Procédures modérées

Une partie des souris utilisées développe spontanément une maladie auto-immune dès vingt-cinq semaines d'âge, et le projet cherche à accélérer ce développement par une infection. 240 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées en fin de protocole ou plus tôt si elles atteignent un point limite. Les expérimentateurs leur injectent des bactéries dans l'abdomen pour provoquer un sepsis, les traitent aux antibiotiques deux heures après, puis prélèvent leur sang derrière l'œil sous anesthésie jusqu'à cinq fois, avec cinq à dix semaines entre deux prélèvements. Une partie d'entre elles sera gardée jusqu'à quarante semaines après l'infection, le porteur indiquant ne pas pouvoir prédire les symptômes qui apparaîtront.

Objectifs

Les maladies auto-immunes à autoanticorps sont des maladies où le système immunitaire, qui est censé protéger le corps, se met à produire des anticorps contre l’organisme lui-même (autoanticorps), et à attaquer certains organes voire tout le corps (on dit alors que c’est systémique). Ces maladies sont rares (moins d’une personne sur 2000) et peuvent être causées par l’environnement (comme la pollution ou l’alimentation), des hormones (elles touchent plus souvent les femmes), et/ou des prédispositions génétiques, c’est-à-dire que certaines personnes sont plus à risque à cause de leurs gènes. On a remarqué que les personnes qui font une infection grave (comme un sepsis, qui est une infection très sévère) et qui vont en réanimation ont un risque cent fois plus élevé que les autres de développer une maladie auto-immune dans les six mois qui suivent leur sortie de l’hôpital. On ne comprend pas pourquoi, après une infection très grave, certains patients développent une maladie auto-immune et d’autres non. Si on arrive à prédire quels patients risquent de développer ce genre de maladies dans ces conditions, on pourra mieux les soigner et essayer d’empêcher que la maladie auto-immune ne se développe, car ces maladies diminuent la qualité de vie des patients et coûtent très cher à la société. Notre projet a pour but de comprendre comment une infection grave peut déclencher une maladie auto-immune, en utilisant des souris pour faire des expériences et observer ce qu’il se passe. On veut répondre à deux questions principales : 1) Est-ce qu’une infection sévère peut déclencher une maladie auto-immune chez des souris déjà à risque ? 2) Est-ce qu’une infection sévère peut aussi déclencher une maladie auto-immune chez des souris normales qui ne sont pas à risque ? En comprenant mieux ces mécanismes, on espère trouver de nouvelles façons d’identifier les individus à risque et ainsi améliorer leur prise en charge et mettre en place des stratégies de prévention.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus du projet se situent à deux niveaux. Le premier niveau concerne les connaissances scientifiques car le projet permettra d’accroître la compréhension des mécanismes du lien entre infection sévère et développement de l’auto-immunité. Les cellules et molécules impliquées dans cette induction auto-immune seront ainsi identifiées. Le deuxième niveau concerne la santé humaine. En effet, la compréhension de ces mécanismes et l’identification des biomarqueurs (marqueurs de maladie faciles à détecter dans le sang ou les urines) associés à cette évolution de l’inflammation aiguë vers l’auto-immunité permettront de pouvoir identifier les patients à risques et de prévenir le développement de telles affections chroniques.

Procédures

Les animaux utilisés dans ce projet seront soumis à 3 types d’interventions : des injections dans le ventre (« intrapéritonéales ») et sous la peau (« sous-cutanées), des contentions (attrapés et immobilisés dans une main) et les animaux seront soumis au prélèvement d’un petit volume de sang sous anesthésie générale. Les gestes réalisés durent moins de 30 secondes chacun. L'anesthésie générale dure entre 1 et 2 minutes. Des animaux seront injectés par voie intrapéritonéale avec des bactéries une seule fois pour imiter une infection sévère. 2 heures plus tard, elles seront traitées avec des antibiotiques par injection sous-cutanée quatre fois sur une période de 24h dans le but de les guérir de l’infection, comme les patients en réanimation. Ces souris auront un prélèvement sanguin sous anesthésie générale avant l’infection, puis certaines seront à nouveau prélevées 4 fois avec 5 à 10 semaines entre deux prélèvements. Cela nous permettra de comparer les paramètres sanguins des souris avant et après infection pour voir si elles ont développé une maladie auto-immune.

Impact sur les animaux

Certaines souris utilisées ici développent une maladie auto-immune légère mais quantifiable dès 25 semaines d’âge. Ces animaux entreront en procédure à l’âge de 10 semaines (+/- 2 semaines), c’est-à-dire à l’âge adulte, et ne seront conservés que deux semaines supplémentaires après l’infection sévère traitée par antibiotique. Nous nous attendons à cette procédure entraîne une accélération du développement de la maladie avec des signes d’auto-immunité à 12 semaines d’âge équivalents à ceux d’animaux non-infectés de 25 semaines. Une autre procédure utilisera des animaux normaux qui seront conservés sur un maximum de 40 semaines après l’infection sévère afin de déterminer s’ils développent une maladie auto-immune ou non, sans que nous puissions prédire concrètement les symptômes éventuels induits. Une grille d’évaluation clinique sera utilisée sur toute la durée de l’expérience afin d’éviter les éventuelles nuisances sur le bien-être des animaux. Lors des procédures, les souris seront soumises à quatre types de nuisance. 1) les contentions nécessaires à la réalisation des actes (injections et prélèvements d’urine) entraîneront un stress léger et bref pour les animaux (moins de 30 secondes chacun). 2) les injections intrapéritonéales (ip) et sous-cutanées (sc) (1 ip et 4 sc/animal réparties sur 24 heures) entraineront des douleurs brèves de piqure à chaque occurrence (moins de 30 secondes). 3) les prélèvements sanguins de faible volume par voie rétro-orbitale sous anesthésie générale gazeuse (1 à 2 minutes) pourront entraîner ensuite un inconfort à l'orbite le temps que la cicatrisation soit complète (24 heures). 4) l’infection entraînera une gêne pour les souris (fièvre et inconfort) durant les deux premières heures. Le traitement antibiotique sera alors réalisé ce qui soulagera les souris rapidement.

Devenir

Les animaux seront systématiquement euthanasiés en fin de procédure pour analyse ou avant dans le cas d’atteinte de points limites.

Remplacement

Les études des maladies de systèmes (impactant différents organes) et de leurs traitements (validés ou expérimentaux) nécessitent de pouvoir tester les hypothèses sur des organismes entiers vivants avant de pouvoir passer chez l’humain. La localisation et l’activation des cellules d’intérêt au cours du développement des maladies étudiées ne peuvent être observées que dans des organismes entiers. Les études in vitro ne permettent pas de reproduire la complexité des organismes, ni des maladies étudiées, ni de la séquence infection/auto-immunité à l’échelle d’un organisme. Malheureusement, aucune des technologies actuelles ne peut se substituer aux modèles animaux dans ce domaine. Nous ne pouvons donc pas utiliser d’autre approche que l’expérimentation animale pour ces études visant à améliorer la prise en charge des patients.

Réduction

Dans notre laboratoire, on a déjà fait le modèle de péritonite avant, ce qui nous permet d’utiliser seulement le nombre de souris nécessaire. Il y aura 10 souris par groupe pour bien prendre en compte les différences entre chaque animal et voir comment ils réagissent à l’infection et au risque de maladies auto-immunes. Cela nous aide à être sûrs que nos résultats sont fiables et qu’on peut vraiment voir s’il y a une différence entre les groupes, sans utiliser plus d’animaux que nécessaire. Les souris qui servent de contrôles seront juste traitées avec des antibiotiques et on n’ajoutera pas d’autres groupes pour ne pas en utiliser trop. Après les expériences, on gardera des échantillons pour pouvoir répondre à d’autres questions plus tard, toujours dans l’idée d’utiliser le moins d’animaux possible. Enfin, pour prouver que nos résultats sont solides et que l’expérience peut être refaite par n’importe quel autre laboratoire avec le même résultat, on fera chaque test trois fois, ce qui est le minimum demandé pour que ce soit accepté scientifiquement.

