Procédures modérées

Pour suivre par IRM où se logent les vaccins à ARN messager après injection dans le muscle, 90 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune est anesthésiée jusqu'à neuf fois, dont quatre fois une heure pour l'imagerie, et subit cinq prélèvements sanguins submandibulaires entre le jour 0 et le jour 28. Le porteur reconnaît que les ponctions répétées peuvent blesser, et alterne les côtés de prélèvement pour cette raison. La méthode est présentée comme un progrès parce qu'elle évite la mise à mort et les biopsies de ganglions, alors que toutes les souris du projet sont tuées à la fin pour vérifier la distribution du vaccin dans ces mêmes ganglions.

Objectifs

Le projet consiste à suivre la biodistribution de vaccins ARNm après injection intramusculaire dans un modèle murin. Plus particulièrement, nous voulons connaître la cinétique d'accumulation dans les ganglions drainants qui est cruciale pour l'effet vaccinal. A cette fin, nous allons ajouter des propriétés d'imagerie IRM à des formulations d'ARNm de composition similaire aux vaccins COVID19. Nous mesurerons également les taux sériques d'anticorps pour établir un lien entre signal IRM dans les ganglions et activité immunologique. L’intérêt est que nous allons doser les anticorps anti-Spike (protéine du COVID19) et pour avoir une relation entre signal IRM dans les ganglions et anticorps circulants.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de mieux comprendre les cinétiques de distribution des vaccins dans les ganglions après injection intramusculaire et d'établir des relations entre présence des formulations ARNm dans les ganglions et activité vaccinale. En effet, les méthodes existantes nécessitent la mise à mort ou des biopsies de ganglions pour quantifier la présence de vaccins dans les ganglions. La méthode proposée permettra un suivi non invasif et sans biopsies de la biodistribution des vaccins dans les ganglions.

Procédures

Nous prélèverons le sang à J0, J7, J14, J21 et J28 pour quantifier les anticorps induits par test ELISA. Chaque souris sera anesthésiée au maximum 9 fois: 5 fois pour les prélèvements submandibulaires, 2 fois pour les injections intramusculaires et 4 fois pour l'IRM. Les anesthésies dureront 5 minutes maximum pour les injections et prélèvements et une heure pour l'imagerie IRM.

Impact sur les animaux

Nous ne nous attendons pas à une douleur suite à l’injection des formulations mis à part la douleur induite lors de l'injection liée à l'aiguille. L'injection de formulations ARNm par voie intramusculaire peut entraîner une réaction inflammatoire. Nous avons déjà administré des vaccins ARNm sans 19F chez la souris sans observer de réactions allergiques ou de douleur. Les ponctions de sang répétées peuvent être aussi à l’origine de blessures.

Devenir

Tous les animaux sont mis à mort en fin de procédure afin d'effectuer des prélèvements qui permettront d’analyser différents paramètres immunologiques et histologiques notamment de confirmer la distribution des formulations dans les ganglions.

Remplacement

Des études sur l'animal entier sont nécessaires pour tenir compte des interactions de l'organisme avec les formulations ARNm et établir un lien entre accumulation dans les ganglions et activité immunologique. Etant donné la complexité des processus mis en jeu, aucune méthode de remplacement fiable n’est disponible. Les méthodes existantes utilisent la radioactivité avec une résolution spatiale inférieure à l'IRM et une toxicité cumulative des radioélements qui limite la généralisation de ces approches pour un suivi chronique par exemple.

Réduction

L’effectif des souris mis en oeuvre est limité au strict minimum permettant d’obtenir des résultats exploitables statistiquement. Les mêmes souris seront utilisées pour l'imagerie IRM et prélèvements de sérum ce qui permettra de diminuer le nombre d'animaux. Nous réaliserons des tests statistiques (ANOVA). L’imagerie permet un suivi longitudinal et donc de réduire l’utilisation d’animaux

Raffinement

Des points limites prédictifs avec une grille de scoring seront mis en place. Les animaux seront suivis quotidiennement dès leur arrivée. les souris seront anestésiées durant les injections, durant l'imagerie IRM et durant les prélèvements de sang. Pour les injections intramusculaires, les souris recevront une injection sous cutanée d'antalgique 10 minutes avant l'injection intramusculaire. Nous alternerons le côté de prélèvement submandibulaire pour éviter les blessures dues aux ponctions répétées de sang.

