Procédures modérées

600 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent jusqu'à cinq injections dans l'abdomen, parfois une injection dans la veine située derrière le globe oculaire, et jusqu'à cinq prélèvements de sang à la veine de la mandibule. Le porteur indique que les injections derrière l'œil peuvent produire des effets indésirables sur cet organe, que les prélèvements exposent à la déshydratation et aux hématomes, et que le déclenchement de la réaction immunitaire altère l'état général des animaux. Elles sont tuées pour prélever la rate et en extraire les cellules productrices d'anticorps, une étape que le porteur juge "indispensable" faute de modèle informatique reproduisant une réponse immunitaire.

Objectifs

Depuis les années 1980, les anticorps ont profondément modifié la thérapeutique dans un grand nombre de pathologies, comme le cancer et les maladies inflammatoires chroniques. Bien que le développement des anticorps soit un processus complexe, et que certains d'entre eux peuvent entraîner des effets indésirables préoccupants, leur apport dans l'arsenal thérapeutique est majeur. Aujourd'hui, plus d'une cinquantaine d'anticorps sont disponibles dans des indications de plus en plus larges. Un grand nombre de nouveaux anticorps est actuellement en développement. Après injection d'un élèment déchenchant une réaction immunitaire (c'est-à-dire une réaction de défense de l'organisme), l’objectif est de récupérer les cellules productrices d’anticorps (spécifiques de cet élèment) pour générer des lignées de cellules sécrétant les anticorps d’intérêt. Ces dernières seront amplifiées à très petite échelle en plaques de culture. Les cellules seront ensuite éclatées pour développer les anticorps. L’utilisation des rongeurs reste indispensable pour créer de nouveaux anticorps contre des cibles car c’est uniquement la stimulation du système immunitaire qui va permettre d’atteindre l’objectif.

Bénéfices attendus

Les anticorps et leurs dérivés constituent la classe des principes actifs qui connaît le plus fort taux de développement actuel dans les domaines biotechnologique et pharmaceutique. En effet, ces anticorps sont des outils de recherche, des réactifs pour les tests d'analyses biologiques et des candidats potentiels à une utilisation thérapeutique. Ils offrent de nouvelles perspectives pour générer une réponse immunitaire protectrice et durable. Ainsi, ils sont aujourd’hui utilisés dans les traitements de cancers, de maladies inflammatoires, de migraine et plus récemment dans la lutte des formes graves de la Covid 19. Aujourd'hui, plus d'une cinquantaine d'anticorps sont disponibles dans des indications de plus en plus larges. Un grand nombre de nouveaux anticorps est actuellement en développement. Ce présent projet a pour but d’engendrer une réponse immunitaire spécifique chez l'animal. L’objectif principal est de récupérer les cellules productrices d’anticorps pour générer des lignées de cellules sécrétant les anticorps d’intérêt.

Procédures

Les souris seront soumises à des injections et des prélèvements de sang. En effet, la réaction immunitaire sera réalisée par une injection dans l'abdomen puis par une autre injection dans l'abdomen (durée: 1 minute par injection) ou dans une veine localisée derrière le globe oculaire (durée: 5min). Le volume administré sera choisi en respectant les volumes maximaux d’administration chez la souris. Des prélèvements de sang (5 au maximum) pourront être réalisés à la veine de la mandibule afin de suivre le niveau de production d'anticorps des souris (durée: 2 min).

Impact sur les animaux

Les souris subiront des injections répétées dans l'abdomen (maximum 4 +1 avec une stimulation forte selon le protocole) ou une injection par voie intraveineuse. Ces administrations peuvent entraîner du stress chez l’animal lié à la contention, des douleurs, inflammations ou risques d'infections aux sites d'injection. Les injections réalisées dans la veine derrière le globe occulaire, peuvent produire des effets indésirables sur l’œil. Elles nécessitent une anesthésie par voie gazeuse des animaux pouvant générer une irritation des voies respiratoires. Les prélèvements de sang peuvent entraîner des risques de déshydratation ou de chute du volume sanguin et des hématomes aux sites de prélèvements. Le déclenchement d'une réaction immunitaire entraîne une altération de l'état général des animaux.

Devenir

Les animaux sont mis à mort à la fin de la procédure car il est nécessaire de prélever les organes pour extraire les anticorps.

Remplacement

L’utilisation des rongeurs reste indispensable pour créer de nouveaux anticorps contre des cibles car c’est uniquement la stimulation du système immunitaire qui va permettre d’atteindre l’objectif. Ces développements nécessitent l’utilisation d’animaux. En effet, ces tests doivent être réalisés sur un organisme entier afin de prélever les organes tels que la rate où sont retrouvés les cellules produisant les anticorps.

Réduction

Le nombre d’animaux inclus dans ce projet est une estimation des projets à venir et a été fixé à N = 10 animaux maximum par série expérimentale. Cela constitut le nombre maximal pour générer des anticorps. Le nombre d’animaux nécessaires par expérience sera calculé en se basant sur les données de la littérature de la cible d’intérêt afin d’évaluer la difficulté à obtenir les anticorps. Afin de limiter le nombre d’animaux utilisés, des prélèvements sanguins répétés seront effectués sur les mêmes individus au cours du temps, permettant de suivre précisément l’évolution de la réponse immunitaire sans avoir recours à différents animaux pour chaque point temporel. De plus, dès que le nombre d’individus présentant une réponse supérieure au seuil minimal requis pour les analyses statistiques sera atteint, la série expérimentale pourra être arrêtée avant d’atteindre les 10 individus initialement prévus.

