Procédures modérées

Renvoyées à leur troupeau d'origine à l'issue de l'expérience, 54 vaches laitières vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Pendant dix semaines, elles reçoivent des rations contenant des peaux de noisette et des coques de cacao, subissent des prises de sang, des prélèvements d'urine et de fèces, et des sondages gastro-œsophagiens pour extraire leur contenu ruminal, geste dont le porteur reconnaît qu'il déclenche une réaction de stress. La finalité tient d'abord à la filière : l'industrie de la confiserie génère ces sous-produits et achète le lait de ces mêmes élevages, ce que le porteur décrit comme un "fort intérêt" à les recycler dans l'alimentation des vaches. Il indique que les coques de cacao contiennent de la théobromine, toxique à dose élevée, et affirme rester sous les seuils européens.

Objectifs

Ce projet de recherche vise à déterminer l'effet de l'inclusion de la peau de noisette et de cacao dans l'alimentation des vaches laitières à des doses compatibles avec une éventuelle application commerciale à l'échelle de l'exploitation. Le projet adoptera une approche interdisciplinaire en se concentrant sur le métabolisme, le processus digestif, la santé et le bien-être des animaux. Nous étudierons également l'effet sur la qualité des produits laitier dérivés (lait, crème, beurre), sous les aspects nutritionnels, technologiques, organoleptiques et de conservation.

Bénéfices attendus

A terme, les résultats obtenus pourront contribuer à réduire les déchets, suivant à la fois les approches de l'économie circulaire, grâce à l’utilisation de sous-produit de l’industrie agroalimentaire, et de l'agroécologie, grâce au potentiel de réduction des émissions de méthane entérique que la composition chimique de ces sous-produits pourrait permettre. L’approche avec des doses compatibles avec l’application en ferme commerciale pourra aussi favoriser une application concrète potentielle par les filières.

Procédures

L’ingestion individuelle des vaches, leur efficacité alimentaire, leurs émissions de méthane et leurs performances (production laitière et poids vif) seront enregistrées quotidiennement pendant une période pré-expérimentale de 3 semaines avec un régime alimentaire standard, puis pendant une période de transition alimentaire de 2 semaines après l'introduction du régime expérimental (contenant les sous-produits de la noisette et du cacao) et une période expérimentale de 5 semaines. Afin de vérifier l'impact de la supplémentation sur l'état physiologique et sanitaire des vaches laitières, nous doserons un certains nombres de métabolites et marqueurs sanguins à partir de prise de sang réalises à la fin de la période pré-expérimentale et à la fin de l'expérimentation. Selon le même calendrier, des échantillons de liquide ruminal prélevés par sonde gastro-oesophagienne permettront d'analyser le contenu du rumen et en particulier des éléments liés à la fermentation et aux micro-organismes présents. Parallèlement, des échantillons d'urine et de fèces seront prélevés pour des analyses d'urée et de digestibilité. L'ensemble des prélèvements sur les animaux n'excédera pas 10 minutes par individu. Des échantillons de lait individuels seront prélevés au cours des opération de traite au début, pendant et à la fin de l'expérience pour l'analyse de la composition détaillée du lait, y compris le profil en matière grasse, la teneur en caroténoïdes et en vitamines et le potentiel antioxydant.

Impact sur les animaux

Plusieurs études ont déjà utilisé ces sous-produits dans l’alimentation des ruminants laitiers (vaches et chèvres) sans aucun effet indésirable. La teneur en théobromine des coques de cacao peut induire de la toxicité en dosée élève, mais les rations seront formulées pour rester a des niveaux largement inférieurs aux seuils autorisée par la Communauté Européenne. Nous pouvons également nous attendre à ce que les prélèvements (notamment les prélèvements de contenus ruminaux par tubage gatstro-oeasaophagien) déclenchent une réaction de stress de courte durée.

Devenir

Les animaux prélevés reprennent leur place normalement dans le troupeau, sans adaptation particulière de leur mode de vie. Ils reçoivent les soins quotidiens habituels, et font l’objet d’une surveillance accrue de la part des personnels animaliers. La décision est prise par le responsable de l'UE ou son délégataire, sur avis du vétérinaire membre de la SBEA.

Remplacement

L’étude porte sur des vaches laitières ingérant des peaux de noisettes et/ou de cacao et la qualité du lait qu'elles produisent. Le projet adoptera une approche interdisciplinaire en se concentrant sur le métabolisme, les processus digestifs, la santé et le bien-être des animaux. Il n'existe à ce jour pas de méthodes permettant d'appréhender ces différentes dimensions en se passant d'étude in vivo (par exemple, des essais in vitro ne permettraient que d'étudier certaines voies métaboliques spécifiques et pas la réponse à l'échelle de l'animal "entier").

Réduction

Un test de puissance du modelé statistique a été réalisé pour évaluer le nombre minimum d’animaux à utiliser (pwr.t.test R). Le test a été réalisé sur des paramètres de performances et composition de base du lait et sur des données d’émissions de méthane entérique précédemment acquises sur l’établissement utilisateur. Le nombre minimum d’animaux résultant variant entre 6 et 9 par groupe selon les paramètres, il a été choisi de recruter 9 animaux par groupe pour assurer la fiabilité des résultats. De plus, des essais préliminaires de fermentation in vitro en rumen artificel ont été réalisés et les doses ont été choisies de sorte à maximiser les chances d'observer des différences significatives in vivo. A l'issu de l'expérimentation, les données seront traitées avec des modèles linéaires mixtes, qui viseront à mettre en évidence des différences de réponses selon la dose de sous-produit administrée et le régime de base (effets fixes) tandis que l'animal sera pris en tant qu'effet aléatoire.