Choix des espèces

Le modèle souris permet d'évaluer les capacités des formulations ARNm dans une espèce à cycle de vie court où les mécanismes immunitaires sont les mêmes que chez l'Homme mais à des échelles de temps compatibles avec un criblage des formulations ARNm. Nous utiliserons des souris Balb/c car c'est ce modèle qui a été utilisé dans nos expériences précédentes de vaccination ARNm et dans les expériences publiées avec les vaccins ARNm de référence. Les souris BALB/c sont un modèle standard crucial dans la recherche immunologique en raison de leur système immunitaire bien caractérisé et de leur réponse régulière aux antigènes, ce qui permet de tester efficacement l’immunogénicité et la sécurité des vaccins ARNm avant les phases cliniques humaines. Des souris adultes (à partir de 8 semaines) ayant un système immunitaire mature seront utilisées.

Les souris utilisées sont sévèrement immunodéficientes, condition sans laquelle les cellules tumorales et immunitaires humaines qu'on leur injecte seraient rejetées. 40 d'entre elles vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune reçoit une injection de cellules cancéreuses humaines dans l'abdomen, y développe une tumeur suivie deux fois par semaine par imagerie sous anesthésie, avec jusqu'à 17 administrations d'un réactif de détection, quatre injections intraveineuses dans la queue et 24 injections sous-cutanées. Toutes sont tuées à la fin pour le prélèvement d'organes, le porteur n'excluant pas une dissémination tumorale et une gêne respiratoire en cas de métastases pulmonaires.

Objectifs

L’immunothérapie dans le domaine du cancer est une approche thérapeutique qui vise à stimuler le système immunitaire du patient pour qu’il puisse éliminer les cellules cancéreuses. Parmi les approches disponibles, il est possible de récupérer certaines cellules immunitaires du patient, de les modifier afin qu’elles reconnaissent spécifiquement les cellules cancéreuses avant de les réinjecter au patient. Cette approche, appelée thérapie cellulaire, a démontré son efficacité dans de nombreux essais cliniques pour le traitement de différents cancers. Nous avons réussi à générer des cellules immunitaires modifiées capables de reconnaître différents types de cancers, tels que le cancer de l’ovaire et un sous-type de cancer du sein très agressif. De plus, nous avons démontré que ces cellules immunitaires modifiées sont capables d’éliminer des cellules cancéreuses in vitro. Cependant, il est nécessaire de vérifier leur potentiel thérapeutique in vivo. Dans ce projet, nous utiliserons des souris immunodéficientes permettant l’étude de la croissance tumorale en présence de cellules immunitaires humaines spécifiques. L’objectif principal est de valider la capacité de ces cellules immunitaires modifiées à éliminer les cellules cancéreuses in vivo, et de déterminer si la version optimisée du produit présente une efficacité supérieure à celle du traitement de référence.

Bénéfices attendus

En cas de résultats positifs, cette étude permettra de valider une nouvelle approche thérapeutique innovante pour les patients atteints de cancer, notamment de cancers de l’ovaire et du sein qui ne répondent pas aux traitements standards. Ceci accélèrera la validation préclinique de cet outil thérapeutique afin d’entamer le transfert vers la clinique.

