Procédures modérées

Inséminées avec de la semence congelée d'âne puis soumises à des lavages utérins sur animal vigile, quatre fois par an, 10 ânesses et 10 juments vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Aucune n'est tuée à l'issue : elles retournent à l'élevage et seront réutilisées dans un projet ultérieur. Le protocole compare deux cryoprotecteurs, le glycérol et le diméthylformamide, en mesurant l'inflammation de la muqueuse utérine que chacun provoque, pour améliorer le taux de fertilité de l'insémination chez l'âne Grand Noir du Berry. Le porteur indique que les prises de sang et les inséminations peuvent causer une douleur modérée et de courte durée, décrit un entraînement des femelles au clicker suivi d'une récompense alimentaire après chaque acte, et présente la jument comme le "modèle" servant à interpréter ce qui est observé chez l'ânesse.

Objectifs

L'âne domestique, en déclin démographique constant, voit certaines races locales, comme le Grand Noir du Berry, menacées. L’insémination artificielle représente une solution clé pour lutter contre la consanguinité, décloisonner les élevages et diffuser une génétique de qualité. Toutefois, en raison de dommages cellulaires irréversibles, l’utilisation de la semence congelée est inefficace pour maintenir un taux de fertilité suffisant et assurer le renouvellement de l’espèce. Les cryoprotecteurs non pénétrants, comme le glycérol, sont essentiels pour la protection des spermatozoïdes au cours de la congélation mais peuvent s’avérer irritants pour le tractus génital femelle. L’endométrite est une pathologie qui se manifeste par une inflammation de la muqueuse utérine. Elle est fréquemment observée chez les équidés, en particulier chez les ânesses, et peut avoir un impact majeur sur la fertilité, le développement embryonnaire et à terme, la gestation. Notre projet vise à comparer l’intensité de la réponse inflammatoire utérine après insémination avec de la semence congelée contenant soit du glycérol, soit du diméthylformamide (DMF) afin de limiter au maximum ce phénomène et d’adapter les protocoles de cryoconservation à l’espèce asine. La jument, dont la physiologie reproductive est mieux caractérisée, servira de modèle pour interpréter les réponses observées chez l’ânesse, espèce encore peu étudiée dans ce domaine. En parallèle, des dosages plasmatiques (oestradiol, progestérone, glucose...) seront effectués chez les ânesses présentant une faible réponse aux inséminations afin de mieux comprendre leur statut endocrinien et métabolique au cours du cycle ovarien et du développement embryonnaire précoce.

Bénéfices attendus

L’objectif est d'aboutir à un protocole d’insémination (milieu de congélation + gestes techniques) optimal pour améliorer le taux de fertilité et contribuer à la sauvegarde des races asines. Outre l’aspect bénéfique pour notre étude, les résultats permettront d’enrichir les données bibliographiques. Les différences physiologiques entre la jument et l’ânesse justifient des études approfondies, notamment pour mieux comprendre les écarts de fertilité entre les deux espèces. Les résultats aboutiront à la rédaction d’un article scientifique et seront présentés aux différents partenaires du projet. Pour finir, la méthode sera transférée à l’ensemble de la filière, notamment aux vétérinaires. Les prélèvements sanguins réalisés sur les ânesses visent à déterminer si l’échec des inséminations chez certaines femelles est dû à un dysfonctionnement endocrinien ou métabolique, plutôt qu’à la qualité de la semence ou à la technique utilisée. La caractérisation des profils hormonaux et métaboliques liés à l’infertilité permettra d’adapter les protocoles de reproduction assistée, en optimisant la sélection des femelles, les traitements et le moment des inséminations.

Procédures

Les lavages utérins seront réalisés sur animaux vigiles à raison de quatre cycles par an (durée estimée : 20 minutes). Les prélèvements de sang à la veine jugulaire seront également réalisés sur animaux vigiles à raison d'un cycle par an aux jours -1 et -2 (période pré-ovulatoire), au jour 0 (ovulation), ainsi qu'aux jours 5, 10, 14 et 18 post-ovulation (durée estimée : inférieure à une minute).

Impact sur les animaux

La contention des animaux peut engendrer du stress tout comme une injection peut entrainer une douleur. Lors des prises de sang et des inséminations artificielles, les animaux peuvent ressentir une douleur modérée et de courte durée, ne provoquant pas de troubles de l’état général.

Devenir

Après avis du vétérinaire sanitaire, en concertation avec le responsable de l'équipe équine, tous les animaux retourneront en élevage.

Remplacement

L’évaluation de l’inflammation utérine chez l’ânesse et la jument nécessite de réaliser des prélèvements dans le tractus génital femelle. La méthode d’imagerie par voie transrectale n’est pas suffisamment résolutive pour mesurer l’intensité de cette réaction physiologique. Les concentrations hormonales dans le sang ne peuvent être étudiées in vitro et nécessitent aussi des prélèvements sur les animaux.

Réduction

Les effectifs ont été calculés afin d'obtenir des résultats statistiquement significatifs avec un nombre minimum d'animaux. Chaque femelle sera utilisée comme son propre témoin. Variables principales après lavage utérin = nombre de cellules immunitaires et taux de fertilité. Variables secondaires = insertion du cathéter seul, cathéter + cryoprotecteur (glycérol ou DMF), cathéter + cryoprotecteur (moins irritant) + semence congelée, type de cellules immunitaires (neutrophiles, lymphocytes T). Variable principale pour les prises de sang = concentration de l'hormone ou du métabolite. Variable secondaire = stade du cycle ou de la gestation. Puissance du test : 95%. Valeurs : moyenne ± écart-type.

Raffinement

Les femelles sont logées en bâtiment conventionnel sur aire paillée avec un accès à l’herbe afin de favoriser l’expression des comportements naturels, l’exercice physique et de limiter l’ennui ainsi que le stress. Le poids des animaux sera régulièrement mesuré afin d’adapter l’alimentation en cas d’amaigrissement ou de prise de poids trop importante, pouvant être délétère à la reproduction. Les animaux sont régulièrement en interaction avec les animaliers et les expérimentateurs, qui observent attentivement leur comportement. Les animaliers ont été spécifiquement formés à la manipulation éthologique des animaux, via la méthode du clicker training. En amont des expérimentations, les juments et les ânesses seront entraînées à venir dans les barres d’échographie qui permettent le maintien de l’animal dans une position stable et l’optimisation des examens en termes de qualité et de rapidité. Chaque acte technique (échographie, insémination, lavage intra-utérin, prise de sang) sera suivi d'une récompense alimentaire. Les interventions seront réalisées par du personnel expérimenté, selon des protocoles précis et rigoureusement définis. En amont des prises de sang, la zone sera désensibilisée par l’utilisation d’une bombe d’air froid. Aucune sédation n’est envisagée pour cette procédure. Néanmoins, tout individu présentant des signes de stress ou d’inconfort sera retiré du protocole. Si des signes de phlébite apparaissent dans les 12 à 24 heures après la prise de sang (chaleur, douleur à la palpation, œdème, raideur de l’encolure), l’animal sera immédiatement pris en charge. L'application d’une crème à base d'antibiotiques et d'anti-inflammatoires non stéroïdiens sera appliquée. Des pommades à base d'héparine seront également utilisées selon les recommandations et l’ordonnance faite par le vétérinaire sanitaire.

Choix des espèces

Le projet porte sur la sauvegarde de l’âne Grand Noir du Berry et le cheval est utilisé comme espèce de référence pour les expérimentations. 20 femelles adultes et cycliques (10 ânesses et 10 juments > 3 ans). Les inséminations artificielles seront effectuées 24 heures après injection d'un inducteur de l’ovulation (5 inséminations/an et 4 lavages/an). Seul du sperme d'âne sera utilisé sur les ânesses et les juments. Les prélèvements sanguins seront réalisés aux jours -1 et -2 (période pré-ovulatoire), au jour 0 (ovulation), ainsi qu'aux jours 5, 10, 14 et 18 post-ovulation (1 cycle/an).

Exposées in utero aux polluants, puis allaitées par des mères elles-mêmes exposées, certaines souris respirent ensuite la fumée de cigarette deux heures par jour pendant trois mois avant d'être tuées à six mois. 1 464 souris vont être utilisées au total, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. Elles subissent aussi un prélèvement de queue dans les dix jours suivant la naissance pour le génotypage, et pour une partie une chirurgie suivie de plusieurs heures d'imagerie pulmonaire sous anesthésie, sans réveil. Le porteur écrit que les souris peuvent apparaître prostrées pendant l'exposition quotidienne à la fumée mais retrouvent leur activité dès la sortie de l'enceinte, et qu'au-delà de cette prostration transitoire aucun signe de souffrance n'est attendu.

Objectifs

La présente demande d'autorisation de projet repose sur l'étude des conséquences respiratoires de l’exposition aux polluants aériens sur la maturation du système immunitaire pulmonaire précoce et les risques d’incidence de bronchopneumopathie chronique obstructive (BPCO) à plus long terme. L'une des premières prises de conscience des effets majeurs de la pollution atmosphérique sur la santé a eu lieu lors d'un épisode survenu à Londres pendant l'hiver 1952 : durant 4 jours, un épais brouillard s'est abattu sur la ville, et 4000 décès supplémentaires (par rapport à la même période les années précédentes) ont été enregistrés, plus de la moitié étant pour causes respiratoires. La pollution atmosphérique est maintenant reconnue comme étant la principale cause environnementale de maladies et de décès prématurés dans le monde selon l’organisation mondiale de la santé. L'hypothèse est ici que l’exposition aux polluants au cours de différentes phases de la vie (périnatale / adolescence / adulte) impacte durablement le système immunitaire pulmonaire générant une sensibilité accrue aux risques de développer une pathologie respiratoire à long terme comme la BPCO dont la cause principale est le tabagisme. Ainsi l'étude a pour objectif d'évaluer les effets de la pollution dans l’induction des maladies respiratoires chez l’animal au-delà de la BPCO. Le projet vise à répondre aux questions suivantes : 1/ Quel est l’impact de l’exposition aux polluants atmosphériques sur le compartiment immunitaire dans les poumons à court et long terme ; 2/ Quelles sont les populations immunitaires qui ont un rôle dans le développement des troubles respiratoires à plus long terme.

