Procédures modérées
Impact de la déplétion des cellules immunitaires dans des modèles de douleur oculaire développés chez la souris.
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Certaines des souris utilisées ont été développées pour permettre la suppression de cellules immunitaires, des caractéristiques dont le porteur affirme qu'elles n'entraînent "pas de problèmes de santé connus". 1 800 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour des prélèvements post-mortem. Une partie reçoit quatorze instillations d'un conservateur de collyre en sept jours, une autre subit une désépithélialisation de la cornée suivie de deux instillations de toxine bactérienne, avec des tests d'anxiété et de sensibilité mécanique de la cornée, ici nommés. Le porteur affirme que l'étude de la douleur oculaire exige un "organisme entier" et qu'aucun système in vitro ne permet d'évaluer une expérience à la fois sensorielle et émotionnelle.
Objectifs
La douleur oculaire est un symptôme d'alerte en réaction à une inflammation ou un traumatisme, affectant les différentes parties de l'œil. La douleur oculaire est remarquable par la variabilité de l'intensité qu'elle peut générer, allant d'une simple gêne oculaire à une douleur intense, voire insupportable. Les douleurs chroniques de la surface oculaire, au-delà de la souffrance exprimée par les patients, entraînent une altération de la qualité de vie. On estime que près de plus d’un patient sur 2 est gêné lors de ses activités quotidiennes. Ces douleurs peuvent être liées à diverses pathologies, telles que des maladies inflammatoires ou infectieuses, des troubles neurologiques et des interventions chirurgicales oculaires peuvent être la cause sous-jacente de douleur cornéenne chronique. La cornée, tissu le plus innervé de l’organisme, est l’un des générateurs de douleur les plus puissants. Parmi les pathologies oculaires, la sécheresse oculaire est une pathologie liée à une diminution de la production de larmes ou à une altération de leur composition, entraînant des lésions de l’épithélium et des nerfs cornéens. Les symptomes sont variés et incluent une sensibilité accrue à la lumière (photophobie), des douleurs, des picotements, une sensation de brûlure oculaire. Ces manifestations s’accompagnent d’une atteinte de la vie quotidienne : troubles du sommeil, anxiété et dépression. La sécheresse oculaire et les douleurs de la surface oculaire représentent aujourd’hui l’un des premiers motifs de consultation en ophtalmologie soulignant l’urgence d’une meilleure compréhension de leurs mécanismes physiopathologiques. C’est dans cette perspective que nous avons entrepris d’en étudier les bases biologiques et les pistes thérapeutiques potentielles. Cette étude vise à étudier le rôle de l’inflammation dans le maintien et la chronicisation de la douleur cornéenne dans différents modèles précliniques développés chez la souris.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra d’étudier l’impact de la déplétion des cellules immunitaires ainsi que de comprendre leurs contributions spécifiques dans les mécanismes de maintien des syndromes douloureux au cours de la douleur oculaire. Ainsi, nous faisons l'hypothèse qu’après une atteinte cornéenne, à lieu un recrutement et une activation importante de cellules immunitaires localement au niveau de la lésion cornéenne et dans le système trigéminal, et ainsi participer aux mécanismes conduisant à la centralisation et à la chronicité de la douleur oculaire.
Procédures
Une partie des animaux recevra, sur animal vigile, une instillation biquotidienne pendant 7 jours d’un conservateur de collyre ou d’une solution saline tamponnée (deux administrations par jour, espacées de 4 heures) soit un total de 14 instillations par animal. Les animaux subiront des contentions manuelles de 30 secondes maximum pour chaque instillation et pour les tests comportementaux suivants : test d’anxiété (2 fois ou 3 fois, contentions 30 secondes et durée de test 10min par animal), test de sensibilité mécanique cornéenne (2 fois ou 3 fois, contentions durée 30 sec et test : 30 secondes). L’imagerie de la surface oculaire sera réalisée sous anesthésie générale (2 fois ou 3 fois par animal en fonction des procédures et durée du test de 5 minutes par animal). Une seconde partie des animaux subira une desépithélialisation cornéenne unique (1min), réalisée sous anesthésie et analgésie (1 fois pendant 10 minutes). Une instillation cornéenne (30 secondes) de toxine bactérienne sera effectuée lors de la chirurgie, puis une seconde 2 jours plus tard sur animal vigile (contention de l’animal pendant 30 secondes). Soit 2 instillations au total par animal. Les animaux subiront des contentions manuelles de 30 secondes maximum pour chaque instillation et pour les tests comportementaux suivants : test d’anxiété (2 fois ou 3 fois, contentions 30 secondes et durée de test 10min par animal), test de sensibilité mécanique cornéenne (2 fois ou 3 fois, contentions durée 30 sec et test : 30 secondes). L’imagerie de la surface oculaire sera réalisée sous anesthésie générale (2 fois ou 3 fois par animal en fonction des procédures et durée du test de 5 minutes par animal). Certains animaux seront soumis à un régime alimentaire particulier contenant un agent pharmacologique dans les croquettes pendant 1, 2 ou 3 semaines en fonction des groupes.
Impact sur les animaux
Les animaux seront soumis à des contentions manuelles répétées lors des instillations biquotidiennes, pouvant entraîner un stress de courte durée (30sec). Les administrations des anesthésiques/analgésiques, peuvent aussi induire un stress ainsi qu’une légère douleur. L'anesthésie peut entraîner un risque cardio-respiratoire, d’hypothermie, et dans de rare cas une mortalité. La desépithélialisation mécanique cornéenne induit une augmentation de la sensibilité cornéenne chez les souris. L’instillation des agents non pharmacologiques sur la cornée, induisent une augmentation de la sensibilité oculaire et l’apparition d’une inflammation cornéenne. Les procédures d’imagerie de surface oculaire présentent un léger risque car elles nécessitent une anesthésie générale, et peuvent induire une légère irritation de la surface oculaire.
Devenir
Des prélèvements et analyses post-mortem sont nécessaires ce qui implique l’euthanasie des animaux par une procédure réglementaire à la fin de chaque procédure. Tous les animaux de ce projet (pour chaque procédure) seront euthanasiés
Remplacement
L’induction et l’étude de la douleur oculaire nécessite un organisme entier. A ce jour, il n’existe aucun système ex vivo ou in vitro permettant d’évaluer la douleur qui est une expérience sensorielle et émotionnelle. En outre, ce projet vise à évaluer, le rôle de l’inflammation dans les mécanismes de douleur, lié à une suppression des cellules inflammatoires dans l’organisme entier de la souris, nécessitant des expériences comportementales et également des évaluations ex vivo de certains marqueurs biologiques qui nécessitent l’analyse de tissus préalablement prélevés sur animaux euthanasiés. Ce projet ne peut donc être réalisé que chez l’animal. Bien que les questions soulevées par ce projet visent à mieux comprendre les mécanismes physiopathologiques mis en jeu au cours de cette pathologie chez l’Homme, il est d’abord nécessaire d’élucider ces points clés à travers l’utilisation d’un modèle rongeur. De plus, une veille bibliographique réalisée confirme qu’à l’heure actuelle, aucun modèle in silico n’existe pour répondre à ces questions.
Réduction
Le projet a été conçu pour utiliser le moins d’animaux possible. Au total, le nombre d’animaux ne dépassera pas 1 800 sur une période de 5 ans. Afin de tirer un maximum d’informations de chaque animal, plusieurs tissus seront étudiés (comme la cornée, un ganglion nerveux et le cerveau). Le nombre d’animaux nécessaires a été déterminé à partir d’études précédentes menées par l’équipe et de calculs statistiques, afin d’obtenir des résultats fiables sans utiliser plus d’animaux que nécessaire.
Raffinement
Les animaux seront hébergés dans des conditions optimisées pour réduire leur stress et conformes à la réglementation en vigueur. Ils seront pris en charge uniquement par du personnel formé et expérimenté, et des professionnels s’occuperont de leur hébergement, de leur manipulation et des éventuelles interventions chirurgicales. La proximité entre les lieux d’hébergement et le laboratoire permet de réagir rapidement si un animal a un problème de santé. Le bien-être des animaux sera suivi quotidiennement grâce à un système d’identification et à un suivi informatisé partagé entre les équipes. Ils seront observés tous les jours, y compris les week-ends et les jours fériés, et leur santé et leur niveau de douleur seront régulièrement évalués selon des critères validés par des experts en bien-être animal. Toutes les interventions pouvant provoquer inconfort ou stress seront réalisées sous anesthésie, avec un traitement contre la douleur avant, pendant et après la procédure. Si un animal présente un problème grave, l’intervention sera immédiatement arrêtée et des mesures appropriées seront prises pour éviter toute souffrance inutile.
Choix des espèces
Les souris sont souvent utilisées en recherche pour mieux comprendre certaines maladies, notamment la douleur oculaire. Dans ce projet, la souris est le modèle le plus adapté car la structure de l’œil et certaines fonctions du cerveau sont proches de celles de l’humain, et il existe de nombreux outils scientifiques spécifiques à cette espèce. Des souris adultes, mâles et femelles, seront utilisées. Certaines sont des souris « classiques », tandis que d’autres ont été spécialement développées pour permettre l’étude de certaines cellules impliquées dans l’inflammation. Ces caractéristiques particulières n’entraînent pas de problèmes de santé connus et ne nuisent pas au bien-être des animaux. Les souris seront accueillies à l’animalerie à l’âge adulte et bénéficieront d’un temps d’adaptation avant le début des expériences. Les procédures seront de courte durée, entre une et trois semaines maximum, si bien que les animaux auront moins de 11 semaines à la fin des expérimentations.
Mise en place d’une défaillance hépatique par administration de CCL4 chez le rat et la souris et évaluation de composés
- Recherche appliquée
- Troubles gastrointestinaux
Rats : 2864
Pour provoquer une défaillance aiguë du foie par une injection unique de produit toxique, 2 816 souris et 2 864 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré, tous tués à l'issue. Les traitements suivent dans les vingt-quatre heures, jusqu'à deux fois par jour par gavage ou par voie intraveineuse, ou en perfusion pendant six heures sur des animaux qui arrivent déjà implantés. Les prélèvements finaux se font sous anesthésie, sans réveil, pour analyser le foie par histologie et transcriptomique. Rien n'est dit des atteintes attendues chez les animaux: à la place, le texte redécrit le modèle et le qualifie d'altération "sévère mais maîtrisée" des fonctions du foie.
Objectifs
Notre laboratoire cherche à mieux comprendre pourquoi le foie peut soudainement cesser de fonctionner correctement après une exposition à des substances toxiques. Cette défaillance rapide du foie est une situation grave, qui s’accompagne souvent d’une forte inflammation et perturbe profondément l’équilibre de l’organisme. Pour étudier ces mécanismes, nous utilisons un modèle expérimental chez le rongeur qui permet de reproduire, de manière contrôlée, les lésions du foie observées dans ce type de situation. Ce modèle permet d’examiner comment le foie réagit à une agression aiguë et comment ses fonctions peuvent être altérées. L’objectif principal du projet est d’évaluer de nouvelles approches thérapeutiques visant à protéger le foie et à favoriser sa récupération après une agression. Ces approches reposent sur des systèmes naturels de transport de biomolécules, capables d’agir sur les processus inflammatoires et de soutenir la régénération des tissus. Grâce à ce modèle, nous cherchons à mieux comprendre comment ces traitements peuvent réduire l’inflammation du foie, favoriser la réparation des tissus endommagés et contribuer au rétablissement des fonctions hépatiques, avec pour finalité le développement de nouvelles stratégies thérapeutiques pour des situations cliniques graves.
