifier que les sites (les zones très précises du cerveau) pour l'injection et d'implantation sont corrects.

Remplacement

Nous cherchons à évaluer le rôle des neurones pendant le comportement de décision, il est donc impossible de remplacer les méthodes in vivo par des methodes in vitro.

Réduction

Nous avons déjà effectué des expériences similaires (pour étudier d'autres zones cérébrales) ce qui nous permet de réduire le nombre d'animaux au strict nécessaire. De plus nous développons un modèle informatique de réseau de neurones récurrent capable de modéliser la prise de décision. L'activité électrique des neurones y est fonction des connexions synaptiques, qui elle-mêmes évoluent en fonction de l'activité électrique des neurones et des récompenses reçues par l'animal (plasticité synaptique). ce modèle fournira des prédictions précises sur ce qu'il est important d'enregister comme activité électrique, ce qui réduit le nombre d'animaux.

Raffinement

Pour diminuer et abolir les douleurs chirurgicales, nous utilisons une combinaison d'anesthésiques et d'antiinflammatoires pendant la chirurgie et en péri-opératoire. La technique sera réalisée en conditions d'asepsie pour prévenir les infections. Si la technique ("optogénétique") qui permet d’allumer ou d’éteindre des neurones grâce à la lumière déclenche des mouvements incontrôlables, même non douloureux, comme lever une patte ou tourner un peu la tête, le protocole sera interrompu. Le protocole sera aussi interrompu si les points limites définis sont atteints. Nous tiendrons une feuille de suivi post-opératoire sur les deux jours suivant l'opération pour évaluer rapidement ces points. Le stress de l’animal sera limité par un enrichissement permanent de l’environnement, ainsi qu’une habituation quotidienne à l’expérimentateur/rice et à la salle expérimentale. Le protocole de comportement consiste en un jeu de décisions et augmente le bien-être des animaux.

Choix des espèces

Le système de décision (le circuit de la récompense) est plus proche anatomiquement et fonctionnellement entre mammifère (rongeurs et Humains) qu'entre mammifères et invertébrés, poissons ou oiseaux. De plus, la génétique de la souris offre des outils de modulations des réseaux neuronaux. Enfin, nos tâches comportementales de type "jeux" ont été spécifiquement développées et adaptées à l'étude des prises de décision de la souris, tout en assurant leur bien-être. Ce projet implique d'utiliser des groupes de souris de même stade de développement (8 semaines) qui est un stade classique dans les études sur les prises de décision (8 semaines étant considéré comme le début de l'âge adulte dans cette espèce).

Porteurs d'électrodes implantées au cours d'une chirurgie de deux à trois heures sous anesthésie, 960 souris et 960 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils subissent une restriction hydrique ou alimentaire, un hébergement individuel pouvant aller jusqu'à un mois, une contention de la tête, et des séances quotidiennes de 25 minutes pendant environ quatre semaines. Ces effectifs couvrent vingt études sur cinq ans pour caractériser l'effet de molécules candidates sur la cognition, le porteur affirmant que le modèle animal est "indispensable" avant tout développement clinique. Les tâches sont présentées comme un "ensemble de tâches standardisées" sans qu'aucune soit nommée.

Objectifs

Le présent projet s’inscrit dans un contexte de recherche préclinique visant à caractériser l’effet de molécules à visée thérapeutique sur la cognition et le fonctionnement cérébral. Les techniques utilisées incluent l’enregistrement et la modulation de l’activité neuronale chez l’animal anesthésié ou vigile et libre de ses mouvements. Ces approches permettent d’évaluer en temps réel l’impact potentiel d’un traitement thérapeutique sur les fonctions neuronales, cognitives et comportementales. Le modèle animal est indispensable pour étudier le potentiel thérapeutique de composés pharmacologiques avant leur éventuel développement clinique. Les rongeurs (souris et rats) sont classiquement utilisés pour la recherche préclinique en santé humaine, notamment dans des études de molécules susceptibles de modifier l’activité neuronale, le comportement et/ou la cognition. Les procédures employées suivent des standards établis dans les laboratoires de recherche publique, garantissant la fiabilité et la reproductibilité des données expérimentales. Avec le nombre d’animaux prévu dans ce projet, 20 études expérimentales pourront être réalisées sur une période de 5 années.