Procédures

Pour réaliser l’injection intrapéritonéale de cellules cancéreuses humaines, chaque souris est brièvement maintenue pendant environ 15 secondes. Une seule injection sera effectuée par animal. À la suite de cette injection, les souris développeront une tumeur au niveau de la cavité abdominale. La croissance tumorale sera suivie par imagerie deux fois par semaine durant toute la durée de la procédure. La veille de la première mesure, les animaux seront rasés. Cette intervention, d’une durée d’environ 2 minutes, pourra être répétée une fois au cours de la procédure si nécessaire. Le jour de chaque acquisition, les animaux seront anesthésiés et maintenus brièvement afin de recevoir un réactif permettant la détection du signal tumoral, puis resteront sous anesthésie durant toute la séance d’imagerie (environ 10 minutes). Chaque souris pourra recevoir au maximum 17 administrations de ce réactif. Le traitement expérimental sera administré par voie intraveineuse au niveau de la queue, nécessitant une immobilisation d’environ une minute ; quatre injections intraveineuses seront effectuées par animal. Des injections sous-cutanées de molécules de soutien aux cellules lymphocytaires seront réalisées trois fois par semaine durant toute la procédure, soit un total de 24 injections sous-cutanées, avec une contention d’environ 15 secondes par geste. Les animaux seront également pesés deux fois par semaine durant la procédure, une contention de 15 secondes étant nécessaire pour cette opération.

Impact sur les animaux

L’injection de cellules tumorales dans la cavité abdominale de la souris est susceptible d’entraîner une douleur modérée et temporaire au moment de l’administration. À la suite de cette injection, les animaux développeront des tumeurs localisées principalement dans la cavité péritonéale. Toutefois, une dissémination tumorale ne peut être totalement exclue. En cas de formation de métastases, notamment au niveau des poumons, une gêne respiratoire pourrait survenir. L’injection intraveineuse du traitement dans la queue peut provoquer une gêne modérée et passagère au moment de l’injection. Des inflammations locales légères peuvent également apparaître à la suite de multiples injections. À ce jour, aucun effet indésirable majeur lié au transfert de cellules immunitaires modifiées chez la souris n’a été rapporté dans la littérature. Nous n’envisageons donc pas d’effets secondaires spécifiques liés à ce traitement. L’administration sous-cutanée de protéines solubles pourrait entraîner une douleur légère ou temporaire au site d’injection. De même, les injections intrapéritonéales répétées nécessaires au suivi de la croissance tumorale par imagerie peuvent induire une inflammation locale ou une gêne transitoire, sans conséquence durable sur le bien-être des animaux. Enfin, les manipulations répétées (injections, pesées, surveillances) peuvent occasionner un stress transitoire.

Devenir

A la fin de la procédure, les animaux seront mis à mort afin de prélever certains organes dans le but d’analyser leur composition immunitaire.

Remplacement

Des expériences in vitro ont déjà été réalisées afin de confirmer l’efficacité des cellules immunitaires modifiées générées et leur capacité à éliminer des cellules tumorales. Les animaux sévèrement immunodéficientes correspondent au modèle majoritaire pour l’évaluation de l’efficacité des thérapies cellulaires utilisant des cellules immunitaires modifiées puisqu’elles permettent la greffe de cellules tumorales humaines et l’injection de cellules immunitaires humaines en l’absence de cellules immunitaires murines. Ce modèle est le seul modèle vivo disponible dans le cadre de notre projet, aucune alternative non-animale n’est aujourd’hui disponible pour s’assurer de la fonctionnalité des cellules immunitaires modifiées in vivo, ce qui est l’objectif de cette étude.

Réduction

Le projet comporte une seule procédure expérimentale, ayant pour objectif principal de démontrer l’effet antitumoral du traitement standard et d’évaluer si la version optimisée de ce traitement présente une efficacité supérieure au produit non optimisé. Dans l’hypothèse où les résultats in vitro montreraient que le traitement optimisé est moins efficace que le prototype initial, aucun test in vivo ne serait réalisé avec ce traitement optimisé. Un outil statistique approprié a été utilisé pour déterminer le nombre minimal d’animaux nécessaire et suffisant afin de garantir la validité scientifique de l’étude tout en respectant le principe de réduction du nombre d’animaux utilisés. De plus, un ensemble optimal de données et d’échantillons sera collecté pour chaque animal, de manière à maximiser les informations obtenues tout en limitant le recours aux animaux au strict minimum requis pour répondre à l’ensemble des objectifs expérimentaux.