Bénéfices attendus
Pour mieux comprendre cette maladie et trouver de nouveaux traitements, nous développons un modèle expérimental chez le rat et la souris. Ce modèle reproduit les principales caractéristiques de l’ALF humaine. Il permet d’étudier en détail les mécanismes biologiques et cellulaires qui mènent à la défaillance du foie, de suivre l’évolution des marqueurs dans le sang et les tissus, et surtout de tester des traitements innovants dans des conditions contrôlées. Ce modèle est une étape essentielle pour mieux comprendre comment l’ALF se développe, et pour identifier de nouvelles cibles thérapeutiques qui pourraient améliorer la prise en charge des patients atteints de cette maladie.
Procédures
Les animaux subiront une administration unique d'un agent toxique pour le foie par voie intrapéritonéale réalisée sur animal vigile d’une durée courte (comprise en 5 et 10 secondes). Les traitements avec des composés pourront être réalisés au maximum en deux fois par jour soit par gavage sur animal vigile d’une durée courte (comprise en 5 et 10 secondes) soit par voie intraveineuse avec contention en tunnel et une durée de traitement entre 5 et 10 secondes soit en perfusion sur des animaux qui arriveront implantés et ce pendant au maximum 6 heures. Les traitements seront étalés sur les 24 heures qui suivent l'administration de l'agent inducteur. Les prélèvements finaux seront réalisés sous anesthésie avec mise à mort des animaux sans réveil des animaux.
Impact sur les animaux
Ce projet a pour objectif de mettre au point un modèle expérimental permettant d’étudier une défaillance aiguë du foie, comparable à celle observée chez l’être humain lors d’atteintes graves et soudaines de cet organe. Ce modèle repose sur une agression unique et contrôlée du foie, suffisante pour provoquer une altération sévère mais maîtrisée de ses fonctions. Une première phase du projet permettra de définir les conditions les plus adaptées pour reproduire cette atteinte de manière fiable et reproductible, tout en limitant au maximum les effets indésirables pour les animaux. Cette étape est essentielle pour s’assurer que le modèle est pertinent et utilisable pour la suite des travaux. L’évolution de l’atteinte hépatique sera suivie sur une courte période, afin d’observer à la fois les effets précoces et les conséquences plus tardives de l’agression. Cette approche permet d’identifier les différentes étapes du processus conduisant à la défaillance du foie et de mieux comprendre comment la maladie se met en place. Une fois le modèle validé, le projet vise à évaluer de nouvelles approches thérapeutiques destinées à limiter les dommages au foie et à favoriser sa récupération. Ce modèle constitue ainsi un outil essentiel pour améliorer les connaissances sur les mécanismes de cette pathologie grave et contribuer au développement de nouvelles stratégies de prise en charge, dans un cadre rigoureux et respectueux du bien être animal.
Devenir
Tous les animaux inclus dans les différentes procédures du projet seront mis à mort de manière éthique et conforme à la réglementation en vigueur, notamment selon les méthodes recommandées par la directive 2010/63/UE et les bonnes pratiques en matière de bien-être animal. Cette euthanasie interviendra à l’issue des protocoles expérimentaux, principalement pour permettre le prélèvement de sang et d’organes, en particulier le foie. Ces prélèvements sont indispensables pour réaliser des analyses histologiques et transcriptomiques, qui permettront d’évaluer l’efficacité des composés testés et de mieux comprendre leurs mécanismes d’action. Aucun animal ne sera conservé au-delà de la durée nécessaire à l’étude, et toutes les procédures seront réalisées dans le respect des principes de remplacement, réduction et raffinement (3R).
Remplacement
Dans notre laboratoire, nous utilisons d’abord des modèles in vitro, comme des cultures de cellules ou des mini-structures appelées sphéroïdes, pour tester et sélectionner des traitements potentiels. Ces méthodes permettent de limiter l’utilisation d’animaux, conformément aux principes éthiques de la recherche. Cependant, elles ont leurs limites : elles ne peuvent pas reproduire toute la complexité du corps humain, ni simuler les réactions globales d’un organisme face à une agression toxique. Par exemple, ces modèles ne permettent pas d’étudier correctement les effets sur le métabolisme, le système immunitaire ou la manière dont le corps absorbe et élimine un médicament. C’est pourquoi, à un certain stade, il devient nécessaire d’utiliser un modèle animal. Nous utilisons un modèle chez le rat et la souris, dans lequel une seule injection d’un produit toxique pour le foie provoque une atteinte aiguë similaire à celle observée chez les patients. Ce modèle est bien contrôlé et permet d’évaluer l’efficacité des traitements dans un organisme complet.
Réduction
Avant de tester un traitement sur des animaux, nous sélectionnons rigoureusement les molécules les plus prometteuses. Seules celles qui ont montré un effet positif dans des tests en laboratoire (sur des cellules et des mini-organes appelés sphéroïdes) sont retenues. Cela permet d’éviter d’utiliser des animaux inutilement, en ne poursuivant que les recherches indispensables. Dans ce projet, nous utilisons un modèle rapide d’atteinte du foie, provoqué par une seule injection d’un produit toxique. Les effets apparaissent en quelques heures, ce qui permet de limiter la durée d’exposition des animaux, de réduire les différences entre individus, et d’obtenir des résultats fiables avec moins d’animaux. Les paramètres étudiés (comme les marqueurs biologiques du foie, l’expression des gènes ou l’état des tissus) sont choisis pour leur fiabilité et leur pertinence scientifique. Grâce à des données déjà connues, nous pouvons calculer précisément le nombre d’animaux nécessaires, en utilisant des méthodes statistiques adaptées. Cela garantit des résultats solides tout en évitant la surutilisation. Le protocole est simple : une seule injection, sans chirurgie ni manipulation répétée. Cela réduit les risques d’échec technique et contribue à limiter le nombre total d’animaux utilisés. Enfin, pour les tests par perfusion intraveineuse, les rats et souris arrivent déjà équipés d’un dispositif implanté. Comme leur état inflammatoire est différent de celui des animaux non traités, il faudra ajuster la dose du produit toxique pour chaque espèce. Ces études seront menées dans des procédures séparées, avec des doses spécifiques, afin de garantir des conditions adaptées et éthiques.
Raffinement
Les animaux utilisés dans ce projet sont hébergés dans des conditions optimisées pour leur bien-être. Les rongeurs sont logés par groupe compatible avec leur comportement social, dans des cages enrichies comprenant du coton compressé pour la construction de nids, des igloos ou des tunnels en polycarbonate teintés pour favoriser le comportement de dissimulation, et des éléments de stimulation tels que des blocs de bois. Un complément alimentaire de type diet gel boost, hautement nutritif et appétent, sera systématiquement mis à disposition après chaque administration de produit toxique pour le foie ou chaque prélèvement, afin de soutenir la récupération et limiter les effets secondaires liés au protocole. Le modèle expérimental mis en œuvre est modéré, basé sur une administration unique de produit toxique pour le foie par voie intrapéritonéale, sans intervention chirurgicale ni douleur attendue. Les effets observés sont principalement transitoires : réduction de l’activité spontanée, baisse de la prise alimentaire et hydrique, et perte de poids modérée. Ces signes sont suivis de manière rapprochée, et des points limites clairement définis permettront d’intervenir rapidement si un animal présente des signes de détérioration non attendus. Le protocole est conçu pour minimiser les manipulations et réduire le stress. L’ensemble de ces mesures vise à raffiner les conditions expérimentales, en assurant un niveau de bien-être élevé pour les animaux tout au long de l’étude, tout en garantissant la pertinence scientifique des observations.
Choix des espèces
Le rat et la souris sont couramment utilisés pour étudier les maladies graves du foie, car leur fonctionnement général présente de nombreuses similitudes avec celui de l’être humain. Les réactions du foie face à une agression, ainsi que sa capacité à se réparer, peuvent ainsi être étudiées de manière pertinente dans ces modèles. Les modèles utilisés permettent de reproduire les principales altérations observées lors d’une défaillance aiguë du foie, notamment les dommages aux cellules hépatiques et la réaction inflammatoire associée. Le recours à différents types d’animaux permet de mieux tenir compte de la variabilité naturelle des réponses biologiques et d’identifier les situations les plus représentatives de la maladie étudiée. Ces modèles offrent également la possibilité d’un suivi rigoureux de l’évolution de la maladie et de l’effet des approches thérapeutiques évaluées, dans des conditions contrôlées. Le choix de ces animaux et des conditions expérimentales vise à obtenir des résultats fiables et reproductibles, tout en limitant le nombre d’animaux utilisés et en respectant leur bien être. Les animaux sont utilisés à un stade de développement où leur organisme est suffisamment mature et stable, ce qui permet de limiter les variations liées à la croissance ou à l’âge et d’assurer une meilleure comparabilité des résultats.
Bases cellulaires de la mémoire : identification des mécanismes de détection de la communication neuronale par les astrocytes.
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
760 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré, toutes tuées à l'issue. Chaque animal reçoit deux injections intracérébrales de cinq minutes sous anesthésie, puis une perfusion sous anesthésie générale de trente minutes. Le projet porte sur la façon dont les astrocytes de l'hippocampe détectent la communication entre neurones et régulent les bases cellulaires de la mémoire. Le porteur juge "indispensable" de comprendre ces mécanismes pour proposer un jour une cible thérapeutique contre les maladies neurodégénératives, et désigne la mise à mort des souris par le mot "sacrifice".
Objectifs
Le fonctionnement du cerveau repose sur le transfert d’information de neurones en neurones au niveau d’une structure spécialisée, la synapse. Afin que cette transmission ait lieu de manière adaptée, il est important de considérer une troisième cellule, l’astrocyte. En effet, l’astrocyte est capable de détecter l’activité neuronale et donc le moment où l’information est transmise au niveau de la synapse. En retour, l’astrocyte régule la qualité avec laquelle ces neurones communiquent en libérant des substances actives. Le but de ce projet est de mieux comprendre comment dans l’hippocampe, une structure jouant un rôle un rôle fondamental dans l’apprentissage et la mémoire, les astrocytes détectent la communication neuronale pour en retour réguler de manière appropriée les bases cellulaires de la mémoire.
Bénéfices attendus
L’intérêt scientifique de ce projet est de mieux comprendre les bases cellulaires de la mémoire. A plus long terme ce travail pourra apporter de nouvelles pistes d’études en recherche clinique. En effet la mémoire est la cible de nombreuses maladies neurodégénératives comme la maladie d’Alzheimer. Afin de pouvoir proposer une cible thérapeutique il est dès lors indispensable de comprendre les fondements cellulaires qui sont à la base de la formation de la mémoire
Procédures
Les différents gestes techniques utilisés dans ce projet sont au nombre de 2 -Chirurgie pour injections intra-cérébral : les animaux seront anesthésiés sous isoflurane durant toute la chirurgie. Les animaux subiront au total 2 injections (5min chacune). -Perfusions : les animaux seront sous anesthésie générale pendant 30 minutes.
Impact sur les animaux
Les procédures de chirurgies sont susceptibles d’induire une légère douleur post intervention, pouvant être accompagnée dans de très rares cas d’une perte de poids et un changement d’activité.