Bénéfices attendus

Nous nous intéressons à étudier le lien entre l’impact de l’exposition aux polluants sur la maturation et l’activation du système immunitaire pulmonaire et le risque d’incidence de pathologies chroniques respiratoires en particulier la broncho-pneumopathie chronique obstructive (BPCO). Cette pathologie correspond à une atteinte progressive et irréversible de la fonction respiratoire, présentent une variabilité très importante chez les patients atteints, et dont les déterminants notamment précoces restent largement méconnus à l'heure actuelle, alors même que cette variabilité impacte grandement la qualité de la prise en charge thérapeutique des patients atteints. Bien que l'exposition tabagique soit le principal facteur de risque, il apparait que l’historique de l’exposition aux polluants représente aussi un facteur déterminant du risque de développer des maladies à plus long terme. Ce projet a pour objectif principal d'identifier les effets des polluants atmosphériques sur le système immunitaire, garant de l'intégrité tissulaire et du bon fonctionnement du système respiratoire. Ce domaine fait partie d'une problématique de santé publique très actuelle au-delà des effets du tabagisme et pour laquelle encore trop peu d'études sont mises en place. Ces études ont pour vocation de permettre une meilleure prise en charge thérapeutique des patients en ciblant la régulation du système immunitaire, et ainsi une amélioration certaine de leur qualité de vie.

Procédures

Prélèvement tissulaire (extremité de la queue) dans les 10 jours suivant leur naissance ou de sang en sous mandibulaire au sevrage après 1 mois d'âge, pour le génotypage procédure de 1 minute.- Exposition aux polluants atmosphériques pendant 7 jours directement dans leur cage d'origine.-Exposition quotidienne aux fumées de cigarette à raison de (2h/jour) pendant 3 mois à la fumée de cigarettes à l'aide d'une machine permettant là encore d'exposer les animaux sans les sortir de leur cage.-Injection retroorbitale sous anésthésie 1 minute par animal sans réveil-Procédure chirurgicale pour imagerie intravitale: 4h par animal : chirurgie 30 min et imagerie entre 2h et 3h30 (anesthésie générale max 4h).

Impact sur les animaux

Les prélèvements tissulaires pour génotypage engendrent des douleurs de courte durée et un stress chez l’animal. Les expositions aux polluants peuvent engendrer un stress chez l’animal de par le changement d'environnement, cependant aucun signe particulier n’a été observé lors des différentes campagnes d'exposition déjà réalisées au laboratoire. Pour l’exposition à la fumée de cigarettes, certaines souris peuvent apparaitre prostrées pendant la durée de l'exposition quotidienne, mais récupèrent leurs activités normales dès la sortie de l'enceinte d'exposition. Au-delà de la possible prostration transitoire, aucun signe de souffrance n’est attendu par ces approches. L’imagerie pulmonaire se fait sous anesthésie complète sans réveil de l’animal. D’expérience, le moindre signe de souffrance de l’animal sous anesthésie sera immédiatement détecté lors de la chirurgie (trouble respiratoire, sursaut musculaire, mobilité moustache) et pendant l'imagerie grâce au suivi continu de l'acquisition des images extrêmement sensible au moindre mouvement de l’animal (témoin de la moindre sensation de douleur). Au moindre cas, une adaptation du dosage en anesthésie sera réalisée en première intention, et sans amélioration dans les 5 minutes, une mise à mort anticipée sera pratiquée. Ainsi pour toutes ces procédures tous les gestes invasifs sont pratiqués sous anesthésie.

Devenir

La totalité des animaux seront mis à mort à la fin des procédures. L'ensemble de l'étude repose sur le prélèvement d'organe ne permettant pas le maintien en vie des animaux ou des approches d'imagerie trop invasives pour permettre un rétablissement sans souffrance de l'animal.

Remplacement

La question de l'impact des expositions aux polluants atmosphériques sur les risques de développer des pathologies pulmonaires a plus long terme rend les modèles animaux incontournables. La réponse in vivo du système immunitaire est au coeur de nos questions. Néanmoins nous utilisons des approches in vitro d'exposition aux polluants sur lignées de cellule qui permettent de cibler les facteurs polluants les plus importants et ainsi réduire les combinaisons à tester in vivo. La modélisation des atmosphères polluants repose aussi sur des analyses épidémiologiques. Nous développons aussi des approches par organoïdes pour ces questions.

Réduction

Le modèle animal généré nous permet d’utiliser les mêmes animaux pour plusieurs approches analytiques. Le regroupement dans le même animal de plusieurs transgènes est un outil majeur pour identifier les différentes populations de cellules en même temps et ainsi réduire le nombre d’animaux. Nous limiterons ainsi le projet aux seules expériences indispensables, tout en tenant compte des contraintes liées à l'utilisation de l'enceinte d'exposition. En effet, un seul type d'atmosphère ne peut être généré en même temps, ce qui implique la répétition des groupes "Air non pollué-référence" pour chaque lot expérimental. Au-delà de l’analyse des poumons nous étendrons notre analyse sur plusieurs autres organes pour anticiper les questions futures. Nous basons notre échantillonnage par groupe sur la variabilité possible des réponses et les besoins rigoureux de reproductibilité afin d’atteindre les différences statistiques minimales. En études longitudinales les tests statitistiques seront réalisés pour comparer dans le temps et entre les groupes et pour des comparaisons deux à deux. Enfin mâles et femelles sont utilisés indépendamment. Bien que l'uniformisation du sexe puisse améliorer l'homogénéité des lots, l'utilisation des deux sexes permet de réduire la génération d'animaux qui ne seraient jamais utilisés et en particulier dans le cas des expositions in utero. Le projet prévoit le recours à un nombre d'animaux aussi limité que possible : 1464 souris au total seront réalisées sur 5 ans

Raffinement

Les animaux sont hébergés avec température et hygrométrie contrôlée, cycle jour/nuit 12/12, avec au maximum 5 animaux par cages. Chaque cage contient plusieurs types d'enrichissements : du papier kraft, des carrés de coton et une maison en cellulose pour le confort des animaux leur permettant d’exprimer leurs besoins naturels de nidification. La surveillance quotidienne du bien-être animal est prise en charge par un personnel dédié au soin et à l’expérimentation. L’exposition aux polluants est une procédure légère sans aucun geste technique réalisé, au-delà du stress possible causé par les changements transitoires des conditions d’hébergement Néanmoins la surveillance des animaux dans ces différents contextes est maintenue et tout animal blessé ou montrant des situations d'inconfort sera mis à mort si aucun traitement n’est envisageable. Pour l’imagerie intravitale, les animaux bénéficient d'une anesthésie gazeuse et sont mis à mort avant le réveil ne nécessitant pas de soin post opératoire. Dans tous les cas la mise à mort se fera faite sous anésthésie.

Choix des espèces

La physiologie pulmonaire de la souris est suffissement proche de celle de l'homme et nous disposons de modèles transgéniques uniques pour cette étude. Les modèles d'exposition aux polluants sont validés pour ce modèle avec des données utiles déjà générées. L'exposition adulte aux polluants sera en partie réalisée sur des souris de 3 à 6 mois d’âge L'exposition in utero sera faite sur souris gestante L'exposition juvénile sera faite sur souris allaitantes et souriceaux entre 0 et 7 jours- Dans certains cas, les souriceaux seront utilisés à J14, J21 et J60 pour étudier les différents stades du développement pulmonaire. Dans d'autres cas, les souriceaux seront exposés à partir de 3 mois d’âge aux fumées de cigarette pendant 3 mois et mis à mort à 6 mois pour étudier les prémisses de la BPCO.

Deux chirurgies du crâne d'une heure chacune, une lésion du cortex moteur puis la pose d'un implant, attendent 90 rats, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils passent ensuite trois IRM sous anesthésie et des épreuves motrices, avant d'être tués pour analyser leur tissu cérébral. Le porteur décrit une douleur aiguë liée à l'incision du cuir chevelu et à la trépanation, des risques de saignements intracrâniens, d'œdème cérébral et de crises d'épilepsie soudaines, ainsi qu'un inconfort prolongé pendant la cicatrisation. Il annonce des tests évaluant l'amplitude des mouvements, la force et la sensibilité des membres antérieurs sans préciser lesquels, et compte parmi les bénéfices du projet la réduction du nombre d'animaux que permet le suivi d'un même individu dans le temps.

Objectifs

L’objectif scientifique de ce projet est de développer une stratégie thérapeutique innovante visant à favoriser la régénération des voies nerveuses motrices après une lésion du cortex moteur. Les effets de cette approche seront évalués à la fois sur le plan tissulaire, par imagerie IRM et analyses histologiques, et sur le plan fonctionnel, au moyen de tests moteurs spécifiquement adaptés. Ce projet se déroule dans 2 établissements utilisateurs (EU). L’AJOUT D’UNE PROCÉDURE VISANT À PERMETTRE UNE POSSIBLE RÉDUCTION DU NOMBRE TOTAL D’ANIMAUX UTILISÉS AINSI QU’UNE OPTIMISATION DES CONDITIONS EXPÉRIMENTALES NÉCESSITE UNE MODIFICATION DU PROJET INITIAL AUTORISÉ AVEC AJOUT DE 6 ANIMAUX.