Raffinement

Les animaux seront logés en stabulation libre respectant leur bien-être : ils seront maintenus en groupe social stable, auront accès à des zones de couchage avec matelas, d’alimentation et d’abreuvement conformes aux besoins de leur espèce, ainsi qu’à des brosses. A la fin de l’étude, ces bovins rejoindront leur troupeau d’origine. Pour tous les prélèvements, les vaches seront placées (contenues) au cornadis ; nous immobiliserons la tête des vaches à l’aide d’un dispositif de lève-tête, placé devant le cornadis. Les manipulateurs qui réaliseront les prélèvements par tubage gastro-oesophagien, les prises de sang, les prélèvements de fèces et d’urines ont été formés par un vétérinaire maîtrisant les gestes.

Choix des espèces

L’industrie agroalimentaire qui génère les sous-produits de la noisette et du cacao, utilise aussi beaucoup de lait de vaches pour la production des aliments de confiserie qui incluent de la noisette et /ou du cacao. Il y a donc un fort intérêt pour cette filière à trouver des solutions pour réutiliser les sous-produits générés dans la filière même, donc dans les élevages des vaches laitières auprès des lesquelles collectent leur lait. Pour cette raison l’expérimentation a recours à des vaches laitières. Les vaches seront des vaches adultes (3-8 ans), en lactation après leur pic de production, puisqu’une partie des prélèvements visent à évaluer l’impact de la distribution des sous-produits sur la qualité des produits laitiers. Elles seront sélectionnées parmi le troupeau de l’établissement utilisateur sur la base de critère tels que le nombre de jours de lactation, la race ou la parité avant d’être mise en lot sur des critères de performance.

Sur 410 souris, 130 ne servent qu'à entraîner les expérimentateurs aux techniques d'injection intramusculaire, intrathécale et intraveineuse. Les 280 autres reçoivent un vecteur viral, 80 d'entre elles deux jours après leur naissance, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à huit semaines pour l'histologie des tissus. Entre sept et huit semaines, chaque souris passe dix tests : agrippement, suspension, tapis roulant, barre crantée, immersion de la queue en bain-marie, sensibilité au froid, plaque froide, réactivité cutanée, enregistrement de l'activité pendant 22 heures et électromyographie sous anesthésie. Le porteur écrit qu'aucun analgésique ne sera administré pendant cette phase parce qu'il fausserait les mesures de sensibilité, et qu'une souris montrant des signes persistants de souffrance sera tuée plutôt que soignée.

Objectifs

Le but de ce projet est de tester une approche de modulation génique prometteuse pour la maladie rare de Charcot- Marie-Tooth (CMT), une neuropathie périphérique entraînant des troubles moteurs et sensitifs. Cette pathologie provoque une perte progressive de force et de coordination, et aucune thérapie curative n’existe actuellement. Nous utilisons des souris reproduisant fidèlement la maladie humaine pour évaluer si la réduction du gène d’intérêt permet d’améliorer la fonction musculaire et nerveuse. Cette stratégie sera testée soit par croisement génétique, soit par thérapie génique utilisant des vecteurs viraux (AAV). Les bénéfices attendus sont une meilleure compréhension des mécanismes de la maladie et la validation d’une approche thérapeutique innovante, transposable ultérieurement à l’Homme. Tous les tests sont conçus pour limiter au maximum la douleur et le stress des animaux. Les critères de bien-être sont surveillés quotidiennement et toute souffrance incompatible avec le maintien dans le protocole entraîne l’arrêt immédiat et l’euthanasie de l’animal.

Bénéfices attendus

Cette étude va permettre une meilleure compréhension des mécanismes pathologiques à l’origine de la maladie, causant des défauts à la fois dans le tissu musculaire et dans le tissu nerveux. Ce projet pourrait également conduire à une preuve de concept thérapeutique pour une maladie aujourd’hui incurable

Procédures

Une partie des animaux (130) sera utilisée pour un entrainement aux différentes techniques d’injection (intramusculaire, intrathécale, intraveineux). Les autres animaux (280) seront répartis comme suivant : 200 animaux seront injectés durée d’injection de quelques secondes) avec des virus adéno- associés ; 80 animaux seront injectés au 2ème et jour après la naissance et 120 animaux seront injectés à 4 semaines. Entre 7 et 8 semaines, les animaux seront soumis à une série de 10 tests comportementaux : test d’aggrippement (durée 3x20s) - test de suspension (durée 3x60s) pour évaluer la force musculaire ; - déplacement sur tapis roulant (max 60s) et – déplacement sur une barre crantée (10x30s environ) pour évaluer la coordination motrice ; -test d’immersion de la queue en bain-marie (3x30s max en tout), -test sensibilité au froid (3 mesures par patte, 30s max par patte) -mesure de réactivité sur plaque froide (3x30s max en tout) et -mesure de réactivité cutanée (4x30s par animal) pour évaluer la sensibilité ; -mesure de l’activité des souris par des capteurs (durée de 22h) ; -mesure de l’activité électrique musculaire, sous anesthésie générale (procédure d'une demi-heure) pour évaluer la conduction nerveuse

Impact sur les animaux

Dans cette étude, nous utiliserons un modèle de la maladie de Charcot-Marie-Tooth dont les caractérisations ont déjà été effectuées et les animaux ne présentent aucun signe de douleur et aucune incapacité locomotrice. Le phénotype général des souris a été décrit et aucune douleur n’a été reportée chez ces animaux. Les tests phénotypiques (de suspension, de déplacements et de sensibilité) peuvent engendrer un stress physique chez l'animal. Les injections peuvent entrainer une réaction inflammatoire. L’électromyographie sera réalisée sous une anesthésie générale.