Raffinement

A l’arrivée des animaux, une période d'acclimatation d’au moins 5 jours est respectée. Une importance particulière est portée au suivi des animaux pour prévenir et remédier à l’apparition de douleur ou de mal-être. Les points limites sont fixés avant le début des expérimentations. Les animaux sont observés quotidiennement et tout signe de douleur ou de détresse entraîne l’établissement d’un score grâce à une grille d’évaluation clinique. En fonction du score obtenu, un protocole d’analgésie approprié est mis en place si besoin. Les injections au niveau du sinus retro-orbitaire sont réalisées après anesthésie gazeuse de l'animal et analgésie locale de l’œil.

Choix des espèces

L’utilisation d’animaux pour créer et produire des anticorps reste nécessaire car aucun modèle bio-informatique ne permet à l’heure actuelle de recréer la réponse du système immunitaire de l’animal en présence d'un organisme étranger. La maturité sexuelle des souris se situant aux alentours des 6 à 8 semaines selon le sexe, il convient d’utiliser des animaux jeunes âgés d’au moins 8 semaines pour les programmes de stimulation de système immunitaire. Généralement, les jeunes animaux sont de meilleurs producteurs d’anticorps que les animaux plus âgés parce que la fonction immunitaire atteint son apogée à la puberté et diminue lentement par la suite.

Gavées chaque jour pendant cinq semaines, soit 35 administrations, 80 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles vivent seules en cage, sont pesées onze fois, puis subissent un prélèvement sanguin sous anesthésie avant d'être tuées pour doser l'ocytocine dans leurs tissus. Le porteur affirme que la complexité du microbiote intestinal ne peut pas encore être modélisée in vitro et qu'il est "nécessaire" de vérifier l'efficacité des composés dans un "organisme entier". Les trois composés testés appartiennent à un client du laboratoire, à un stade que le RNT qualifie de très précoce, et l'éventuelle mise sur le marché d'un médicament reste au conditionnel.

Objectifs

Le microbiome intestinal a été montré comme ayant un impact sur un très grand nombre de fonctions physiologiques. En effet, un nombre croissant de données indique que de nombreuses pathologies s'accompagnent d'un déséquilibre du microbiote et que la restauration de ce microbiote s'accompagne souvent d'une amélioration, voire d'une disparition des symptômes. Ainsi, certaines bactéries, et notamment L. reuteri, réduisent l'inflammation intestinale, freinent la perte osseuse, ou encore favorisent la cicatrisation des plaies cutanées. Or il a été montré que l'intestin possède des cellules capables de secréter de l'ocytocine et que cette dernière joue un rôle majeur dans l'équilibre de certaines population bactériennes et en particulier dans les effets bénéfiques. Ainsi, d'intense recherche visent aujourd'hui au développement de thérapies induisant une augmentation de la sécrétion intestinale d'ocytocine. L'objectif du présent projet est de tester la capacité d'une série de composés en développement (Composés X, Y et Z), développé par notre client, a induire une augmentation de la sécrétion d'ocytocine chez la souris.

Bénéfices attendus

Ce projet s'inscrit dans le cadre du développement de composés visant à traiter certaines pathologies inflammatoires de l'intestin ainsi que l'ostéoporose via une production accrue d'ocytocine. Bien que le projet soit une phase très précoce du développement, si l'issue du projet s'avère favorable, le développement dans lequel s'engage notre client pourrait aboutir, à terme, à la mise sur le marché de nouveaux médicaments.

Procédures

Les animaux seront soumis aux interventions suivantes: 1) Manipulations par les expérimentateurs pour des mesures de poids corporel (11 mesures au cours de l'étude; durée de la mesure : 1 minute); 2) Administration quotidienne de placébo ou d'un candidat médicament par gavage orale (35 administrations; durée de l'administration : 1 minute); 3) Prélèvement sanguin sous anesthésie (prélèvement; durée : 3 minutes).

Impact sur les animaux

De par leur caractère social, l'hébergement en cage individuelle constituera une nuisance d’isolement sur les animaux. Les animaux garderont toutefois un contact visuel et olfactif avec leurs congénères. Les mesures régulières du poids corporel peuvent provoquer un stress léger, notamment en raison de la manipulation et de la restriction temporaire des mouvements. Les traitements par gavage oral, réalisés pendant 5 semaines, peuvent entraîner une gêne légère et un stress modéré. Bien que des études préliminaires aient été conduites préalablement à notre étude, des effets indésirables pourraient être induits par les composés testés. Enfin, au dernier jour de l’étude, les animaux seront anesthésiés ce qui pourra engendrer un stress de courte durée pour permettre la réalisation d'un prélèvement sanguin.

Devenir

A l'issue de la procédure, les animaux seront mis à mort afin de réaliser un dosage d'Ocytocine tissulaire.

Remplacement

Une première série d'étude a été conduite in vitro afin de vérifier l'impact des composé testés sur un modèle de cultures cellulaires ensemencées à l'aide de la bactérie L. reuteri. Néanmoins, la complexité du microbiote intestinal ne peut pas encore être modélisée in vitro et l’utilisation d’animaux à des fins scientifiques se justifie ici car il est nécessaire de vérifier l'efficacité des composés dans un organisme entier.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés a été calculé et rationalisé à partir de l'expérience acquise par notre laboratoire sur l'analyse des paramètres d'intérêt. Ainsi, le nombre d'animaux par groupe a été adapté en fonction des paramètres d'intérêt de façon à être en mesure de mettre en évidence une différence statistiquement significative sur les paramètres étudiés. Les données seront analysées à l'aide de tests statistiques appropriés.

Raffinement

Le protocole a été planifié de façon à limiter au maximum tout stress et tout inconfort pour les animaux. Les traitements seront administrés par des expérimentateurs expérimentés à ce type de pratique. Les animaux seront hébergés en cages individuelles pour les besoins de l’étude, avec accès à l'eau et à la nourriture ad libitum. Les animaux conserveront des contacts olfactifs et visuels, et un enrichissement des cages sera assuré par l'ajout d'igloos, de matériels de nidification et de briquettes en bois spécialement conçues pour les rongeurs. Le prélèvement sanguin réalisé au jour 28 (D28) sera précédé d’une anesthésie afin de limiter le stress des animaux. Enfin, un suivi quotidien des animaux à l'aide d'une grille de score permettra une intervention rapide en cas d’atteinte des seuils établis. Ces interventions incluent, entre autres, une surveillance renforcée et l’emploi d’analgésiques en cas de douleur avérée.