Bénéfices attendus

Ce projet vise à démontrer l’intégration d’un nouveau biomatériau dans le tissu cérébral et à évaluer son potentiel à favoriser la récupération structurelle et fonctionnelle de la composante motrice. Les principaux bénéfices attendus sont : - Restauration tissulaire ciblée : le biomatériau pourrait stabiliser la matrice extracellulaire et soutenir la reconstruction des circuits corticospinaux. - Amélioration fonctionnelle : en favorisant la régénération neuronale et la réorganisation synaptique, il pourrait améliorer la mobilité et la coordination motrice. - Réduction des interventions multiples : un implant efficace limite le recours à des traitements répétitifs ou invasifs, réduisant le stress et la souffrance des animaux. - Avancée méthodologique : le suivi longitudinal par IRM et tests comportementaux permet d’observer l’évolution de la récupération chez le même animal, augmentant la robustesse des données et réduisant le nombre d’animaux nécessaires.- - Impact translational potentiel : les résultats pourraient guider le développement futur de thérapies régénératives pour les AVC ou traumatismes cérébraux, combinant implants biomimétiques, facteurs de croissance et thérapie cellulaire. En résumé, le projet allie compréhension fondamentale de la régénération cérébrale et perspective thérapeutique.

Procédures

Tous les animaux seront soumis à 2 chriurgies sous anesthésie (réalisation de lésion (durée 1h) puis pose de l'implant (durée 1h)) au niveau cérébral (EU 1/2). Une IRM cérébrale sous anesthésie (durée 1h) sera réalisée 3 fois aprés la lésion (EU 2/2). La mise à mort sera réalisée pour la récupération des tissus cérébraux (EU 1/2).

Impact sur les animaux

Nuisances liées à la chirurgie: La procédure chirurgicale elle-même constitue une source importante de gêne pour l’animal. Elle peut provoquer une douleur aiguë immédiate liée à l’incision du cuir chevelu, à la trépanation et à la manipulation du tissu cérébral. Malgré l’utilisation d’anesthésie générale et d’analgésiques adaptés, un risque résiduel d’inconfort ou de douleur persiste, notamment lors de la phase de réveil. La chirurgie comporte également des risques de complications, tels que : - Saignements intracrâniens - Infections post-opératoires - Réactions inflammatoires locales - Œdèmes cérébraux pouvant altérer le bien-être de l’animal et interférer avec la récupération attendue Conséquences post-opératoires et facteurs additionnels de stress Après l’intervention, les animaux peuvent présenter un inconfort prolongé lié à la cicatrisation et à l’adaptation physiologique post-lésion. Cela peut se traduire par : - Altération de la motricité - Diminution de l’appétit - Modification du comportement exploratoire - Apparition de crises d’épilepsie soudaines Les premiers tests comportementaux réalisés après récupération peuvent également induire un stress psychologique, en raison de la nouveauté des situations expérimentales et de la contrainte de manipulation.

Devenir

La procédure se termine par la mise à mort des animaux afin de pouvoir étudier leurs tissus cérébraux. Cette étape est nécessaire pour observer directement comment le biomatériau s’intègre dans le cerveau, et pour mesurer la reconstruction des zones touchées et la récupération des cellules et des circuits moteurs. Les informations obtenues permettent également de mettre en relation les changements observés dans le cerveau avec les performances motrices mesurées chez l’animal, donnant ainsi une vision complète de l’efficacité du traitement.

Remplacement

L’accident vasculaire cérébral (AVC) est une maladie grave causée par l’obstruction ou la rupture d’un vaisseau sanguin dans le cerveau, entraînant des séquelles neurologiques. Malgré les progrès de la recherche en laboratoire, les modèles actuels ne permettent pas encore de reproduire la complexité du cerveau humain, en particulier sa vascularisation et les réactions biologiques qui suivent un AVC. Pour mieux comprendre ces phénomènes et tester de nouvelles thérapies, il est donc nécessaire d’utiliser un modèle animal. Ce projet vise à évaluer une stratégie innovante basée sur l’implantation de biomatériaux dans la zone lésée du cerveau, afin de favoriser la régénération. Les effets seront suivis à la fois par des tests fonctionnels (motricité, force, comportement) et par imagerie cérébrale (IRM). Après avoir obtenu des résultats encourageants avec d’autres biomatériaux chez le rat, nous allons maintenant tester un nouveau biomatériau biodégradable, plus proche des conditions physiologiques humaines et offrant un meilleur potentiel régénératif.

Réduction

L’utilisation de méthodes non invasives comme l’IRM et les évaluations motrices permet de suivre les mêmes animaux dans le temps, ce qui limite le nombre d’animaux nécessaires. Nous prévoyons d’utiliser 84 animaux adultes, mâles et femelles, sur une période de 5 ans, et nous réutiliserons, lorsque possible, les données d’animaux témoins provenant de protocoles antérieurs. Les animaux seront répartis en différentes catégories : animaux non lésés, animaux ayant subi une chirurgie factice (sham lésion), animaux avec implantation factice (sham-implant), et hémisphères sains des animaux lésés. Le suivi longitudinal de chaque animal permettra d’évaluer la récupération motrice ainsi que les changements observés à l’IRM et en histologie, tout en respectant le principe de réduction du nombre d’animaux utilisés.

Raffinement

Le principe fondamental des 5 libertés est strictement respecté tout au long de l’étude. Les rats sont hébergés dans des cages ventilées, par groupes de deux individus (espèce grégaire), dans une salle dédiée exclusivement à cette espèce. L’alimentation est disponible ad libitum, y compris pendant les phases d'entraînement et d’évaluation motrice, sans jeûne ni restriction alimentaire. Le suivi de l’état de santé général est assuré par les expérimentateurs et le personnel de zootechnie : les animaux sont pesés chaque semaine et bénéficient de contrôles vétérinaires réguliers. Une attention renforcée est portée aux animaux opérés, qui font l’objet d’une surveillance quotidienne par du personnel formé. Cette surveillance comprend l’observation de l’appétit, du poids, de la mobilité, de l’état du pelage, du comportement général, et s’appuie sur un score clinique. Ce score guide les décisions à prendre : mise en place d’un traitement visant à diminuer la douleur, renforcement du suivi, retrait de l’étude ou mise à mort si nécessaire. La prise en charge de la douleur repose sur des protocoles stricts et validés, en cohérence avec les principes de nociception et leur impact potentiel sur le bien-être animal et la qualité scientifique des données (cf. paragraphe sur les chirurgies). Un enrichissement environnemental est systématiquement mis en place, incluant des éléments cognitivement stimulants (tunnels, boules de fouille, boules traversantes, odeurs naturelles variées…) ainsi qu’une stimulation sociale via une arène de rencontre intercage. les animaux sont conditionnés de manière progressive aux tâches motrices, à l’aide de renforcements positifs. Cette procédure est conçue pour être peu anxiogène et respectueuse du bien-être animal. Le transport des animaux de l’EU 1/2 à l’EU 2/2 (trajet routier de 10 km) est également encadré avec attention. Les cages sont sécurisées pour le transport, les biberons sont retirés afin d’éviter l’humidification de la litière, les animaux ont accès à des croquettes et à une coupelle de nourriture molle, les couvercles sont scotchés pour prévenir toute ouverture accidentelle, les cages sont placées dans des sacs isothermes afin de limiter les variations thermiques, les chocs et les nuisances sonores.

Choix des espèces

Le rat constitue un modèle privilégié pour l’étude de la récupération fonctionnelle de la motricité du membre supérieur après lésion cérébrale et implantation de biomatériaux. En effet, la mobilité et la force du membre antérieur représentent des fonctions motrices essentielles, dont la récupération est déterminante pour l’autonomie des patients cérébrolésés dans les activités de la vie quotidienne. De plus, des tests comportementaux validés et adaptés chez le rat permettent d’évaluer l’amplitude des mouvements, la force musculaire ainsi que la sensibilité des membres supérieurs. Enfin, le suivi longitudinal de la progression tissulaire est réalisé grâce à des examens d’imagerie (IRM) non invasifs, indolores et pratiqués sous anesthésie, garantissant le bien-être de l’animal. Pour l'IRM, la taille du cerveau de rat est privilégiée par rapport à la souris. Les expériences sont conduites sur des animaux adultes âgés d’environ 3 mois, ce qui correspond à l’âge adulte chez l’homme et se rapproche de la tranche d’âge à laquelle surviennent majoritairement les AVC ischémiques.

Jusqu'à vingt et une injections par animal, une pompe osmotique posée sous la peau par incision et une séance d'imagerie intravitale : 2 058 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. Ces souris sont modifiées pour accueillir des cellules souches humaines, ce qui les rend sévèrement immunodéficientes et vulnérables aux infections, et elles reçoivent un traitement chimiothérapeutique avant la greffe. Le porteur signale une douleur pouvant durer plusieurs jours après la pose de la pompe, et des abcès possibles aux points d'injection répétée. Le projet vise des vecteurs injectables directement dans le sang, pour épargner aux patients la manipulation de leurs cellules hors du corps et une chimiothérapie dont le porteur écrit que les conséquences sont "lourdes pour l'organisme".

Objectifs

La β-thalassémie et la drépanocytose sont les maladies héréditaires génétiques les plus fréquentes au monde. Elles sont dues à des mutations génétiques causant de nombreux symptômes ainsi qu’une réduction de l’espérance de vie (40 ans). Des thérapies géniques sont développées depuis des années afin de guérir ces maladies. Cependant, ces traitements nécessitent la manipulation des cellules souches hors du corps de chaque patient avant leur transplantation. Ce genre de manipulation est complexe et présente plusieurs limitations techniques. De plus, les traitements actuels nécessitent que les patients subissent une chimiothérapie dont les conséquences sont lourdes pour l’organisme. Nous proposons dans ce projet de contourner toutes ces limitations et d’améliorer l'efficacité de ces thérapies en testant une nouvelle génération de vecteurs thérapeutiques ciblant directement les cellules souches à l’intérieur du corps du patient.

Bénéfices attendus

Les résultats de ce projet apporteront une preuve de concept de l’application de nos stratégies de modification du génome par administration directe dans la circulation sanguine. Ces nouveaux traitements permettront d’augmenter l’efficacité des thérapies actuelles et de réduire à la fois leur coût et la souffrance des patients.

Procédures

Anesthésie gazeuse (2X), 30s à 15min. Anesthésie profonde (1X), 1min. MODIFICATION Injections (21X maximum), 30s par intervention. Injection en intraveineuse (1X), 1 min par intervention. Prélèvements sanguins sous anesthésie gazeuse (2X) et sous anesthésie profonde (1X), 2 min par intervention. Injection en sous-cutanée (7X), 10s par intervention. Imagerie intravitale (1X), 10min par intervention. Pose de pompe osmotique (X1) : incision, 15min par intervention.