Devenir

Les animaux de cette étude seront mis à mort à 8 semaines après caractérisation comportementale. Une étude histologique des tissus affectés sera ensuite effectuée.

Remplacement

Le modèle souris étant physiologiquement et structurellement assez proche de l’Homme, il nous permettra d’étudier d’une part la physiopathologie de la maladie de Charcot-Marie-Tooth et d’autre part de mieux comprendre les voies de signalisation impliquées dans le développement de cette maladie. De plus, une étude exclusivement réalisée sur des cellules ne pourrait pas se suffire à elle-même car les effets sur l’ensemble de l’organisme et l’évaluation de la force musculaire, de la coordination motrice et de la conduction nerveuse seraient impossibles à évaluer. Une étude sur culture de cellules mutantes ne peut être envisagée car les symptômes décrits ne se développeraient pas et la caractérisation du modèle serait alors impossible.

Réduction

Dans cette étude, nous utiliserons des souris mâles et femelles issues des croisements pour maximiser les informations obtenues tout en réduisant le nombre total d’animaux. Chaque souris sera suivie longitudinalement, c’est-à-dire qu’elle sera étudiée à plusieurs moments au cours de sa vie, afin de mesurer l’évolution des symptômes musculaires et nerveux. Grâce à cette approche, nous pourrons obtenir des résultats fiables tout en appliquant le principe de réduction : utiliser le moins d’animaux possible pour répondre aux questions scientifiques.

Raffinement

Les nouveau-nés seront avec leurs parents jusqu’au sevrage. Après cette période, les animaux seront hébergés par groupes de 2 à 5 par cage, dans un environnement ventilé. La température sera maintenue constante et un cycle lumineux de 12 heures jour/nuit sera respecté. Chaque cage sera équipée de nids et les animaux auront un accès illimité à l’eau et la nourriture. Un tube par cage sera également disposé. Les souris CMT présentent des difficultés au temps de suspension, de la nourriture en gel ainsi que des pellets seront donc directement placés dans la cage afin de soulager l’animal dans son accès à la nourriture. À partir du moment où les animaux seront au phénotypage (semaine 7 et 8), ils seront contrôlés du lundi au vendredi lors des tests afin de pouvoir détecter au plus tôt les premiers signes de souffrance ou de stress comme un pelage ébouriffé ou terne, un dos voûté, de l’apathie, des comportements répétitifs (léchage excessif, tourner en rond), une maigreur visible (pesée lundi semaine 7 et semaine 8), ou encore une agressivité envers les congénères. Si un de ces signes se présente de manière sévère ou persistante, l’animal sera euthanasié et retiré de l’étude afin de lui éviter toute souffrance, cette décision est justifiée par le fait que l’administration d’analgésiques pourrait altérer les paramètres comportementaux ou sensoriels étudiés (baisse de la sensibilité), compromettant ainsi la validité scientifique des données. Cependant, un antalgique sera administré en sous-cutanée au niveau de la nuque avant l'injection d'AAV afin de ne pas induire de douleur. La zone d’injection sera régulièrement inspectée pour détecter tout gonflement ou changement de couleur pouvant indiquer une infection.

Choix des espèces

La souris est utilisée comme modèle pour étudier la maladie de Charcot-Marie-Tooth (CMT), car son système musculaire et nerveux est suffisamment proche de celui de l’humain pour reproduire les principaux aspects de la pathologie. Les autres espèces présentent des différences trop importantes, et les modèles cellulaires ne permettent pas d’observer les effets à l’échelle de l’organisme, notamment sur la fonction musculaire et la conduction nerveuse. Les animaux sont étudiés à l’âge de 7 à 8 semaines, correspondant à un stade où le phénotype de la maladie est pleinement exprimé. Cela permet d’évaluer de manière pertinente les effets de la pathologie ainsi que l’efficacité de la thérapie.

Capturés dans des passes à poissons, anesthésiés, munis de deux puces RFID puis transportés jusqu'à une heure trente en cuve oxygénée, 1 125 poissons subissent des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, avant d'être relâchés vivants en aval de l'ouvrage étudié. Il s'agit de 150 aspes, 225 barbeaux, 300 brèmes, 300 hotus et 150 anguilles jaunes, retenus parce qu'ils comptent parmi les plus abondants du fleuve et que leur comportement est déjà documenté. Le porteur reconnaît que les puces implantées peuvent constituer une gêne durable, et prévoit de mettre à mort tout poisson présentant des signes cliniques sévères. L'étude sert à vérifier l'efficacité du dispositif de franchissement d'un barrage hydroélectrique, la continuité écologique étant présentée comme une "obligation règlementaire".