Bénéfices attendus

L’objectif de ce projet est d’accompagner des études précliniques combinant approches comportementales et neurophysiologiques afin de mieux comprendre les effets de composés pharmacologiques à visée thérapeutique. Ce projet permettra de caractériser de manière précise l’impact de ces composés sur la cognition, le comportement et le fonctionnement cérébral, en fournissant des données fiables et reproductibles sur leurs effets neuronaux et cognitifs. Ces informations contribueront à identifier les cibles thérapeutiques pertinentes et à orienter le développement de nouveaux traitements dans un contexte préclinique.

Procédures

Les animaux reçoivent un traitement par injection ou dans l’eau.1 à plusieurs administrations (max 2–4 semaines) (Une seule injection dans le cerveau lors de l’opération), petits volumes adaptés au poids. Lorsque le traitement est donné dans l’eau, les animaux le reçoivent progressivement en buvant chaque jour. Ils sont soumis à une procédure chirurgicale sous anesthésie générale d’une durée approximative de 2 à 3 heures, permettant l’enregistrement de l’activité neuronale dans une région cérébrale d’intérêt. Selon les études, les animaux effectueront différentes tâches comportementales adaptées aux molécules et aux régions cérébrales étudiées. Un ensemble de tâches standardisées est utilisé, dont la récurrence et la durée peuvent varier d’une séance unique de 15 minutes jusqu’à une séance quotidienne de 25 minutes sur environ 4 semaines. Cette approche combinant mesures neurophysiologiques et évaluation comportementale permettra de mieux caractériser l’impact des composés pharmacologiques sur la fonction cérébrale et la cognition. L’hébergement individuel sera appliqué uniquement aux animaux porteurs d’implants ou soumis à un contrôle hydrique ou calorique,(de quelques jours à plusieurs semaines, maximum 1 mois), tandis que la restriction hydrique ou alimentaire sera mise en place sur la période expérimentale correspondante afin de mesurer individuellement les apports (de quelques jours à une semaine).

Impact sur les animaux

Le stress sera limité grâce à une habituation progressive à l’expérimentateur. Toutes les interventions ont été régulièrement utilisées en laboratoire. Les expérimentateurs auront une solide expérience dans l'exécution de ces interventions. Les effets indésirables attendus sur les animaux comprennent : Un risque de douleur durant la chirurgie et une douleur aiguë liée à la récupération post-chirurgie implantatoire. Ce risque est compensé par l’analgésie. Un risque de perte de poids durant le contrôle calorique. En cas de perte de poids, l'animal est nourri ad libitum pendant 48 h. Un risque de perte d’implant lié aux chirurgies implantatoires pouvant induire une douleur. Un risque de stress à court terme induit par notre paradigme expérimental de tête restreinte. Les tests de comportement peuvent induire du stress pour les animaux. Un risque de stress lié à l'hébergement individuel des animaux

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort après les procédures comportementales, en vue de la réalisation de contrôles histologiques.

Remplacement

L’utilisation de ces animaux se justifie pour plusieurs raisons : 1) Aucune alternative ne permet de se passer de l’utilisation de modèles animaux lorsqu’il s’agit d’étudier les processus cognitifs/comportementaux. En effet, ce type d’étude repose sur l’analyse du comportement animal et nécessite d’avoir une espèce suffisamment proche de l’espèce humaine pour en extrapoler les résultats. 2) L'organisation du système nerveux central de ces animaux est suffisamment proche de celle de l'homme pour permettre une extrapolation acceptable des résultats obtenus l'espèce humaine. 3) De plus, nous étudions le fonctionnement des circuits neuronaux alors même que le sujet est éveillé et soumis à des tests comportementaux : il nous faut donc travailler avec des animaux vivants et vigiles.

Réduction

Nous avons adopté des mesures visant à réduire le nombre d'animaux lié à leur mode production : en utilisant pour la réalisation de ce projet tous les animaux quel que soit leur sexe (i.e. mâle et femelle). La force de notre hypothèse, les expériences pilotes précédentes ainsi que la qualité de nos procédures basées sur des années d'expérience, nous permettront de réduire significativement le nombre d'animaux utilisés. Le nombre d'animaux a été calculé par l'estimation de la variance observée avec ce type de donnée permettant d'atteindre une signification statistique.