Devenir
Pour l’ensemble des procédures de ce projet, la récupérationn du cerveau implique le sacrifice des animaux
Remplacement
Pour l’ensemble de ce projet, il est nécessaire d’utiliser un modèle murin dont la lignée transgénique est non domageable.
Réduction
Concernant le nombre total d’animaux impliqués dans ce projet, il s’agit du nombre d’animaux nécessaire à l’obtention de données de qualité exploitable et permettant une analyse statistique fiable. En effet, le nombre de souris par groupe a été évalué en s'appuyant sur un outil statistitique et selon les études précédemment effectuées au laboratoire dans le même domaine tout en tenant compte des divers problèmes que nous pourrons rencontrer au cours des différentes phases expérimentales.
Raffinement
Les animaux seront hébergés au sein d'un établissement utilisateur agréé dans des conditions d’hébergement favorisant leur bien-être (enrichissement, suivi quotidien par du personnel qualifié, …). Enfin, des points-limites ont été établis entraînant une prise en charge de l’animal afin d’anticiper toute souffrance et réduire au mieux l'inconfort des animaux (anesthésie, analgésie, gel oculaire, tapis chauffant). En effet, les animaux seront observés quotidiennement et la douleur sera évaluée selon la grille d’évaluation, organisées selon 5 critères : Apparence Physique/Comportement/Changements de poids /Changements de l’activité/Aspect de la cicatrisation
Choix des espèces
Le modèle utilisé est la souris. La souris est classiquement utilisée afin de mieux comprendre le rôle des astrocytes dans la communication neuronale et la plasticité synaptique à long terme (base cellulaire de la mémoire). Ce modèle permet de produire des tranches aiguës de cerveau afin de réaliser des études d’électrophysiologie et d’imagerie. Les souris seront réceptionnées dès l’âge de 3 ou 6 semaines afin d’être âgées de 7 ou 9 semaines minimum au moment des injections intra cérébrales. Les questions que nous posons concernent le stade adulte, c’est pourquoi les expériences seront réalisées sur des souris femelles et mâles âgées de 12 à 18 semaines.
Production de souris humanisé pour le système immunitaire
- Recherche appliquée
- Cancers
- Maladies infectieuses
- Troubles immunitaires
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système cardiaque
Produites pour être vendues à des chercheurs et à des entreprises, 72 000 souris immunodéficientes vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Dans la méthode principale, les nouveau-nés de moins de cinq jours reçoivent une irradiation de trois minutes puis une injection de cellules souches humaines dans le foie, avant un transport de quarante-cinq minutes en camion vers un éleveur professionnel. Le porteur explique que seules les femelles sont humanisées, "car il n'existe pas de demande du marché pour les mâles", et que la production est ajustée chaque semaine aux besoins prévus. Aucune de ces souris n'est tuée dans le cadre du projet, toutes étant gardées vivantes pour être utilisées ensuite par les clients, ce qui laisse leur devenir réel hors du champ de ce résumé.
Objectifs
Depuis plusieurs années, certaines souris spéciales, dites « immunodéficientes », sont utilisées comme modèles pour étudier le système immunitaire humain. Ces souris n’ont pas de défenses immunitaires propres, ce qui permet d’y greffer des cellules humaines. On leur injecte notamment des cellules souches du sang humain, capables de reconstruire un système immunitaire complet. L’objectif est de créer des souris dont le système immunitaire est en grande partie humain, afin de mieux comprendre les maladies, tester des traitements ou développer des vaccins. Le but de ce projet est de produire ces souris « humanisées » et de les mettre à disposition de chercheurs et d’entreprises pour enrichir la connaissance et développer les médicaments de demain.
Bénéfices attendus
Les souris dotées d’un système immunitaire humain sont des modèles essentiels pour la recherche médicale, car elles reproduisent des caractéristiques proches de celles de l’être humain. Elles permettent de tester des médicaments dans des conditions plus réalistes, notamment pour des maladies liées au système immunitaire, au cancer, à l’inflammation ou au métabolisme. Ces modèles améliorent la qualité des recherches en offrant des résultats plus fiables et reproductibles. Cela contribue à réduire les échecs lors des essais cliniques et à accélérer le développement de nouveaux traitements. En utilisant des modèles adaptés, la recherche gagne en pertinence et limite le recours à des approches moins efficaces.
Procédures
Deux méthodes sont utilisées pour humaniser le système immunitaire humain chez les souris. Méthode 1, la plus courante, concerne les nouveau-nés âgés de moins de 5 jours. Ils reçoivent une irradiation unique, très courte (environ 3 minutes), suivie d’une injection de cellules souches humaines directement dans le foie, qui ne dure que quelques secondes. Méthode 2, utilisée uniquement dans de très rares cas (2% d'humanisations), concerne des jeunes femelles âgées de 4 à 5 semaines. Elles reçoivent deux injections intrapéritonéales de busulfan à 24 heures d’intervalle, chacune ne durant que quelques secondes. Ensuite, une seule injection de cellules est réalisée par voie rétro-orbitale sous anesthésie gazeuse. Bien que l’injection elle-même prenne seulement quelques minutes, l’animal reste anesthésié pour une durée totale maximale de 7 à 10 minutes. Chaque animal ne suit qu’une seule méthode complète, soit au stade nouveau-né, soit à l’âge adulte.
Impact sur les animaux
Les souris utilisées dans ce projet sont des animaux immunodéficients et doivent donc être maintenues dans des conditions très protégées pour éviter les infections. Lorsqu’elles ne sont pas exposées à des agents infectieux, elles restent en bonne santé. Un léger stress peut survenir lors de leur transport entre les sites, ainsi que lors de la manipulation des nouveau-nés et de leur séparation avec la mère. Chez les nouveau-nés, l’injection dans le foie peut provoquer une légère gêne de courte durée. Les injections intrapéritonéales de busulfan peuvent entraîner un inconfort transitoire au point d’injection ainsi qu’une période limitée de malaise, se manifestant par une baisse d’activité, un appétit diminué et une légère perte de poids. L’injection rétro-orbitale peut causer une irritation oculaire passagère liée à la manipulation, mais le produit injecté n’est pas irritant. Pour garantir une qualité optimale des soins et des conditions sanitaires, les animaux humanisés sont hébergés chez un éleveur professionnel jusqu’à leur expédition vers l’utilisateur final. En conséquence, ils doivent être transportés depuis notre site vers celui de l’éleveur. Ce trajet, d’une durée d’environ 45 minutes en camion agréé, est direct et réalisé dans des conditions contrôlées. Bien que court, ce déplacement peut entraîner un stress transitoire chez les souris.
Devenir
Tous les animaux sont gardés à vie à l’issue de chaque procédure de ce projet. Ils sont destinés à être utilisés dans des études scientifiques menées par les utilisateurs finaux, ce qui constitue l’objectif principal de leur production.
Remplacement
Les souris immunodéficientes portant un système immunitaire humain reconstitué sont aujourd’hui des modèles essentiels pour étudier le fonctionnement de cellules humaines dans un organisme vivant, avant les phases cliniques. Des méthodes alternatives sans animaux se développent, comme les systèmes organ-on-chip, les co-cultures avancées ou les organoïdes, qui permettent de reproduire certaines fonctions de tissus humains. Ces approches offrent des avantages, notamment la possibilité d’utiliser des cellules provenant de patients, et elles sont progressivement intégrées aux stratégies de développement pour réduire l’usage d’animaux. Toutefois, elles ne permettent pas encore de reproduire les interactions complexes entre organes, les régulations hormonales ou métaboliques, ni la dynamique complète du système immunitaire. Pour ces raisons, les modèles de souris humanisées restent indispensables pour comprendre les réponses immunitaires dans un organisme entier et obtenir des données fiables avant les essais chez l’homme.
Réduction
Le nombre de souris humanisées produites est défini en fonction des besoins prévus pour les six prochains mois. La production est répartie en petits lots hebdomadaires, ce qui permet d’ajuster les objectifs de production chaque semaine. Les fluctuations naturelles peuvent être compensées grâce à des lots produits jusqu’à deux semaines avant ou après. Ainsi, seules les souris réellement nécessaires sont produites et toute surproduction est évitée. Enfin, seules les femelles sont actuellement humanisées, car il n’existe pas de demande du marché pour les mâles. Des méthodes innovantes sont à l’étude pour, à terme, permettre l’utilisation des mâles ou réduire leur proportion à la naissance.
Raffinement
Les souris sont maintenues en conditions sanitaires strictes afin de les protéger des infections, auxquelles elles sont très sensibles en raison de leur immunodéficience. Pour l’humanisation selon la méthode 1, les petits sont manipulés avec précaution afin de limiter leur stress et permettre leur retour sans difficulté auprès de la mère. Avant toute manipulation, le technicien frotte ses gants avec de la litière afin de conserver l’odeur du nid. Cela est appliqué lors de l’irradiation et de l’injection des cellules humaines. Pour la méthode 2, l’injection rétro-orbitale est réalisée sous anesthésie afin de garantir le confort de l’animal. Après chaque procédure, les animaux font l’objet d’une surveillance attentive pendant 1 à 2 jours afin de détecter rapidement toute complication. En cas de perte d’appétit ou de poids, de la nourriture molle ou en gel est ajoutée pour faciliter l’alimentation.
Choix des espèces
Les progrès en génétique permettent aujourd’hui de créer des rongeurs présentant un système immunitaire humain ou l’humanisation de certains organes. Ces modèles sont essentiels pour mieux comprendre les maladies humaines et développer des traitements adaptés. Le rongeur est choisi pour sa taille et sa manipulation aisée, ce qui en fait un modèle idéal pour l’humanisation du système immunitaire par injection de cellules souches humaines. Ces modèles sont utilisés pour des études précliniques avant les essais chez l’Homme, notamment pour évaluer l’efficacité de nouveaux médicaments. Ils permettent d’analyser le rôle des cellules immunitaires humaines dans des contextes complexes, comme les tumeurs ou les réactions inflammatoires. Le stade de développement des animaux utilisés est déterminé par la méthode d’humanisation : pour l’humanisation par irradiation et injection intra-hépatique de cellules souches de sang, des nouveau-nés âgés de 4 à 5 jours sont utilisés, car cette approche fonctionne mieux chez les très jeunes animaux. Pour la méthode utilisant le busulfan et l’injection en rétro-orbitale, des rongeurs âgés de 4 à 5 semaines sont choisis, car ils tolèrent ce traitement, qui serait toxique chez les nouveau-nés.
Analyse de la régénération musculaire après une lésion induite par un exercice d’intensité variable EU2/2 – MODIFICATION
- Recherche fondamentale
- Système musculosquelettique
Jusqu'à sept mesures de force sous anesthésie générale, trois lavages vaginaux, quatre injections intrapéritonéales et une séance d'imagerie pouvant durer trois heures: 1 189 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour des analyses tissulaires et cellulaires. L'exercice imposé par électrostimulation sous anesthésie provoque une blessure du muscle du mollet droit, que le porteur compare à un claquage chez l'être humain. Le projet cherche à établir l'influence du sexe sur les étapes de la réparation musculaire et à identifier les mécanismes cellulaires en jeu. Le porteur affirme qu'aucun signe de souffrance n'est visible lors des lavages vaginaux ni au décours du dommage musculaire, tout en déclarant des nuisances modérées pour l'ensemble des animaux du fait du cumul des actes.