Raffinement

L’effet des composés (cellules cancéreuses et réactifs injectés) sur l’état physiologique des souris est suivi par observation clinique, pesée des animaux et mesure des tumeurs par imagerie. Des points limites adaptés sont définis de manière objective pour le projet, incluant des critères d’arrêt de l’expérience en cas de souffrance des animaux. Aucun effet indésirable lié à des molécules de soutien dans le modèle de souris utilisé n’est attendu. Les souris seront anesthésiées pour le suivi longitudinal réalisé par imagerie. Leur réveil est facilité en plaçant la cage sur un tapis chauffant.

Choix des espèces

Les souris utilisées correspondent au modèle majoritaire pour l’évaluation de l’efficacité des thérapies cellulaires utilisant des cellules immunitaires modifiées puisqu’elles permettent la greffe de cellules tumorales humaines et l’injection de cellules immunitaires humaines en l’absence de cellules immunitaires de souris. Ce modèle est le seul modèle vivo disponible dans le cadre de notre projet, aucune alternative non-animale n’est aujourd’hui disponible pour s’assurer de la fonctionnalité des cellules immunitaires transférées in vivo, ce qui est l’objectif de cette étude. Les animaux utilisés seront à l’âge de 6-8 semaines afin de pouvoir réaliser les greffes dans l’abdomen et l’injection en intraveineuse des cellules immunitaires dans des conditions optimales.

420 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent un composé par voie orale six jours sur sept pendant huit semaines, puis passent le rotarod, où elles sont forcées de marcher cinq minutes sur une roue en rotation, le test du gait, et le test de von Frey, qui applique des forces croissantes sur la patte au moyen d'un filament. La lignée utilisée porte une mutation de Mfn2 qui reproduit une dénervation musculaire et des défauts locomoteurs apparaissant après six mois. Le porteur indique que les composés ont déjà montré un effet bénéfique sur un modèle in vitro dérivé de cellules humaines de patients, et qualifie néanmoins le passage chez la souris d'étape "indispensable".

Objectifs

La maladie de Charcot Marie Tooth (CMT) est une maladie génétique touchant le système nerveux périphérique (SNP). Les patients souffrant de CMT présentent une faiblesse et atrophie musculaire prédominante aux membres inférieurs, des déformations squelettiques des extrémités, ce qui entraine une difficulté pour se mouvoir et pour les formes de CMT les plus sévères, la nécessité d'un fauteuil roulant. Contrairement à la maladie de Charcot (ou sclérose latérale amyotrophique), la CMT ne réduit pas l’espérance de vie des patients, mais affecte fortement leur qualité de vie. Une des formes les plus fréquente de CMT est la forme CMT2A. Au niveau cellulaire, nos travaux précédents ont montré que la Mfn2 mutée entraine des défauts d'organelles dans les neurones conduisant à l’activation d’un stress cellulaire . Ce projet a pour but de tester plusieurs composés pharmacologiques, dont l’effet a d’abord été validé dans des modèles cellulaires, permettant d’améliorer le contact entre ces deux organelles et de réduire le stress cellulaire, dans un modèle murin modélisant de la maladie CMT2A.

Bénéfices attendus

L'ensemble de ce projet nous permettra de déterminer si ces composés pharmacologiques représentent une possibilité thérapeutique pertinente pour la CMT2A. Si un effet bénéfique est obtenu, cela pourrait dans le futur conduire à un essai clinique chez l’homme. A plus long terme ces approches pourront être mise en place pour d'autres formes de CMT liées à des défauts de stress du réticulum endoplasmique ou à des défauts d’organelles

Procédures

Les animaux seront soumis à : une administration de traitement par voie orale en prise spontanée 6j/7 pendant 8 semaines (léger; quelques minutes); des tests de comportement permettant la mesure de la locomotion et de la sensibilité des pattes (maximum 15 minutes par animal pour chaque test) . Chaque test sera réalisé sur deux jours (entrainement et test) en incluant des moments de récupération pour les animaux entre chaque essais ( 5 minutes) et entre chaque test (au moins deux jours). A la fin de l'expérience, les animaux seront euthanasiés.