Raffinement

À chaque étape du projet, le bien-être de nos animaux sera au cœur de nos préoccupations. Nos animaux, hébergés en cages collectives sur racks ventilés, garnies de litières leur permettant de reproduire un comportement naturel de fouissage et d’un enrichissement constitué d'un nid végétal et de tubes de carton, leur permettent de construire des nids, de jouer et de ronger. Leur soin est confié à du personnel qualifié et expert. Il surveille quotidiennement l’ensemble des animaux et de façon plus poussée et spécifique pendant les phases de récupération qui suivent les procédures invasives (chirurgie). Nous utilisons des anesthésiques et analgésiques adaptés aux procédures chirurgicales. L’expérimentateur possède une solide expérience pour toutes les procédures proposées. Des points limites suffisamment précoces sont définis pour éviter toute souffrance animale, avec la mise en place de mesures pour les soulager, comme la réhydratation, le réchauffement et une nourriture adaptée.

Choix des espèces

La souris et le rat : -sont des mammifères étroitement liés à l'espèce humaine sur le plan phylogénétique, et certains de leurs comportements peuvent être comparés à ceux de l'humain. Ces rongeurs sont fréquemment utilisés dans les études électrophysiologiques, utilisant la technique de fiber photométrie, ainsi que dans les manipulations optogénétiques. -permettent des approches in vivo pour étudier les effets de composés thérapeutiques sur le système nerveux central, ainsi que leurs corrélations avec les fonctions cognitives, à travers l'analyse comportementale. Les animaux seront utilisés au stade adule, soit à partir de 10 semaines, un âge qui correspond à la maturité des circuits neuronaux des aires cérébrales ciblées. De plus, les rongeurs adultes sont plus résistantes et récupèrent plus rapidement après la chirurgie que les plus jeunes. L’utilisation d’animaux génétiquement altérés permet de diriger l’expression de différents senseurs dans des neurones spécifiques, afin d’obtenir des conclusions plus précises et pertinentes.

Les souris dont la tumeur dépasse 1 500 mm3, qui perdent plus de 20 % de leur poids ou dont le point d'injection s'ulcère sont mises à mort avant paralysie complète. 792 souris immunodéficientes vont être utilisées, toutes tuées, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe sous-cutanée de cellules de myélome, une injection du composé radioactif, des séances d'imagerie sous anesthésie pouvant durer deux heures, puis une ponction cardiaque terminale suivie d'une dislocation cervicale. Le projet reprend une molécule abandonnée en essai clinique de phase II sur le cancer du pancréas, reformulée avec du cuivre radioactif pour cumuler chimiothérapie et radiothérapie interne.

Objectifs

Malgré des avancées importantes dans les stratégies thérapeutiques ces dernières décennies, le myélome multiple (MM) reste incurable. La surveillance de la progression maligne et de la récidive après traitement sont des défis centraux pour améliorer le taux de survie des patients atteints de MM. Le mécanisme de cuproptose induisant la mort cellulaire dépendante du cuivre a été exploré à travers l'utilisation de l'elesclomol en chimiothérapie. En raison d'un effet thérapeutique suboptimal dans le cancer du pancréas ainsi que de problèmes de solubilité, celui-ci a été abandonnée lors des essais de phase II . Actuellement, il a été mis au point une version hydrosoluble de l'elesclomol offrant ainsi la possibilité d'améliorer l'efficacité thérapeutique de cette molécule et suscitant un nouvel intérêt clinique. À travers ce projet, l'objectif est d'exploiter le double effet de l'elesclomol en le fonctionnalisant avec le cuivre (Cu64 ou Cu67), permettant ainsi la réalisation de la cuproptose tout en associant l'efficacité potentielle de la radiothérapie interne du cuivre radioactif. Le cuivre est l'un des radioéléments les plus prometteurs pour l'approche théranostique en raison de sa disponibilité en cyclotron et de ses propriétés physiques. Les objectifs du projet sont de développer de nouvelles molécules à base d’elesclomol dans le cadre de traitement du myélome multiple mais également le dépistage et le suivi du développement tumoral chez l’homme. Après la confirmation par les études in vitro, les molécules présentant les meilleurs résultats sur les lignées cellulaires de MM seront étudiées in vivo sur modèles murins. Le projet in vivo consistera aux études de pharmacocinétiques, de biodistribution et d’efficacité thérapeutique sur souris après greffe tumorale. L’étude de biodistribution des molécules radiomarquées sera réalisée par tomographie d’émission de positons (TEP) couplée à l’imagerie par tomodensitométrie X (TDMX). Cette démonstration de concept pourrait conduire au développement d'une nouvelle approche thérapeutique de radiothérapie interne vectorisée en utilisant la chimiothérapie comme double vecteur thérapeutique, ouvrant ainsi la voie à une nouvelle approche thérapeutique.