Impact sur les animaux

Les altérations génétiques des animaux utilisés dans ce projet provoquent une immunodéficience sévère qui les rend vulnérables aux infections microbiennes. Le traitement myéloablatif léger appliqué aux souris peut provoquer une douleur transitoire durant les heures qui suivent l’injection intrapéritonéale. L’anesthésie gazeuse ou par injection intrapéritonéale peut provoquer une baisse de la température corporelle et un assèchement des yeux. L’administration par injection sous-cutanée ou intrapéritonéale peut provoquer une douleur légère et un stress. La pose de pompe osmotique par chirurgie sous-cutanée peut provoquer une douleur légère durant plusieurs jours après l’opération. L’injection de cellules souches en intraveineuse et sous anesthésie peut provoquer un stress transitoire. L’imagerie intravitale peut provoquer chez les animaux un stress et une baisse de la température corporelle liée à l’anesthésie gazeuse prolongée nécessaire à sa mise en œuvre. Les prélèvements de sangs réalisés sous anesthésie gazeuse peuvent provoquer une douleur. MODIFICATION : Les injection répétées de médicament sur 21 jours peuvent provoquer une irritation légère ou un abcès au niveau des sites d’injection.

Devenir

Tous les animaux inclus dans ce projet seront mis à mort à la fin de cette procédure car nous avons besoin de prélever leurs organes afin de réaliser plusieurs analyses moléculaires et biochimiques.

Remplacement

Le développement des vecteurs de ce projet a été réalisé en laboratoire, sans l’usage d’animaux, dans les conditions qui se rapprochent des celles observées dans le corps humain. La nature de ce projet, qui se focalise sur la capacité de ces nouveaux vecteurs à fonctionner dans la circulation sanguine, nous oblige naturellement à nous tourner vers un modèle animal proche de l’homme.

Réduction

La lignée de souris utilisée dans ce projet a été choisie dans le but de réduire le nombre d’animaux nécessaires à l’obtention de résultats significatifs. Pour le traitement statistique de nos données, nous aurons recours à plusieurs tests statistiques destinés à réduire les lots du projet de manière optimale. Par ailleurs, nos élevages de souris seront synchronisés en amont de chaque expérience de manière à utiliser au maximum les animaux de chaque portée.

Raffinement

La lignée de souris utilisée dans ce projet a été choisie dans le but de raffiner nos protocoles en diminuant la souffrance engendrée par le conditionnement chimiothérapeutique. Chaque procédure douloureuse sera précédée d’une anesthésie gazeuse ou une anesthésie par injection. Lors des prélèvements de sang, un anesthésique local sera appliqué à l’œil afin de diminuer la douleur qui suit la manipulation. Les animaux seront pesés au cours du conditionnement afin de surveiller toute perte de poids anormale. Une surveillance quotidienne sera réalisée par le personnel compétent de l’animalerie ainsi qu’une surveillance hebdomadaire par les responsables du projet. Les animaux seront hébergés sur portoir ventilé, avec un accès à la nourriture et à la boisson ad libitum. Chaque cage bénéficie d’un enrichissement matérialisé par un tunnel translucide rouge destiné à diminuer le stress et stimuler l’activité, des carrés de cellulose afin de favoriser la nidification et un bâtonnet en bois pour répondre aux besoins naturels des rongeurs. Enfin, la souffrance des animaux sera surveillée régulièrement et la décision de leur mise à mort encadrée par une grille de score spécifique.

Choix des espèces

Les seuls modèles animaux aujourd'hui disponibles pour l'étude des cellules souches humaines ont été développés chez la souris. Cette espèce est facile à élever en animalerie et présente une homogénéité génotypique importante. Les membres de notre laboratoire disposent d'une expertise sur cette espèce, ce qui facilite la réalisation d'un tel projet. Les animaux subiront une greffe de cellules souches à l'âge de 5 à 7 semaines car il s'agit de l'âge optimal pour obtenir les meilleures chances de succès de greffe de cellules souches humaines.

Pour un travail pratique destiné à des étudiants de master, 108 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une partie reçoit une injection de streptozotocine trois semaines avant la séance pour être rendue diabétique, d'autres sont des rats génétiquement diabétiques, et tous subissent le jour du travail pratique une injection de glucose, six prélèvements de sang par incision de la queue et deux à deux heures trente de manipulations, avant d'être tués. Le porteur affirme qu'aucune alternative non animale ne permet d'atteindre les "objectifs pédagogiques fixés" et que l'utilisation de rats est "indispensable" pour observer la régulation glycémique. Sur le choix de l'espèce, il s'en tient à une phrase sur les similitudes de physiologie entre le rat et l'humain.

Objectifs

Ce projet vise à caractériser un diabète expérimental chez le rat, en comparaison avec un animal sain, dans le cadre d’un TP pour des étudiants en Master 1. Il permet aux étudiants de comprendre les principes diagnostiques du diabète et d’analyser des données physiologiques in vivo. Les mesures ponctuelles (glycémie à jeun, tests dynamiques) donnent une valeur instantanée, tandis que les indicateurs intégratifs (hémoglobine glyquée) reflètent la glycémie sur plusieurs semaines. Leur combinaison offre une évaluation complète de la pathologie métabolique.

Bénéfices attendus

Ce projet pédagogique permet aux étudiants de mettre en pratique des compétences expérimentales en physiologie animale dans un cadre éthique et réglementé. Il favorise la compréhension des mécanismes physiopathologiques du diabète et l’interprétation de paramètres glycémiques et insulinémiques. La comparaison de deux modèles de diabète différents (STZ et GK) illustre l’hétérogénéité de la pathologie et développe l’esprit critique des étudiants. Enfin, il sensibilise les étudiants au bien-être animal, en mettant en œuvre une analgésie préventive, une anesthésie adaptée et une mise à mort contrôlée.

Procédures

Certains animaux subiront une injection intrapéritonéale de streptozotocine (STZ, 40 mg/kg) pour l’induction du diabète (réalisée 3 semaines avant le TP). Tous les animaux (témoins, rats rendus diabétiques par STZ et rats GK spontanément diabétiques) seront soumis à plusieurs interventions expérimentales : - Injection intrapéritonéale de glucose (1 g/kg) lors du test de tolérance au glucose ; - Prélèvements sanguins sous anesthésie : 6 échantillons de 100 µL par animal (plus une goutte pour glycémie à jeun) prélevés par incision caudale ; - Mise à mort contrôlée à la fin du TP. Toutes ces interventions sont réalisées sous analgésie et anesthésie, avec un suivi attentif de l’état physiologique des animaux. La durée totale des manipulations le jour du TP est d’environ 2 à 2,5 heures par animal, tandis que l’injection de STZ est ponctuelle et réalisée une seule fois, trois semaines avant le TP.

Impact sur les animaux

Les rats diabétiques, qu’ils soient issus du modèle chimique (STZ) ou du modèle spontané (GK), présentent une hyperglycémie chronique, qui peut entraîner des manifestations physiologiques telles que polyurie et légère perte de poids. Ces effets font partie de la pathologie étudiée et nécessitent une surveillance accrue et un entretien adapté des cages (changement deux fois par semaine pour maintenir l’hygiène). Chez les rats STZ, la procédure de suivi de la glycémie implique des prélèvements sanguins hebdomadaires et limités (10 µL) réalisés sur la queue, effectués de manière ponctuelle et rapide. Cette manipulation est considérée comme minimale et ne nécessite pas de prise en charge analgésique supplémentaire. L’ensemble des manipulations prévues durant le TP (analgésie, anesthésie, prélèvements sanguins, mis à mort contrôlée) est conçu pour limiter au maximum le stress et l’inconfort des animaux et garantir leur bien-être pendant toute la durée de l’expérience.

Devenir

A l'issue de la procédure 1, les rats sont maintenus en vie 3 semaines pour aller en procédure 2. A l'issue de la procédure 2, tous les animaux seront mis à mort.

Remplacement

Ce projet s’inscrit dans une approche expérimentale physiologique, et à ce stade, aucune alternative non animale ne permet d’atteindre les objectifs pédagogiques fixés. L’utilisation de rats est indispensable pour étudier l’impact du diabète sur la régulation glycémique et la réponse insulinique in vivo, ainsi que pour observer de manière intégrée les paramètres physiopathologiques associés à l’hyperglycémie. Les modèles diabétiques choisis, rats STZ pour le diabète induit par STZ et rats Goto-Kakizaki (GK) pour le diabète spontané, constituent des modèles bien établis et largement validés dans la littérature scientifique. Ils présentent des caractéristiques physiologiques et métaboliques proches de celles observées chez l’homme, ce qui permet aux étudiants de comprendre et d’analyser de manière réaliste les mécanismes du diabète.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés dans ce TP est limité au strict minimum nécessaire pour atteindre les objectifs pédagogiques. Chaque binôme de deux étudiants travaille sur deux rats, comprenant un rat sain et un rat diabétique. Pour le modèle diabétique, la moitié des binômes utilise un rat STZ et l’autre moitié un rat Goto-Kakizaki (GK). Le modèle STZ présente une variabilité individuelle dans l’intensité et l’installation de l’hyperglycémie, liée à la sensibilité variable des cellules β pancréatiques à la streptozotocine. Pour garantir que tous les binômes disposent d’un rat diabétique stable, un surplus de 10 % de rats STZ est prévu, soit 1 rat supplémentaire, portant le nombre total de rats STZ à 9 au lieu de 8. De plus, le nombre de rats STZ injectés pourra être légèrement augmenté si le nombre de rats GK disponibles pour la date du TP est insuffisant. En effet, en raison de l’état diabétique, le rat GK se reproduit moins efficacement que le rat Wistar sain, ce qui peut limiter la disponibilité des animaux diabétiques pour le TP. Cet ajustement permet de maintenir un nombre suffisant d’animaux diabétiques, tout en restant conforme à la règle de réduction. Le TP s’adresse à 32 étudiants, soit 16 binômes, nécessitant 32 rats au total. Les résultats obtenus par chaque binôme sont mutualisés et discutés au sein de la salle, optimisant l’exploitation des données et évitant l’utilisation d’animaux supplémentaires.