Objectifs

L’objectif principal de cette étude est d’évaluer, grâce à l’utilisation de suivis télémétriques (RFID et acoustique), le comportement des poissons au droit d’un ouvrage hydroélectrique complexe localisé sur un grand fleuve. Compte tenu du dimensionnement des ouvrages hydroélectriques présents sur de tels fleuves, anticiper le comportement des poissons et dimensionner des dispositifs de franchissement efficaces pour un large panel d’espèces avec différentes capacités de nages relève d’un véritable défi technique. Il s’agit ici d’analyser le comportement et de suivre le déplacement de différentes espèces de poissons sur un site comportant plusieurs voies de passage et de valider l’efficacité du dispositif de franchissement actuellement en place.

Bénéfices attendus

Les résultats de cette étude pourront permettre d’identifier les freins éventuels à la continuité écologique sur le site étudié, et serviront de base pour les réflexions d’aménagement ou de gestion des ouvrages dans un objectif de permettre la libre circulation des poissons, voire d’orienter la conception d’ouvrages aux enjeux similaires.

Procédures

L’objectif est de procéder à l'identification individuelle de 975 poissons d’espèces de rivière (aspe, barbeau, brème, hotu) et 150 anguilles, puis de les relâcher vivants dans le milieu naturel en aval des ouvrages à étudier. L’intervention sur chaque poisson consiste en une anesthésie suivie de l’implantation de deux puces RFID. La procédure est rapide, d’une durée maximale de 5 minutes par poisson.

Impact sur les animaux

Les animaux vigiles pourront subir un stress au moment de la capture et de leur manipulation avant anesthésie. Il est possible que les puces d'identification insérées puissent représenter une gêne ou un inconfort pour les poissons (corps étranger). Le transport des individus marqués depuis le site de marquage vers les points de lâcher (trajet d’une demi-heure à 1h30 en cuve oxygénée) peut également constituer une phase stressante pour les poissons.

Devenir

L’objectif étant d’analyser le comportement des poissons au droit d’un ouvrage hydroélectrique complexe, il est nécessaire que tous les animaux capturés et marqués d’émetteurs soient relâchés vivants dans le milieu naturel, en aval du système que l'on cherche à étudier.

Remplacement

L’étude vise à étudier le comportement des poissons au droit d’un ouvrage hydroélectrique complexe, mais également leurs comportements fins au droit d’une passe à poissons. Leur comportement est intégrateur de facteurs biologiques (instinct, anatomie et physiologie), environnementaux (température de l’eau, luminosité, débit, autres individus présents dans la passe) et physiques liés au dimensionnement de l’ouvrage et de la passe à poissons elle-même (vitesses, hauteurs de chute, etc..). Les poissons sont ici au centre du questionnement ; il n’est donc pas envisageable de remplacer le modèle animal dans cette étude.

Réduction

Le rétablissement de la continuité écologique est une obligation règlementaire qui doit bénéficier à un maximum d’espèces avec des comportements et capacités de nage variés. Afin de réduire le nombre d’animaux utilisés, 5 espèces ont été retenues (aspe, barbeau, brème, hotu, anguille européenne) parmi plus d’une vingtaine migrant sur le fleuve étudié. Ces espèces ont été choisies car elles comptent parmi les plus abondantes dans le fleuve où est implanté l’ouvrage étudié, ont des capacités de nage variées et ont déjà été utilisées dans le cadres d’études similaires (comportements bien documentés). Le nombre d’individus minimum nécessaire prend en compte la complexité du site à étudier, le nombre de paramètres environnementaux pouvant influencer le déplacement des poissons ainsi que les taux de redétections des espèces cibles (entre 30 et 80% selon l’espèce). L’effectif total par espèce est réduit au maximum mais doit permettre de disposer d’un nombre d’individus suffisant s’orientant dans les différentes voies de passage du système et de vérifier la significativité des facteurs comme l’espèce, la rive de relâcher, les conditions hydrologiques pendant la migration. Ainsi, 150 aspes, 225 barbeaux, 300 brèmes et 300 hotus seront étudiés ainsi que 150 anguilles. Au total, un maximum de 1125 poissons sera étudié, réparti sur trois campagnes de marquage.

Raffinement

Capture : Les poissons seront capturés dans des passes à poissons entre les mois de mars et juillet, période propice à leur activité migratoire. Plusieurs méthodes non dommageables aux poissons ont été retenues pour leur complémentarité. Stabulation (post capture et réveil) : Les poissons utilisés dans le cadre du projet seront maintenus dans des conditions de stabulation optimales : grand volume d’eau renouvelé et provenant directement du milieu dans lequel ils ont été capturés pour garantir une bonne oxygénation et une température stable. L’anguille étant une espèce qui évite la lumière, les individus seront mis en stabulation à l’obscurité pour réduire le stress. Manipulations et marquage : Des précautions seront prises pour minimiser les risques d’infection liés aux procédures ; les opérateurs utiliseront des gants stériles et le matériel utilisé pour le marquage des poissons sera stérilisé. Seuls les poissons présentant un état sanitaire satisfaisant (non moribond, absence de malformations, sans blessure majeure) seront retenus pour l’étude. Le marquage sera réalisé sous anesthésie afin de limiter au mieux la douleur et le stress. Des points limites sont établis au préalable et régulièrement vérifiés pendant la durée de l’expérimentation. L’objectif est de retirer des procédures (avant marquage par exemple) tout individu ayant une mauvaise réaction à l’anesthésie et de s’assurer du bien-être des animaux à toutes les étapes du protocole. Dans le cas où un poisson présenterait un ou des signes cliniques sévères, celui-ci pourra être mis à mort selon un protocole défini en amont. Enfin, les poissons ne seront relâchés dans le milieu naturel qu’après réveil complet ; retour à une nage normale, absence de perte d’équilibre, rythme respiratoire normal et réactions aux stimuli extérieurs normaux (fuite). Transport : Afin de garantir de bonnes conditions de transport des poissons marqués jusqu’au site de lâcher, l’eau de transport sera alimentée en continu en oxygène.