Bénéfices attendus

Menée à bien, cette étude devrait permettre d’ajouter ces molécules comme nouvel outil de traitement et de diagnostic du myélome multiple. Elle permettra également de mieux comprendre la conjugaison des effets liés à l’elesclomol combiné à l’approche par radiothérapie interne vectorisée. Cette étude devrait également démontrer l’intérêt de cette approche pour réduire les toxicités associées aux traitements du cancer chez l’Homme grâce à l’amélioration de la pharmacocinétique par rapport aux chimiothérapies classiques.

Procédures

L’administration des molécules se feront par voie intraveineuse sur animal vigil d’une durée

Impact sur les animaux

L’elesclomol a été testé chez l’Homme dans des essais cliniques précoces dont aucune nuisance n’a été observée. L’ensemble des informations liées à la toxicité cellulaire de la molécule et de sa formulation ont été établies in vitro sur plusieurs lignées cellulaires cancéreuses. Nous n’attendons pas de nuisances liées à la molécule sur les souris immunodéficientes car celle-ci sera réalisée à 70% de la MTD identifié en PE1 au maximum. Les nuisances et les points limites identifiées sur souris avec tumeur attendues sont une perte de poids (max >20%), une augmentation du volume tumoral excessif (jusqu’à induire des difficultés locomotrices, à induire une souffrance/une douleur ou >1500mm3), l’apparition de nécrose/ulcération/infection possible au lieu d’injection. Un score de 3 sur la grille de score impliquera la mise à mort de l’animal avant paralysie complète

Devenir

Toutes les souris seront mises à mort pour prélèvement et analyses post-mortem.

Remplacement

Des études in vitro déterminant la cytotoxicité de la molécule ont été préalablement réalisés afin de remplacer une partie des expérimentations in vivo. Cependant à ce stade du projet, l’utilisation de modèles animaux reste inévitable pour examiner l’aspect translationnel de nos travaux. La pharmacocinétique et la toxicité systémique (toxicité qui affecte tout l’organisme) ne peuvent être déterminées que in vivo. Cette étude préclinique, visera à évaluer la pertinence clinique de l’utilisation de ces molécules radiomarquées pour étudier la biodistribution par imagerie TEP ainsi que le traitement du myélome multiple et du glioblastome, et d’y intégrer les paramètres environnementaux inhérents à un organisme entier.

Réduction

Les effectifs sont justifiés par l’importante variabilité des résultats obtenus pour l’efficacité du traitement pour obtenir des résultats statistiquement significatifs. Une approche statistique a déterminé que le nombre d'animaux par groupes nécessaire pour déterminer un effet significatif lors de l'analyse des données est de 6 individus. Cette taille fournira la puissance nécessaire pour détecter une réduction du volume tumoral de ≥30% par rapport au contrôle, avec un écart-type de 25% au maximum dans le groupe de contrôle. Le nombre d’animaux a été réduit au strict minimum pour être statistiquement significatif et scientifiquement irréprochable. Le nombre de paramètres mesurés par animal a été optimisé et nous avons privilégié les études longitudinales lorsque cela était possible. L’étude de toxicité sur souris saine ainsi que de biodistribution servent d’études pilotes avec un nombre restreint de groupes qui conditionnera la suite du projet, le nombre annoncé est donc un nombre maximum d’animaux pour l’étude de 3 fonctionnalisations de elesclomol.

Raffinement

Toutes les manipulations susceptibles de générer de la douleur seront réalisées sous anesthésie générale. Les souris seront observées et la croissance des tumeurs sera mesurée régulièrement. Des études préalables nous ont permis de définir les points limites les plus précoces afin d’éviter toute souffrance animale par interruption de la procédure. Une période d’acclimatation de 2 semaines sera observée avant le début d’une procédure. Les animaux seront habitués 2-3x par semaine pendant au moins 1 semaine avant le début d’une procédure, afin de réduire le stress dû aux manipulations lors de l’étude. Les animaux seront hébergés en groupes sociaux selon les normes en vigueur avec des conditions d’hébergement et d’enrichissement de leur environnement permettant à l’animal d’exprimer des comportements naturels. L’imagerie se fait sous anesthésie gazeuse dans une enceinte chauffée avec monitora de la température et de la fréquence respiratoire.