Objectifs
Le projet se déroule dans 2 EU. Il vise i) à mettre en évidence l’influence du sexe sur les différentes étapes de la réparation musculaire en nous appuyant sur un modèle préclinique standardisé de lésions musculaires physiologiques induites par un exercice d’intensité variable (i.e., de légère à élevée) ; ii) à identifier les mécanismes cellulaires et moléculaires sous-jacents.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de i) à mettre en évidence l’influence du sexe sur les différentes étapes de la réparation musculaire en nous appuyant sur un modèle préclinique standardisé de lésions musculaires physiologiques induites par un exercice d’intensité variable (i.e., de légère à élevée) ; ii) à identifier les mécanismes cellulaires et moléculaires impliqués. Ce projet pourrait permettre d’améliorer la prise en charge des atteintes musculaires associées à plusieurs situations physiopathologiques (vieillissement, cancer...)
Procédures
Les souris sont soumises à des lavages vaginaux (3 maximum, EU1/2), un protocole d’exercice par électrostimulation (sous anesthésie générale, durée 15 minutes maximum, EU1/2), à une mesure de force (sous anesthésie générale, durée 5 minutes maximum, 7 mesures maximum, EU1/2). Une partie des animaux est également soumis à des injections ip (4 maximum, EU1/2) (moins d’une minute), une injection sous-cutanée et à une analyse par imagerie (sous anesthésie générale, durée 3 heures maximum, EU2/2)
Impact sur les animaux
Des nuisances et effets indésirables "modérés" sont attendus du fait d’un cumul d’actes (contention, injections, lavages vaginaux, électrostimulation, anesthésies). Les souris femelles sont soumises à des lavages vaginaux (3 maximum) afin de contrôler leur cycle ovarien. L’ensemble des animaux est soumis à un protocole d’exercice qui induit une blessure des muscles du mollet droit mimant ainsi un « claquage » chez l’homme. Des mesures de force sont réalisées sous anesthésie générale pour déterminer la cinétique de réparation de la fonction musculaire. Notre expérience depuis le début du projet montre qu'il n'y a aucun signe de souffrance visible chez les animaux lors des lavages vaginaux et au décours de l'induction du dommage musculaire et des mesures de force. Toutefois, le cumul de ces actes peut générer du stress pour les animaux. Enfin, le traitement antalgique préalable à la session d’imagerie peut générer du stress lors de la contention.
Devenir
Tous les animaux sont mis à mort pour réaliser des analyses tissulaires et cellulaires
Remplacement
Le laboratoire a une longue expérience des essais in vitro par la culture cellulaire. Aussi, bien que l'analyse de la régénération musculaire puisse être en partie étudiée in vitro, ce processus repose notamment sur l’interaction entre différentes cellules qui ne peut être étudiée qu'in vivo, justifiant le recours à l'expérimentation animale
Réduction
L'utilisation des animaux est strictement réduite au nombre nécessaire pour l'établissement des données expérimentales, à l'aide des analyses statistiques effectués précédemment pour ces procédures. Nous utilisons un dispositif expérimental totalement non-invasif qui permet de réaliser des protocoles d’exercice et de mesurer la force musculaire de manière concomitante sur les mêmes animaux rendant les préparations chirurgicales totalement obsolètes et réduisant ainsi le nombre d’animaux utilisés
Raffinement
Les protocoles les moins invasifs et les moins douloureux possibles sont privilégiés. La procédure expérimentale utilisée inclut un recours systématique à l'anesthésie générale adaptée lors de l’électrostimulation et de la mesure de la force musculaire. Notre expérience sur ce modèle de dommage musculaire et de lavages vaginaux montre que l'ensemble (100%) des animaux est inclus pour réaliser des analyses fonctionnelles et biologiques. Un lavage vaginal est effectué ce qui permet d’éviter la réalisation d’un prélèvement intravaginal (frottis). Un traitement antalgique est réalisé 30 minutes avant la session d’imagerie.
Choix des espèces
Des travaux précédents ont montré que les processus mis en œuvre au cours de la régénération musculaire chez la souris sont proches de ceux observés chez l'homme. Les animaux utilisés sont à l'âge adulte (8-12 semaines).
Étude du système vasculaire intra-nerveux et des effets de molécules vasodilatatrices dans le cas d’une neuropathie périphérique chimiquement induite à des souris développant une carcinose péritonéale, une tumeur intra-caecale ou sous-cutanée.
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Le nerf sciatique est mis à nu par incision cutanée trois à huit fois par animal, une vingtaine de minutes à chaque fois. 1 530 souris porteuses d'une tumeur du colon reçoivent une chimiothérapie qui provoque une neuropathie périphérique, 1 440 d'entre elles dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Le porteur qualifie les douleurs des pattes de "sensations d'inconfort", tout en précisant qu'elles peuvent apparaître dès les premiers jours et "ne disparaîtront pas". Toutes sont tuées pour prélever cerveau, nerfs sciatiques, peau des pattes, ganglions et tumeur, et les tests censés évaluer leur douleur, environ trois fois par semaine pendant deux à huit semaines, ne sont pas nommés.
Objectifs
Nous avons mis au point un modèle murin de neuropathie périphérique induite par la chimiothérapie sur des souris. Nos résultats suggèrent que l’administration de molécules vasodilatatrices améliore les symptômes d’une neuropathie périphérique chimiquement induite. Afin d’évaluer cette piste thérapeutique, il est important de vérifier qu’elle n’interfère pas avec l’efficacité antitumorale de la chimiothérapie. Pour ce faire, nous souhaitons induire une neuropathie périphérique chez des souris présentant une tumeur abdominale provoquée par une injection de cellules cancéreuses du colon murin. Ce projet permettra donc de statuer sur l’utilisation de ces molécules vasodilatatrices dans le traitement des symptômes neuropathiques induits par la chimiothérapie aux stades aigus et chroniques.
Bénéfices attendus
Si nous prouvons dans ces expériences que l’administration conjointe d’une chimiothérapie et de molécules vasodilatatrices, seules ou en combinaison, n’interfère pas avec l’efficacité du traitement anti-cancéreux, alors l’utilisation de ces molécules vasodilatatrices dans le traitement des symptômes neuropathiques induits par une chimiothérapie aux stades aigus et chroniques pourra être envisagée. Cela permettra aux patients de mieux supporté les traitements anti cancéreux et pourra éventuellement, en évitant l’abandon des soins, augmenter le pronostic des patients.
Procédures
Les animaux recevront une injection de cellules tumorales par 3 voies différentes. Pour deux d’entre elles, une seule injection rapide dans l’abdomen de l’animal sera suffisante. Pour la dernière, la procédure nécessitera l’endormissement de l’animal et une petite procédure chirurgicale d’environ 20 minutes. Ensuite, les animaux recevront différentes molécules d’intérêt dans le traitement des douleurs. Ces injections sont rapides, tous les jours ou tous les deux jours pendant 2 à 8 semaines. Enfin, l’administration de chimiothérapie sera effectuée une fois tous les deux jours pendant 2 semaines ou une fois par semaine pendant 8 semaines. Afin de suivre la progression tumorale, les animaux recevront entre 3 et 8 injections d’un produit permettant la visualisation de la tumeur. Les animaux seront soumis à une incision cutanée afin d’exposer le nerf sciatique 3 à 8 fois pendant une vingtaine de minutes. Enfin, les animaux seront soumis à différents tests comportementaux permettant d’évaluer leur douleur. Ces tests seront effectués en moyenne 3 fois par semaine pendant 2 à 8 semaines et auront une durée d'environ 15 minutes pour chaque animal.
Impact sur les animaux
Les souris recevant une dose cumulée de chimiothérapie, nous pouvons nous attendre à une petite perte de poids de nos animaux. Les souris traitées à la chimiothérapie développeront une neuropathie périphérique avec des sensations d’inconfort au niveau des pattes notamment. Ces sensations douloureuses pourront être ressenties dès les premiers jours de la procédure et ne disparaitront pas. Une sensation d’inconfort pourra être ressentie après l’incision cutanée nécessaire à la réalisation du laser doppler. La manipulation des animaux lors des différentes administrations pourra engendrer un léger stress chez les animaux. Le développement des tumeurs pourra, en fonction du modèle, engendrer une gêne causée par la présence d’une masse tumorale au niveau de l’abdomen ou une gêne post-chirurgicale au niveau des sutures au niveau de l’abdomen. Les tests comportementaux utilisés pour évaluer la douleur pourront également engendrer du stress et de la gêne chez les animaux.
Devenir
Les animaux seront mis à mort à l’issue de chacune des procédures et nous prélèverons les organes (cerveaux, nerfs sciatiques, peaux de pattes, ganglions dorsaux, tumeur) afin de conduire des études post mortem.
Remplacement
Ce projet modélise une pathologie humaine, la neuropathie périphérique chimiquement induite à un stade chronique et l’effet d’une potentielle solution thérapeutique. Ce projet nécessite la mesure de différents paramètres comportementaux et physiologiques ; il n’est pas possible de s’affranchir de l’expérimentation animale.
Réduction
Le nombre d’animaux a été dimensionné pour permettre l’obtention de résultats statistiquement valides en prenant en compte les différents risques inhérents aux types d’expériences réalisées.
Raffinement
Les animaux bénéficieront d’une période d’acclimatation d’une semaine ou plus. Les incisions nécessaires seront effectuées avec une analgésie et une anesthésie appropriées. Les animaux seront suivis grâce à une grille de score permettant la mise en place de points limites précoces permettant la prise en charge de toute douleur ou souffrance de façon rapide. Certaines expériences ont été raffinées grâce à un suivi par fluorescence non invasif.
Choix des espèces
Nous utiliserons pour ces expériences des souris males immunocompétents, espèces largement utilisées dans la recherche en cancérologie pour sa capacité d’incrémenter l’incidence tumorale après injection des cellules cancéreuses. La neuropathie périphérique chimiquement induite est un effet secondaire de nombreux traitement anti-cancéreux. C’est donc une pathologie qui touche majoritairement les adultes. Nous travaillons alors chez la souris adulte, âgée entre de 3 et 6 mois.
Exposition à long terme de deux additifs alimentaires riches en aluminium, le carbonate de calcium E170 et le pigment nacré d’aluminosilicate de potassium (INS176ii) sur les fonctions immunitaires et métabolique
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
Nourries pendant environ trois mois avec des additifs riches en aluminium, le carbonate de calcium E170 et un pigment nacré d'aluminosilicate de potassium, 1 200 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour prélever leurs tissus. Les gestes qu'elles subissent restent décrits en termes vagues, des "mesures réalisées ponctuellement" et des "prélèvements biologiques" effectués "de manière encadrée", sans que le texte précise lesquels ni à quelle fréquence. Une étape destinée à induire une réponse inflammatoire est annoncée avec une baisse de poids "plus marquée", elle aussi sans détail. Les bénéfices annoncés visent l'évaluation des risques et l'aide aux politiques publiques, quand le protocole imposé aux souris reste, lui, sans description précise.
Objectifs
Différentes études ont montré que l’aluminium peut avoir des effets délétères sur le système nerveux et le système immunitaire. La population générale y est principalement exposée par l’alimentation, en raison de sa présence naturelle dans l’environnement mais aussi de son utilisation dans de nombreux produits du quotidien. L’aluminium est notamment présent dans certains aliments transformés, du fait de son utilisation lors de leur fabrication ou de leur conditionnement. Étant donné que l’alimentation constitue la principale voie d’exposition à l’aluminium, ce projet vise à étudier le devenir de substances alimentaires riches en aluminium, administrées seules ou en combinaison. Nous chercherons à déterminer si une exposition à l’âge adulte à ces substances peut favoriser l’apparition d’altérations de la barrière intestinale et de dysfonctionnements du système immunitaire.