Raffinement

Avant et pendant les expériences, les souris vivent dans de bonnes conditions pour éviter qu’elles soient stressées. Elles ne sont jamais seules, ont toujours des objets pour s’occuper (comme du coton pour faire leur nid ou des petites maisons pour se cacher) et sont observées tous les jours. Pendant les expériences, on fait tout pour que les souris souffrent le moins possible. Après l’infection, on les surveille toutes les 6 heures pendant 24 heures et il n’y a que quelques souris à la fois pour pouvoir bien toutes les observer. Le traitement avec des antibiotiques commence 2 heures après que les souris ont reçu les bactéries, et donc aucune ne mourra à cause de cela. Si une souris est trop malade, elle sera euthanasiée tout de suite, sans attendre la fin de l’expérience. L’état de santé des souris est suivi grâce à une grille d’évaluation. On regarde à chaque fois trois choses : sa posture, sa façon de bouger et l’état de ses poils. À chaque critère, on donne un score de 0 à 3. Si la souris a 6 points ou plus au total, ou si elle a 3 points dans la posture ou la mobilité, elle sera euthanasiée. Après le traitement, en plus de surveiller les souris chaque jour, on continue de calculer les scores des souris chaque jour pendant 3 jours, puis une fois par semaine pendant 40 semaines, pour vérifier si elles restent en bonne santé. On regarde aussi leur poids et si elles n’ont pas de problèmes de peau, de poumons ou d’articulations. Si une souris atteint certains scores qui montrent qu’elle va trop mal, elle est euthanasiée et analysée immédiatement.

Choix des espèces

Notre projet s’inscrit dans l’objectif de définir des mécanismes de développement de maladies d’intérêt pour la santé humaine afin de pouvoir améliorer la prise en charge des patients. Les procédures et les souris utilisées dans le présent projet nous permettront d’atteindre cet objectif. L’espèce Mus musculus domesticus est le seul modèle de mammifères disposant des lignées modifiées génétiquement pertinentes pour les objectifs scientifiques de notre projet et dont la biologie se rapproche suffisamment de la biologie humaine pour que son étude puisse y être transférée. De plus les outils d’analyse disponibles et l’expertise acquise des modèles utilisés ici justifient l’utilisation de ce modèle. Les animaux entrant en procédure auront tous un âge supérieur ou égal à 10 semaines (stade adulte). Ce stade adulte correspond au stade de la population de patients concernés par la présente investigation.

Soumises à un régime riche en lipides pendant quatorze semaines, à cinq prélèvements sanguins sur animal éveillé, à deux jeûnes de six heures et à un gavage, 528 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour analyses post-mortem. Le porteur qualifie lui-même de modérément douloureux le prélèvement de sang réalisé sans anesthésie. L'objet du projet tient en une phrase, comprendre le rôle d'un gène dans les cellules immunitaires du tissu adipeux, et les retombées contre l'obésité et le diabète sont renvoyées au long terme. Sur les 528 animaux, il écrit seulement que leur nombre a été calculé pour obtenir une puissance statistique suffisante.

Objectifs

L'objectif du projet est de comprendre le rôle d'un gène particulier dans les cellules immunitaires associées au tissu adipeux, dans des conditions normales et lors d'un régime riche en lipides qui induit de l'obésité.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de faire avancer de manière conséquente notre connaissance des cellules immunitaires associées au tissu adipeux, et qui contribuent au développement de l'obésité. Ce projet permettra à plus long terme d'identifier des cibles moléculaires pour envisager de nouvelles thérapies contre l'obésité et les maladies métaboliques telles que le diabète.

Procédures

Prélevement sanguin : maximum 5 fois par animal, 3 secondes; Régime alimentaire spécifique : 14 semaines; Injection intrapéritonéale : maximum 1 injection par animal, 3 secondes; Mise à jeun : une fois pendant 6h et 3 jours après une deuxième fois pendant 6h; Gavage : maximum 1 fois par animal, 5-10 secondes.

Impact sur les animaux

Le régime riche en lipides est susceptible d'engendrer divers effets métaboliques, et conduit généralement à une prise de poids significative et à une réduction de l'activité. Prélèvement de sang sur animal vigile : douleur modérée au moment de la réalisation du geste. Injection intrapéritonéale : douleur légère de courte durée. Mise à jeun : Jeune de courte durée: stress et sensation de faim. Gavage : stress de courte durée.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort pour des analyses post-mortem.

Remplacement

Il n’existe pas de méthode alternative pour réaliser ce travail qui nécessite l’analyse de tissus entiers. Le tissu adipeux est un tissu complexe qui comporte de nombreuses cellules qui interagissent afin de maintenir un équilibre. La dynamique du tissu adipeux, des cellules immunitaires qu’il abrite ainsi que les interactions et le recrutement potentiel de cellules d’autres organes sont des conditions qui ne peuvent pas être adéquatement reproduites in vitro.

Réduction

Le nombre de souris à utiliser a été calculé afin que les résultats obtenus puissent présenter une puissance statistique suffisante.

Raffinement

Les animaux seront maintenus dans des groupes de plusieurs individus dans un environnement enrichi. Un suivi de score clinique sera effectué pour éviter toute souffrance inutile des animaux.

Choix des espèces

La souris est le modèle de choix car la physiologie de la souris est proche de celle de l’homme. D’autre part les mécanismes immunitaires sont bien caractérisés chez la souris, ce qui en fait un modèle particulièrement adapté pour étudier les cellules immunitaires. Nous utiliserons des souris adultes pour que leurs tissus soient pleinement développés.

Gardés en vie à la fin du projet et remis à un centre de primatologie pour être réutilisés dans une autre expérience, 3 macaques vont subir des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré pendant un à trois ans. Chacun reçoit deux chirurgies d'environ douze heures pour implanter puis retirer des matrices d'électrodes dans le cerveau, et passe cinq jours par semaine attaché en chaise pour des séances d'enregistrement d'une heure trente à trois heures, pendant quatorze à trente-six mois. Le porteur mentionne une restriction hydrique partielle pouvant entraîner une perte de poids, le stress de l'immobilisation de la tête et les risques infectieux autour des implants crâniens. Il présente cette réutilisation comme une mesure de réduction, les macaques déjà habitués au dispositif évitant d'y soumettre des animaux naïfs.

Objectifs

Chez les primates, comme les singes ou les humains, attraper des objets avec les mains est une action essentielle pour interagir avec l’environnement. Pour y parvenir, le cerveau doit coordonner de nombreux muscles et tenir compte de la position du corps dans l’espace. Notre travail part de l’idée que la posture joue un rôle important dans la façon dont le cerveau représente les interactions possibles avec l’environnement, et la façon dont il prépare et contrôle les mouvements de la main. Nous pensons que cette organisation repose sur la coopération de plusieurs zones du cerveau impliquées dans le toucher et le mouvement. Ces régions échangent des informations pour combiner la position du corps et les actions à réaliser. Pour vérifier cette hypothèse, nous étudierons des singes macaques à l’aide de plusieurs méthodes. Nous observerons d’abord leurs mouvements lorsqu’ils attrapent des objets dans différentes postures (assis ou quadrupède), et lorsque les objets sont placés à différents endroits. Cela permettra de voir comment les contraintes du corps et de la gravité influencent leurs gestes. Nous mesurerons également l’activité de certaines zones du cerveau pendant ces actions, afin de comprendre comment la posture modifie la préparation et l’exécution des mouvements. Enfin, nous utiliserons des techniques de stimulation cérébrale et des anesthésiques pour mieux identifier le rôle précis de chacune de ces régions. L’objectif final de ces recherches est de montrer que la posture joue un rôle clé dans la manière dont les primates, y compris les humains, interagissent avec leur environnement.