Impact sur les animaux

Les animaux CMT2A présentent un phénotype léger d’apparition tardive (après 6 mois) sans impact sur la qualité de vie et surive des animaux. Dans le cas de l’administration guidée par micropipette, les animaux subiront à l’âge adulte un traitement par voie orale de 6 jours par semaine pendant deux mois. Cela impliquera une légère contention de l'animal une fois par jour au moyen d'une légère pression exercée par la paume de la main de l'expérimentateur. L'administration par micropipette ne créera pas d'inconfort, et les composés ont déjà été testé et sont bien tolérés. Au cours du test rotarod, les souris seront forcées à marcher sur une roue qui tourne pendant 5 min. Pour les souris transgéniques qui présentent des défauts locomoteurs sur ce test, cela pourra conduire à une fatigue musculaire légère. Nous n'anticipons pas de nuisance liée au test du gait. Le test VonFrey, qui a pour but d’analyser la réponse sensitive, entraîne par contre un inconfort de courte durée suite à l’exposition à un filament de 0.5 mm qui vient exercer des forces croissantes sur la patte de la souris. Les souris ressentiront ainsi une légère piqûre au niveau de leur paume qui entraine un léger inconfort de quelques secondes.

Devenir

mise à mort et récupération des tissus

Remplacement

l est difficile d'accéder aux cellules de patients du système nerveux périphériques (neurones moteurs et sensitifs et cellules de Schwann). Les neurones moteurs et sensitifs de patients peuvent être différentiés à partir de cellules pluripotentes humaines induites et constituer ainsi un modèle humain de la pathologie CMT pour les formes axonales. Nos données préliminaires ont déjà montré un effet bénéfique de ces composés sur un modèle in vitro de la CMT2A. Néanmoins le passage in vivo, notamment chez la souris, est une étape indispensable pour établir la preuve de concept et la mise au point de la dose du traitement, sa biodisponibilité, afin d'envisager par la suite un essai thérapeutique chez l'homme.

Réduction

Le nombre d'animaux a été limité au minimum nécessaire (= 15 animaux par groupe) pour mettre en évidence un effet significatif sur des paramètres de locomotion et de sensibilité en se basant sur nos travaux précédents et des tests statistiques. Au total nous utiliserons 420 animaux répartis de la manière suivante : Deux groupes génétiques : contrôles et mutants - Quatre groupes thérapeutiques : 1 solution véhicule (contrôle) et 4 différents composés pharmacologiques.

Raffinement

Nous nous assurerons de diminuer le stress des souris en les manipulant en coupe ou en tunnel. Afin d’optimiser le bien-être de nos animaux, nous avons opté pour une méthode d’identification couplée au prélèvement pour génotypage afin de réduire la douleur et le stress des animaux. Nous avons choisi de privilégier un mode d’administration de notre composé pharmacologique par voie orale via la méthode MDA plutôt que par gavage afin de réduire considérablement le stress des animaux et d’éventuels risques de blessures lors de l’injection.

Choix des espèces

La souris reste un des modèles les plus aisés à modifier génétiquement et proche de l'homme (99% des gènes sont homologues). Elle est l'espèce la plus utilisée pour modéliser des maladies neurodégénératives ou neuromusculaires telles que la CMT. Elles développent la plupart du temps des anomalies observées chez l'homme et ont permis de mieux comprendre les mécanismes cellulaires sous-jacents à ces pathologies. Dans notre cas, la lignée utilisée pour la CMT2A reproduit une partie des anomalies histologiques et comportementales observés chez ces patients telles qu'une dénervation musculaire, et des défauts locomoteurs tardifs. Pour les trois études, les traitements seront réalisés à 4 mois (proche du début ds symptômes moteurs) pendant 8 semaines. L'ensemble des groupes de souris de ces études seront suivis pendant les deux mois de traitement (soit de 4 à 6 mois).