Choix des espèces

La souris, comme tout modèle animal, est un modèle qui présente des différences dans la composition exacte du microbiote comparativement à l'humain. Néanmoins, on observe une bonne conservation des grands types bactériens entre humain et souris. Par ailleurs, l'interaction microbiote/ocytocine est conservé chez les deux espèces. La souris reste donc un modèle d'intérêt sur le plan préclinique. Les animaux seront utilisés au stade adulte. Le choix de ce stade de développement est guidé par la population humaine ciblée par les composés testés, à savoir une population adulte.

864 souris subissent une neurochirurgie de 45 minutes et 288 une chirurgie viscérale, sous anesthésie et analgésie. Au total 1 792 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées ensuite pour prélever le cerveau ou d'autres tissus. Cinq cent douze d'entre elles passent quatre semaines seules en cage pour un conditionnement opérant, 544 subissent un jeûne de 24 heures, et le régime gras est censé faire grimper leur poids jusqu'à 200 % du poids initial sur vingt semaines. Le porteur annonce des tests comportementaux sur 656 souris, d'une durée de dix à cent vingt minutes, sans préciser lesquels.

Objectifs

L’obésité est problème majeur de santé publique. Cette maladie chronique touche presque 18% de la population française (quasiment la moitié des français.es si l’on compte aussi les personnes en surpoids). Elle s’accompagne de nombreuses comorbidités, notamment le diabète et les symptômes anxieux et dépressifs. On sait aussi que les bactéries de l'intestin (le microbiote) est déréglé dans l'obésité. Afin d’envisager de nouvelles thérapies pour limiter les comorbidités associées à l’obésité, il est nécessaire de mieux comprendre comment le cerveau contrôle le poids corporel et les émotions, et comment l'intestin communique avec le cerveau. Nous voulons tester l'hypothèse selon laquelle certaines cellules du cerveau, appelées cellules gliales, sont sensibles à des molécules produites par le microbiote intestinal. Nous pensons que les animaux mâles et femelles ne répondront pas de la même façon à ces molécules.

Bénéfices attendus

Les informations tirées de la réalisation de ce projet permettront de mieux comprendre la communication entre l’intestin et le cerveau, notamment le rôle de certaines cellules gliales dans les dérèglements métaboliques et cognitifs en réponse à un régime riche en calories. Ce projet a une véritable portée translationnelle dans la mesure où s’ils supportent notre hypothèse, l’utilisation de ces molécules produites par le microbiote (également retrouvés dans le sang humain) pourrait éventuellement être proposée pour traiter des personnes souffrant d’obésité avec présence de diabète ou de symptômes anxieux. De plus, si nos résultats diffèrent entre les deux sexes, cela permettra de cibler une population donnée, ce qui participe à la mise en place d’une médecine de précision.

Procédures

1) Analyse de la composition corporelle sur animaux vigiles : 5 min, entre 1 et 5 fois. Nombre d’animaux : 1492. 2) Chirurgie viscérale, sous anesthésie et antalgie, 20 min, 1 fois. Nombre d’animaux : 288. 3) Neurochirurgie sous anesthésie et antalgie, 45 min, 1 fois. Nombre d’animaux : 864. 4) Test de tolérance au glucose et à l’insuline sur animaux vigiles : Entre 4 et 6 mesures de glycémie sur une goutte de sang. Chaque mesure dure 10sec, espacées de 10 min. Nombre d’animaux : 560. 5) Enregistrements de la consommation de nourriture, d’eau, d’oxygène et l’activité physique. Durée : 16 jours en hébergement individuel. Nombre d’animaux : 144. 6) Mise à jeun, 24h, entre 1 et 2 fois, espacée d’une semaine. Nombre d’animaux : 544 (1 fois), 48 (2 fois). 7) Tests comportementaux. Durée : entre 10 et 120 min, répété 1 fois pour chaque test, espacé de minimum 1 jour. Nombre d’animaux : 656. 8) CONDITIONNEMENT OPERANT. DUREE : 4 SEMAINES en HEBERGEMENT INDIVIDUEL. NOMBRE D’ANIMAUX : 512.

Impact sur les animaux

1. Stress induit par l’hébergement individuel : ceci ne sera réalisé uniquement lorsque la mesure des apports et des dépenses énergétiques individuels (calorimétrie indirecte) ou une tâche d’apprentissage avec accès individuel contrôlé aux mangeoires (conditionnement opérant) sont nécessaires. Durée maximum : 4 semaines. Légère perte de poids initiale (5 %) sur les deux premiers jours avant reprise de la croissance normale (basée sur nos observations antérieures). 2. Stress de contention lors de l’analyse de composition corporelle. Ce test nécessite de placer l’animal dans un tube en plastique au fond duquel les souris sont bloquées. Ce stress est cependant d’une durée limitée, l’analyse ne prenant que 5 minutes au maximum. 3. Prise de poids consécutive au régime gras HFD (sur 20 semaines maximum). La prise de poids estimée (basée sur nos études antérieures) ne devrait pas dépasser 200% du poids initial. 4. Perte de poids consécutive au jeun (4h ou 24h). La perte de poids estimée (basée sur nos études antérieures) ne devrait pas dépasser -10% du poids mesuré le jour précédent. 5. Perte de poids/appétit post-opératoire. La peau et soit le périoste, soit la paroi péritonéale devant être incisés, une douleur post-opératoire est attendue. La reprise de poids est attendue dès le deuxième à troisième jour post-opératoire (basée sur nos études antérieures). 6. Stress induit par les tests comportementaux. La durée réduite de chacun des tests (moins de 2h, sans manipulation) n’induit pas de nuisances sévères (pas de perte de poids attendue). 7. Les complications chirurgicales (mauvaise cicatrisation, hémorragie) devraient rester bien en dessous du seuil de 20% du nombre total d’animaux (d’après nos études antérieures). 8. Stress induit par des prélèvements sanguins répétés (maximum 6 prélèvements consécutifs en 2h). 9. Stress métabolique suite à des variations importantes de la glycémie (hyper ou hypoglycémies pendant 2h maximum).