Bénéfices attendus
Ce projet apportera des données utilisables pour l'évaluation des risques pour la santé humaine et animale sur l’exposition à l’aluminium de sources alimentaires afin d'aider les politiques publiques. Cet impact pourra être pris en compte par les instances règlementaires afin de réguler l'exposition humaine.
Procédures
Les animaux seront soumis à une intervention nutritionnelle correspondant à une exposition prolongée à certaines substances alimentaires intégrées à leur alimentation, sur une période d’environ trois mois à l’âge adulte. Au cours de l’étude, différents paramètres liés au métabolisme et au fonctionnement intestinal seront évalués à l’aide de mesures réalisées ponctuellement. Des prélèvements biologiques seront effectués de manière encadrée afin de permettre ces analyses, dans des conditions visant à limiter au maximum l’inconfort et le stress des animaux. Par ailleurs, des échantillons fécaux seront collectés régulièrement tout au long de l’expérience afin de suivre l’évolution des paramètres d’intérêt.
Impact sur les animaux
La mise en œuvre de l’étude pourra entraîner un stress ou un inconfort modéré chez les animaux. Celui-ci sera limité par une habituation régulière aux manipulations et par un suivi attentif tout au long de l’expérience. Certaines évaluations pourront occasionner un inconfort transitoire, notamment lors de l’administration de substances ou de la réalisation de prélèvements biologiques. Des mesures adaptées seront systématiquement mises en place afin de limiter la douleur associée à ces gestes. Enfin, une des étapes de l’étude visant à induire une réponse inflammatoire légère pourra s’accompagner d’une diminution du poids corporel plus marquée que lors des autres phases, qui fera l’objet d’une surveillance renforcée.
Devenir
A l'issue de toutes les procédures, tous les animaux seront mis à mort afin d'effectuer différents prélèvements de tissus nécessaires pour l'étude.
Remplacement
Les modèles alternatifs ne permettent pas aujourd'hui d’étudier la répartition des particules d’Aluminium dans l’organisme ni de recréer la complexité des dialogues Microbiote-intestin -foie -cerveau.
Réduction
Nous avons conçu nos expériences pour répondre à nos questions scientifiques tout en utilisant le moins d’animaux possible. Le nombre d’animaux a été choisi avec soin afin d’obtenir des résultats fiables, sans en utiliser plus que nécessaire. D’après nos études précédentes, le nombre le plus adapté est de 10 mâles et 10 femelles (et donc un total de 20 animaux par groupe). Les résultats obtenus seront ensuite analysés à l’aide de méthodes scientifiques reconnues, afin de vérifier que les différences observées sont réelles et non dues au hasard.
Raffinement
Durant l'étude l'angoisse sera atténuée par des manipulations hebdomadaires lors du suivi de poids ou d'observations. Concernant la gestion de la douleur nous appliquerons un analgésique local sur la queue avant les prélèvements sanguin. L’identification des animaux à l’aide d’un poinçon d’oreille permettra de réaliser un suivi individuel (observations, contrôles de prise de poids des animaux). Dans le cas où un animal présenterait des signes de souffrance, il sera retiré de l'étude et des soins adaptés pratiqués. Le cas échéant une euthanasie sera pratiquée.
Choix des espèces
La souris est un modèle reconnu en toxicologie, pour lequel de nombreux outils sont développés afin d’étudier le microbiote, l’intestin et le foie. Les souris mâles et femelles seront utilisées à l’âge adulte (6 semaines) afin d’être mature sexuellement. Cela permettra d’étudier les impacts d’une exposition à l’âge adulte sur le développement des fonctions intestinales, métaboliques et immunitaires.
EDS : Etudes précoces de toxicité pour l’évaluation de la perturbation endocrinienne chez le rat juvénile.
- Recherche appliquée
- Toxicologie (hors obligations réglementaires)
Un gavage quotidien pendant jusqu'à quarante jours chez les mâles, et des prélèvements sanguins pouvant atteindre 15 % du volume sanguin total: 1 760 rats juvéniles vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. L'étude mesure l'ouverture vaginale et la séparation préputiale pour repérer les produits chimiques qui perturbent la puberté, selon des lignes directrices reconnues en Europe et aux États-Unis. Le porteur annonce des effets toxiques modérés, dont des pertes de poids, une salivation augmentée, des tremblements ou des variations de mobilité et de température corporelle. 1 610 rats seront tués pour prélever leurs organes, 100 réutilisés dans un projet de formation ou de prélèvement d'échantillons, et 50 gardés en vie pour être adoptés, à condition de ne présenter aucun signe de mal-être.
Objectifs
Le premier objectif de ce projet est de vérifier si un produit chimique peut agir comme certaines hormones naturelles, en particulier les œstrogènes (que ce soit de manière agoniste/en activant des récepteurs ou antagoniste en les bloquant). Certains produits peuvent en effet imiter ou bloquer l’action de ces hormones, ce qui peut perturber le fonctionnement normal de l’organisme. Cela peut avoir des conséquences négatives sur la santé, notamment sur la croissance et la reproduction. Le deuxième objectif du projet est d’identifier les produits chimiques qui pourraient perturber le système hormonal. Pour cela, on observe leur impact sur le développement de la puberté chez de jeunes rats, mâles et femelles. Ces tests précoces permettent de repérer rapidement les substances potentiellement problématiques et d’éviter des études plus longues impliquant davantage d’animaux. Ils fournissent de nombreuses informations et reposent sur des méthodes reconnues au niveau international, comme les tests utérotrophiques et pubertaires (lignes directrices en Europe et aux états unis).
Bénéfices attendus
Cette étude conduite précocement avec un nombre restreint d’animaux permet d’identifier très tôt dans le développement d’une molécule des effets sur l’équilibre hormonal ou la croissance d’un animal juvénile et d’arrêter le développement de molécules qui pourraient présenter des alertes de perturbation endocrinienne importantes et ainsi éviter des études plus importantes avec plus d'animaux.
Procédures
Les animaux juvéniles seront gavés journalièrement à l’aide d’une sonde souple et flexible en plastique adaptée à leur taille et âge pendant 3 à 23 jours chez la femelle et maximum 40 jours chez le mâle. Cette technique est réalisée en moins de 15 secondes. Des prélèvements sanguins d’une durée inférieure à 2 minutes, pourront être réalisés sur animaux vigiles et/ou animaux anesthésiés. Ce prélèvement peut être unique ou répété en respectant les durées de la récupération physiologique ainsi que le volume maximal prélevable correspondant à 15 % du volume sanguin total. Pour les prélèvements d’organes, les animaux sont mis à mort à la fin de l'experimentation.
Impact sur les animaux
Un stress léger peut se produire lors de la manipulation ou de la contention des animaux. Le gavage effectué à l’aide d’une sonde souple peut induire un léger inconfort et très rarement une irritation de l’œsophage. Des micro-prélèvements peuvent être effectués par ponction à la veine saphène ou pour un volume plus important à la veine submentale ou à la veine sublinguale. Les prélèvements de sang peuvent induire une douleur légère et de légers hématomes au point de prélèvement. Les effets toxiques attendus sur ce projet sont modérés car une étude de tolérance et de choix de doses a déjà été réalisée. Certains signes de toxicité modérée peuvent néanmoins apparaître en cours d'études incluant des pertes de poids ou des signes cliniques de type augmentation de salivation, augmentation ou diminution de la mobilité, tremblements ou impact sur la température corporelle.
Devenir
En raison du but de l’étude qui est d’évaluer les effets sur la maturité sexuelle, les animaux sont généralement mis à mort pour prélèvements d’organes. Si aucun prélèvement n’est réalisé (exemple : femelles de la partie pubertaire), les animaux témoins ne présentant aucun signe de mal être en fin de procédure pourront être gardés pour être réutilisés dans le projet formation ou sample par exemple ou gardés en vie pour être adoptés.
Remplacement
Avant de réaliser cette étude sur le modèle animal, de nombreux essais in vitro (exemple : Aromatase, steroidogenesis, androgen/oestrogen receptor binding affinity) ou in silico - réalisé par ordinateur à partir de données déjà acquises - sont utilisés pour prédire le potentiel effet de perturbation endocrinienne (sur les hormones) d’une substance, mais ils ne permettent pas de reproduire la complexité tissulaire ou la composition biologique complète d’un organisme entier, conduisant - ou pas - à l’induction d’effets de perturbation endocrinienne, ni la gravité des effets induits par l'exposition au produit. De plus, certains paramètres comme le développement de la puberté par évaluation du début de l’ouverture vaginale ou de la séparation préputiale ne peuvent pas être mesurés in vitro.
Réduction
Ce projet se fait dans le respect des 3Rs avec un nombre minimal d'animaux basé sur l’expérience du laboratoire et permettant une évaluation biologique et statistique suffisantes : 8 animaux/groupe (6 femelles/groupe seulement pour la partie utérotrophique). Deux molécules peuvent être testées dans une seule étude afin de réduire le nombre d’animaux utilisés (1 seul groupe témoin). Après plus de 5 années d'expérience, le nombre d’animaux par groupe a été redéfini et est le minimum d’animaux nécessaires compte tenu de la sensibilité et de la variabilité du test, afin de faire une évaluation correcte des paramètres enregistrés. L’objectif reste également de ne tester chez l’animal que des molécules sélectionnées comme non toxiques par des méthodes alternatives et donc de réduire le nombre d’animaux utilisés dans le processus de recherche et développement.
Raffinement
Les conditions d’hébergement enrichies et adaptées aux animaux juvéniles (exemple : gel de nutrition ajouté pour le sevrage des femelles à l'age de 18 jours), le personnel formé ainsi que l’utilisation d’une manipulation douce des animaux permettent de réduire le stress pré-procédural au strict minimum. Les animaux sont observés quotidiennement y compris les week-ends, avec une attention plus particulière pendant la première phase de traitement (au moins 2 observations dans la journée). Ils sont pesés quotidiennement pour vérifier leur croissance et leur bien-être. Des points limites suffisamment prédictifs et adaptées aux animaux juvéniles seront appliqués. Des micro-prélèvements sanguins seront privilégiés. Lors des prises de sang, l’usage d’un tapis chauffant pourra être utilisé pour maintenir la température corporelle des animaux sous anesthésie. Le jour précédent leur mise à mort, les animaux juvéniles sont déplacés dans une salle proche de la salle de nécropsie pour éviter le stress du transfert le jour même. Les prélèvements de sang sont réalisés dans une salle séparée et différente de celle utilisée pour la mise à mort. Pour la partie utérotrophique le test aurait pu être réalisé sur des femelles adultes ovariectomisées par (retrait chirurgical des ovaires) (OECD 440). Cette méthode n’a pas été retenue au laboratoire afin d’éviter le prétraitement chirurgical des animaux.