Choix des espèces

Les espèces étudiées sont le barbeau fluviatile, la brème commune, l’aspe, le hotu et l’anguille européenne. Des comptages réalisés sur les passes à poissons ont montré que ces espèces totalisent plus de 94% des migrations dans le fleuve où sont implantés les ouvrages étudiés. Ces espèces présentent des comportements et capacités de nage différentes, dont le comportement de migration et le franchissement de passe à poissons a déjà été documenté ce qui permettra des comparaisons. De plus, les individus adultes (de grande taille) de barbeau et de hotus présentent des capacités de nage plutôt élevées et proches de celles de saumons atlantiques de taille moyenne, ce qui en fait de bons modèles de substitution de cette espèce migratrice rare. Ces espèces sont suffisamment abondantes pour envisager des analyses statistiques robustes. Dans le cas des espèces holobiotiques (barbeau, brème, hotu, aspe), les individus étudiés seront des adultes (de plusieurs années) en recherche active d’habitats favorables à leur reproduction. Pour l’anguille, espèce migratrice amphihaline se reproduisant en mer, le stade biologique concerné par l’étude est l’anguille jaune ; stade juvénile (plusieurs mois à années) en migration de montaison pour coloniser le bassin en recherche de zones de grossissement.

2 588 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent jusqu'à trente administrations de composés thérapeutiques, jusqu'à trente injections d'un produit qui rend les tumeurs visibles et quatre prélèvements de sang, et développent une gêne respiratoire au stade avancé du cancer du poumon. Une partie a 78 semaines, âge que le porteur rapporte à 56 ans chez l'humain, pour comparer le développement tumoral entre individus jeunes et âgés. Le bénéfice tient en une phrase, proposer à terme de nouvelles options aux malades, et le porteur conclut que l'étude du cancer chez la souris reste "indispensable".

Objectifs

Les cellules produisent l’énergie dont elles ont besoin grâce aux mitochondries, de véritables « centrales énergétiques ». Lorsqu’elles sont endommagées, ces structures peuvent provoquer la mort des cellules. Les cellules cancéreuses, en revanche, ont développé un système de tri et de recyclage appelé mitophagie, qui leur permet d’éliminer les mitochondries défectueuses et ainsi de survivre, même face aux traitements. Nos travaux ont montré que ce mécanisme est activé tout au long du développement du cancer du poumon et qu’une protéine clé joue un rôle central dans ce processus. La bloquer rend les tumeurs plus sensibles aux traitements. Ce projet vise à mieux comprendre ce mécanisme afin d’améliorer l’efficacité des thérapies actuelles, notamment la chimiothérapie, les thérapies ciblées et l’immunothérapie.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra à terme de proposer de nouvelles options thérapeutiques pour les patients souffrants de cancer du poumon.

Procédures

Dans ce projet les souris seront soumises à différentes types d’interventions comme : -des contentions : pour les anesthésier (30 secondes, 1 fois), pour les traiter (30 secondes, de 1 fois à 30 fois), pour leur administrer des composés pour la visualisation des tumeurs (30 secondes, nombre voir ci-après), -des administrations de composés thérapeutiques (10 secondes, 30 fois au maximum), d’un produit pour visualiser les tumeurs (10 secondes, 30 fois au maximum) -de prélèvements sanguins (30 secondes, maximum 4).

Impact sur les animaux

Les nuisances subies par les animaux seront du stress lors des contentions et des administrations, une gêne respiratoire uniquement pour le groupe de souris représentant le cas de stade avancé de tumeurs pulmonaires.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort afin de prélever les organes pour réaliser les analyses in vitro nécessaires à notre étude.

Remplacement

Le développement d’un cancer ne dépend pas seulement de la transformation d’une cellule normale en cellule cancéreuse. Il repose aussi sur l’environnement qui entoure la tumeur, composé d’autres cellules, de signaux liés au métabolisme et de phénomènes inflammatoires. Tous ces éléments interagissent et collaborent pour permettre à la tumeur de se développer. La croissance d’une tumeur résulte donc d’un dialogue constant entre les cellules cancéreuses et leur environnement, en particulier avec le système immunitaire. À l’heure actuelle, il n’existe pas de méthode globale capable de reproduire toutes ces interactions complexes en laboratoire. C’est pourquoi l’utilisation de modèles animaux, comme la souris, reste indispensable pour étudier le développement du cancer dans un organisme vivant.

Réduction

Dans un but de réduction, nous utiliserons indifféremment les mâles et les femelles, ce qui nous permettra d’utiliser la grande majorité des animaux générés dans les élevages. Des études préalables in vitro permettent de sélectionner des gènes d’intérêt afin de réduire le nombre tester in vivo, et l’ordre de réalisation des procédures servira à comparer différentes conditions afin de sélectionner la plus efficace pour réduire le nombre d’animaux utilisé dans certaines expériences.