Devenir

À l’issue de chaque procédure, les animaux seront mis à mort et des tissus seront récupérés (cerveaux ou autres), pour des études réalisées post-mortem.

Remplacement

Ce projet et notre hypothèse sont basés sur des résultats d’études cliniques chez l’Homme (variation de concentration sanguine des molécules du microbiote chez des populations obèses). Le but de ce projet est de comprendre le rôle de l’axe intestin-cerveau dans la mise en place des désordres métaboliques et cognitifs induits par l’obésité. Dans ce contexte, la région cérébrale que nous étudions n’est pas isolée, et interagit avec d’autres structures du cerveau mais également avec des organes périphériques (notamment l’intestin où réside le microbiote intestinal). Les effets que nous étudions sont donc la résultante de cette communication entre divers réseaux de neurones et la périphérie. Les variables métaboliques (poids, composition corporelle, régulation de la glycémie) et le comportement intégré (anxiété) nécessite l’utilisation d’un modèle animal. En effet, des interactions aussi complexes ne peuvent être modélisées in vitro, et certains des effets étudiés cités plus haut nécessitent un animal vivant. De même, il n’existe pas encore de modèle informatique qui pourrait remplacer l’animal dans le cadre de cette étude.

Réduction

Nous avons utilisé des tests mathématiques (test de puissance statistique) pour déterminer le nombre minimum d’animaux nécessaire pour obtenir des résultats exploitables statistiquement. Afin de réduire le nombre d’animaux utilisés, nous avons optimisé la stratégie de croisements des animaux reproducteurs afin d’utiliser tous les animaux d’une même portée (animaux contrôles et génétiquement modifiés sont frères et sœurs) et donc ne pas multiplier le nombre de portée avec des animaux qui ne présenteraient pas les caractéristiques (génotype) attendues. De plus, nous avons regroupé dans la mesure du possible nos différents tests métaboliques sur les mêmes animaux, de manière à obtenir un maximum d’information à partir des mêmes animaux. En particulier, l’analyse de la composition corporelle (masse grasse vs masse maigre) est réalisée dans un appareil qui ne nécessite pas la mise à mort des animaux. Cela nous permet ainsi de réaliser plusieurs mesures à des temps différents sur les mêmes animaux, au lieu d’avoir recours à des lots différents. Pour l’analyse des résultats, nous comparerons les différents groupes expérimentaux avec l’aide de différents tests statistiques adaptés au type de mesures comparées.

Raffinement

Nous avons défini différents points de raffinement tout au long de l’étude : 1) Période d’habituation avant utilisation en expérimentation de 1 semaine minimum. 2) L’évaluation de la prise alimentaire nécessite parfois la répartition des animaux en cages individuelles. Pour compenser le manque d’interactions sociales, les cages, transparentes et enrichies, seront rapprochées au maximum les unes des autres. L’environnement sonore permettra de limiter le stress des bruits extérieurs (radio). 3) Notre étude nécessite des chirurgies qui seront réalisées sous anesthésie générale avec un protocole analgésique ainsi que des mesures de maintien du bien-être animal décrites précisément dans les procédures. 4) Des points limites précoces et terminaux appropriés ont été définis avec des mesures conservatoires prévues pour chaque critère.

Choix des espèces

LLes caractéristiques suivantes font de la souris un animal de choix pour notre projet de recherche. 1) sa physiologie générale est suffisamment proche de celle de l’être humain ce qui fait que les résultats obtenus chez la souris sont transposables à l’Homme 2) petite taille facilitant son hébergement 3) court cycle de reproduction permettant d’avoir un nombre suffisant d’animaux rapidement 4) possibilité d’obtenir des animaux génétiquement modifiés 5) comportement alimentaire et émotionnel depuis longtemps étudiés chez la souris 6) bon nombre des tests comportements existants chez la souris donnent des résultats qui sont transposables à l’Homme Toutes les souris de cette étude seront étudiées à l’âge adulte (à partir de 8 semaines), âge qui correspond à un stade où le crâne a fini sa croissance, ce qui permet l’utilisation d’une cartographie de référence du cerveau (atlas stéréotaxique) pour les neurochirurgies.

Les animaux qui perdent plus de 20 % de leur poids en trois jours, avec prostration et dos courbé, sont mis à mort. 4 750 souris, rats et hamsters dorés vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, tous tués à l'issue pour prélever foie, sang et tissus. Ils reçoivent des régimes gras et sucrés, parfois additionnés d'éthanol, pendant jusqu'à 60 semaines, avec un ou deux gavages par jour, des tests de tolérance au glucose, des séjours de 40 heures en cage individuelle sans enrichissement et des courses de 20 minutes sur tapis roulant. Le porteur retient le hamster parce qu'il consomme spontanément l'alcool, et rattache ce choix à la hausse de la consommation humaine depuis les confinements liés au COVID-19.