Raffinement

Tous les rats seront surveillés quotidiennement (aspect global, signes de stress ou de douleur). De même pour les paramètres environnementaux des pièces d'hébergement : la température, les horaires des cycles jours/nuits, les taux d'hydrométrie. Pour les rats Wistar le change de litière est fait une fois par semaine avec un enrichissement sous forme de cubes de papier pour qu'ils puissent faire un nid et un bout de bois à ronger. Le changement de l'eau des biberons est fait 2 fois par semaine. Pour les rats STZ et les rats GK diabétiques qui ont une augmentation du volume et de la fréquence des urines, le change des biberons sera fait 3 fois par semaine. Pour ces rats, le change des cages est fait 2 fois par semaine dans une litière ultra absorbante pour leur apporter un maximum de confort ; nous éviterons le nid qui une fois souillé par l'urine entraine des mauvaises odeurs et de l'humidité ; sera disposé dans la cage un bout de bois à ronger pour favoriser le bien-être et et l’expression de comportements naturels, propres aux rongeurs. Les prélèvements sanguins hebdomadaires réalisés sur la queue de l’animal, d’un volume de 10 µL, ne provoquent pas de douleur notable et ne nécessitent donc aucune prise en charge analgésique. Une fois par semaine nous évaluerons par grille de score adapté, l'apparence, le comportement, et l'hydratation des animaux. Seront mis à mort les rats ayant un score caractéristique de souffrances sévères (moins de 10% attendus).

Choix des espèces

Le choix du rat pour cette étude réside dans le fait que cette espèce présente de grandes similitudes dans sa physiologie et physiopathologie avec celles de l’humain.

Injectées dans le muscle de la patte avec une toxine, la notexine, pour forcer une régénération musculaire, ou avec un virus porteur d'un gène, 268 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles sont identifiées par tatouage aux phalanges et génotypées par prélèvement de queue, puis certaines passent cinq séances de mesure de composition corporelle et de test de force entre la quatrième et la douzième semaine. Le porteur indique que ces souris peuvent développer une faiblesse musculaire importante, et affirme que l'injection du virus ne provoque pas d'effets nuisibles notables, en s'appuyant sur ses propres résultats publiés. Toutes sont tuées pour disséquer leurs muscles, analyses présentées comme "indispensables" pour comprendre la myopathie myotubulaire, et le porteur qualifie le modèle murin d'"irremplaçable".

Objectifs

La myopathie myotubulaire est une maladie génétique néonatale très grave caractérisée par une hypotonie et une atrophie musculaire sévère. C’est une maladie incurable qui conduit au décès des patients par détresse respiratoire dès le plus jeune âge. Le gène responsable de cette maladie code la Myotubularine. C'est une enzyme qui régule une classe de lipides appelée phosphoinositides (PIs). Ce projet a pour objectif de caractériser et d’étudier deux modèles de souris qui reproduisent la dérégulation des lipides contrôlés par la Myotubulaine. Notre but est d’identifier les processus cellulaires ciblés par ces lipides dans le tissu musculaire et comment leur dérégulation impacterait l’apparition et la progression de la maladie. Dans ce contexte, des résultats de l’équipe montrent que l’accumulation les lipides régulés par la Myotubularine régulent le systéme de dégradation des protéines. D’autre part, nos expériences dans des modèles cellulaires dépourvus de la Myotubularine montrent que ces cellules manifestent des défauts de différentiation musculaire. Nous proposons ainsi d’étudier les impactes de la dérégulation des lipides régulés par la myotubularine MTM1 dans le modèle murin (in vivo) spécifiquement dans le muscle squelettique. MODIFICATION L’AJOUT DE LA PROCEDURE 4 NECESSITE UNE MODIFICATION DU PROJET INITIAL AUTORISE AVEC AJOUT DE 44 ANIMAUX.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de décortiquer dans un contexte intégré et physiologique les effets musculaires de la dérégulation des lipides régules par la Myotubularine et ainsi apportera une meilleure compréhension des mécanismes physiopathologiques mis en jeu dans la myopathie myotubulaire liée à l’X. Il permettrait ainsi de proposer de nouvelles pistes thérapeutiques pour cette maladie génétique incurable.

Procédures

Injection d'une toxine (Notexin) à faible dose qui induit la régénération du muscle et donc la formation de nouvelle fibres musculaires: Nombre 72, Durée = 3J ou bien 12J ou bien 24J Post injection (en intramusculaire). Injection d'un viris (l'Adeno-associated virus) pour permettre l’acheminement de gène (non oncogène) dans un tissu afin d'étudier en détail la fonction de ce gène d’intérêt : Nombre 48, Durée 5 semaines post injection (en intramusculaire). Tous les animaux utilisés dans ce projet sont identifiés par un tatouage aux phalanges et sont génotypés suite à un prélèvement de queue inférieur à 0,5mm par le service de l’animalerie habilités pour ce geste. MODIFICATION : 5 FOIS (SEMAINES 4-6-8-10-12), SUR ANIMAL VIGILE: -MESURE DE COMPOSITION CORPORELLE : CONTENTION DANS L’APPAREIL DE MESURE DE LA COMPOSITION CORPORELLE, 2 MINUTES -TEST DE FORCE:5 X 1 SECONDE, AVEC AU MOINS 1 MINUTE DE REPOS ENTRE 2 ESSAIS

Impact sur les animaux

Les souris concernées dans cette étude peuvent développer une faiblesse musculaire importante. Chez l’homme la pathologie liée à la perte de fonction des gènes étudiées dans ce projet induit une myopathie rare et sévère avec qui entraine le décès chez les nouveau-nés ou à l’enfance. De ce fait on suspecte que les protéines étudiées sont nécessaires au développement du muscle qui démarre pendant la vie fœtale. Afin d’étudier ce process et de s'affranchir de l’analyse des fœtus, on a choisi de reproduire la formation du muscle en injectant une toxine (Notexin) à faible dose qui induit la régénération du muscle et donc la formation de nouvelles fibres musculaires. Cette injection se fait d’une manière localisée (Tibialis de la souris) mais pourrait rarement provoquer une nuisance modérée (irritations et démangeaisons). La formation de nouvelles fibres musculaire dans le modèle murin se fait assez rapidement au bout d’une vingtaine de jours et le muscle retrouve sa fonction normale. De même, afin d'approfondir le lien entre nos gènes d’intérêt et la régénération musculaire, on propose d’utiliser un outil d’acheminement des gènes pour les exprimer dans un tissu : les Adénovirus associés. C’est une approche fréquemment employée dans le muscle et utilisée dans les thérapies géniques chez l’homme. L’injection de ces virus est localisée (Tibialis) et ne provoque pas d’effets nuisibles notables chez les souris (résultats antérieurs publiés par le porteur du projet). Enfin tous les animaux utilisés dans ce projet sont identifiés par un tatouage aux phalanges et sont génotypés suite à un prélèvement de queue inférieur à 0,5mm par le service de l’animalerie habilités pour ce geste. MODIFICATION : LA MESURE DE COMPOSITION CORPORELLE INDUIRA UN STRESS DU A LA CONTENTION DANS L’APPAREIL, QUI S’ARRETERA DONC DES LA FIN DE LA MESURE. LA MESURE DE FORCE POURRA INDUIRE UNE FATIGUE MUSCULAIRE LEGERE IMMEDIATEMENT A LA SUITE DU TEST.

Devenir

A l'issue des procédures 1, 2 et 3 (MODIFICATION: "ET PROCEDURE 4"), les animaux sont mis à mort et les muscles sont disséqués et analysés. Ces analyses sont indispensables pour comprendre comment l’altération des phosphoinositides impacte des processus importants de la proteostase musculaire dans le contexte de la myopathie myotubulaire.

Remplacement

En dépit de l’exitance de modèles cellulaires (cellules musculaires de souris dépourvus de l’expression de MTM1 et de Fbxw7) développés par le porteur du projet, ces modèles ne traduisent pas la physiopathologie de la maladie. En effet, cette myopathie apparait dès la naissance chez l’homme et s’aggrave progressivement en touchant spécifiquement le muscle (la fibre musculaire formée qui ne peut pas être reproduite en culture cellulaire). Cette particularité rend l’exploration des cellules musculaires en culture très limitante (restreint aux aspects moléculaires et cellulaire de la perte de l’expression de la protéine MTM1) pour étudier la physiologie de la maladie et envisager des solutions thérapeutiques. De même, il n’existe pas à ce jour des systèmes cellulaires plus intégré (type organoïde) pour étudier le muscle qui est un organe complexe soumis à l’innervation et la contraction. En ce qui concerne la régénération musculaire, c’est un processus complexe qui met en œuvre l’ensemble des cellules résidentes dans le muscle (fibres musculaires, cellules immunitaires, cellules de soutiens du stroma, cellules nerveuse…) et de ce fait impossible à reproduire dans un système in vitro/in cellulo ou ex vivo). Ainsi, le recours au modèle murin est irremplaçable pour le déroulement de ce projet.

Réduction

Le nombre d’animaux par groupe est 8 animaux pour les lignées sans intervention et 6 animaux pour les mêmes lignées avec intervention. Deux animaux en plus par groupe seront inclus afin d’anticiper des pertes. Ainsi le nombre de souris/groupe est réduit à son maximum en respectant les contraintes statistiques dans les publications scientifiques, sans compromettre les objectifs du projet et pour permettre des analyses statistiques fiables. Le nombre de souris utilisé est calculé de manière à donner des résultats statistiquement significatifs en tenant compte de la variabilité entre individus et entre groupe experimentaux.