Choix des espèces

La raison la plus importante du choix des souris pour nos études est leur similitude avec les organismes humains en ce qui concerne l’anatomie, la physiologie et la génétique. La disponibilité d’animalerie agrée pour la souris ainsi que l’expertise présente à proximité facilite le suivi et la qualité des expérimentations. Le modèle murin est d’autant plus indiqué car il permet de combiner une étude de toxicité et d’efficacité thérapeutique sur des souches immunodéprimées particulièrement adaptées à l’études de la biologie des cancers. Les souris mâles et femelles auront un poids compris entre 20 et 45g lors de leur utilisation et seront âgés de 8-12 semaines, soit l’âge de leur maturité sexuelle. Cet âge permet de s’affranchir des problèmes à la fois prés pubères et de vieillissement et donc évite d’inclure des paramètres supplémentaires dans la compréhension des mécanismes mis en jeu.

Rendre l'élevage de truites plus résistant aux canicules : 270 truites arc-en-ciel juvéniles sont soumises pendant 18 jours à un manque d'oxygène, à des températures proches de leur limite physiologique, ou aux deux, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Toutes sont ensuite anesthésiées puis tuées par surdosage de tricaïne pour prélever leur système digestif. Le porteur annonce une léthargie initiale et une baisse de prise alimentaire de 15 à 20 %, qu'il présente comme temporaire, et n'attend aucune mortalité. Il justifie ces conditions en indiquant qu'elles correspondent à ce que les poissons rencontrent dans le milieu naturel, et rappelle que la truite arc-en-ciel est l'espèce piscicole la plus produite en France.

Objectifs

Ce projet vise à évaluer les mécanismes de réponse cellulaire du système digestif de la truite arc-en-ciel (Oncorhynchus mykiss) soumis à un stress thermique et à une diminution de la disponibilité en oxygène dans le milieu (hypoxie).

Bénéfices attendus

Le principal bénéfice attendu de ce projet est la production de données expérimentales solides sur les mécanismes cellulaires et moléculaires impliqués dans la réponse du système digestif de la truite arc-en-ciel (Oncorhynchus mykiss) soumise à un stress thermique et hypoxique. Ces connaissances apporteront des éléments essentiels pour identifier les cibles physiologiques et moléculaires clés permettant des interventions nutritionnelles adaptées, nécessaires pour renforcer la résilience des poissons face aux épisodes de canicule, dont la fréquence augmente avec le changement climatique.

Procédures

Les animaux seront soumis, pendant une durée de 18 jours, à des contraintes spécifiques, en fonction du groupe de traitement : • Traitement 2 : exposition à des conditions hypoxiques. • Traitement 3 : exposition à des contraintes de température. • Traitement 4 : exposition à des contraintes combinées de température et d’hypoxie. • Traitement 5 : exposition à des contraintes de température. • Traitement 6 : exposition à des contraintes combinées de température et d’hypoxie. À la fin de la période expérimentale, les poissons seront capturés par du personnel formé et expérimenté, anesthésiés dans un bain de tricaïne méthanesulfonate, puis euthanasiés par surdosage de tricaïne.

Impact sur les animaux

Le stress thermique et hypoxique auquel les animaux seront soumis est susceptible d’induire une léthargie au début, le temps que les poissons s'habituent, mais cette gêne sera temporaire. Par ailleurs, la prise alimentaire diminuera, mais cette réduction sera faible (de 15 à 20% retour d’expérience sur des expérimentations similaires), car l'impact global reste limité en raison de l'exposition à des températures proches de la limite physiologique des poissons. Aucune mortalité n’est attendue, du moins pas en conséquence de la manipulation des animaux, des conditions expérimentales ou des modifications physiques de leur environnement.

Devenir

Tous les poissons impliqués (270 animaux) seront euthanasiés afin de prélever des tissus pour les analyses biologiques et biochimiques essentielles aux objectifs du projet.