Objectifs

L’augmentation de l'urbanisation dans le monde, combinée à la consommation d'aliments contenant des quantités importantes de graisses, d’acides gras saturés et de fructose sont considérés comme les principaux responsables des troubles métaboliques. Les mécanismes physiologiques ancestraux favorisant le stockage de l'énergie sous forme de graisse dans le tissu adipeux, le foie et le sang pour assurer la survie de l’individu en cas d’absence de nourriture, sont maintenant associés à l’obésité, la résistance à l'insuline, au diabète de type 2 et la Stéatose Hépatique Non-Alcoolique (NASH) . Dans ce contexte, un effort de recherche continu est engagé pour développer un ou des traitement (s) pour lutter contre ces dysfonctionnements. Ces dysfonctions métaboliques sont très complexes et sont liées entre elles, les études in vitro servent pour cibler le potentiel thérapeutique des molécules mais il est essentiel de pouvoir tester ces molécules sur des modèles animaux proche de l'Homme. Il est important de mesurer les dysfonctions métaboliques, cardiaques et rénales car à ce jour, il n’y a pas de thérapies efficaces pour les traiter. En outre, ces modèles animaux ne tiennent pas compte du fait que les patients atteints de NASH consomment également de l'alcool. Il a été démontré que la consommation d'alcool favorise la progression de la NASH vers des formes plus sévères. De plus, cette consommation d'alcool a considérablement augmenté dans la population générale depuis la pandémie de COVID-19, à cause des périodes de confinements. Par conséquent, il est important d'inclure la contribution de l'alcool dans les complications hépatiques liées à l'obésité et la NASH afin de mieux modéliser le contexte humain. Si les modèles d'alcool chez le rat ou la souris ne sont pas très pertinents car ces deux espèces ne sont pas naturellement attirées par l’alcool, le hamster est un modèle intéressant car il consomme spontanément et métabolise efficacement l'éthanol. Cette capacité serait liée à l'anatomie particulière de l'estomac du hamster, qui se compose de deux compartiments où la fermentation alcoolique des aliments ingérés, a lieu dans la poche pré-gastrique. Ces modèles seront utiles pour tester des thérapeutiques potentielles ciblant l'obésité, le diabète, la dyslipidémie, la stéatose, la NASH, la fibrose et l'inflammation.

Bénéfices attendus

L'intérêt de ce projet est le développement de modèles nutritionnels ressemblant à la réalité humaine occidentale (sédentarité et régime hyperénergétique avec ou sans alcool) qui permettront de mieux comprendre les mécanismes impliqués dans le développement des maladies métaboliques et ainsi de tester et valider plus rapidement de nouvelles thérapies pour le traitement de l'obésité, de la NASH, de la fibrose, des maladies cardiovasculaires et rénales associées aux maladies métaboliques, qui sont parmi les maladies les plus problématiques pour la santé publique française et mondiale.

Procédures

Pour induire des dysfonctions métaboliques, des régimes hypercaloriques associés ou non à des boissons enrichies en fructose et/ou en éthanol et/ou en composé chimique pro-inflammatoire seront mis à disposition dans les cages d'hébergement à partir de 4 ou 6 semaines d'âge et jusqu'à la fin du projet (jusqu’à 60 semaines). Les composés à tester/de référence seront administrés une à deux fois par jour par toutes voies possibles (1 minute sur animal vigile et 5 minutes sur animal anesthésié). 3 prélèvements de sang seront réalisés au cours de la vie de l’animal afin de suivre des paramètres biologiques ou l’élimination des produits testés. Un prélèvement de sang dure environ 2 minutes par animal. Dans le cas de prélèvements de sang visant à quantifier des paramètres métaboliques, les animaux seront mis à jeun 6h maximum avant le prélèvement. Des tests de tolérance au glucose et à l’insuline pourront être effectués la semaine précédant la fin de projet. La surcharge en glucose ou en insuline pour un animal diabétique induit une difficulté de retour à l’euglycémie. Si l’animal montre des signes de détresse, nous pourrons l’aider à retrouver une glycémie normale en administrant soit du glucose soit de l’insuline. Pour mesurer la fonction cardiaque, nous ferons des échocardiographies sur animal anesthésié en fin de projet (durée inférieure à 30 min). Pour mesurer la dépense énergétique, nous hébergerons les animaux pendant 40h en cage individuelle sans enrichissement, en début, milieu et fin de période de traitement. POUR MESURER LA FORCE MUSCULAIRE, NOUS TESTERONS L'AGRIPPEMENT SUR GRILLE (2 MINUTES DE FACON HEBDOMADAIRE) ET LA DUREE DE COURSE SUR TAPIS ROULANT EN MESURANT LES ECHANGES GAZEUX (20 MINUTES TOUS LES 15 JOURS). Pour mesurer l'impact sur la fonction rénale, nous mesurerons le débit de filtration glomérulaire en début et en fin de projet et la mesure de divers paramètres urinaires en cage métabolique uniquement en fin de projet. Cela consiste à administrer un composé fluorescent par voie veineuse (sous anesthésie pendant environ 10 minutes) et de mesurer sa distribution via un capteur posé sur la peau pendant 2h (animal vigile). Pour faire les échographies, nous devrons au préalable épiler les animaux, sous anesthésie pendant environ 10 minutes. Les récoltes d'urine se feront sur 24h en cage métabolique.

Impact sur les animaux

Les animaux seront nourris à partir de 4 ou 6 semaines d'âge en fonction de la procédure et jusqu'à la fin du projet (jusqu’à 60 semaines) avec des régimes enrichis en graisse et ou en sucre, cela va modifier leur métabolisme. Les effets indésirables sont les dysfonctions métaboliques : obésité, diabète, stéatose hépatique qui peuvent engendrer de la douleur. Les administrations et les prélèvements peuvent engendrer un léger stress et une douleur légère. Les animaux auront des mises à jeun alimentaires de 6 heures maximum. Certaines techniques nécessitent une anesthésie légère, l’animal peut mettre quelques minutes à récupérer. Durant les récoltes urinaires, les animaux seront isolés et hébergés sur grille pendant 24h.