Bénéfices attendus

À court et moyen terme, cette recherche vise avant tout à mieux comprendre comment le cerveau combine la posture du corps et les mouvements du bras et de la main pour interagir avec les objets. Plus précisément, nous voulons comprendre comment plusieurs régions du cerveau travaillent ensemble pour adapter les gestes en fonction de la position du corps et de l’objet à attraper. Pour cela, nos objectifs sont les suivants : • Etudier comment les mouvements de la main s’ajustent en fonction de la posture du sujet et de la position de l’objet ; • Observer l’activité des neurones, à la fois individuellement et en groupe, dans plusieurs zones du cerveau impliquées dans le toucher et le mouvement ; • Comprendre comment ces différentes régions du cerveau s’influencent mutuellement, en modifiant localement leur activité ; • Partager l’ensemble de nos données avec la communauté scientifique pour faire progresser la recherche. À plus long terme, ces travaux pourraient avoir des applications importantes. Ils pourraient notamment aider à mieux évaluer et traiter certains troubles liés à la posture et au mouvement chez les patients. Ils pourraient aussi contribuer au développement de robots plus performants et d’interfaces cerveau-machine, capables de mieux prendre en compte la posture du corps pour contrôler des gestes de préhension de manière plus naturelle et efficace.

Procédures

Les animaux seront soumis aux interventions suivantes : – Déplacement au centre IRM pour acquisition d'images, sous anesthésie, 1 fois pour une durée d'environ 4h. – Chirurgies d'implantation et de désimplantation des matrices multi-électrodes et de la chambre d’enregistrement, sous anesthésie, 2 chirurgies pour une durée d'environ 12h chacune (à répéter pour chaque hémisphère, le cas échéant). – Entraînement aux changements posturaux en cage d’hébergement, ≤30 min, 5 jours par semaine, durant 1 à 4 semaines. – La prise quotidienne de l'animal en chaise pour entraînement et enregistrements électrophysiologiques incluant des sessions avec présentation de vidéos, environ 1h30 (jusqu'à 3h), 5 jours par semaine, durant 14 à 36 mois. – La prise de l'animal en chaise pour microstimulations, 20 sessions d'environ 1h30 (jusqu'à 3h). – La prise de l'animal en chaise pour enregistrements électrophysiologiques sous anesthésie gazeuse ou pharmacologique, 20 sessions (habituation + enregistrement) d'environ 2h (jusqu'à 3h).

Impact sur les animaux

Dans ce projet, les macaques suivront une procédure de sévérité modérée. Les nuisances ou effets indésirables attendus sont le stress pendant les sessions d’entrainement et d’enregistrement et la douleur et les infections en lien avec les procédures chirurgicales. Plus spécifiquement, les sources de stress sont i) Les premières sorties (jusqu’à plusieurs semaines) de la cage vers la chaise d’entrainement ii) La positionnement dans le box expérimental et l’entraînement dans la tâche expérimentale iii) La restriction des mouvements de tête. Pour la connexion des matrices ou le protocole d’anesthésie iv) La restriction hydrique partielle liée au besoin expérimental pouvant engendrer une perte de poids. En lien avec les chirurgies et le protocole IRM, la contention pour l’induction par injection IM est source de stress. L’intubation endotrachéale, la mise sous respiration mécanique et l’anesthésie générale (gaz halogéné) peuvent causer des irritations de la trachée. Les zones cicatricielles et les implants crâniens peuvent constituer une source de douleur et de risques infectieux en post-opératoire.

Devenir

À la fin du projet, les animaux seront gardés en vie et après avis vétérinaire, remis à disposition d’un centre de primatologie pour leur réutilisation. Ils pourront soit 1) être réutilisé dans un autre projet basé sur un dispositif expérimental similaire, permettant d’éviter l’utilisation d’autres animaux naïfs (réduction). Les animaux réutilisés seront déjà habitués au contexte expérimental (interactions quotidiennes avec l’homme, mise en chaise, travail dans le dispositif comportemental) ou 2) en particulier les femelles peuvent retourner dans un établissement d’élevage pour être inclues dans un programme de reproduction.

Remplacement

Le projet implique l’utilisation d’animaux car il n'existe pas de méthode alternative permettant de répondre à nos objectifs scientifiques, ici l’analyse de l’activité cérébrale en lien avec la réalisation de comportements complexes. Le macaque représente ici un modèle animal idéal car son répertoire comportemental comprend des postures corporelles fonctionnellement distinctes pour différentes finalités fonctionnelles, et particulièrement la posture assise favorisée pour la manipulation complexe et la posture quadrupède pour les déplacement ou la manipulation plus grossière. Ce projet nécessite également l'enregistrement de l'activité cérébrale avec une grande résolution temporelle et spatiale, ce qu’il est impossible d’obtenir avec des méthodes non invasives.

Réduction

Nous prévoyons d’inclure jusqu’à 3 animaux dans le projet. Toutefois, si les objectifs scientifiques du projet sont atteints avec 2 animaux, nous n’inclurons pas de 3e animal. Cette approche permet d’anticiper certains aléas. En effet, les interventions chirurgicales comportent toujours un risque, la qualité des enregistrements peut varier selon la manière dont l’implant s’intègre au cerveau, et les réactions au stress ou l’apprentissage des tâches peuvent différer d’un animal à l’autre. Si les données recueillies chez deux animaux sont suffisantes pour obtenir des résultats fiables, le troisième animal ne sera pas inclus dans l’étude. Pour chaque animal, des dispositifs d’enregistrement permettent de mesurer l’activité de nombreuses cellules nerveuses dans différentes zones du cerveau en même temps. Le nombre de cellules effectivement enregistrées peut varier selon la réussite de l’implantation. Le fait d’utiliser ces dispositifs permet de recueillir une grande quantité d’informations, à différentes échelles, au fil du temps. Les séances d’enregistrement pourront être répétées sur une période allant d’un à trois ans. Cela permet d’augmenter progressivement la quantité de données recueillies et de vérifier la stabilité des résultats dans le temps. La durée exacte dépendra de la qualité des premiers enregistrements et de leur stabilité. Dans des conditions optimales, le suivi peut se poursuivre sur plusieurs années. Enfin, les données obtenues dans ce projet alimenteront une base de données partagée avec d’autres équipes de recherche. Cette mise en commun permettra, à moyen et long terme, de limiter le recours à de nouveaux animaux pour des études similaires.

Raffinement

Conformément à la législation, les animaux du projet sont hébergés avec un congénère pour favoriser les interactions sociales. Les cages et volières sont enrichies de perchoirs, de cordes et de jeux suspendus, pour encourager les comportements exploratoires, ainsi que le retour à une activité normale en période post-chirurgicale. Après chirurgie, un délai minimal d'une semaine sera observé et selon l'état de récupération, l'animal sera sorti en chaise afin de reprendre une routine qui lui est familière. Les méthodes de renforcement positif (entraînement et habituation) seront utilisées afin de réduire le stress des sujets. L’IRM anatomique pré-chirurgicale permet de mieux planifier l’implantation des matrices chroniques, pour bien atteindre les aires corticales ciblées. Les matrices multi-électrodes de nouvelle génération permettent des enregistrements simultanés de neurones dans différentes aires et couches corticales en limitant les contraintes sur les animaux (pas de fixation de la tête, temps de préparation de l’animal pour les enregistrement très court, limitation des risques d’infection).

Choix des espèces

Les macaques sont des primates non humains fréquemment utilisés en recherche en raison de la similitude de leur système visuomoteur et de l’anatomie fonctionnelle de leur cerveau avec ceux de l’humain. Plus spécifiquement, notre projet requiert un modèle animal dont le répertoire comportemental inclut des postures corporelles fonctionnellement associées à des niveaux de dextérité différents du membre supérieur. Le macaque possède la capacité d’effectuer aussi bien des saisies de puissance pendant la locomotion, que des mouvements de manipulation fine en position assise, ce qui en fait un modèle idéal pour ce projet. L’utilisation répandue des macaques en neuroscience a permis l’optimisation des procédures d’entraînement, de la gestion de leur alimentation, de leur hébergement et des soins vétérinaires. Dans ce projet, nous utiliserons indifféremment des macaques rhésus ou fascicularis en fonction de la disponibilité des animaux, leurs comportements de préhension et l’organisation fonctionnelle de leurs cerveaux étant très similaires. Les animaux seront utilisés au stade de jeune adulte/adulte. A ce stade de développement, ils ne sont plus en croissance et leurs besoins physiologiques sont stabilisés. Cela permet un contrôle plus précis des protocoles expérimentaux, que ce soit en termes de volume des récompenses pour l'apprentissage par renforcement, de contrôle du régime alimentaire dans la cage ou de localisation des structures cérébrales cibles pour les implants chirurgicaux. Par ailleurs, les animaux étant encore jeunes, ils présentent une meilleure tolérance aux procédures expérimentales et une meilleure récupération suite aux procédures nécessitant une anesthésie.