Huit échantillons de matériau implantés sous la peau du dos d'un même animal, en une chirurgie de trente minutes : 20 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, tous tués à l'issue pour les analyses histologiques. Une douleur modérée est annoncée après l'implantation, ainsi qu'un risque d'infection en cas de rejet du matériau ou de réouverture de la plaie. L'objet est de vérifier la biocompatibilité de membranes destinées à la régénération osseuse, avant une éventuelle mise sur le marché. Le rat est présenté comme la première étape de validation, le porteur annonçant qu'en cas de résultats satisfaisants une validation sur "gros animal" sera "nécessaire".

Objectifs

Les pertes de substances osseuses représentent un défi en chirurgie orale et orthopédique. En clinique, l'utilisation de greffe autologue est très répandue mais présente certains inconvénients (chirurgie additionnelle, morbidité du site donneur...). Ainsi, le développement de biomatériaux en régénération osseuse est indispensable pour pallier ces limitations. Pour évaluer la biocompatibilité des biomatériaux étudiés, nous souhaiterions avoir recours à un modèle animal déjà développé et maîtrisé au sein de notre unité. Ce modèle est facile à mettre en œuvre et reproductible. Le modèle sous-cutané chez le rat adulte réalisé au niveau dorsal est le modèle choisi afin d’évaluer la bicompatibilité des biomatériaux implantés.

Bénéfices attendus

Ce projet permettrait le développement de nouveaux dispositifs médicaux (membranes pour la régénération osseuse guidée) dans le domaine de l'ingénierie tissulaire osseuse dans la perspective d’une utilisation en clinique.

Procédures

Les animaux auront une chirurgie cutanée au niveau dorsal (implantation sous-cutanée de conditions expérimentales). L’intervention a lieu une seule fois et dure environ 30 mn par animal.

Impact sur les animaux

L'implantation en site sous-cutané peut entraîner une douleur modérée. Des complications post-opératoires sont à envisager : infection, notamment en cas de rejet du matériel implanté, ou réouverture de la plaie.

Devenir

Après l'implantation, les animaux de chaque lot correspondant à un temps expérimental donné seront mis à mort à l’issu du temps expérimental. Des analyses histologiques seront ensuite réalisées sur ces animaux.

Remplacement

La cytotoxicité des matériaux utilisés aura au préalable était évaluée in vitro selon les recommandations de la norme NF EN ISO 10993. En suivant, les produits destinés à être implantés chez l'humain doivent nécessairement être testés chez l'animal avant les essais cliniques. Les matériaux doivent être d'abord testés dans modèle de rat, et si les résultats obtenus sont satisfaisants, d'autres essais seront envisagés permettant de valider tous les aspects nécessaires à une future application chez l'Homme. Ces différentes phases ne peuvent être remplacées actuellement dans le processus de validation d'un nouveau dispositif médical.

Réduction

Ne seront testés in vivo que les matériaux ayant démontré une absence de cytotoxicité in vitro , et une seule lignée de rats sera utilisée. De plus, afin de réduire le nombre de rat, 8 échantillons seront implantés par animal. Enfin, la même lignée de rats que celle déjà utilisée au sein de notre unité est choisie, afin de diminuer le nombre de conditions à évaluer et d'éviter l'ajout de rats supplémentaires pour cette évaluation.