Devenir

En fin de projet, tous les animaux seront euthanasiés pour récupération de tissus et de sang, et évaluation de critères d’efficacité des composés (histologie, immuno marquages et expression de gènes dans le foie, paramètres métaboliques et de fonction hépatique dans le sang...)

Remplacement

Des projets de cultures ainsi que de co-cultures cellulaires sont de plus en plus développées pour tenter de mimer les différents organes. Ce seront des alternatives à l'utilisation de l'animal, notamment pour les études de screnning, de toxicité et d'efficacité sur l’organe cible. Cependant, ces modèles ne sont encore suffisamment développés et ne sont pas un miroir suffisamment fiable de ce qu'il se passe dans la complexité de l’organisme. Les dysfonctions métaboliques associées aux complications hépatiques, cardiovasculaires et rénales ne peuvent être envisagées et reproduites que dans un système in vivo pour le moment.

Réduction

Avec un nombre final d'animaux égal à 10 par groupe de traitement, une différence de +/- 30% est théoriquement détectable. La stratégie expérimentale consiste à mesurer les valeurs de chaque paramètre mesurable de façon longitudinale (taux de lipides, glycémie, taux de transaminases, marqueurs inflammatoires dans le sang/plasma), l'animal est donc son propre contrôle, dans la mesure du possible, ce qui permettra de réduire le nombre d'animaux par groupe.

Raffinement

Plusieurs types d'enrichissements seront placés dans les cages hébergeant les animaux : des objets en bois seront systématiquement ajoutés pour permettre aux rongeurs de les mordiller. En effet, le régime gras est assez mou contrairement aux croquettes classiques, donc cet enrichissement est très adapté. La durée de ces projets étant souvent longue, nous alternerons les enrichissements au fil du temps (petits ou gros tunnels, boules ou briquettes en bois, lanières de papier ou morceaux de coton). L'état des animaux sera contrôlé quotidiennement, le poids corporel, la prise alimentaire et la prise hydrique seront mesurés par du personnel compétent afin de s'assurer de leur bien-être. Si un animal ne suit pas la courbe de poids attendue, une recherche approfondie d’éventuels symptômes sera faite. Les points limites de ce projet seront les suivants : absence de mouvement, piloérection et dos courbé. Si un animal présente des signes de stress ou de douleur, il sera pris en charge par l'équipe zootechnique et la structure du bien-être animal. Des soins tels que : hydratation et mise en place de nourriture dans la litière si nécessaire seront effectués. Si l'animal présente une dermatite, par exemple, un protocole de soin sera effectué (nettoyage / désinfection / cicatrisation). Si l'état de l'animal ne s'améliore pas dans les 48 heures, les expérimentateurs compétents excluront l'animal de l'étude et l'euthanasieront. Si un animal atteint l'un des points limites, il sera euthanasié immédiatement. Pendant la phase de traitement, si la perte de poids est supérieure à 20% en l'espace de 3 jours et associée à d'autres signes tels que la prostration, le dos courbé et l'absence de toilettage, l'animal doit être euthanasié ou la dose et la fréquence de traitement adaptées.

Choix des espèces

Les souris et les rats sont suffisamment caractérisés pour l'étude des maladies métaboliques. Les hamsters présentent un métabolisme du cholestérol et des acides biliaires semblable à celui des humains. Les rats et les hamsters peuvent aider à étudier les effets de médicaments potentiels pour les complications cardiovasculaires (dysfonctionnement diastolique) et rénales. Chez les hamsters, la combinaison d'un régime riche en graisses, en cholestérol et en fructose et de la consommation d'alcool peut imiter le mode de vie de certains patients atteints de NASH, notamment pendant et après le confinement lié à la pandémie COVID-19. Si le modèle associé à la consommation d'alcool chez le rat ou la souris n'est pas très pertinent, le hamster est un modèle intéressant car il consomme et métabolise l'éthanol très facilement. Cette capacité serait liée à l'anatomie particulière de l'estomac du hamster, qui se compose de deux compartiments où la fermentation alcoolique des aliments ingérés a lieu dans la poche prégastrique. Les animaux sont utilisés à partir de 4 ou 6 semaines d’âge afin d'être similaire à la problématique humaine (sédentarité et alimentation hyper énergétique) dès le jeune âge.

2 200 souris subissent une électrostimulation sous anesthésie destinée à léser leur muscle, puis une mesure de force musculaire également sous anesthésie. Toutes vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le porteur qualifie ce dispositif de "totalement non-invasif" alors qu'il sert à endommager le muscle, et affirme que l'interaction entre cellules ne peut être étudiée qu'in vivo. Les souris sont tuées pour prélever le tissu musculaire et analyser le métabolisme des cellules souches qu'il contient.

Objectifs

Le muscle squelettique peut se réparer complètement après une blessure grâce au processus de régénération musculaire. Cette régénération est notamment médiée par une population cellulaire spécifique, les cellules souches musculaires. De précédentes études ont démontré l’importance du métabolisme dans la fonction de ces cellules. Le projet vise à i) caractériser le comportement et le destin de cette population cellulaire au cours de la régénération, ii) identifier les régulations métaboliques sous-jacentes, iii) identifier des cibles biologiques qui permettraient d’influer sur la régénération musculaire.

Bénéfices attendus

Le projet permettra de caractériser les régulations métaboliques qui surviennent au cours de la régénération musculaire et d’identifier des cibles potentielles qui permettraient d’influer sur cette régénération. De plus, les analyses réalisées au cours de ce projet conduiront à la création d’une base de données importante sur le métabolisme des cellules souches lors de la régénération musculaire qui pourra alimenter des projets ultérieurs et être mise à disposition de la communauté scientifique. A terme, ce projet pourrait permettre d’améliorer la prise en charge des atteintes musculaires associées à plusieurs situations physiopathologiques.