Nourris avec des croquettes toxiques pour les reins ou injectés avec un antibiotique néphrotoxique, 320 rats développent une insuffisance rénale, puis subissent trois, sept ou quinze jours plus tard une chirurgie vasculaire de pose de cathéters suivie d'une séance de dialyse de deux à quatre heures. Les procédures relèvent d'un niveau de souffrance modéré et le porteur y attend des saignements, des hémorragies, un œdème ou une nécrose au point d'injection, une prostration et une perte de poids. Il écrit que ces atteintes ne peuvent pas être complètement évitées parce que l'induction d'une insuffisance rénale est "absolument indispensable" au projet. Aucun rat ne quitte vivant la table d'opération, tous sont tués à la fin de la séance pour prélèvements.

Objectifs

L’insuffisance rénale aiguë est une maladie très fréquente associée à une importante mortalité, particulièrement dans les services de soins intensifs. L’hypothèse d’atteintes rénales induites par la dialyse menée de manière trop systématique a été proposée depuis longtemps. Des arguments récents en faveur de cette hypothèse ont émergé d’analyses statistiques d’essais de recherche clinique comparant différentes stratégies de dialyses au cours de l’insuffisance rénale aiguë en réanimation. Cependant, aucune étude animale ni humaine n’a jamais été réalisée pour étudier précisément cette hypothèse et les mécanismes physiopathologiques en découlant. L’objectif de ce projet est de mettre en place un modèle expérimental de dialyse chez le rat qui va permettre une meilleure compréhension du sujet. Nous envisageons d’explorer plusieurs modèles expérimentaux de maladies rénales ciblant différentes cellules rénales, dans le but de renforcer la pertinence physiopathologique du dispositif expérimental. Enfin, nous prévoyons d’optimiser la procédure de dialyse elle-même, notamment en intégrant de nouvelles membranes de dialyse plus performantes et en augmentant la durée, dans le but d’accroître l’efficacité. L’objectif du projet est de poursuivre l’étude des complications de la dialyse et d’améliorer l’efficacité du modèle.

Bénéfices attendus

Environ un tiers des patients admis en unité de soins intensifs développe une insuffisance rénale aiguë, caractérisée par une diminution soudaine et significative de la fonction rénale. Il est désormais bien établi que même un épisode modéré d’insuffisance rénale augmente le risque de mortalité. Par ailleurs, de nombreuses études ont démontré que l’insuffisance rénale aiguë constitue un facteur de risque majeur dans la progression vers une insuffisance rénale chronique, y compris chez les enfants, et ce, dans un délai de quelques semaines à quelques mois. Dans ce contexte, il apparaît essentiel d’améliorer la prise en charge des patients en optimisant les modalités de dialyse, afin de limiter la transition vers la maladie chronique.

Procédures

(1) Induction des modèles d’insuffisance rénale. Une partie des animaux sera nourrie avec des croquettes toxiques pour les reins et une autre recevra un antibiotique toxique pour les reins sous forme de deux injections réalisées à l’état vigile (durée 15 secondes). Une autre partie recevra une molécule toxique pour les reins avec une injection sous anesthésie générale (5 min). (2) Chirurgie réalisée 3, 7 ou 15 jours (selon le modèle d’insuffisance) sous analgésie et anesthésie. Des prélèvements sanguins sont effectués. Les animaux sont placés sur un plateau chauffant. A la fin de cette étape de deux à quatre heures, les animaux sont euthanasiés par une méthode règlementaire. Ce protocole a une durée de 2,5 à 4,5 heures.

Impact sur les animaux

Les nuisances peuvent être générées par (1) Stress lié aux manipulations régulières pour les injections et les pesées (stress lors de la contention). (2) Les douleurs induites sont de courte durée mais les animaux peuvent développer une inflammation locale. Certaines injections peuvent entrainer un saignement, un œdème ou une nécrose. (3) Les complications associées aux injections de molécules toxiques pour les reins et au régime riche en adénine. L'induction d'une insuffisance rénale entraine une altération de l'état général, une prostration et une perte de poids. L’injection d'une molécule peut s’accompagner d’une perte de l’appétit et donc d’une dénutrition. (4) Les complications liées à la chirurgie vasculaire (pose des cathéters) pouvant provoquer des saignements, hémorragies et des douleurs malgré une prise en charge de la douleur. (5) Les complications liées à l'anesthésie au moment de la chirurgie et l'euthanasie (détresse respiratoire, arrêt cardio respiratoire, stress thermique). Ces nuisances seront réduites au maximum grâce à l'utilisation de mesures de raffinement appropriées. Elles ne peuvent pas être complètement évitées car l'induction d'une insuffisance rénale est absolument indispensable pour le projet.

Devenir

Tous les animaux (320) seront euthanasiés en fin de chaque procédure, par une méthode réglementaire sous anesthésie générale par une personne expérimentée. Les différents prélèvements nécessaires pour les analyses sont réalisés après constatation de l’absence de battements cardio respiratoires.

Remplacement

Il n'est pas possible d’envisager des méthodes de remplacement pour notre projet, l’étude des effets de la dialyse ne pouvant être réalisée in vitro sur des lignées de cellules rénales ou au cours d’une étude clinique chez l’homme du fait des gestes invasifs engendrés Cependant, une étape de mise au point et amélioration du circuit de dialyse sera réalisée sans animal avec une solution physiologique contenant de l’albumine et de l’urée. Ces tests permettront d’évaluer la capacité de filtration et de sélectivité de nos membranes.

Réduction

Des expériences préliminaires ont permis d’évaluer l’hétérogénéité inter-individuelle du phénotype étudié (fonction rénale) dans nos modèles d'insuffisance rénale. Des lots de vingt animaux sont nécessaires pour obtenir la puissance suffisante pour mettre en évidence les différences phénotypiques entre les groupes et s’assurer de la reproductibilité de ces résultats d’une série à l’autre. Les effectifs ont été calculés à partir d'un module statistique. Nous utiliserons des test statistiques appropriés pour l'analyse des résultats. Le nombre total d'animaux est de 320 rats.

Raffinement

(1) Raffinement hébergement et surveillance. Les animaux sont acclimatés dans l'animalerie une à deux semaines avant le début de la procédure. Les rats sont placés au nombre de deux par cage. Les conditions d’hébergement sont conformes à la réglementation en vigueur pour l’espèce concernée. Le bien-être des animaux est assuré par une surveillance quotidienne de l’aspect et de la motricité ainsi que par une pesée régulière pendant toute la durée des protocoles. Le bien- être des animaux est également assuré par un enrichissement de leur environnement grâce à l'utilisation d'une litière à base de cellulose composée de plusieurs éléments, de tailles différentes (matière compacte initialement, décompactée par les animaux), de morceaux de bois à ronger et d'un dôme refuge en cellulose dans toutes les cages. (2) Les injections sont réalisées avec une aiguille très fine , ce qui limite les risques hémorragiques. Lors de certaines injections, les rats sont sous anesthésie générale et placées sur un plateau chauffant. Une compression à l’aide d’une compresse sera appliquée afin d’arrêter le saignement. Les injections sont réalisées par du personnel expérimenté. (3) Raffinement Chirurgie. Pour assurer le bien-être des animaux, les actes chirurgicaux s'accompagneront d'une prise en charge péri-opératoire de la douleur et d'une anesthésie appropriée. Les instruments chirurgicaux sont stérilisés. Les animaux sont placés sur un plateau chauffant.