Remplacement

L’objectif de cette étude est d’examiner les mécanismes cellulaires et moléculaires impliqués dans la réponse digestive de la truite arc-en-ciel (Oncorhynchus mykiss) lorsqu’elle est exposée à un stress thermique et hypoxique. Ces processus physiologiques reposent sur des interactions complexes et intégrées entre plusieurs tissus du système digestif, qui ne peuvent pas être reproduites de manière fiable par des approches in vitro (culture cellulaire) ou in silico (modélisation informatique). Par conséquent, le recours à des animaux vivants est indispensable afin d’obtenir des données précises et biologiquement pertinentes sur les impacts physiologiques de ces facteurs de stress environnementaux dans des conditions expérimentales contrôlées.

Réduction

Le plan expérimental a été soigneusement conçu pour utiliser un nombre minimal de poissons, tout en garantissant la rigueur scientifique et la reproductibilité des résultats. L’étude comprend six traitements (un témoin et cinq conditions de stress), chacun répliqué dans trois bacs, soit un total de 18 bacs, avec 15 truites arc-en-ciel juvéniles par bac, pour un total de 270 poissons. Cette taille d’échantillon et ce niveau de réplication ont été déterminés afin de fournir une puissance statistique suffisante pour détecter les effets des traitements sur les réponses moléculaires, tout en évitant une surreprésentation inutile. Les poissons seront répartis aléatoirement dans les bacs et acclimatés avant le début des traitements expérimentaux, afin de minimiser la variabilité et de maximiser les informations obtenues de chaque individu. De plus, le choix des conditions de stress et de la réplication des bacs a été guidé par l’expérience préalable et la littérature scientifique, dans le but de réduire le nombre d’animaux tout en maintenant la robustesse et la fiabilité des résultats.

Raffinement

Dans le cadre de ce projet, plusieurs mesures seront mises en œuvre afin d’améliorer le bien-être animal et de minimiser la douleur, la souffrance et le stress : • Les conditions d’hébergement seront optimisées en termes de nutrition, densité de peuplement, qualité de l’eau et photopériode. • Les stress thermiques et hypoxiques appliqués dans l’étude correspondent à des conditions naturellement rencontrées par les animaux dans le milieu naturel, ce qui limite l’introduction de facteurs de stress artificiels. • Une surveillance continue des animaux sera assurée afin de détecter précocement tout signe de détresse et de permettre la mise en place rapide de mesures correctives. Ces mesures garantissent que les procédures expérimentales sont conduites conformément aux principes de raffinement, en priorisant le bien-être des animaux tout en maintenant la validité scientifique de l’étude. Le bien-être animal sera évalué quotidiennement à l’aide d’une grille de scoring basée sur des points limites prédéfinis. Les critères pris en compte incluront : comportementaux : prostration ou isolement prolongé, anomalies de nage, diminution marquée de la prise alimentaire, positions inhabituelles dans la colonne d’eau ; physiques : altérations de l’état corporel, lésions cutanées, signes de pathologies ou dégradation de l’aspect général. En cas d’atteinte d’un seuil critique (score ≥3 pour l’un des critères), l’animal concerné sera euthanasié sans délai, conformément aux procédures réglementaires en vigueur, afin de prévenir toute souffrance inutile.

Choix des espèces

La truite arc-en-ciel (Oncorhynchus mykiss) est l’espèce piscicole la plus produite en France et présente une importance agronomique et commerciale majeure. Cependant, cette espèce est de plus en plus confrontée à la fréquence et à l’intensité croissantes des vagues de chaleur liées au changement climatique. Ces épisodes thermiques peuvent avoir des effets sévères sur sa physiologie, sa croissance et sa survie. Ainsi, l’identification de stratégies d’atténuation efficaces constitue une priorité pour assurer à la fois la durabilité de l’aquaculture et le bien-être des animaux. Pour développer de telles stratégies, il est essentiel de comprendre comment la température et la disponibilité en oxygène influencent le métabolisme cellulaire du système digestif de la truite arc-en-ciel. Les poissons auront un poids moyen compris entre 20 et 40 g au début de l’expérience, ce qui indique qu’ils seront au stade juvénile. Cette taille permettra de réaliser les expériences dans des conditions optimales au sein de l’unité expérimentale, tout en étant suffisamment grande pour prélever des échantillons de tissus digestifs en quantité adéquate pour les différentes analyses moléculaires ultérieures.