Procédures

Les souris sont soumises à un protocole d’exercice (sous anesthésie générale, durée 15 minutes maximum) et à une une mesure de force musculaire sous anesthésie.

Impact sur les animaux

Des nuisances et effets indésirables "modérés" sont attendus du fait d’un cumul d’actes (électrostimulation, anesthésies). Le stress des animaux inclut : 1) l'anesthésie gazeuse lors de l'induction de la blessure musculaire (environ 15 minutes), 2) l'anesthésie gazeuse avant la mise à mort (environ 1 minute).

Devenir

Les animaux sont mis à mort en vue de récupérer le tissu musculaire pour des analyses tissulaires, cellulaires et moléculaires.

Remplacement

Bien que l'analyse de la régénération musculaire puisse être en partie étudiée in vitro, ce processus repose notamment sur l’interaction entre différentes cellules qui ne peut être étudiée qu'in vivo, justifiant le recours à l'expérimentation animale.

Réduction

L'utilisation des animaux est strictement réduite au nombre nécessaire pour l'établissement des données expérimentales, à l'aide des analyses statistiques effectuées précédemment pour ces procédures. Nous utilisons un dispositif expérimental totalement non-invasif qui permet de réaliser un dommage musculaire induit par l’exercice et de mesurer la force musculaire de manière concomitante sur les mêmes animaux rendant les préparations chirurgicales totalement obsolètes et réduisant ainsi le nombre d’animaux utilisés.

Raffinement

Les protocoles les moins invasifs et les moins douloureux possibles sont privilégiés. La procédure expérimentale utilisée inclut un recours systématique à l'anesthésie générale adaptée lors de l’exercice et de la mesure de la force musculaire.

Choix des espèces

Des travaux précédents ont montré que les processus mis en œuvre au cours de la régénération musculaire chez la souris sont proches de ceux observés chez l'homme. Les animaux utilisés sont âgés de 8-12 semaines, ce qui correspond à des animaux jeunes adultes.

Le mode d'administration, le nombre de prélèvements et le rythme des doses dépendent ici de l'appréciation du client. 400 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour prélèvement d'organes. Les expérimentateurs leur injectent des anticorps IgE, puis l'allergène vingt-quatre heures plus tard pour déclencher une réaction anaphylactique, qui provoque une chute de la température corporelle, de fortes démangeaisons et parfois un gonflement du museau. Aucun anti-inflammatoire ni analgésique ne leur sera administré, un tel traitement faussant la mesure de la réaction, et le porteur ajoute qu'une molécule doit avoir été testée chez l'animal pour obtenir une autorisation de mise sur le marché.

Objectifs

Quel que soit l’âge du patient, l’anaphylaxie est une réaction allergique grave qui apparait rapidement et peut être mortelle même en cas de prise en charge rapide. Elle est imprévisible et peut être déclenchée par différents types d'allergènes (l’ovalbumine contenue dans les œufs, le venin d’abeille…). Les patients qui déclenchant l’anaphylaxie ont été en contact une première fois avec l’allergène ce qui a induit une réponse de leur système immunitaire qui, lors d’un deuxième contact, va réagir de manière excessive pour combattre l’allergène. L’anaphylaxie peut alors déclencher une baisse de la pression artérielle, des douleurs abdominales, des démangeaisons autour de la bouche…amenant jusqu’à la mort du patient en quelques heures ou minutes. À ce jour, il est donc impératif d’améliorer le suivi des patients et de diminuer le risque de décès. Pour ce faire, il est nécessaire de disposer de modèles animaux fiables mimant la physiopathologie de l’anaphylaxie. L’objectif scientifique de ce projet est d’évaluer l’efficacité de nouvelles molécules thérapeutiques sur la récupération des souris suite à l’induction d’une anaphylaxie générale ou d’une anaphylaxie locale cutanée. Les animaux seront d’abord mis en contact avec l’allergène une première fois par injection, puis une deuxième fois avec une deuxième injection qui déclenchera alors la réaction anaphylactique. Les animaux recevront la molécule thérapeutique à tester avant, pendant ou après l’induction de l’anaphylaxie, dépendamment du mode d’action et de la connaissance que possèdent nos clients sur l’efficacité potentielle de leur molécule. Le sang et les organes prélevés dans les études inclues dans ce projet permettront de répondre à l’objectif de caractérisation et de quantification de l’inflammation et d’évaluer l’efficacité de la molécule testée. L’objectif général de ce projet est de contribuer au développement de nouvelles stratégies thérapeutiques pour une meilleure prise en charge des patients et réduire leur risque de mourir.

Bénéfices attendus

Le bénéfice attendu à court et moyen termes réside dans l’identification des mécanismes impliqués dans l’atténuation des symptômes de l’anaphylaxie. Le bénéfice attendu à long terme de ce projet est l’identification de nouvelles stratégies thérapeutiques permettant une meilleure prise en charge des patients sujets à l’anaphylaxie et une réduction de la mortalité associée.