Raffinement

Afin de garantir le bien-être des animaux, ceux-ci seront observés chaque semaine à l’aide d’une grille d’évaluation adaptée. Cela permettra de détecter rapidement tout signe de douleur, de stress ou de problème de santé. L’utilisation de modèles génétiques contrôlables permet de maîtriser le développement de la maladie et d’assurer un suivi attentif et régulier des animaux. L’évolution des tumeurs pulmonaires sera suivie au cours du temps grâce à une technique d’imagerie réalisée sous anesthésie, ce qui permet une évaluation précise tout en limitant l’inconfort. Cette approche aide à définir au plus juste le moment d’arrêter l’expérimentation, dans le but de préserver au maximum le bien-être des animaux. Toutes les procédures potentiellement stressantes ou douloureuses, comme certaines injections et les examens d’imagerie, seront réalisées sous anesthésie. Enfin, un gel protecteur sera systématiquement appliqué sur les yeux afin d’éviter leur dessèchement et toute atteinte visuelle.

Choix des espèces

La souris est une espèce animale relativement proche phylogénétiquement de l’homme, ce qui pourra permettre d’extrapoler rapidement les résultats obtenus chez la souris vers le développement de traitements chez les patients atteints de cancer du poumon. Le cancer ne se développe pas seulement lorsqu’une cellule normale devient cancéreuse. Il a aussi besoin d’un environnement particulier autour de la tumeur, composé d’autres cellules, de signaux métaboliques et de réactions inflammatoires, qui favorisent sa croissance. Le développement d’une tumeur dépend donc d’une interaction étroite entre les cellules cancéreuses et leur environnement, notamment avec le système immunitaire. Aujourd’hui, il n’existe pas de méthode alternative capable de reproduire toutes ces interactions, c’est pourquoi l’étude du cancer dans des souris reste indispensable. Les souris seront utilisées à l’âge de 8-12 semaines (équivalent âge humain = 16 ans) ou à 78 semaines (équivalent âge humain = 56 ans) afin d’étudier le développement du cancer du poumon chez des individus jeunes et âgés.

800 rongeurs, 400 souris et 400 rats, vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, tous tués pour prélever leurs organes. Ils reçoivent jusqu'à huit injections d'un composé pharmaceutique, jusqu'à quatre séances d'imagerie sous anesthésie et quatre prélèvements de sang. Le but étant de trouver la dose au-delà de laquelle apparaissent des effets indésirables graves, ils peuvent développer œdèmes, convulsions, tremblements, arythmies cardiaques, difficultés respiratoires et diarrhées. Le porteur conclut que le recours à l'expérimentation animale est "indispensable" pour caractériser la tolérance d'un candidat médicament, le bénéfice final annoncé étant "la mise sur le marché de nouveaux produits pharmaceutiques".

Objectifs

Les études de doses maximales tolérées (résumé sous l’acronyme anglais de MTD, Maximum Tolerated Dose) d’un composé pharmaceutique (médicament, vaccin, agent de contraste..) permettent de définir la dose maximale à laquelle l’administration d’un composé n’induit pas d’effet indésirable grave. Ces études sont conduites en amont des études de toxicologie réglementaires exigées avant une première administration chez l’Homme lors des tests cliniques et, au final, pour l’obtention d’une autorisation de mise sur le marché (AMM). L’objectif de ce projet est donc de déterminer les doses maximales de différents composés pharmaceutiques / candidats médicaments ou vaccins administrés chez le rongeur (souris ou rat) sans que celles-ci ne provoquent d’effets indésirables sévères ou pouvant remettre en question la survie de l’animal.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de définir des doses limites administrables de plusieurs produits. Cela permettra de sélectionner des doses pertinentes pour les études de toxicologie réglementaire. Les études de MTD constituent une étape clé dans le développement et la caractérisation d’un produit permettant d’anticiper les risques cliniques et soutenir l’établissement d’un schéma posologique sûr lors de la transition vers l’homme. Le bénéfice final attendu est la mise sur le marché de nouveaux produits pharmaceutiques.

Procédures

Les animaux recevront le produit testé en dose unique ou répétée en respectant les volumes d’injections recommandés. Lors d’injections répétées, 8 injections maximum par animal pourront être réalisées. Sur animaux vigiles, les injections seront réalisées en quelques secondes (temps inférieur à 1 minute) et la durée sera d’environ 5 minutes sur des animaux anesthésiés. Des examens d'imagerie pourront également être réalisés, avec parfois injection d’un produit de contraste, sous anesthésie générale pendant une durée de 5 à 20 minutes. La fréquence des examens sera au maximum de 2 acquisitions par semaine jusqu’à la fin de l’étude (soit 4 examens au total). Des prélèvements sanguins pourront être réalisés sur animaux anesthésiés au maximum 2 fois par semaine pendant toute la durée de l’étude (soit au maximum 4 prélèvements de sang). Un prélèvement s’effectue en moyenne en 1 à 2 minutes.

Impact sur les animaux

Les animaux seront manipulés régulièrement pour différents actes techniques avec ou sans anesthésie (pesées, suivis cliniques, administration de composés, prélèvement de sang…) ce qui pourra leur engendrer un stress. De plus, lié à l’objectif du projet (recherche de la limite supérieure de sécurité de prise d’un traitement), les animaux pourront développer divers effets indésirables et réactions liés à l’administration du composé d’essai à des doses élevées : inflammation locale ou systémique, œdème, perte de poids, variation de température, léthargie ou au contraire hyperactivité, déshydratation, dyspnée, arythmies cardiaques, tremblements, convulsions, diarrhées, vomissements, modifications de la formulation globale sanguine, etc.). La détermination de points limites précoces et adaptés permettra la bonne prise en charge des animaux présentant des signes cliniques. La sévérité et la durée des signes pourront varier entre les groupes en fonction des produits testés et de leurs concentrations.