Raffinement

L’effet de la réexpression de MTM1 et de Fbxw7 dans le muscle des deux modèles étudiés par l’outil AAV fera l’objet d’un suivi. Dans les deux cas, afin de restreindre la réexpression de MTM1 et Fbxw7 dans les cellules musculaires et minimiser au maximum des effets indésirables potentiels, les deux gènes seront sous contrôle d’un promoteur musculaire (expression restreinte au muscle squelettique). La procédure de suivi des animaux injectés par la Notexin ou des Adeno associated virus consistera à faire des observations quotidiennes. Tout effet indésirable peu importe son degré fera l'objet d'un suivie. Une observation des animaux en expérimentation est réalisée quotidiennement. L’état général de l’animal est évalué : prise de nourriture, toilette et mouvements habituels sont considérés comme des signes de bonne santé. La douleur est évaluée par les signes de prostration, de perte d’appétit ou de poids et de mouvements pénibles. Le poids qui traduit entre autres la masse musculaire (atteinte musculaire suite à la délétion des gènes d’intérêt) sera mesuré dès la naissance et tous les 3 jours. L’environnement des animaux est enrichi (bandes de papier Sizzle-Nest pour la nidification, cube de bois pour usure des dents, tunnel ou d'igloo). Pour les animaux qui développeront une faiblesse musculaire (myopathie), l'accès à la nourriture et à l'eau sera facilité en plaçant des croquettes humidifiées et de l'hydrogel dans la cage. Des points d'alertes et des points limites sont fixées par le responsable afin d'entreprendre l'action à appliquer pour réduire la souffrance animale.

Choix des espèces

Nous utilisons des souris parce que le modèle animal de la perte fonctionnelle de la Myotubularine reproduit les principales caractéristiques de la maladie humaine et permet ainsi de se rapprocher le plus de la physiopathologie de la maladie. Le modèle Fbxw7 n’est disponible que chez la souris. D’autre part, l’étude de la myogenèse in vivo après la régénération musculaire a été trés bien décrite chez la souris. C’est un processus conservé et de ce fait traduit ce qui se passe chez l’homme. Il n'existe pas de modèles alternatifs et accessibles pour induire et suivre la myogenèse au cours du temps. Les cultures primaires de cellules satellites isolées de souris de 2 semaines présentent l'avantage de reproduire la différenciation musculaire ex vivo et de complémenter les résultats acquis in vivo, permettant ainsi de réduire le nombre d'animaux nécessaires à l'étude. Les souris sans intervention seront utilisées entre 2 et 20 semaines selon le besoin (survie du phénotype). Un lot de souriceaux âgés de 2 semaines sera utilisé afin d’établir des cellules primaires et compléter l’étude in vivo après régénération (diminuer le nombre de souris). Cet âge est la meilleure fenêtre de prélèvement pour isoler les cellules souches du muscle (cellules satellites).

75 souris subissent chacune la totalité du protocole : perçage de l'oreille, douze pesées, deux passages en tube de contention, deux périodes de jeûne dont une de douze heures, une injection de sucre dans le ventre, un gavage d'huile, deux incisions de la queue et dix prélèvements de sang. Elles sont toutes tuées à l'issue, après une ponction cardiaque sous anesthésie, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. L'objet du projet est de comparer des croquettes formulées à l'huile de palme et à l'huile de colza gélifiée, pour fournir à l'industrie alimentaire des arguments sur de futures margarines et pâtes à tartiner. Le porteur écrit que le recours à l'expérimentation animale est "indispensable à ce stade", après une étude pilote qui avait déjà servi à sélectionner les croquettes.

Objectifs

Les matières grasses sont essentielles pour assurer la texture de nombreux aliments mous. Cette texture est généralement obtenue par l’utilisation d’huiles riches en acides gras saturés, comme l’huile de palme, reconnues pour augmenter le risque de maladies cardiovasculaires. Il est donc nécessaire d’identifier des alternatives plus favorables à la santé tout en conservant les propriétés technologiques des produits alimentaires. Les oléogels constituent une alternative innovante permettant de structurer une huile végétale liquide, ici l’huile de colza, dont le profil lipidique est favorable en raison de sa richesse en acides gras oméga-3. Cette structuration repose sur l’utilisation de petites molécules oléogélatrices dérivées d’acides aminés ou d’endocannabinoïdes (messagers chimiques fabriqués par le corps lui-même). La nature de ces molécules nous permet de faire l’hypothèse, d’après ce qui est décrit dans la littérature, qu’elles pourraient exercer des effets bénéfiques, notamment en régulant la prise alimentaire et contrôlant l’inflammation. L’objectif de ce projet est de comparer les effets métaboliques de différentes croquettes formulées : • soit avec de l’huile de palme, naturellement solide; • soit avec de l’huile de colza structurée sous forme d’oléogel à l’aide de deux oléogélateurs distincts (X et Y). Les analyses porteront sur des paramètres circulants et tissulaires impliqués dans la régulation de la prise alimentaire, le métabolisme lipidique et glucidique, ainsi que l’inflammation. L’oléogélateur X sera testé à deux concentrations (2 % et 4 %), ses propriétés technologiques variant selon la concentration. L’oléogélateur Y sera testé uniquement à 4 %, la concentration à 2 % ne résistant pas aux conditions thermiques de fabrication des croquettes. Le recours à l’expérimentation animale est indispensable à ce stade afin d’évaluer les effets physiologiques intégrés de ces nouvelles formulations. Une étude pilote préalable a confirmé la bonne consommation des croquettes et l’absence d’impact négatif sur le bien-être des souris.

Bénéfices attendus

À court terme, cette étude apportera des connaissances nouvelles sur les effets métaboliques des oléogels dans un modèle animal bien caractérisé. Elle permettra de mieux comprendre l’impact de la structuration d’huiles végétales sur la régulation de la prise alimentaire, le métabolisme lipidique et glucidique, ainsi que sur les réponses inflammatoires. Ces résultats constitueront une base scientifique solide pour évaluer la valeur nutritionnelle de ces oléogels. À long terme, ce projet contribuera au développement de formulations alimentaires plus favorables à la santé, en fournissant à l’industrie des éléments scientifiques pour remplacer les graisses saturées par des alternatives à base d’huiles végétales gélifiées. Ces innovations pourraient améliorer le profil nutritionnel de produits de consommation courante (margarines, pâtes à tartiner, produits de boulangerie), favoriser un meilleur apport en acides gras essentiels, notamment les oméga-3, et ainsi contribuer à la réduction du risque de maladies métaboliques et cardiovasculaires dans la population.

Procédures

Les 75 animaux subiront un petit perçage de l’oreille permettant leur identification (moins de 30 secondes avec contention). Les 75 animaux seront pesés une fois par semaine pendant 12 semaines, soit 12 pesées par animal (chaque pesée dure moins de 30 secondes). Parmi eux, 60 animaux recevront pendant 12 semaines une alimentation spécifique, constituée de croquettes enrichies en huiles végétales, associées ou non à des oléogélateurs. Les 75 animaux seront placés à deux reprises dans un tube cylindrique afin d’être introduits dans un appareil permettant la mesure de la composition corporelle (répartition de la masse grasse et de la masse musculaire). Chaque mesure dure moins de 2 minutes, et les deux séances seront espacées de 11 semaines. Les 75 animaux subiront deux périodes de jeûne nécessaires à la réalisation des tests métaboliques : – une période de jeûne de 6 heures (entre 7 h 30 et 13 h 30) ; – une période de jeûne nocturne (entre 20 h et 8 h). Ces deux périodes de jeûne seront espacées d’au moins une semaine. Les 75 animaux recevront une injection dans le ventre d’une solution de sucre afin de mesurer la tolérance au glucose (contention et injection : moins de 30 secondes). Les 75 animaux subiront un gavage d’un bolus d’huile afin d’évaluer le métabolisme des graisses (contention et gavage : moins de 30 secondes). Les 75 animaux subiront deux petites incisions à l’extrémité de la queue (moins de 1 mm) afin de permettre les prélèvements sanguins au cours des tests métaboliques (une incision par test, sans contention, durée inférieure à 30 secondes, avec un intervalle d’au moins une semaine entre les deux tests). Dans le cadre du test de tolérance au sucre, les 75 animaux subiront six prélèvements d’une goutte de sang à l’extrémité de la queue (moins de 30 secondes par prélèvement, sans contention). Dans le cadre du test de tolérance aux graisses, les 75 animaux subiront quatre prélèvements sanguins réalisés selon les mêmes modalités. En fin de protocole, les 75 animaux recevront une injection d’un mélange d’anesthésiques, permettant le prélèvement de sang au niveau du cœur, suivi de la mise à mort (contention et injection : moins de 30 secondes).

Impact sur les animaux

L’identification des animaux par poinçonnement de l’oreille peut entraîner une légère douleur transitoire, sans conséquence durable. La pesée hebdomadaire constitue une source de stress léger et temporaire. La consommation de croquettes riches en lipides va induire une prise de poids modérée, sans altération de la mobilité ou du comportement. Lors des mesures de composition corporelle, les souris seront placées brièvement (moins de 2 minutes) dans un tube cylindrique, ce qui peut générer un léger stress. Les tests métaboliques (tolérance au sucre et tolérance aux lipides) peuvent également provoquer un stress ponctuel : • les périodes de jeûne (6 heures pour le test du sucre et 12 heures pour le test des lipides) sont susceptibles d’engendrer un inconfort modéré • l’injection de sucre et le gavage d’huile sont associés à une douleur ou un stress transitoire • les prélèvements sanguins se font à partir d’une petite incision (< 1 mm) à l’extrémité de la queue, provoquant une légère douleur momentanée. Au total, six prélèvements de sang seront réalisés pendant le test de tolérance au sucre (une goutte à chaque fois) et quatre prélèvements pendant le test de tolérance aux lipides, sans contention, induisant un stress temporaire. • le placement en cage individuelle pendant les 2 heures suivant l’injection de sucre peut également être une source de stress. En fin de protocole, les animaux seront anesthésiés par injection dans le ventre avant le prélèvement sanguin intracardiaque. Cette étape entraîne une brève douleur et un stress transitoire.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à l’issue de la procédure afin de collecter les tissus d’intérêt et de procéder aux analyses permettant de répondre à l’objectif du projet.