Choix des espèces
Le rat est le modèle expérimental choisi en raison de son utilisation fréquente dans les études de toxicologie du développement et de la disponibilité de la souche suffisamment caractérisée. Les modèles rongeurs et notamment le rat est recommandé par la communauté scientifique et les instances réglementaires. Des données historiques issues des études précédemment conduites sont disponibles dans le laboratoire avec l’espèce et la souche choisie (Rat Wistar). Ces caractéristiques permettent d'obtenir une grande quantité d'informations sur la physiologie et la pathologie de ces animaux. Ces études visent à étudier les effets d’un composé d’essai sur différents paramètres de la puberté. Ainsi, de jeunes rats immatures agés de 18 et 23 jours au début de l’étude sont utilisés dans ce projet conformément aux recommandations des lignes directrices internationales. Cela nécessite donc l’utilisation d’animaux sexuellement immatures. Des mesures seront prises pour garantir que seuls les animaux sevrés à un âge bien précis soient utilisés dans l'étude, car la sensibilité du test varie en fonction de l'âge de l'animal. L’utilisation de jeunes femelles dont dont le systeme hormonal n'est pas encore actif (axe hypothalamo-pituito-ovarien non fonctionnel) est nécessaire afin d’avoir de faibles niveaux d’œstrogènes endogènes/naturels en circulation. La partie uterotrophique devant s’arrêter au jour 21 après la naissance et le traitement étant de 3 jours consécutifs (lignes directrices internationales), des femelles immatures au jour 18 après la naissance seront utilisées.
Rôle d’un neuropeptide dans la détermination de la préférence alimentaire chez la souris
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
Pour établir le rôle d'un neuropeptide dans la préférence alimentaire, 288 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. Elles passent cinq jours isolées en cage métabolique, reçoivent des injections quotidiennes pendant cinq jours et subissent sept prélèvements de sang par incision du bout de la queue, au cours de tests glycémiques d'une à deux heures. Le porteur reconnaît que l'isolement peut entraîner un stress et une perte de poids, et que les tests peuvent provoquer une hypoglycémie si la quantité d'insuline injectée n'est pas optimale. Toutes finissent par une ponction cardiaque sous anesthésie, qui provoque la mort, ou par une perfusion intracardiaque, pour prélever le sang et les organes.
Objectifs
Ce projet a pour but d'étudier le rôle d'une molécule dans la détermination de la préférence alimentaire et des intolérances alimentaires chez la souris. Cette étude pourrait ouvrir de nouvelles perspectives thérapeutiques dans le traitement de ces intolérances et de maladies inflammatoires intestinales.
Bénéfices attendus
Avec ce projet, nous souhaitons mettre en lumière le rôle d'une molécule dans la préférence alimentaire et faire le lien avec les intolérances alimentaires et les maladies inflammatoires de l'intestin. Cela pourrait ouvrir de nouvelles perspectives thérapeutiques dans le traitement de ces troubles chez l'humain.
Procédures
Les animaux seront soumis à des tests glycémiques d'une durée de 1h et 2h durant lesquels des prélèvements de sang seront effectués à partir de l'extrémité de la queue des animaux. Ils resteront libres de leurs mouvements (7 prélèvements de microgouttes de sang par animal, moins d'une minute par prélèvement). Les traitements par injections auront lieu une fois par jour pendant 5 jours. On réalisera une mesure de la prise alimentaire des souris grâce aux cages métaboliques où les souris seront isolées pendant 5 jours. Les souris seront également soumises à un prélèvement de sang terminal (ponction cardiaque causant la mort de l'animal) ou à une perfusion intra-cardiaque en étant anesthésiées, cela durera 5 min avant d'être mises à mort.
Impact sur les animaux
L'isolement dans les cages métaboliques pendant 5 jours peut entraîner un stress et une perte de poids chez les souris. Le gavage, les injections et les prélèvements sanguins peuvent entraîner un stress. La légère incision à l'extrémité de la queue peut provoquer une douleur. Les tests glycémiques peuvent entraîner une hypoglycémie si la quantité d'insuline injectée n'est pas optimale. Les injections des molécules ont déjà été réalisées lors de précédentes études et n'ont pas montré d'effets indésirables. Le bien-être des animaux sera surveillé régulièrement par le personnel de l'animalerie ou les expérimentateurs.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure car nous avons besoin de prélever leur sang et/ou leurs organes pour les analyser ultérieurement.
Remplacement
Pour étudier le rôle de notre molécule dans la détermination de la préférence alimentaire, nous devons travailler sur des modèles murins in vivo. Nous ne pouvons pas réaliser ces expériences in vitro ou sur cultures cellulaires puisque nous avons besoin de mesurer des paramètres sanguins et métaboliques ainsi que d'étudier le comportement alimentaire, ce qui ne peut être effectué que sur des organismes entiers in vivo. De plus, les invertébrés ne possèdent pas les structures cérébrales et endocrines équivalentes aux mammifères pour le contrôle de la glycémie et de la prise alimentaire.
Réduction
Les expériences seront limitées à un nombre de 24 souris (12 femelles et 12 mâles) par condition de traitement pour être statistiquement analysables. Les tests glycémiques, qui n'impliquent pas d'effet néfaste à long terme pourront êtres menées successivement sur les mêmes animaux en respectant une période de repos aux cours desquelles les paramètres physiologiques et le bien-être des souris seront régulièrement évalués. Nous utiliserons des tests statistiques appropriés pour analyser les résultats efficacement.
Raffinement
L'anesthésie et l'analgésie seront utilisées selon les procédures décrites dans ce document, des points limites seront mis en place et le bien-être des souris sera vérifié régulièrement par le personnel de l'animalerie et les expérimentateurs.
Choix des espèces
Pour étudier le rôle de la molécule dans la détermination de la préférence alimentaire, nous devons travailler sur des modèles murins in vivo. Nous avons besoin de mesurer des paramètres sanguins et métaboliques ainsi que d'étudier le comportement alimentaire, ce qui ne peut être effectué que sur des organismes entiers in vivo. De plus, les modèles animaux invertébrés ne possèdent pas les structures cérébrales et endocrines équivalentes aux mammifères pour le contrôle de la glycémie et de la prise alimentaire. Au cours de cette étude nous étudierons la physiologie de la souris adulte. Elles seront donc âgées d'au moins 8 semaines.
Régulation par les endocannabinoïdes et la corticostérone des processus de mémoire et de la dynamique du calcium dans les cellules hippocampiques
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système nerveux
Opérées pendant une heure et demie pour recevoir dans le cerveau un tube d'injection ou un dispositif d'enregistrement, les souris de ce projet reçoivent aussi jusqu'à deux injections de molécules agissant sur le système du stress avant des tests de mémoire. 2 856 souris vont être utilisées sur cinq ans, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré, toutes tuées pour analyser leur cerveau. Les tests sont nommés, reconnaissance d'objets nouveaux et mémoire de localisation, trois essais de neuf à dix minutes sur trois jours, pour comprendre comment la corticostérone altère la mémoire et si le mécanisme décrit chez les mâles vaut aussi chez les femelles. Le porteur décrit le génotypage comme la coupe de 0,2 cm du bout de la queue entre cinq et douze jours de vie, suivie d'un tatouage des orteils, et reconnaît que cela provoque "un état de stress et de douleur", tout en classant 864 de ces souris en souffrance légère.
Objectifs
Ce projet apportera de nouvelles connaissances sur les mécanismes qui régulent les effets cognitifs du stress, via la sécrétion d’une hormone (la corticostérone), et d'établir (et à long terme d'exploiter) les propriétés thérapeutiques potentielles des substances cannabinoïdes dans les troubles liés au stress. On sait qu'une interaction entre les corticostéroïdes et le système endocannabinoïde intervient dans la régulation des processus cellulaires impliqués dans les troubles de la mémoire. Ceci est exclusivement connu pour les animaux mâles. C'est pourquoi, dans ce projet, un premier objectif est d'étudier si les mécanismes d'altération de la mémoire induits par la corticostérone sont les mêmes chez les animaux femelles. Des preuves suggèrent également l'implication d'une autre sous-population de récepteurs cannabinoïdes dans l'altération de l'effet du stress et de la corticostérone sur les processus de mémoire spatiale. Nous souhaitons répondre aux questions suivantes : (i) quel est le mécanisme par lequel la corticostérone altère la mémoire, (ii) comment la corticostérone engage-t-elle le système endocannabinoïde dans les processus de mémoire affectés, et (iii) quel est le rôle de calcium dans cet effet ? Ce projet ouvrira ensuite la voie au développement de stratégies thérapeutiques efficaces pour les troubles de la mémoire liés au stress.
Bénéfices attendus
Le stress est associé à plusieurs états pathologiques, dont les déficits cognitifs. Les actions des corticostéroïdes dans le cerveau peuvent provoquer des effets aigus et chroniques dans plusieurs zones du cerveau qui sont associées à la mémoire. Ce projet contribuera à donner un nouvel éclairage sur la modulation de la mémoire par les corticostéroïdes. Bien que l'effet du stress et des corticostéroïdes sur la mémoire ait été bien décrit dans diverses études humaines et animales et que le rôle du système endocannabinoïde dans ces effets ait commencé à attirer l'attention, les détails de cette interaction corticostéroïde-endocannabinoïde affectant la mémoire sont largement inconnus. Ce projet a pour but de caractériser les processus moléculaires induits par les corticostéroïdes et liés à l'apparition des déficits de mémoire. À cet égard, ce projet aidera à disséquer l'interaction des corticostéroïdes avec le système endocannabinoïde impliquée dans les différents processus de mémoire. En contribuant à disséquer davantage les déficits cognitifs liés au stress, ce projet débouchera sur de nouvelles stratégies de traitement des troubles associés.
Procédures
Dans le cadre de ce projet, les souris seront soumises à des tests comportementaux pour évaluer leur capacité de mémoire (test de reconnaissance d'objets nouveaux ou test de mémoire de localisation d'objets). Ces tests consistent en 3 essais sur 3 jours consécutifs, chacun durant 9 ou 10 minutes, respectivement. Dans le cadre de ces tests de mémoire, l'animal subira des injections de différentes molécules afin de tester l'implication de différentes protéines dans l'effet du stress sur la mémoire. Les animaux recevront au maximum 2 injections de molécules différentes (à au moins 30 minutes d'intervalle), dont une sous-cutanée et une intrapéritonéale. De plus, les souris subissent également une procédure chirurgicale comprenant l'injection d'une molécule ainsi que l'implantation d’un tube d'injection ou un dispositif d'enregistrement. Ces interventions chirurgicales durent typiquement 1,5h.
Impact sur les animaux
Les différentes procédures décrites dans ce projet varient en fonction de leurs effets sur les souris. En fonction des résultats obtenus, la nécessité d'effectuer des expériences supplémentaires conformes aux procédures sera évaluée. Les lignes suivantes décrivent ce que les animaux subiront au maximum. En fonction des retours expérimentaux, certains animaux pourraient ne pas subir l’intégralité de la procédure. Comme nous utilisons des lignées de souris mutantes, chaque procédure comprend le génotypage, qui se fait en coupant 0,2 cm de l'extrémité de la queue des souris à l'âge de p5-p12 et, pour une identification future, les orteils des pattes seront tatoués par micro-tatouage. Cela provoque un état de stress et de douleur chez l'animal. Nous utiliserons des tests de mémoire. Pour tester l'effet des corticostéroïdes sur les performances de la mémoire, les souris recevront une injection des molécules qui interagit avec le system du stress. Un animal ne recevra pas plus de deux injections et ces deux injections seront espacées d'au moins 30 minutes. Ces manipulations conduisent à un état de stress chez les souris. Les niveaux élevés de corticostérone dans le sang, déclenchés par une injection directe de corticostérone, se normalisent en 1 à 2 heures. De même, les autres composés injectés n'agissent pas plus de quelques heures sur l'animal. De plus, les animaux subissent une intervention chirurgicale. Les animaux seront manipulés et soumis à une anesthésie générale [induction à l'isoflurane 5,0 % - entretien à 2,0 %]. Il a 3 phases d’anesthésie lors de la procédure. L’animal peut ressentir du stress lors des phases d’induction de l’anesthésie (animal placé dans une boite à induction) et de réveil. Au cours de ces opérations, le scalp des animaux est ouvert, ce qui peut entraîner un risque d'infection et un inconfort après l'opération. Par ailleurs, l’animal peut présenter un inconfort au niveau des sutures dans les heures suivant l’opération. Pour les procédures 3 et 4, l'implantation d'une fibre optique ou d'une canule représente un risque supplémentaire d'infection. De plus, ces implants augmentent le temps d'inconfort après la chirurgie car l'animal doit s'adapter.