Devenir

Le projet ayant pour but l’évaluation de la dose maximale tolérée d’un composé pharmaceutique, il nécessite des prélèvements d’organes en fin d’étude donc tous les animaux seront euthanasiés.

Remplacement

Actuellement, il n’existe pas de méthode alternative permettant de reproduire de manière fiable la complexité physiologique (métabolisme, système immunitaire, fonction respiratoire, cardiaque, neurologique…) d’un organisme vivant. L’étude de la tolérance d’un candidat médicament nécessitant une évaluation de l’impact de ce traitement sur l’ensemble de ces différentes fonctions physiologiques, le recours à l’expérimentation animale est indispensable pour pouvoir caractériser la tolérance du traitement de manière exhaustive.

Réduction

Pour obtenir des résultats statistiquement exploitables permettant de conclure sur une réelle tolérance du traitement testé, des groupes de 6 animaux minimum seront utilisés. Dans le cas d’utilisation de composés marqué (compatible avec les objectifs du projet), l’évaluation de la tolérance d’un produit et de son impact sur la physiologie d’un animal pourra être complété par de l’imagerie. L’avantage de l’imagerie médicale est de plus facilement corréler un effet observé à l’injection d’un composé mais aussi de suivre un même animal au cours du temps et donc de diminuer le nombre d’animaux intégrés au projet.

Raffinement

Une période d’acclimatation d’au moins 5 jours sera respectée, portée à 7 jours en cas de transport aérien. Les animaux seront hébergés collectivement en cage tout au long du projet (de l’acclimatation à la fin de l’étude), avec des enrichissements adaptés à leurs besoins. Ils feront l’objet d’une observation quotidienne afin de détecter tout signe clinique anormal et d’appliquer, dès que nécessaire, les mesures appropriées pour garantir leur bien-être : mesures de soutien (désinfection de plaies, isolement, réchauffement, etc.) ou mise à mort humanitaire si l’état clinique est jugé moribond. Le poids des animaux sera mesuré quotidiennement après administration des produits testés. Un scoring clinique sera réalisé parallèlement à l’aide d’une grille d’évaluation. Les critères examineront à la fois l’état général (comportement, pelage, écoulements nasaux ou oculaires…) et des atteintes plus spécifiques d’un système physiologique (détresse respiratoire, troubles gastro intestinaux…), directement ou indirectement liés à la voie d’administration du composé. L’ensemble de ces éléments permettra d’attribuer un score global reflétant l’état de santé général des animaux et d’orienter la prise de décision. Des examens cliniques approfondis pourront également être réalisés. Toute anomalie clinique sera rapportée au vétérinaire responsable du suivi. Lors des anesthésies, une attention particulière sera portée pour éviter l’hypothermie : animal sur tapis chauffant ou sous lampe chauffante pendant toute la durée de l’anesthésie.

Choix des espèces

Les rongeurs (souris et rats) ont été choisis car ce sont des modèles standards, polyvalents (multiplicité des souches disponibles dont certaines sans poil) et couramment utilisés dans les études de tolérance en raison de leur facilité à obtenir des lots homogènes (âge et sexe fixés). Le choix entre la souris et le rat sera directement lié aux contraintes de volumes d’administration ou de prélèvements (plus faible chez la souris). De plus, leur taille réduite permet l’utilisation de technique d’imagerie optique corps entier pouvant être un atout non négligeable pour le suivi d’un composé à l’échelle systémique. Des souches de souris sans poil seront privilégiées dans le cas d’utilisation de composés bioluminescents ou fluorescents pour obtenir les résultats les plus pertinents (absence de la bioluminescence naturelle des poils donc augmentation de la sensibilité). Des souris et des rats de minimum 6 semaines seront utilisées au cours de ce projet (stade jeune adulte - adulte) afin de s’affranchir de la période de forte croissance de l’animal et d’avoir des animaux présentant un poids d’environ 20g pour les souris et 250g pour les rats.

Les souris qui perdent plus de 20 % de leur poids, respirent vite ou portent une plaie non guérie après deux jours sont mises à mort. 468 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour prélever leurs poumons. Elles inhalent sous anesthésie des molécules qui déclenchent un cancer du poumon, puis reçoivent jusqu'à vingt injections réparties sur six semaines, avec perte de poids et gêne respiratoire liées aux tumeurs. Le porteur écrit qu'aucune médication n'est prévue pour ne pas interférer avec les expériences, alors que les molécules testées seront selon lui "bientôt proposées en routine aux patients".

Objectifs

Les cancers du poumon sont la première cause de mortalité par cancer en France et dans le monde. Malgré les avancées thérapeutiques récentes, principalement basées sur les thérapies ciblées et les immunothérapies, de nombreuses tumeurs restent résistantes aux traitements et le taux de survie global à cinq ans ne dépasse pas 26 %. Il y a maintenant des nouvelles molécules qui bloquent un gène très important dans la survenue des tumeurs du poumon. Dans ce projet nous souhaitons caractériser l’apport de ces nouvelles molécules sur les thérapies classiques (chimiothérapie combinée à l’immunothérapie), identifier les potentiels mécanismes qui bloqueraient l'efficacité de ces traitements combinés et définir des stratégies pour contourner ces blocages.