Raffinement

Pour réduire l’angoisse : une période d’adaptation d’une semaine sera respectée avant le début des expérimentations. Une cage après l’autre sera amenée à la salle de chirurgie, séparée de la zone d’hébergement des animaux pour éviter toutes sources de stress des animaux opérés et des animaux à opérer. Avant la chirurgie, les animaux recevront des analgésiques afin de prévenir toute douleur lors de l'opération. Ils seront ensuite anesthésiés dans une chambre à induction puis maintenue anesthésiés au masque avec de l'isoflurane. Après la chirurgie, chaque rat se réveille dans une cage à part pour éviter le contact avec des congénères non anesthésiés. Après le réveil complet, le rat sera réintégré à sa cage d’origine. Les animaux seront ensuite observés sur une semaine. Toutes les modifications de comportement et d’aspect seront consignées dans un fichier informatique par les personnes impliquées directement dans ce projet. Une grille de score basée sur des critères significatifs sera mise en place et des points limites adaptés seront utilisés. Un arbre décisionnel sera suivi pour déterminer la conduite à tenir, incluant la mise à mort en fonction de critères d'arrêt de souffrance définis. Un raffinement est également mis en place lors de l'hébergement : les animaux sont avec leurs congénères, en présence de litière en copeaux de peupliers AVEC ENRICHISSEMENT EN TUNNEL DE POLYPROPYLENE, ainsi que des bâtons à ronger qui sont régulièrement mis dans les cages.

Choix des espèces

Le Rat est une espèce adaptée à la première étape de validation chez l'animal de matériaux destinés au traitement des pertes osseuses. Le rat permet de valider la biocompatibilité du produit. De plus, il est utilisé dans de nombreuses études. En cas de résultats satisfaisant et supérieurs à ce qui est obtenu avec les produits de référence actuellement sur le marché, une validation chez le gros animal sera nécessaire. Des rats adultes de 9 à 10 semaines, d'un poids d'environ 350 g seront utilisés. En effet les animaux utilisés doivent avoir achevé leur développement et leur croissance.

1 100 souris reproduisant l'atteinte pulmonaire de la mucoviscidose vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent par le nez, sous anesthésie, une molécule bactérienne qui déclenche une inflammation des poumons, subissent des injections dans la veine de la queue sur animal éveillé, et une canule est placée dans leur trachée pour mesurer le flux d'air. Pendant 72 heures, l'air de leurs cages est modifié pour reproduire un pic de pollution parisien. Le porteur écrit que "seule l'expérimentation sur des animaux vivants" permet d'étudier ces interactions entre organes, tout en indiquant que les travaux préalables du laboratoire ont porté sur des cellules in vitro.

Objectifs

La mucoviscidose est une maladie génétique caractérisée par une vulnérabilité à l’infection par les microbes de l’environnement qui induisent une forte inflammation des poumons, dégradant progressivement cet organe et conduisant à l’insuffisance respiratoire. Une des raisons pouvant participer à la gravité de la réponse inflammatoire est une mauvaise production par ces patients de molécules aidant à résoudre l’inflammation et qui sont appelées SPMs. Une autre possibilité est que l’exposition à la pollution de l’air aggrave l’inflammation. Nous étudierons la production des SPMs dans un contexte de pollution de l’air sur un modèle murin mimant l’infection pulmonaire des patients atteints de mucoviscidose. Nous évaluerons aussi si les SPMs peuvent être utilisés pour traiter l’inflammation. Nous utiliserons ici des souris qui reproduisent des symptômes proches des patients vivant avec la mucoviscidose au niveau du poumon pour que notre modèle soit réaliste. Nous nous intéresserons aussi aux différences d’inflammation et de production des SPMs chez les souris mâles et femelles car il existe des différences de l’atteinte respiratoire entre patients et patientes encore inexpliquées.

Bénéfices attendus

Les bénéfices à court terme de ce projet sont : - une meilleure compréhension de l’impact de la pollution de l’air sur des souris dont l’atteinte mime la mucoviscidose des êtres humains, - une preuve de concept que les SPM pourrait traiter l’inflammation des poumons dans la mucoviscidose. - mieux comprendre les différences de gravité de la maladie respiratoire selon le sexe A long terme, les résultats de cette étude pourront être utilisés pour développer de nouvelles recommandations et de nouveaux traitements de l’inflammation des poumons pour les patients vivant avec la mucoviscidose.