Choix des espèces

Nous utiliserons des rats mâles âgés de plus de 6 mois pour plusieurs raisons : - ils présentent une physiologie rénale comparable à celle de l’homme. - ils présentent une taille et un poids plus importants que les souris et que les rats Lewis par exemple, permettant une mise en place plus adéquate du modèle d’hémodialyse. - ils présentent un volume sanguin total théoriquement suffisant pour éviter toute transfusion sanguine.

504 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, chacune hébergée seule et nourrie trois jours d'un régime hypercalorique avant d'être tuée pour prélèvement de tissus. La nuisance principale que le porteur identifie est le stress de l'isolement, qu'il compte compenser par du coton, des tunnels et de la litière prise chez les congénères. L'objet réel se limite à décrire la phase précoce de l'inflammation de l'hypothalamus chez des souris rendues obèses, les retombées thérapeutiques étant renvoyées au long terme. Vingt et un mâles et vingt et une femelles par groupe sont déclarés nécessaires, ce qui porte l'effectif à 504 animaux pour une expérience de trois jours.

Objectifs

Pour développer de nouvelles thérapies contre l'obésité et ses complications, il est important de mieux comprendre les mécanismes biologiques qui contrôlent l'appétit et le poids corporel. Une petite zone du cerveau appelée hypothalamus médio-basal (MBH) joue un rôle clé dans la gestion de l'énergie du corps. Un régime riche en graisses provoque une inflammation dans cette zone, appelée neuro-inflammation. Les cellules immunitaires du cerveau et des méninges participent à cette inflammation dans le MBH en réponse à ce régime riche. Mais nous ne connaissons pas le rôle exact joué par les cellules immunitaires méningées. En comprenant mieux ces mécanismes, nous pourrions trouver des moyens de limiter l'inflammation et prévenir la prise de poids. Pour cette étude nous utiliserons un modèle animal d’obésité, des souris nourries avec un régime hypercalorique favorisant la prise de poids pendant trois jours . Le projet comprend une seule procédure expérimentale.

Bénéfices attendus

Les informations tirées de la réalisation de ce projet permettront de mieux comprendre les changements inflammatoires des cellules immunitaires des méninges et du cerveau dans le développement de l’obésité en lien avec l’inflammation du MBH. Dans une perspective thérapeutique à long terme, ces données seront utiles pour tenter de moduler la réponse inflammatoire liée à un régime hypercalorique.

Procédures

La nourriture hypercalorique peut induire un stress digestif pendant les 24 premières heures. Le stress dû à l'hébergement individuel est la nuisance principale rencontrée. Nous essaierons de limiter ce stress en ajoutant cotons et tunnels supplémentaires, et litière provenant de ses congénères (avant hébergement individuel). Cependant si le stress est trop intense, nous la replacerons avec ses congénères au bout de 48h. L’animal sera sorti de l’expérience.

Impact sur les animaux

Le stress induit par l'hébergement individuel et le changement de nourriture (régime alimentaire hypercalorique sera de courte durée (3 jours phase précoce de la réponse inflammatoire). Les animaux contrôles seront eux nourris avec la nourriture standard et hébergés individuellement également.

Devenir

A la fin de chaque procédure les animaux sont mis à mort selon les méthodes réglementaires pour prélever les tissus pour analyse.

Remplacement

L’utilisation du modèle animal murin est essentielle dans ce projet, car dans l’état actuel des connaissances, il est impossible de recréer in vitro les multiples interactions cellulaires d’un système complexe en développement (méninges, cerveau et système immunitaire).

Réduction

Nous tenterons de limiter au maximum le nombre d’animaux utilisés tout en effectuant des expériences pertinentes et complètes. Une approche statistique solide requiert 21 animaux par groupe. Des exemples de données publiées ainsi que nos précédents travaux non publiés prévoient un effet sexe en particulier lors des interactions cellules immunitaires et système nerveux. Nous aurons donc des groupes de 21 males et 21 femelles par expérience.

Raffinement

Les souris seront suivies régulièrement et des points limites adaptés et précoces permettront en cas de souffrance avérée de prendre des mesures adéquates en concertation avec notre vétérinaire référent ou notre structure SBEA (surveillance renforcée, analgésie, enrichissement, etc.). Afin de compenser le manque d’interactions sociales et le possible stress de l'hébergement individuel, nous procèderons à un enrichissement double de la cage,et mettrons dans la cage de la litière de ses congénères. La souris sera habituée à l’expérimentateur une semaine avant afin de limiter son stress lors des pesées quotidiennes.

Choix des espèces

La souris est un mammifère où les processus qui régissent le développement du système nerveux central sont similaires à l'Homme. La régulation du poids corporel, le comportement alimentaire et le métabolisme glucidique sont depuis longtemps étudiés chez la souris, qui représente donc une espèce adaptée à ce type d’études. La maturation du cerveau et des méninges est terminée à 8 semaines c’est pourquoi nous utiliserons ce stade de développement. la consommation d’un régime gras induit une réponse neuro-inflammatoire dimorphique (plus importante chez les mâles). Nous obtiendrons une observation la plus réaliste possible des influences hormonales en lien avec l’inflammation en utilisant les deux sexes. Nous utiliserons des souris C57BL6J de type sauvage âgées de 8 semaines pour lesquelles la croissance est terminée.

Sept prélèvements de sang en trois semaines après une injection unique de dérivés perfluorés : 16 cochons juvéniles vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, tous tués à l'issue. L'objectif déclaré est de savoir si le PFOB commercial, employé comme agent de contraste ou substitut sanguin, aboutit à la présence de PFOA dans le sang. Le porteur reconnaît que l'effectif de quatre animaux par groupe n'a pas été calculé et repose sur le caractère semi-quantitatif de l'étude. Les cochons ne peuvent pas être gardés en vie parce qu'ils risqueraient d'excréter ces PFAS dans l'environnement, et l'espèce a été retenue pour sa masse graisseuse où ces composés s'accumulent.

Objectifs

Le bromure de perfluorooctane (PFOB) est un liquide utilisé pour de nombreuses applications médicales comme agent de contraste, comme substitut sanguin ou comme agent principal lors de ventilation liquidienne totale. En raison de son processus de synthèse industrielle, le PFOB dans sa forme commerciale peut contenir des résidus d’iodure de perfluorooctane (PFOI) ou de perfluorooctane hydroxylé (PFOH). Ces deux composés pouvant potentiellement se transformer lentement dans l’atmosphère, en présence d’un rayonnement infrarouge, en acide perfluorooctanoïque (PFOA) qui est un composé dérivé des substances perfluoroalkylées et polyfluoroalkylées (PFAS), il est nécessaire de savoir si le PFOB commercial peut aboutir à la biosynthèse de PFOA in vivo. Cela permettra d’évaluer le potentiel toxique de ce composé commercial sur les patients traités et d’envisager éventuellement une stratégie de purification du PFOB commercial. Ces substances sont en effet aujourd’hui au centre des préoccupations en termes de toxicologie pour leur persistance dans l’organisme. Leur demi-vie d’élimination est en effet très longue (plusieurs années pour le PFOA) et ils peuvent présenter une toxicité hépatique. L’objectif est donc d’évaluer si le PFOB commercial peut aboutir à la présence de PFOA dans le sang et de déterminer l’origine (PFOB, PFOI et/ou PFOH) de ce PFOA éventuel. Un objectif secondaire de cette étude est de déterminer les paramètres pharmacocinétique de ces molécules dans le sang des animaux. Pour cela, les animaux recevront une injection de PFOB commercial ou une injection de PFOB pur ou une des deux impuretés principales (PFOI et PFOH) purs. Chez ces animaux, le PFOB, PFOI et PFOH et la présence de PFOA seront ensuite dosé toutes les semaines dans le sang pour déterminer si le PFOB commercial peut mener à la production de PFOA et l’origine de cette production de PFOA.