Procédures

Plusieurs interventions pourront être mises en place sur les animaux. L’induction de la pathologie (une seule fois par animal) pourra se faire par injection intraveineuse ou intrapéritonéale des IgE (anticorps produits en cas de réponse allergique) et de l’allergène correspondant 24h plus tard (allergène de synthèse). Pour cela, les souris seront anesthésiées (5minutes) à l’aide d’un gaz anesthésiant et recevront l’injection intraveineuse (1 minute) pour la voie intraveineuse. L’injection se fera sans anesthésie pour la voie intrapéritonéale (30 secondes). L’induction de la pathologie pourra aussi se faire par injection sous-cutanée des IgE (anticorps produits en cas de réponse allergique) puis injection intraveineuse de l’allergène correspondant 24h plus tard. Pour cela, les souris seront anesthésiées (5minutes) à l’aide d’un gaz anesthésiant et recevront l’injection sous-cutanée (1minute) puis, 24h plus tard, les souris seront de nouveau anesthésiées à l’aide du gaz anesthésiant et recevront l’injection intraveineuse (1 minute). Au cours de la procédure, les souris recevront des administrations répétées de composés client : les modes d’administration possibles incluent l’alimentation, l’eau de boisson, le gavage, les injections intrapéritonéale, sous-cutanée, intravasculaire, intradermique (environ une minute par animal : saisie de l’animal, pesée de l’animal pour adapter la dose, puis administration de la substance). Selon l’appréciation du client, un ou plusieurs prélèvements de sang pourrons être effectués. Les prélèvements de sang n’excèderont pas 12 % du volume de sang total de l’animal et seront suivis d’une semaine minimum de récupération avant le prochain prélèvement. Le volume prélevé est dépendant du poids de l’animal.

Impact sur les animaux

L’anaphylaxie généralisée provoque comme effets indésirables : une baisse de la température corporelle et une sensation de démangeaison importante. Parfois, un gonflement du museau peut être observé. L’anaphylaxie cutanée provoque comme effets indésirables : une sensation de démangeaison localisée à l’oreille ainsi qu’un léger gonflement de l’oreille. La réalisation de prélèvements sanguins et les administrations (uniques ou répétées, selon les études) pourront également générer un stress chez l’animal. Les modes d’administration considérés comme nuisibles (pouvant induire une gène ou une douleur) incluent tous les modes d’injection.

Devenir

Tous les animaux du projet seront mis à mort à l'issue des procédures afin de pouvoir procéder aux prélèvements d'organes et à la caractérisation du statut inflammatoire terminal.

Remplacement

Lorsque cela sera possible, les composés de nos clients seront préalablement testés sur culture cellulaire ou organes isolés permettant ainsi de mieux définir les doses à administrer par exemple. Cependant, l’utilisation des animaux sera nécessaire car les modifications physiopathologiques liées à l’anaphylaxie sont très complexes, doivent être mesurées dans un organisme entier. De plus, pour obtenir une autorisation de mise sur le marché, une molécule doit avoir été testée chez l’animal afin d’engranger des preuves d’efficacité fonctionnelle et de détecter d’éventuels effets indésirables. Nous devons donc être en mesure de prévoir l’apparition d’effets secondaires dans l’éventualité de l’utilisation future des candidats médicaments en clinique. Les effets indésirables ne peuvent s’observer que sur un animal vivant car ils peuvent impliquer plusieurs organes et plusieurs régulations physiologiques. L’utilisation des animaux sera donc essentielle à nos études mais nous nous efforcerons de limiter au maximum le nombre d’animaux utilisés en effectuant des tests préliminaires sur d’autres modèles n’impliquant pas les animaux.

Réduction

Au sein de cette étude, nous avons réduit le nombre d'animaux utilisés au maximum pour une étude statistique soit 8 animaux par groupes. La comparaison des groupes entre eux sera faite à l'aide de test statistiques. Le nombre d’animaux nécessaires pour répondre aux différentes problématiques scientifiques exposées dans ce projet a été déterminé en se basant sur des travaux préliminaires ainsi que sur l’expertise de notre société sur l’utilisation de ces modèles animaux. Les doses à tester seront au préalable, systématiquement évaluées après documentation dans la littérature ou par retour d’expérience du client. Par ailleurs, compte tenu de la variabilité des paramètres observés au sein d’un groupe homogène, une analyse sur des groupes de 8 animaux sera nécessaire afin de pouvoir mettre en évidence des différences statistiques. Les tests statistiques seront réalisés sur un ligiciel spécifique afin de vérifier les différences obtenues entre les groupes.

Raffinement

Les procédures seront réalisées en respectant le bien-être animal, afin de limiter souffrance, douleur et angoisse. Les souris seront hébergées conformément à la réglementation avec enrichissement environnemental (igloo, carrés de ouate systématiquement et, si nécessaire, tunnel en carton, buchettes et boulettes en bois). Après induction de la pathologie, un suivi régulier sera effectué (score 1 et/ou score 2). Le score 1, reportera l’aspect général de l’animal et sera mis en place dans les deux modèles. Le score 2 reportera la réponse clinique à l’induction de la pathologie. L’atteinte d’un score trop important induira la sortie de l’animal de l’étude et sa mise à mort s’il ne récupère pas dans les heures qui suivent. Étant donné que l’anaphylaxie est basée sur l’inflammation, aucun traitement anti- inflammatoire ou analgésique ne sera administré, car cela compromettrait les résultats en agissant sur les voies de signalisation ciblées ainsi que sur le comportement et l’état physique, paramètres clés de l’évaluation. De plus, des interactions possibles entre le traitement testé et les médicaments anti-inflammatoires ne peuvent être exclues. Les prélèvements et administrations répétées pouvant induire du stress, un enrichissement sera maintenu. Les aiguilles et sondes de gavage seront adaptées au poids et au mode d’administration. Par ailleurs, lorsque cela sera nécessaire, des anesthésiques pourront être utilisés.

Choix des espèces

L’utilisation de souris dans la modélisation de pathologies présentes chez l’Homme a longuement été décrite et justifiée de par leur proximité avec l’Homme. Par ailleurs, la souris est largement décrite comme une espèce de choix dans les modèles de développement de maladies inflammatoires telles que l’anaphylaxie compte tenu des outils cellulaires et moléculaires existants. Il s’agit en effet d’un modèle bien établi et bien documenté dans la littérature pour l’analyse de la fonction immunitaire. Par ailleurs, l’étude de l’anaphylaxie nécessite des animaux ayant un système immunitaire mature, c’est-à-dire âgées de 7 à 12 semaines.