Devenir
Les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure afin d'utiliser les cerveaux pour des analyses biochimiques ou électrophysiologiques ou, en cas de manipulation préalable (injection de molécules ou d'implants), pour l'histologie qui permettra de vérifier la présence des molécules et la et l'implantation correcte.
Remplacement
Pour comprendre les mécanismes complexes de la mémoire, qui dépendent du comportement actif du rongeur, nous ne pouvons malheureusement pas utiliser des méthodes alternatives plus simples (cultures cellulaires in vitro, modèles informatiques in silico) car celles-ci fournissent des informations trop limitées et ne peuvent reproduire toute la complexité d’un organisme vivant. La réponse au stress et aux niveaux élevés de corticostéroïdes dans le cerveau est immensément complexe et peut influencer le comportement des souris et de tout autre organisme de manière cruciale. L'effet des corticostéroïdes sur différentes cellules du cerveau a déjà été décrit. Dans une prochaine étape, l’observation des effets des corticostéroïdes au comportement est cruciale pour mieux comprendre les conséquences cognitives du stress. En ce qui concerne l'effet de la corticostérone sur le calcium, nous utilisons un modèle in vitro complexe d'une région cérébrale majeure impliquée dans les processus de mémoire. Pour relier les résultats obtenus à partir de ces expériences ex vivo aux processus de mémoire, nous nous appuyons malheureusement sur les performances comportementales actives des souris afin de garantir la transposition à une situation in vivo.
Réduction
Pour le R de réduire, en effectuant un petit nombre d'expériences pilotes au début de ce projet, nous pouvons réduire considérablement le nombre d'expériences ultérieures (et donc le nombre d'animaux) nécessaires pour tirer des conclusions. Nous nous engageons à utiliser le nombre minimum d'animaux strictement nécessaire pour dégager une conclusion statistique solide à partir de cette population. La réalisation de l'ensemble de ce projet nécessite l'utilisation d'un maximum de 2856 souris sur une période de 5 ans. Ce nombre est justifié par l'utilisation de différentes approches comportementales et pharmacologiques dans plusieurs lignées de souris avec différentes modifications des protéines que nous souhaitons étudier. Pour les études incluant le comportement et l’analyse moléculaire, les animaux utilisés dans chacun des groupes expérimentaux ne dépasseront pas le chiffre de 12. Ce nombre de souris est le minimum requis pour avoir une signification statistique et est conforme aux études antérieures utilisant des méthodologies similaires. Cependant, si nos premières expériences montrent qu'il est possible de réduire le nombre de souris, ce nombre sera réduit en conséquence.
Raffinement
Lorsque les animaux arrivent, ils sont observés quotidiennement par du personnel qualifié et l'environnement d'élevage des souris est enrichi (matériel de nidification). Les animaux sont logés dans des cages collectives et pas dans des cages individuelles, avec un environnement enrichi (matériel de nidification) et un accès libre à l'eau et à la nourriture. Nous attendons au moins 1 semaine (7 jours) pour permettre aux animaux de s'adapter au cycle jour/nuit de notre animalerie expérimentale. Pour le point limite, nous le définissons par un état anormal constaté sur deux jours consécutifs (perte de poids de 20% sur deux jours consécutifs, ataxie, hypolocomotion, pelage non soigné). Cette évaluation est basée sur un gille de score qui comprend des aspects comportementaux et physiques et des mesures seront prises en fonction des scores obtenus. Ainsi, si le score est supérieur à ce qui est décrit sur la grille de score, l'animal sera euthanasié après consultation de la vétérinaire référente. Si le score ne passe pas ce seuil fixe, des mesures conservatoires seront mises en place. Ces mesures comprennent la mise en place de matériel d'enrichissement supplémentaire comme des tunnels ou des grésillements en cas de comportement agressif, des soins adéquats en cas de blessures cutanées, l'application de médicaments analgésiques en cas de signes de douleur, injection de sérum physiologique chaud, hébergement temporaire en enceinte thermostatée et maintien du régime à base de la nourriture humide. En cas de chirurgie, nous procédons à une anesthésie générale des animaux et pendant la procédure chirurgicale, toute hypothermie sera prévenue à l'aide d'un tapis chauffant. Le dessèchement oculaire sera prévenu par administration de gel ophtalmique. Une analgésie de la zone de chirurgie et aussi une analgésie générale sera appliquée. Dans la période postopératoire un analgésique sera administré systématiquement pour éviter la douleur et répétée une fois par jour pour 2 jours. De plus, le poids des souris sera enregistré quotidiennement pendant 5 jours en post-chirurgie. La mise en place des points limites chez l'animal repose sur une évaluation comportementale (voir ci-dessus) et le suivi de leur courbe de poids (réduction de plus de 20% de son poids sur 2 jours consécutifs).
Choix des espèces
Pour évaluer l'implication du système endocannabinoïde dans la régulation des effets du stress et de la corticostérone et de ses conséquences sur l'apprentissage et la mémoire, il n'existe pas d'autre alternative que l'expérimentation animale. L'organisation de base des circuits neuronaux est préservée chez les mammifères, que ce soit le rongeur ou l'humain. L'utilisation d'invertébrés ayant un système nerveux complètement différent serait donc inappropriée. De plus, la grande majorité des études portant sur les circuits cérébraux et les mécanismes de formation de la mémoire ainsi que l'étude du système endocannabinoïde ont été réalisées dans le modèle murin. Par ailleurs, l'utilisation de lignées de souris transgéniques est l'épine dorsale technologique de cette étude. Donc, la grande majorité des outils génétiques disponibles pour étudier la fonction de protéines spécifiques sont disponibles exclusivement dans le modèle murin. Enfin, les infrastructures sont équipées pour l'étude systématique de la souris et pour assurer le bien-être approprié requis. Les souris utilisées seront adultes (âgées de 8 à 14 semaines post natales). Cela se justifie par l’immaturité du système nerveux au cours de l’adolescence, impliquant notamment une fluctuation de l’abondance et de la répartition du récepteur CB1 lors de cette période. En outre, cela nous permet de rester cohérents avec la littérature, car la plus grande quantité de souris adultes utilisées pour des expériences comportementales est âgée de 8 à 14 semaines.
Etude de l’impact de l’augmentation de la température pendant l’incubation des œufs et en élevage, sur la croissance, le métabolisme et les performances de reproduction chez les coqs.
- Recherche appliquée
- Bien-être animal
140 poulets vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré, 60 d'entre eux tués pour prélèvements et 80 renvoyés dans un élevage classique. Les 120 coqs adultes subissent sept prélèvements sanguins entre douze et trente-quatre semaines, dix pesées, et une élévation artificielle de la température du bâtiment par plages de six heures pendant sept jours, à trente-trois semaines. L'exposition des œufs à des températures élevées pendant l'incubation est testée pour maintenir les performances de reproduction des coqs pendant les canicules, dans un contexte où les fortes chaleurs dégradent la croissance, l'indice de consommation et le rendement des carcasses. Le porteur retient le poulet parce qu'il s'agit de "l'espèce majeure sur le terrain" et d'un "modèle reconnu par la filière", les animaux arrivant à un jour d'âge comme dans un élevage commercial.
Objectifs
En élevage de volailles, les fortes chaleurs en période estivale est à l’origine d’une baisse significative des performances zootechniques tels qu’une dégradation de la croissance et de l’indice de consommation, une augmentation de la mortalité, des problèmes comportementaux et des baisses des rendements carcasses… Il a récemment été montré que l’exposition des œufs embryonnés à des températures élevées pendant l’incubation permet le déclenchement d’adaptations physiologiques et moléculaires résultant en une amélioration de la résilience des poulets face aux températures élevées tout au long de leur vie. En revanche, il n’a pas encore été montré que cette exposition à la chaleur pouvait également avoir un impact positif sur les mâles reproducteurs. C’est dans ce contexte que s’inscrit notre projet au cours duquel nous chercherons à étudier l’impact de l’exposition des œufs embryonnés à des températures élevées sur le métabolisme et les performances de reproduction des coqs.
Bénéfices attendus
L’objectif principal de ce projet est de tester si l’exposition des œufs embryonnés à des températures élevées pendant l’incubation, peut renforcer la robustesse des animaux, leur capacité d’adaptation et améliorer les performances de reproduction des coqs en cas de fortes chaleurs telles que celles rencontrer lors des périodes estivales.
Procédures
Tous les animaux du projet auront 10 pesées individuelles sur une période de 34 semaines. Elles seront réalisées sur animaux vigiles et la durée d’une pesée sera inférieure à 10 secondes par animal. 120 coqs adultes auront 7 prélèvements sanguins, à 12, 16, 20, 24, 28, 32 et 34. Chaque prélèvement se fera sur animal vigile et durera moins de 15 secondes. Au moment de la contention pour les prélèvements sanguins, une photo de leur crête sera prise ; la contention totale ne durera pas plus de 1 minute / animal. Les 120 coqs seront soumis à une élévation de la température dans le bâtiment d'élevage par plages de 6h et sur une durée totale de 7 jours à l’âge de 33 semaines.
Impact sur les animaux
Les effets négatifs sur les animaux sont principalement liés aux prises de sang répétées mensuellement : douleur légère et transitoire (inférieure à 15 secondes) générée par la pénétration de l’aiguille et stress léger et passager lors de la contention. Les pesées entraineront un stress léger et transitoire lié à la contention. L’exposition des coqs adultes à la chaleur peut entrainer des conséquences physiologiques (augmentation de la température corporelle, déséquilibre hydro-électrolytique, réduction de l’appétit) ainsi que des conséquences comportementales (agitation, agressivité, apathie, ou comportements visant à éviter la chaleur comme regroupement en zones fraîches). L'élevage des coqs en groupe peut entrainer de l'agressivité, notamment à partir de la maturité sexuelle ; elle sera néanmoins minimisée par les effectifs de petite taille dans les parquet.
Devenir
En fin de procédure, 60 mâles (30 par lignée) seront mis à mort à des fin de prélèvements et les 80 restants (40 par lignée) retourneront dans le système d’élevage classique.
Remplacement
A ce jour, il n’existe pas de méthodes alternatives in vitro ou in silico pour étudier les réponses physiologiques, métaboliques ou comportementales individuelles des individus. De plus, aucun modèle cellulaire ou in vitro n'est capable de reproduire l'effet de la programmation thermique chez l'espère cible, le poulet de chair, et son impact durant toute la durée de vie de l'animal et sur la descendance.