Bénéfices attendus

Nous évaluerons la présence de PFOA dans les 4 groupes afin d’évaluer la cinétique de biotransformation éventuelle en PFOA des différentes molécules injectées.

Procédures

Tous les animaux seront soumis à une injection intraveineuse unique de dérivés perfluorés dilués dans 1ml et à des prises des sang régulières (7 prélèvements de sang sur 3 semaines). La durée de l’injection sera de l’ordre de quelques secondes.

Impact sur les animaux

Les composés dérivés des PFAS sont des molécules présentant une toxicité très chronique (plusieurs années). La durée d’étude du présent protocole rend très improbable l’observation du moindre effet clinique des composés utilisés. Néanmoins, lors de l’injection si un effet délétère est observé (crise convulsive) alors nous considérerons cette observation comme un point limite et l’animal sera mis à mort.

Devenir

Tous les animaux sont mis à mort en fin de protocole, en effet, les composés administrés appartiennent à la classe des PFAS et peuvent constituer un risque de pollution environnementale. Il n’est donc pas possible de garder les animaux en vie en raison du risque d’excrétion de ces molécules dans l’environnement

Remplacement

La pharmacocinétique est une science intégrant l’ensemble de l’effet des organes sur le devenir des molécules. Il est donc impossible de reproduire l’intégralité des phénomènes pharmacologiques ou toxicologiques in vitro (absence de Remplacement possible). L’étude de la biotransformation de molécules doit se faire in vivo, en utilisant des animaux à des fins scientifiques.

Réduction

Afin de mesurer la présence ou non de PFOA et d’établir des critères permettant de caractériser la pharmacocinétique, le projet sera constitué de 4 animaux dans chaque groupe. Le nombre d’animaux utilisé n’a pas été calculée mais repose sur le fait qu’il s’agit d’une étude descriptive semi-quantitative pour laquelle le critère primaire est la présence ou non de PFOA dans le sang. Avec ce nombre d’animaux, nous pourrons établir des ordres de grandeur de paramètres pharmacocinétique sans pour autant déterminer précisément leurs valeurs, ce qui n’est pas l’objet du projet. La variabilité attendue d’après les résultats de la littérature est relativement faible et nous estimons que 4 animaux par groupe (2 mâles et 2 femelles) permettront aussi de mettre en évidence des variabilités du métabolisme lié au sexe.

Raffinement

Dès leur arrivée à l’animalerie, les animaux seront hébergés dans des boxes collectifs, par groupes de 4 animaux, avec des copeaux de bois au sol et enrichissement avec des jouets en plastique. Tout au long de l’étude, les animaux seront observés quotidiennement afin de détecter une éventuelle prostration ou une baisse de l’état général. Afin d’éviter que les prises de sang constituent une source de stress trop importante pour les animaux, une sédation sera mise en place. La procédure n’étant pas douloureuse, aucune analgésie n’est envisagée. Lors de l’injection des molécules, si un effet délétère est observé alors nous considérerons cette observation comme un point limite et l’animal sera mis à mort.

Choix des espèces

Notre choix s’est porté sur l’espèce porcine compte tenu de sa proximité avec l’homme (notamment au niveau du métabolisme des xénobiotiques) et de la répartition de sa masse graisseuse qui peut constituer un tissu préférentiel d’accumulation des composés perfluorés. D’autre part, la taille de ces animaux permet de rendre possible des prélèvements sanguins aussi importants qui ne pourraient pas être réalisés chez d’autres espèces plus petites. Nous utiliserons des porcs juvéniles de 30 kg car ce poids facilite la manutention de l’animal et ce jusqu’à la fin du projet en considérant la prise de poids durant 21 jours.

300 souris subissent une chirurgie unique sous anesthésie provoquant un accident vasculaire cérébral, ischémique ou hémorragique selon le groupe, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles sont ensuite observées six ou vingt-quatre heures, avec deux prélèvements de sang et deux évaluations neurologiques, puis tuées pour doser des biomarqueurs et mesurer le volume de la lésion cérébrale. Le porteur reconnaît que certaines présentent après l'opération une fatigue, une perte de mobilité ou des difficultés à se nourrir pouvant durer jusqu'à la fin de la période d'observation. Il écrit que, malgré plus de vingt ans de recherches et de nombreuses études humaines, aucune donnée disponible n'explique l'évolution de ces marqueurs, et conclut que le recours à la souris est "indispensable".

Objectifs

L’accident vasculaire cérébral (AVC) est une urgence médicale majeure et constitue l’une des principales causes de décès et de handicap dans le monde. Parmi les AVC, ceux causés par un caillot qui bloque une grosse artère dans le cerveau (appelés AVC ischémiques) peuvent bénéficier de traitements efficaces. Cependant, même avec une prise en charge rapide, plus d’un patient sur deux reste dépendant trois mois après l’AVC. Le facteur le plus important pour améliorer les chances de récupération est le temps : chaque demi-heure de retard augmente considérablement le risque de décès ou de séquelles. Or, avant d’initier un traitement, les médecins doivent réaliser une imagerie (scanner ou IRM) pour vérifier s’il s’agit d’un AVC ischémique (avec occlusion d’une artère) ou hémorragique (avec saignement d’une artère), car les traitements sont opposés selon le type. Ce délai d’attente est donc un obstacle majeur. Des travaux récents ont identifié des molécules présentes dans le sang (biomarqueurs) qui pourraient permettre de reconnaître rapidement le type d’AVC. Mais ces biomarqueurs n’ont pas encore été testés dans des conditions permettant leur utilisation fiable en pratique. En particulier, on ne connaît pas leur évolution dans le temps ni leur réponse spécifique selon le type d’AVC. Ce projet a pour objectif d’étudier, chez la souris, l’évolution de ces biomarqueurs dans des modèles expérimentaux d’AVC ischémique et hémorragique. Grâce à un environnement contrôlé, il sera possible de mieux comprendre leur comportement dans le temps et d’identifier ceux qui permettent de différencier rapidement les types d’AVC. À terme, ces résultats pourraient contribuer au développement d’un test sanguin rapide chez l’humain, utilisable dès les premiers instants, pour orienter plus vite les patients vers le bon traitement, et ainsi diminuer la mortalité et le risque de séquelles neurologiques sévères après un AVC.

Bénéfices attendus

À court terme, ce projet cherche à repérer des marqueurs biologiques dans le sang qui réagissent très tôt après un accident vasculaire cérébral (AVC). L’objectif est de mieux comprendre ce qui se passe dans le corps dès les premières heures, et de voir si certains marqueurs sanguins permettent de faire rapidement la différence entre les deux grands types d’AVC : l’AVC ischémique (lié à un caillot) et l’AVC hémorragique (lié à une rupture de vaisseau). Cette phase permettra de faire progresser les connaissances sur les mécanismes de l’AVC et d’identifier des éléments utiles pour améliorer le diagnostic dans les services d’urgence. À long terme, ces découvertes permettront de créer un outil de diagnostic simple et rapide, basé sur un test biologique réalisable dès la première prise en charge du patient. Cet outil pourra : •Accélérer la mise en route du bon traitement, ce qui est essentiel car chaque minute compte. Un gain d’une heure pourrait réduire d’environ 20 % les risques de décès ou de handicap. •Orienter le patient directement vers le service le plus adapté à sa situation (urgences classiques, service spécialisé, salle d’imagerie interventionnelle), en évitant les pertes de temps liées à des transferts inutiles. À plus long terme, ce système pourrait aussi être intégré dans les études cliniques testant de nouveaux traitements, pour pouvoir les administrer plus tôt et de façon plus ciblée. En résumé, ce projet a pour but d’améliorer la rapidité et la précision du diagnostic des AVC, ce qui bénéficiera directement aux patients en augmentant leurs chances de survie et de récupération. Il contribuera aussi à une meilleure organisation des soins d’urgence et à une avancée importante dans le domaine des maladies neurologiques.