Bénéfices attendus

Ces expériences pré-cliniques nous permettront de mieux appréhender l’efficacité des nouveaux traitements pour bloquer la progression des cancers du poumon. Ces traitements, qui incluent de nouvelles molécules qui suppriment l'activité d’un gène impliqué dans la progression des cancers, seront bientôt proposés en routine aux patients .

Procédures

- Les souris seront soumises à l'inhalation de molécules stimulant l’initiation du cancer. Cet acte dure moins de 30 secondes. Il est réalisé sous anesthésie pour diminuer le stress de l'animal. - Injections: 20 secondes x nombre d’injection, au maximum 20 injections par animal réparties sur 6 semaines. - Manipulation pour prise de poids : 15 secondes par animal, ce qui est le temps nécessaire pour prendre la souris, la poser sur la balance, reporter son poids et la reposer dans sa cage.

Impact sur les animaux

- Stress à la préhension. – Stress lié à l’injection.- Perte de poids liée à la présence de tumeurs. – gene respiratoire liée la présence de tumeurs.

Devenir

À l’issue de chaque procédure, les animaux seront mis à mort pour permettre le prélèvement des tissus pulmonaires et l’analyse post mortem des échantillons. Les poumons seront prélevées pour des analyses histologiques et biochimiques afin de répondre aux objectifs scientifiques du projet. Les critères d’analyse incluront : 1. La taille et le nombre des lésions cancéreuses pour évaluer la progression tumorale. 2. La présence de cellules immunitaires dans les lésions tumorales, afin de confirmer leur implication dans le développement des cancers. Ces analyses permettront de valider ou d’infirmer les hypothèses du projet, notamment en ce qui concerne l’efficacité des nouveaux inhibiteurs pour ralentir ou stopper la progression des tumeurs. En résumé, la mise à mort des animaux est essentielle pour atteindre les objectifs expérimentaux, tout en garantissant que les animaux ne subissent aucune souffrance inutile à l’issue de la procédure.

Remplacement

Nous avons utilisé des approches de culture cellulaire et analyses informatiques dans les étapes préliminaires qui ont permis le financement de ce projet. Les concentrations actives des molécules que nous testerons ont été validées sur des cultures cellulaires et/ou grâce à une étude exhaustive de la littérature. A ce jour il n'existe pas de méthode de remplacement (co culture de cellules associée à une modélisation informatique ou modèles invertébrés) qui permettent de caractériser chez les mammifères la dynamique des interactions cellulaires et moléculaires mises en jeu dans les pathologies telle le cancer du tissu pulmonaire résistants aux traitements. De ce fait, le recours à l’animal vivant est requis.

Réduction

Une étude exhaustive de la littérature a été menée avant d'initier ce projet pour s'assurer de la non-reproduction de résultats déjà publiés. De plus, nous avons réalisé une étude statistique prévisionnelle qui nous permet de prédire le nombre minimal d’animaux qu’il faut inclure par groupe expérimental afin d’obtenir des résultats statistiquement significatifs. Les expériences seront arrêtées dès que nous aurons obtenu les résultats permettant de valider nos hypothèses de travail.

Raffinement

Nous avons montré l’absence de toxicité de nos composés et de leur véhicule sur des cellules en culture et sur des animaux vigiles. Nous avons choisi une technique basée sur l’instillation. L’instillation est réalisée sous anesthésie gazeuse sous une lampe chauffante pour limiter la perte de température. Le temps d’anesthésie a été adaptée pour limiter le risque de fausse route. Les animaux seront mis à mort avant l'apparition de signes cliniques extérieur. Pour limiter au maximum la souffrance des souris nous avons établi une fiche d’observation qui liste les mesures que nous prenons pour assurer le bien-être et nous avons défini des points limites (non guérison de plaie après traitement, manque de soin associé à un isolement pendant plus de 2j, suintement au site d’injection, respiration rapide, blessure étendue ou surinfectée, perte de poids >20%) à partir desquels l’expérience sera arrêtée. Aucune médication n’est prévue pour ne pas interférer avec nos expériences. Dans le cas de blessures légères, nous appliquerons un antiseptique pour nettoyer la plaie et réaliserons un suivi spécifique des animaux et si la blessure n’est pas en cours de guérison pas après 2j, l’animal sera mis à mort.

Choix des espèces

Nous avons choisi d’utiliser la souris car la similitude de son patrimoine génétique avec celui de l’Homme nous permet, dans la mesure du possible, d’extrapoler les résultats et en tirer des conclusions valables pour l’Homme. De plus, il existe beaucoup d’outils (Anticorps, imagerie) qui permettent de travailler avec les souris. Le modèle génétiquement modifié que nous utilisons est bien caractérisé dans la littérature comme dans notre centre de recherche. Il est particulièrement adapté à notre projet avec un développement de cancer du poumon après l’expression de la forme active d'un gène promoteur de tumeur. Les souris femelles et mâles seront mises en expérimentation à un âge minimum de 8 semaines, soit à l’âge adulte. A cet âge, le système immunitaire des souris est mature. Les souris seront mises à mort au maximum 4 mois après le début de l’expérience pour permettre le prélèvement des tissus et leur analyse.