Réduction
Les prises de sang ne seront réalisées à partir de 12 semaines d’âge, uniquement sur les mâles qui auront été soumis à un coup de chaleur. En effet, afin de réduire au maximum le nombre d’animaux avec prise de sang, les mâles témoins ne seront pas prélevés ; nous comparererons les résultats de chaque individu avant et après le coup de chaleur. Afin d’avoir des résultats statistiquement significatifs tout en tenant compte de la variabilité attendue (poids, métabolisme, robustesse, reproduction), nous avons besoin d’une taille d’effectifs de 30 animaux par modalité. En répartissant les 30 animaux d’une même modalité dans 6 groupes, cela nous permet, d’avoir des données statistiques fiables et de trouver des différences significatives sur la base de l’indice de consommation qui est mesuré collectivement, par parquet.
Raffinement
Les animaux seront élevés dans des parquets (petits enclos où se trouvent les poulets), au sol sur des copeaux et en groupe afin de créer des relations sociales. Des perchoirs, des ficelles et des pierres à piquer seront installées dans chaque parquet en tant que matériel d’enrichissement. Les animaux seront hébergés dans des conditions optimales d’alimentation et de soins, selon des normes mieux-disantes que celles prévues par la règlementation. Toutes les contentions seront réalisées dans le calme. Afin de limiter le nombre de contentions, les prélèvements sanguins se feront juste après la pesée. Le matériel de pesée sera adapté à la taille et à la morphologie des animaux. Pendant la période d'élévation de la température dans le bâtiment d'élevage, une attention particulière sera portée sur le comportement des animaux. Les durées de chaleurs seront réalisées sur des plages de 6h et une vigilance sera apportée quant à la baisse effective des températures pour assurer des phases de récupération. Une grille d’évaluation du bien-être des animaux, basée sur leur comportement et leur état de santé, est complétée quotidiennement par le personnel animalier afin de détecter toute altération de leur état de bien-être.
Choix des espèces
S'agissant d'un objectif finalisé sur la santé des volailles, le choix du poulet a été fait car il s’agit l'espèce majeure sur le terrain et un modèle reconnu par la filière. Il s'agit également de l'espèce cible du projet d'étude. Les animaux seront mis en place dans le bâtiment d’élevage à 1 jour d’âge car c’est l’âge d’arrivée classique dans un élevage commercial. Ils seront ensuite élevés pendant 35 semaines afin de pouvoir étudier la reproduction de ces animaux. L’épisode artificiel de forte chaleur sera appliqué à 33 semaines, pendant la période de reproduction car il s’agit de l’âge où les animaux sont les plus sensibles au pic de température.
Etude des mécanismes régulant la formation et la survie des lymphocytes T résidents mémoires dans le cerveau lors de l’infection par Toxoplasma gondii chez la souris
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
- Système nerveux
Exposées sept minutes aux rayons X, infectées par Toxoplasma gondii, gavées une fois par jour pendant deux semaines et soumises à des injections hebdomadaires, les souris de ce projet subissent aussi jusqu'à deux prélèvements sanguins. 1 680 souris vont être utilisées, dont 1 605 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, toutes tuées pour prélever leur cerveau et leurs organes lymphoïdes. Le projet porte sur les lymphocytes T résidents mémoires qui contrôlent la persistance du parasite dans le cerveau, avec des retombées annoncées pour les personnes immunodéprimées exposées à une encéphalite toxoplasmique. Pour décrire ce que subissent ces souris, le porteur retient une perte de poids pouvant atteindre 20 % entre le septième et le quinzième jour, puis une phase chronique qu'il qualifie de généralement asymptomatique, sans expliquer ce qui justifie de classer 1 605 d'entre elles en souffrance sévère.
Objectifs
Le parasite Toxoplasma gondii (Toxo) peut infecter une large gamme d’animaux , dont la souris (hôte dit naturel) et l’homme (hôte dit accidentel). Chez l’Homme, il est responsable d’encéphalites (inflammation du système nerveux central) chez les sujets immunodéprimés et de malformations chez le fœtus. Les lymphocytes T (LT) CD8 jouent un rôle primordial dans la lutte contre les pathogènes intracellulaires tels que Toxo. Nous avons récemment demontré que la différenciation des LT CD8 en LT dit résidents mémoires des tissus, aussi appelés Trm, était requise pour contrôler la persistence du parasite au sein du cerveau lors de la phase chronique de l’infection. La compréhension de la réponse immunitaire médiée par les Trm contre Toxo est donc essentielle au developpement de nouvelles thérapies contre ce type de pathogène chronique qui établit une latence à long-terme chez son hôte et peut se ré-activer de manière souvent fatale chez les sujets immunodéprimés. Nos résultats préliminaires ont identifié des voies de signalisation qui pourraient contribuer à la persistence et aux fonctions protectrices des Trm dans le cerveau. Dans ce projet, nous utiliserons l’infection chez la souris par le parasite Toxo pour étudier le rôle de molécules impliquées dans le developpement et la persistance des Trm dans le système nerveux central. En particulier nous déterminerons les conséquences de l’élimination de molécules cibles dans les Trm sur le contrôle de l’infection. Ainsi, les résultats attendus de notre étude aideront au développement de nouvelles thérapies ciblées et plus efficaces contre de nombreuses infections chroniques, mais aussi potentiellement dans le cancer où la présence de Trm a été montrée comme étant un indicateur de bon prognostic et de réponse à l’immunothérapie du cancer.
Bénéfices attendus
Sous sa forme latente, le parasite Toxo présent dans le cerveau d'une personne exposée peut se réactiver et causer une encéphalite en cas de défaillance immunitaire. Notre projet permettra d'identifier des mécanismes de protection immunitaire contre l'infection chronique du cerveau par T. gondii et de mieux comprendre comment les réactions immunitaires influencent le fonctionnement cérébral. Ainsi ce projet pourrait améliorer la prise en charge de personnes à risque d'encéphalite toxoplasmique en cas d'immunodépression (SIDA, cancer...) mais aussi plus généralement les résultats attendus de notre étude aideront au développement de nouvelles thérapies contre les infections chroniques.
Procédures
Les souris recevront une exposition aux rayons X pendant environ 7 minutes. Elles subiront des injections intraveineuses et/ou intrapéritonéales (1 injection toutes les semaines pour un maximum de 4 semaines), des administrations orales (gavage) de médicaments une fois par jour pour un maximum deux semaines, et des prélèvements de sang (maximum 2 prélèvements espacés de 4 semaines). Toutes les injections ne durent que quelques secondes et s'effectuent sur animaux anesthesiés à l'exception des injections d'anticorps et des gavages qui s’effectuent sur animaux vigiles.
Impact sur les animaux
La phase aiguë de l'infection par T. gondii est habituellement symptomatique entre Jour 7 et Jour 15 (phase aiguë de la toxoplasmose) et les souris peuvent perdre jusqu’à 20% de leur poids initial. S’en suit la phase chronique qui est généralement asymptomatique avec le parasite latent.
Devenir
Tous les animaux intégrés dans chaque procédure expérimentale seront mis à mort en fin d’étude afin de prélever les organes (Cerveau, organes lymphoides secondaires) nécessaires aux analyses phénotypique et fonctionnelles des cellules immunitaires et en particulier des Trm mais aussi des mesures de charges parasitaires et d'inflammation.
Remplacement
Le recours à l’expérimentation animale dans le cadre de cette étude se fait après de nombreuses études in vitro dans des modèles cellulaires. Lorsque cela est possible, des expériences in vitro utilisant des lymphocytes T et des lignées cellulaires infectées par T. gondii sont réalisées. De plus, au lieu d'être propagé in vivo dans des souris comme c'était le cas historiquement, le parasite est cultivé sur des fibroblastes humains. Cependant, ces techniques ne permettent pas d’étudier l’impact des lymphocytes T sur le contrôle du parasite et la neuroinflammation, et n’interviennent qu’en complément de l’expérimentation animale. La complexité des systèmes immunitaires et nerveux, et du tissu cérébral, autant dans sa composition cellulaire que son architecture, fait qu’il est impossible de simuler (sous forme de modélisation informatique ou d’expériences en culture cellulaire) la ‘connectique’ des populations cellulaires mises en jeu. Il n’est donc actuellement pas possible de répondre aux objectifs proposés dans ce projet par des méthodes excluant totalement l’utilisation du modèle animal.
Réduction
Les expériences sont organisées de manière à réduire au maximum le nombre d’animaux. Nous avons également pu valider certaines approches expérimentales in vitro permettant d’optimiser l’utilisation des animaux. Afin d’assurer la fiabilité de nos résultats, nous travaillerons avec des groupes tests et contrôles d’au minimum 5 animaux et répéterons nos expériences 3 fois. Le nombre d’animaux utilisés correspond dans nos expériences et dans celles des groupes travaillant sur des modèles équivalents au nombre minimal permettant une interprétation sans ambiguïté des résultats. Ceci garantira la valeur statistique de l'étude en intégrant les variations expérimentales et les variations inter-individus. Les tests statistiques varient suivant les expériences et sont réalisés avec un logiciel de statistique adapté.
Raffinement
Le bien-être de l’animal est un facteur de variabilité expérimentale. Nous prenons ceci en compte grâce au suivi rapproché quotidien des animaux qui évaluera leur état général (prise de nourriture, toilettage, mouvements), l’aide à l’alimentation en cas de besoin, l’enrichissement de leur environnement et le respect de l’aspect social du groupe (pas d’isolement ni de changement de cage). L’expérimentation sera arrêtée en cas de dégradation trop importante de la santé d’un animal selon les points limites d’arrêt de la procédure définis dans notre fiche de scoring pour limiter la douleur, la souffrance ou l’angoisse de l’animal. Les signes cliniques attendus de l’infection sont : - En phase aiguë (J7-15) : perte de poids et mobilité réduite. Les animaux seront mis à mort sous 24h si ils atteignent un des score limite défini sur notre fiche de scoring. Il sera nécessaire de respecter un délai de 24h car le développement d’une réponse immunitaire permet dans bon nombre de cas une amélioration rapide de l’état général et la transition vers la phase chronique moins symptomatique. - En phase chronique (>J15) : ataxie / syndrome vestibulaire. Les animaux seront euthanasiés en cas de présence de l’un de ces signes. La procédure ne prévoit pas l’utilisation d’analgésiques ou anti-inflammatoires, car ils risquent d’interférer avec les processus inflammatoires au cours de notre expérimentation.
Choix des espèces
T. gondii peut infecter tout animal homéotherme mais les rongeurs sont des hôtes naturels du parasite. Compte-tenu des nombreux outils d'analyse de la réponse immunitaire qui existent chez la souris, cette espèce est pertinente pour disséquer les mécanismes cellulaires et moléculaires des interactions hôte-parasite. De plus, la physiopathologie de la toxoplasmose chronique chez la souris reproduit plusieurs caractéristiques retrouvées chez l’homme : rôle protecteur de l’immunité cellulaire médiée par les lymphocytes T, kystes persistant dans le cerveau, phénomène d’encéphalite, modifications comportementales. Des souris adultes, âgées de 2 à 5 mois (afin de participer à l’effort de réduction car la susceptibilité à l’infection varie peu à ces âges), seront utilisées afin de pouvoir étudier les effets des manipulations sur un système nerveux central et immunitaire mature. Dans le cas des transferts de moelle osseuse, la reconstitution du système hématopoïétique prend 8 à 10 semaines, puis les souris subiront la procédure d'infection par Toxo et seront suivies 11 semaines après infection, donc l’âge maximal d’utilisation des souris sera de 30 semaines.