Procédures

Le projet sera mené sur 300 souris, réparties en quatre groupes correspondant à différents modèles d’accident vasculaire cérébral (AVC). Chaque souris sera observée et suivie selon une organisation identique comprenant une période d’acclimatation à l’animalerie de 7 jours, un examen de base avant l’intervention durant 5 minutes et une prise de sang de très faible volume. Chaque souris sera utilisée pour une unique intervention chirurgicale sous anesthésie et analgésie durant moins de 20 minutes. Ensuite elle sera observée pour une durée de 6h ou de 24h où elle subira deux prélèvements veineux durant moins de 10 secondes et deux évaluations cliniques durant moins de 5 minutes sans aucune contention prolongée.

Impact sur les animaux

Dans le cadre de ce projet, certaines interventions peuvent entraîner un inconfort ou des effets secondaires chez les souris, mais toutes les procédures sont encadrées et réalisées dans le respect du bien-être animal. Les tests neurologiques réalisés après l’intervention peuvent provoquer un léger stress, mais celui-ci est de très courte durée. Les prélèvements de sang effectués sur des animaux éveillés peuvent entraîner un bref inconfort, comparable à une piqûre, mais ils sont très courts et les volumes prélevés sont minimes. De même, les injections (sous la peau ou dans l’abdomen) peuvent provoquer un léger inconfort au moment de l’acte, mais la douleur est passagère. Concernant les chirurgies pratiquées dans ce projet, une douleur modérée et transitoire est possible au niveau de la zone opérée. Après la chirurgie, certains animaux peuvent présenter une gêne neurologique : fatigue, perte de mobilité ou difficultés à se nourrir. Ces effets sont surveillés et pris en charge, mais peuvent durer jusqu’à la fin de la période d’observation. Dans tous les cas, des traitements antidouleur adaptés sont administrés, et des critères précis sont mis en place pour limiter toute souffrance inutile. Les animaux sont étroitement surveillés tout au long de l’étude, et toute détresse conduit à une intervention immédiate.

Devenir

A l’issue de chaque procédure expérimentale, les animaux seront mis à mort à un temps défini dans le cadre d’un recueil d’organes et de tissus (sang, cerveau) nécessaires aux objectifs scientifiques du projet. La mise à mort est indispensable pour l’analyse biologique (dosage de biomarqueurs), histologique (analyse du volume lésionnel) et immuno-histochimique (étude de l’expression et de la localisation tissulaire des protéines d’intérêt).

Remplacement

À ce jour, il n’existe aucune méthode alternative permettant de répondre à la question scientifique posée sans recourir à l’expérimentation animale. Malgré plus de 20 ans de recherches et de nombreuses études humaines, aucune donnée disponible ne permet d’expliquer de manière précise et fiable comment évoluent certains marqueurs biologiques après un accident vasculaire cérébral (AVC). Les modèles développés en laboratoire (sur cellules, dits "in vitro") ne permettent pas non plus de reproduire l’ensemble des mécanismes complexes qui se déclenchent lors d’un AVC, comme les réactions inflammatoires, la coagulation, les atteintes des vaisseaux sanguins ou encore la souffrance neuronale. Les modèles animaux, en particulier chez la souris, sont aujourd’hui les seuls à permettre une reproduction fidèle de ce qui se passe dans le corps humain lors d’un AVC, que ce soit par obstruction d’un vaisseau ou hémorragique (saignement cérébral). Ces modèles sont déjà largement utilisés pour comprendre la maladie et tester de nouvelles approches thérapeutiques. En l’absence d’alternative fiable chez l’humain ou en laboratoire, l’utilisation de modèles animaux est donc indispensable pour répondre à la question posée dans ce projet de recherche, dans le but de mieux comprendre la maladie et d’améliorer la prise en charge des patients à l’avenir.

Réduction

Afin de réduire au maximum le nombre d’animaux utilisés dans ce projet, plusieurs stratégies ont été mises en place. Les marqueurs étudiés ont été directement sélectionnés à partir de données humaines déjà disponibles, issues de grandes bases cliniques, d’analyses de la littérature scientifique et de tests réalisés sur du sang de patients. Ensuite, chaque souris incluse dans le protocole permettra d’obtenir plusieurs prélèvements de sang à différents moments, ce qui évite d’utiliser un animal par point de mesure. Grâce aux progrès des techniques de laboratoire, de très faibles volumes de sang (quelques microlitres) suffisent désormais pour analyser les marqueurs recherchés. Ces prélèvements sont réalisés selon les recommandations internationales, sans dépasser les seuils autorisés. Enfin, un calcul précis du nombre de souris nécessaires a été réalisé avant le début du projet grâce à une évaluation statistique, pour s’assurer que chaque animal utilisé est indispensable. Grâce à l’organisation choisie, ce protocole permet de réduire d’environ deux à trois fois le nombre de souris qui aurait été nécessaire avec une approche classique. L’ensemble de ces mesures permet de respecter les principes éthiques de la recherche animale et de limiter son impact tout en garantissant des résultats fiables.

Raffinement

Avant toute procédure susceptible d’induire une douleur modérée, une analgésie préventive sera administrée. Une crème ou un spray anesthésique local sera également appliqué afin d’engourdir la zone traitée et de limiter l’inconfort au réveil. Les souris seront ensuite installées dans une chambre chauffée pour favoriser un réveil confortable. Les animaux auront un accès permanent à l’eau et à une alimentation adaptée, notamment sous forme gélifiée après l’intervention pour favoriser leur récupération. L’état de santé sera surveillé de manière rigoureuse grâce à des grilles d’évaluation précises, permettant de détecter toute douleur ou signe de détresse. Ces évaluations porteront à la fois sur le comportement de l’animal et sur ses capacités motrices. En cas de douleur mal soulagée ou de signes de souffrance importants, l’application de points limites stricts et spécifiques au projet sera réalisée.

Choix des espèces

L’espèce utilisée sera la souris sur laquelle toutes les techniques décrites ont déjà été validées dans la littérature. Les souris seront utilisées à l’âge adulte (à partir de 8 semaines). C'est à cet âge que les modèles utilisés sont validés.

Pour classer six peptides selon qu'ils freinent ou stimulent le système immunitaire, 160 souris subissent une réaction allergique provoquée sur l'oreille, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le protocole tient en huit jours : rasage de l'abdomen sous anesthésie, dépôt d'un produit allergisant sur la peau, deux injections des peptides à tester, puis application du même produit sur l'oreille droite pour déclencher un gonflement, mesuré à l'épaisseur. Toutes sont tuées le lendemain de la dernière mesure pour prélever leurs oreilles. Le porteur affirme que l'étude chez l'animal est "indispensable" pour valider ces molécules, après un tri de plus de cinquante peptides sur cellules en culture, et indique qu'aucune des plus de 200 souris déjà utilisées dans ce modèle n'a nécessité de mise à mort anticipée.

Objectifs

Ce projet vise à évaluer l'efficacité de nouvelles molécules (appelées peptides) capables de réguler le système immunitaire, c'est-à-dire notre système de défense contre les infections et les maladies. Notre système immunitaire possède des mécanismes de contrôle comparables aux freins et accélérateurs d'une voiture. Parfois, ces mécanismes sont déréglés : le système immunitaire peut être trop actif (causant des maladies auto-immunes comme la polyarthrite ou des allergies) ou pas assez actif (permettant aux cancers de se développer). Nous testerons six molécules différentes : - Quatre molécules « freins » qui pourraient calmer un système immunitaire trop actif - Deux molécules « accélérateurs » qui pourraient stimuler un système immunitaire insuffisant Pour évaluer ces molécules, nous utiliserons un modèle de réaction allergique cutanée chez la souris. Ce modèle reproduit ce qui se passe lors d'un eczéma de contact chez l'homme : la peau devient rouge et gonflée au contact d'une substance à laquelle l'organisme a été préalablement sensibilisé. En mesurant l'intensité de cette réaction inflammatoire, nous pourrons déterminer si nos molécules sont capables de la diminuer (pour les « freins ») ou de l'augmenter (pour les « accélérateurs »), et ainsi identifier les candidats les plus prometteurs pour le développement de futurs traitements.