Remplacement

À ce stade, une étude chez l’Homme n’est pas possible, car les oléogélateurs X et Y n’ont pas encore reçu d’autorisation de mise sur le marché. L’objectif de ce projet est d’étudier les effets de la consommation d’huiles de colza rendues solides sur le fonctionnement du métabolisme, en particulier sur la prise alimentaire, la gestion des graisses et des sucres par l’organisme, ainsi que sur les phénomènes inflammatoires. Ces effets résultent de l’action conjointe de plusieurs organes (intestin, foie, tissu adipeux, muscle et cerveau). Ils ne peuvent pas être étudiés de manière satisfaisante à l’aide de cultures de cellules isolées ni de modèles informatiques. Le recours à un modèle animal complet est donc nécessaire pour évaluer l’effet global de ces formulations alimentaires sur l’organisme.

Réduction

La taille des groupes a été déterminée à l’aide d’un calcul permettant de définir le nombre minimal d’animaux nécessaire pour obtenir des résultats fiables. Ce calcul a conduit à un effectif de 15 souris par groupe. Ce nombre correspond au minimum requis pour obtenir des résultats solides et interprétables, tout en limitant strictement le nombre d’animaux utilisés, conformément au principe de réduction. Le nombre de groupes expérimentaux a été limité aux conditions strictement nécessaires grâce à une étude pilote préalable, qui a permis de vérifier que les croquettes étaient bien consommées par les souris et n’entraînaient pas de modification du comportement alimentaire. Cette approche progressive a permis d’éviter l’utilisation inutile d’animaux.

Raffinement

Plusieurs précautions seront prises pour limiter au maximum stress, douleur et inconfort des animaux, tout en assurant la qualité des résultats. Les manipulations seront réalisées par deux personnes expérimentées (gestes rapides, cohérents et réalisés avec douceur, moins de stress). Les animaux seront surveillés trois fois par semaine. Leur consommation de nourriture sera vérifiée chaque semaine par cage, et leur poids sera mesuré individuellement une fois par semaine. Tout changement de comportement, d’apparence ou d’état général sera immédiatement pris en compte. Pour la mesure de la composition corporelle, un apprentissage préalable sera réalisé (une semaine avant) afin d’habituer les souris à entrer dans le tube de mesure. Cette étape vise à minimiser le stress et à éviter les mouvements brusques durant la procédure, qui dure moins de deux minutes. Pour les tests métaboliques, les quantités administrées (solution sucrée ou huile) sont limitées afin de réduire l’inconfort. Une seule incision de 1 mm sera réalisée à l’extrémité de la queue pour chaque test (pour les prélèvements suivants il suffit simplement de gratter la petite croûte avec une compresse). Les prélèvements sanguins se font sans contention. Les tests seront espacés d’une semaine pour laisser aux animaux le temps de récupérer. Lors du test du métabolisme des sucres, si la glycémie d’un animal ne revient pas à la normale dans les 90 minutes suivant l’injection, un suivi supplémentaire sera réalisé à 240 min, puis à 360 min si nécessaire. À la fin de l’étude, les animaux seront anesthésiés afin de permettre le prélèvement sanguin final. La mise à mort sera ensuite effectuée rapidement par dislocation cervicale. Des points limites prédictifs et adaptés à l’étude ont été établis afin de détecter précocement toute souffrance ou altération de l’état général.

Choix des espèces

La souris représente le modèle le plus approprié pour notre projet. La majorité des études publiées dans le domaine de la nutrition et du métabolisme utilisent cette espèce, ce qui permet la comparaison de nos résultats avec la littérature. Sur le plan physiologique, la souris présente un métabolisme des graisses proche de celui de l’Homme. Ces similitudes en font un modèle de référence pour l’étude des effets métaboliques de nouvelles formulations lipidiques. Par ailleurs, les souris présentent une réponse métabolique stable aux régimes riches en lipides, ce qui permet de limiter la variabilité et de réduire le nombre d’animaux nécessaires. Le recours à la souris est justifié pour évaluer les impacts physiologiques des huiles de colza gélifiées, dans des conditions contrôlées et scientifiquement transposables à l’Homme. Enfin, l’étude pilote permettant de sélectionner les différents types de croquettes testées ici a été réalisée chez la souris. L’administration des croquettes enrichies en différentes huiles et gélifiants débutera chez des souris âgées de 8 semaines, comme au cours de l’étude pilote. À cet âge, les animaux ont terminé leur période de sevrage et le changement de régime alimentaire est généralement bien toléré. Ce moment du développement est également optimal pour éviter que d’éventuelles variations physiologiques observées ne soient confondues avec des effets liés à la croissance (chez des animaux trop jeunes) ou au vieillissement (chez des animaux plus âgés).

Chaque personne formée s'entraîne sur cinq animaux. 863 souris et 173 rats vont être utilisés dans ce programme de tutorat, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, tous tués sans réveil à l'issue. Les stagiaires apprennent sur eux les injections sous la peau, dans le ventre et dans une veine, les prises de sang à différents endroits du corps et des gestes chirurgicaux, chaque animal enchaînant plusieurs gestes selon le niveau de la personne en formation. Le porteur indique que ces animaux sont, quand c'est possible, des surnuméraires ou des témoins en fin de suivi, ce qui donne "une utilité à des animaux qui auraient été euthanasiés sans avoir servi", et présente cette formation comme "une étape indispensable pour améliorer les pratiques scientifiques".

Objectifs

Ce projet a pour but de former, de manière encadrée et progressive, les personnes amenées à manipuler des rats et des souris dans le cadre de la recherche scientifique. Il s’agit d’un programme de formation pratique qui permet aux nouveaux arrivants d’apprendre les gestes techniques nécessaires, comme les prises de sang ou les injections, dans des conditions sécurisées et respectueuses des animaux. Ce type de formation est obligatoire en France et en Europe avant de pouvoir intervenir sur des animaux à des fins scientifiques. Le projet vise à garantir que chaque personne soit bien préparée, accompagnée, et évaluée avant de travailler de façon autonome. Il contribue ainsi à améliorer la qualité des soins aux animaux et la fiabilité des expériences. Ce programme de formation participe également à une démarche éthique plus large, en veillant à limiter le nombre d’animaux utilisés et à réduire au maximum leur stress ou leur douleur.

Bénéfices attendus

Ce projet de formation permet aux personnes qui travaillent en recherche d’apprendre à manipuler correctement les animaux de laboratoire, en particulier les rats et les souris. Il est important que ces gestes soient bien maîtrisés, car une erreur technique peut faire souffrir l’animal ou fausser les résultats d’une étude scientifique. Pour apprendre, les participants doivent s’entraîner directement sur des animaux vivants, car certains gestes ne peuvent pas être reproduits correctement sur des modèles artificiels. Toutefois, tout est mis en œuvre pour limiter le nombre d’animaux utilisés et pour réduire au maximum leur stress ou leur douleur. Cette formation encadrée permet ainsi d’assurer une meilleure prise en charge des animaux dans les futurs projets de recherche, en garantissant que les personnes soient compétentes, formées et responsables. C’est une étape indispensable pour améliorer les pratiques scientifiques tout en respectant les animaux.

Procédures

Les animaux utilisés dans ce projet de formation seront principalement des rats et des souris. Ils seront soumis à différents gestes techniques que les participants doivent apprendre à maîtriser. Ces gestes incluent par exemple des injections (sous la peau, dans le ventre ou dans une veine), des prises de sang à différents endroits du corps, ou des gestes plus complexes comme ceux réalisés lors d'une chirurgie. Chaque animal suivra un parcours progressif avec plusieurs gestes différents, adaptés au niveau du stagiaire. Tous les gestes sont réalisés dans un cadre très encadré, avec des limites strictes sur le nombre d’interventions par animal. À la fin de leur participation, les animaux seront endormis profondément puis euthanasiés sans réveil. L’apprentissage est organisé de manière à limiter au maximum les manipulations inutiles et à garantir le respect du bien-être animal tout au long du programme. La durée de chaque geste est volontairement limitée et adaptée au niveau de formation, afin de réduire au maximum le temps de manipulation et l’impact sur l’animal.

Impact sur les animaux

Les gestes que les participants apprennent à réaliser sur les rats et les souris peuvent parfois provoquer un léger inconfort, voire une douleur temporaire. Cela dépend du type de geste (prise de sang, injection, etc.), de la fréquence à laquelle il est réalisé, et du niveau d’expérience de la personne en formation. Parmi les effets indésirables possibles, on peut citer : un stress passager lié à la manipulation de l’animal ou à la contention (tenir l’animal immobile pour le geste) ; de petites inflammations ou hématomes au point d’injection ou de prélèvement sanguin ; des réactions à l’anesthésie, comme une respiration ralentie ou un réveil plus long que prévu ; des complications rares comme une infection locale ou une fausse route lors de l’administration par la bouche ou le nez. Certaines chirurgies sont simulées, mais si une intervention réelle est nécessaire, elle est faite sous anesthésie profonde et l’animal n’est pas réveillé ensuite. Dans tous les cas, les gestes sont réalisés de manière encadrée, avec des mesures de prévention de la douleur et un suivi attentif de l’état de santé de chaque animal.

Devenir

Dans le cadre de ce projet de formation, tous les animaux seront euthanasiés à la fin de leur participation. Cela s’explique par le fait que certains gestes techniques réalisés sont potentiellement invasifs ou causent un stress ou un inconfort temporaire. De plus, le projet a une visée pédagogique, ce qui implique des manipulations répétées sur un même animal. Afin d’éviter toute douleur ou souffrance prolongée, et de respecter les règles de bien-être animal, chaque animal sera endormi profondément lorsque cela est nécessaire, puis euthanasié de manière conforme aux réglementations en vigueur, sans qu’il ne se réveille. Cette décision permet de garantir à la fois une formation de qualité et un traitement respectueux des animaux utilisés.

Remplacement

Dans ce projet de formation, l’utilisation d’animaux vivants n’a lieu qu’en dernier recours, lorsque cela est vraiment nécessaire pour apprendre correctement un geste. Avant cela, les participants passent par une phase de préparation théorique, avec des documents, des vidéos pédagogiques et des explications détaillées. Ensuite, lorsque c’est possible, ils s’entraînent sans utiliser d’animal vivant. Par exemple, ils peuvent manipuler des cadavres d’animaux déjà euthanasiés pour d’autres raisons, ou utiliser des morceaux de tissus animaux (comme de la peau de poulet) ou encore des modèles en plastique conçus pour simuler des gestes. Ces étapes permettent d’apprendre les bons réflexes et de s’habituer au matériel sans faire souffrir d’animaux. L’usage d’animaux vivants est donc limité à ce qui est strictement nécessaire pour valider les compétences dans des conditions proches de la réalité.

Réduction

Ce projet de formation a été conçu pour utiliser le moins d’animaux possible, tout en permettant aux participants d’apprendre correctement les gestes nécessaires à leur travail. Chaque personne formée apprend plusieurs gestes sur un seul animal, ce qui permet de mutualiser les apprentissages et d’éviter d’utiliser un animal différent pour chaque geste. En moyenne, une personne réalise une seule procédure de formation qui nécessite cinq animaux. Au total, pour l’ensemble du projet, cela représente environ 863 souris et 173 rats sur cinq ans, en comptant une marge de sécurité pour les imprévus. Quand cela est possible, les animaux utilisés ne sont pas élevés spécifiquement pour ce projet : ce sont par exemple des animaux surnuméraires, des animaux non utilisés dans d’autres expériences ou des animaux de contrôle en fin de suivi. Cela permet de réduire encore davantage le nombre d’animaux produits et de donner une utilité à des animaux qui auraient été euthanasiés sans avoir servi. Cette organisation permet donc de former les professionnels de manière efficace, tout en respectant les principes de réduction fixés par la réglementation européenne.

Raffinement

Dans ce projet de formation, tout est mis en œuvre pour limiter au maximum la douleur, le stress ou l’inconfort que pourraient ressentir les rats et les souris. Les participants commencent toujours leur apprentissage sans utiliser d’animaux vivants, en s’exerçant d’abord sur des modèles ou des animaux déjà décédés. Ce n’est qu’une fois ces étapes franchies qu’ils manipulent un animal vivant, sous la supervision d’un formateur expérimenté. Quand un geste est potentiellement douloureux, un médicament antidouleur (buprénorphine) peut être donné à l’animal avant l’intervention. Si un geste s’avère trop difficile à réaliser sans gêne pour l’animal, une anesthésie temporaire peut être utilisée pour éviter toute souffrance. Les chirurgies, lorsqu’elles sont nécessaires, sont toujours faites sous anesthésie profonde et l’animal n’est pas réveillé ensuite. L’état de chaque animal est suivi à l’aide d’une grille d’observation (cf. Annexe 4) qui permet de détecter rapidement tout signe de douleur ou de malaise. Si un animal atteint un seuil critique (appelé « point limite »), il est euthanasié sans souffrance. Des soins supplémentaires sont apportés, comme le maintien au chaud, la mise à disposition d’aliments faciles à manger après une anesthésie, et la surveillance régulière de leur état. Toutes ces mesures sont mises en place pour respecter les principes de protection animale définis par la réglementation européenne, et garantir une formation de qualité sans exposer inutilement les animaux à la douleur.

Choix des espèces

Les rats et les souris sont les deux espèces les plus utilisées dans la recherche scientifique. En France, elles représentent environ 70 % des animaux utilisés dans les laboratoires. Ce sont donc les espèces que les participants à cette formation seront amenés à manipuler dans leur travail. Les animaux utilisés sont tous adultes, en bonne santé, et sans maladie. Ce choix est important : les animaux adultes sont plus faciles à manipuler, leur taille permet de bien voir les gestes à effectuer, et cela correspond aux conditions réelles dans lesquelles les chercheurs travaillent. Aucun animal jeune ou âgé n’est utilisé pour la formation. Utiliser des rats et des souris adultes permet donc d’apprendre dans de bonnes conditions, tout en limitant les risques pour l’animal et en respectant les règles éthiques.

480 souris reçoivent sous la peau une greffe de cellules cancéreuses du pancréas, puis pour certaines des injections d'anticorps trois fois par semaine pendant quinze semaines, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le porteur chronomètre chaque geste, une minute pour la greffe, moins d'une minute par injection, et mentionne plus brièvement l'ulcération cutanée que peut provoquer la tumeur au point d'implantation et les indurations dues aux injections répétées. L'anticorps testé ralentit déjà la croissance de cellules tumorales dans le cancer du foie, et le porteur affirme qu'une validation dans un "animal entier" reste requise avant tout passage clinique. Toutes sont tuées pour prélever tumeurs, foie et plasma.

Objectifs

Le cancer du pancréas est aujourd’hui l’un des cancers les plus meurtriers, avec très peu d’options thérapeutiques efficaces. Pour les formes avancées, les traitements actuels permettent rarement de dépasser une année de survie. Bien que l’immunothérapie ait révolutionné la prise en charge de plusieurs cancers, elle reste pour le moment peu efficace dans le cancer du pancréas. Cependant, de nouvelles pistes suggèrent que des traitements combinés pourraient améliorer la réponse des patients. Ce projet vise à mieux comprendre le rôle d’une protéine très fortement augmentée dans les tumeurs du pancréas, qui semble favorisée par les cellules cancéreuses et associée à un plus mauvais pronostic. Nous avons développé un anticorps dirigé contre cette protéine, qui ralentit déjà la croissance de cellules tumorales dans le cancer du foie. Nous pensons qu’elle pourrait également jouer un rôle important dans le cancer du pancréas et influencer la réponse immunitaire. Notre objectif est donc double : - Comprendre comment cette molécule contribue au développement du cancer du pancréas et à la manière dont la tumeur interagit avec son environnement. - Tester de nouvelles stratégies thérapeutiques, en évaluant si l’anticorps que nous avons développé, seul ou associé à l’immunothérapie, peut ralentir la croissance tumorale et améliorer l’efficacité des traitements. À terme, ce projet pourrait ouvrir la voie à de nouvelles approches thérapeutiques pour un cancer qui manque cruellement d’options efficaces.

Bénéfices attendus

Les cancers du pancréas sont un grave problème de santé public. Bien que rare, il est pratiquement incurable en l’état actuel et les patients atteints ont une durée de vie très faible. Notre projet est une étape vers la mise en place de nouveaux traitements plus efficaces. Nous pensons que notre anticorps peut améliorer l’efficacité des thérapies ciblant le système immunitaire et ainsi la survie de très nombreux malades dans le futur.

Procédures

La majorité des animaux de ce projet seront soumis à une injection unique sous la peau de cellules cancéreuses. Cette injection prend environ une minute à être réalisée sur animaux anesthésiés. Dans certains cas la croissance de la tumeur sous cutanée peut entrainer l’apparition d’une ulcération cutanée au niveau du site d’implantation des cellules. Certains animaux recevront un traitement par anticorps 3 fois par semaine pendant une durée pouvant aller jusqu’à 15 semaines. Les injections seront réalisées sur animaux vigiles, ce qui prend moins d’une minute à être réalisée. Les injections répétées peuvent parfois engendrer une induration ou très rarement une ulcération au niveau des sites d’injection. Un stress physique lors de la manipulation et de la contention nécessaires à l’injection des traitements sont attendus, mais de courte durée. Les animaux subiront un prélèvement de sang terminal. Cette procédure est réalisée sur animaux anesthésiés et est réalisé en environ 1 minute.

Impact sur les animaux

Les injections répétées peuvent parfois engendrer une induration ou très rarement une ulcération au niveau des sites d’injection. Dans certains cas la croissance de la tumeur sous cutanée peut entrainer l’apparition d’une ulcération cutanée au niveau du site d’implantation des cellules. Un stress physique lors de la manipulation et de la contention nécessaires à l’injection des traitements sont attendus, mais de courte durée.

Devenir

Tous les animaux de ce projet seront mis à mort afin de collecter les tissues (tumeurs ; foie ; plasma) qui seront utilisées pour des analyses ultérieures.

Remplacement

Afin de remplacer les études in vivo, nous avons procédé à des études in vitro sur lignées cellulaires et ex vivo sur des tissus de patients afin de démontrer la validité de l’approche. Celle-ci nécessite en parallèle une validation dans un modèle physiologique complet sur animal entier avant transposition clinique chez l’humain.

Réduction

Les tailles d’effectifs ont été déterminées à priori grâce à un logiciel dédié afin d’obtenir des résultats statistiquement fiables et robustes. Les données obtenues grâce aux animaux de ce projet seront analysées avec des tests statistiques classiques.

Raffinement

Afin de raffiner au mieux notre méthodologie, le protocole expérimental est planifié en amont. L’environnement des animaux est enrichi avec des tubes de coton pour la nidification et des briques de tremble à ronger. Les animaux seront hébergés en portoirs ventilés, ce qui les protégera des infections. Les animaux seront maintenus en groupe. Des points limites précoces ont été établis afin d’interrompre si nécessaire les procédures permettant de soustraire les animaux à toute douleur ou souffrance. Les procédures invasives ou stressantes sont réalisées sous anesthésie générale et analgésie. Avant les procédures le nécessitant, au cours de la période d’acclimatation de 7 jours, les souris seront laissées 2-3 jours sans manipulation puis habituées à la contention afin de diminuer le stress lié aux injections répétées.

Choix des espèces

Les souris sont de petits mammifères très proches de l’homme notamment du point de vue immunologique. Le modèle proposé dans cette étude a contribué dans le passé à établir le potentiel curatif des approches thérapeutiques ciblant le système immunitaire actuellement prescrites chez l’homme. Les animaux seront utilisés à un âge adulte de 8 semaines afin qu’ils présentent un système immunitaire mature. De plus il est préférable de greffer les cellules sur des animaux adultes afin que les tumeurs grandissantes entravent le moins possible leur capacité de mouvement