Bénéfices attendus

Bénéfices scientifiques : Cette étude permettra de mieux comprendre comment réguler le système immunitaire avec de nouvelles molécules, ouvrant des pistes pour traiter des maladies actuellement difficiles à soigner. Bénéfices médicaux potentiels : Pour les molécules « freins » : elles pourraient aider à traiter des maladies où le système immunitaire attaque l'organisme par erreur (maladies auto-immunes comme la polyarthrite rhumatoïde, le lupus, la sclérose en plaques) ou pour prévenir le rejet après une greffe d'organe. Pour les molécules « accélérateurs » : elles pourraient renforcer les traitements contre le cancer (immunothérapie) ou améliorer la réponse aux vaccins chez les personnes dont le système immunitaire est affaibli. Avantages de ces nouvelles molécules par rapport aux traitements existants : - Coût de fabrication plus faible - Administration plus simple (injection sous la peau plutôt que perfusion à l'hôpital) - Meilleure diffusion dans les tissus.

Procédures

Le protocole s'étend sur 8 jours. Par convention, le jour du challenge (application sur l'oreille) est désigné Jour 0. Les étapes préalables de sensibilisation sont numérotées en jours négatifs (J-7, J-6, J-2, J-1), indiquant le nombre de jours avant le challenge. Les souris subiront les interventions suivantes sur une durée totale de 8 jours : 1. Rasage de l'abdomen (Jour -7, durée : 5 min) : réalisé sous anesthésie gazeuse brève (2-3 min) pour éviter le stress de contention. Récupération complète en moins de 5 minutes. 2. Sensibilisation cutanée (Jour -6, durée : 30 sec) : application d'une goutte de produit allergisant sur l'abdomen rasé. Ce geste est réalisé sur animal éveillé avec contention manuelle douce. Cette étape prépare le système immunitaire à réagir au produit. 3. Injections sous la peau (Jours -2 et -1, durée : 20 sec par injection) : deux injections des molécules à tester dans le haut du dos. Ces gestes sont réalisés sur animal éveillé avec contention manuelle douce. 4. Application sur l'oreille (Jour 0, durée : 30 sec) : application du même produit allergisant sur l'oreille droite pour déclencher la réaction allergique localisée. Ce geste est réalisé sur animal éveillé. 5. Mesures (Jours 0 et +1, durée : 2 min par souris) : mesure de l'épaisseur de l'oreille avec un instrument de précision pour quantifier l'inflammation. Ces mesures sont réalisées sur animal éveillé. À l'issue des mesures (Jour +1), les animaux sont euthanasiés et les oreilles sont prélevées pour des analyses au microscope.

Impact sur les animaux

Effets attendus : Rasage (Jour -7) : stress bref lié à l'anesthésie (quelques minutes), récupération rapide. Sensibilisation cutanée (Jour -6) : possibilité d'une légère rougeur temporaire sur l'abdomen, sans gêne notable pour l'animal. Injections (Jours -2 et -1) : stress bref lié à la contention (moins de 20 secondes). Possibilité d'une petite bosse sous la peau au point d'injection, disparaissant en 1-2 jours. Réaction allergique sur l'oreille (Jour 0 à Jour +1) : c'est la phase où les effets sont les plus visibles : - Gonflement de l'oreille traitée (augmentation d'épaisseur de 0,1 à 0,3 mm) - Rougeur et légère chaleur de l'oreille - Ces effets restent strictement localisés à l'oreille traitée État général : les souris conservent un comportement normal (alimentation, déplacements, interactions avec leurs congénères). Pas de perte de poids significative attendue. Signes pouvant nécessiter une euthanasie anticipée (observés chez moins de 2% des animaux selon notre expérience) : - Perte de poids importante - Extension des lésions cutanées au-delà de la zone traitée - Grattage excessif ou automutilation - Prostration ou isolement du groupe - Signes de douleur non contrôlée. Sur plus de 200 souris utilisées dans ce modèle dans notre laboratoire, aucun animal n'a nécessité d'euthanasie anticipée.

Devenir

Aucun animal ne sera maintenu en vie à l'issue de la procédure. Tous les animaux (160 souris) seront euthanasiés à la fin de l'étude, le protocole nécessitant le prélèvement des oreilles pour analyses microscopiques.

Remplacement

Avant de recourir à l'expérimentation animale, des tests sur cellules en culture ont été réalisés pour sélectionner les candidats les plus prometteurs parmi plus de 50 peptides. Cependant, ces méthodes ne permettent pas de reproduire le fonctionnement complet du système immunitaire : elles ne peuvent pas évaluer le devenir des peptides dans l'organisme, les interactions entre les différents types de cellules immunitaires, ni le recrutement de ces cellules vers le site d'inflammation. L'étude chez l'animal est donc indispensable pour valider l'efficacité de ces molécules avant tout développement thérapeutique.

Réduction

Le nombre d'animaux a été calculé mathématiquement au minimum nécessaire pour obtenir des résultats fiables. Sur plus de 50 molécules conçues initialement, seules les 6 plus prometteuses — présélectionnées par des tests en laboratoire — sont testées chez l'animal. Chaque souris fournit plusieurs mesures (épaisseur de l'oreille, poids de la biopsie, analyses microscopiques), ce qui maximise les informations obtenues par animal. Les résultats seront publiés et rendus accessibles à la communauté scientifique afin d'éviter toute duplication inutile de ces expériences.

Raffinement

De nombreuses mesures sont prises pour assurer le bien-être des animaux et minimiser leur inconfort : Hébergement adapté : - Souris hébergées en groupe (4-5 par cage) pour préserver les contacts sociaux - Cages enrichies avec matériel de nidification (papier, coton), abris et litière abondante - Conditions de température, humidité et lumière contrôlées - Période d'acclimatation de 7 jours avant le début des manipulations Réduction du stress lors des manipulations : - Rasage réalisé sous anesthésie gazeuse brève - Manipulations douces et rapides - Surveillance et prise en charge de la douleur : - Observation quotidienne de tous les animaux, renforcée (2 fois par jour) pendant la phase de réaction allergique - Utilisation d'une grille d'évaluation standardisée avec des critères objectifs (poids, aspect du pelage, comportement, aspect des lésions) - Points limites définis : si un animal montre des signes de souffrance importante, il est immédiatement euthanasié - La surveillance est renforcée lors de la phase de réaction, et que l'euthanasie est immédiate en cas de signes de souffrance (score 3) Durée limitée : - Protocole de 8 jours seulement - Euthanasie réalisée à la fin de l'étude, avant que l'inflammation ne devienne inconfortable, sous anesthésie profonde (méthode rapide et sans douleur)

Choix des espèces

Choix de l'espèce : La souris a été choisie pour les raisons suivantes : 1. Modèle validé : le modèle d'allergie cutanée utilisé est un standard international pour évaluer des molécules modulant le système immunitaire. Il existe de nombreuses données publiées permettant de comparer nos résultats. 2. Sensibilité adaptée : la souche de souris choisie présente une bonne sensibilité aux réactions allergiques cutanées, ce qui permet de détecter efficacement l'effet de nos molécules. 3. Pertinence pour l'homme : les mécanismes immunitaires ciblés par nos molécules sont très similaires chez la souris et chez l'homme (plus de 70% de ressemblance), ce qui permet d'envisager une application future chez l'homme. 4. Disponibilité : ces souris sont facilement disponibles auprès de fournisseurs agréés, avec des caractéristiques génétiques standardisées garantissant la reproductibilité des expériences. Stade de développement : Les souris utilisées seront des adultes jeunes (7-9 semaines), car : 1. À cet âge, le système immunitaire est pleinement mature, garantissant des réponses représentatives. 2. C'est l'âge standard utilisé dans la littérature scientifique, facilitant la comparaison des résultats. 3. Les souris sont suffisamment développées pour bien tolérer les manipulations.