Procédures

Les animaux seront soumis à des traitements administrés en moins d’une minute soit par injection dans la veine de la queue soit par aspiration de gouttes de solution par le nez. Conformément aux normes éthiques en vigueur, l’injection dans la veine de la queue sera réalisée sur souris éveillées, et l’administration intranasale sur les souris anesthésiées. Enfin pour mesurer la fonction pulmonaire des souris, celles-ci seront complètement anesthésiées et une canule sera placée (geste prenant moins d’une minute) dans leur trachée pour mesurer le flux d’air (la durée de la mesure est d’une dizaine de minutes). Pour induire un environnement pollué, l’air circulant dans les cages des souris sera modifié pour avoir une composition similaire à celle de Paris au cours d’un pic de pollution, cette exposition durera 72 heures.

Impact sur les animaux

Les souris exposées 3 jours à la pollution atmosphérique peuvent présenter des signes de stress liés au changement de lieu d’hébergement et au bruit environnant. Les animaux seront hébergés par 2 à 5 dans une cage identique à celle de leur environnement habituel afin de limiter leur stress. Les SPM sont des molécules produites par notre corps de façon naturelle. Elles ne sont pas toxiques et, à ce jour, aucun effet secondaire n’a été observé chez les souris qui en ont reçus. Nous ne prévoyons donc pas d’effets indésirables suite à l’utilisation de SPM. De plus, certaines études montrent que les SPM pourraient avoir un effet anti-douleur. Pour provoquer l’inflammation des poumons, nous administrons une solution d’une molécule produite par les bactéries. Cette molécule ne peut pas causer d’infection du poumon mais elle agit comme un signal qui alerte les défenses du corps. Le résultat est une réaction inflammatoire dans le poumon. Cela peut entraîner une perte de poids chez la souris ainsi qu’un inconfort temporaire et une diminution de l’activité. Cependant, aucune douleur importante ou stress fort n’est attendu. Les animaux seront tout de même suivis quotidiennement pour s’assurer de l’absence d’effet néfaste inattendu. Ils seront pesés et observés chaque jour pour détecter tout signe de malaise. Si nécessaire, de la nourriture humidifiée sera ajoutée dans la cage des souris pour faciliter leur alimentation et leur hydratation. Si un animal se trouve dans un état grave imprévu, celui-ci sera mis à mort pour éviter toute souffrance.

Devenir

L’ensemble des animaux utilisés ici sera mis à mort à la fin des protocoles pour un prélèvement et une analyse de la réponse inflammatoire dans le poumon.

Remplacement

Nous étudions ici un modèle complexe qui repose sur l’interaction entre plusieurs types de cellules, entre différents organes, et le déplacement de cellules d’un organe à un autre. Nous voulons aussi regarder des différences entre mâles et femelles. Malheureusement, à l’heure actuelle seule l’expérimentation sur des animaux vivants permet l’étude de ces différents éléments. Cette étude vient compléter les études préalables de notre laboratoire qui ont été réalisées sur des modèles de cellules in vitro.

Réduction

Afin d’utiliser le moins d’animaux possible, nous avons étudié les publications préexistantes et pris en compte leurs résultats pour construire notre projet. Un certain nombre d’expériences ont aussi été effectuées au préalable sur des modèles de cellules pour sélectionner un nombre réduit de SPM à tester dans notre projet sur la souris. Enfin, une étude statistique a été menée pour choisir le nombre minimal de souris à utiliser tout en étant sûr de pouvoir observer toute différence pertinente entre nos groupes de souris.

Raffinement

Les souris seront hébergées dans un environnement adapté où elles disposeront de nourriture et eau à volonté. Les éléments nécessaires pour former un nid et une maisonnette seront fournis dans la cage pour assurer le bien-être des souris. Autant que possible, les souris seront au contact d’une seule personne pour leur permettre de s’habituer à elle et de diminuer leur stress. Le personnel qui manipule les souris est formé pour assurer leur bien-être et leur éviter toute souffrance. Au cours des expériences, les souris seront pesées et observées pour détecter tout mal-être le plus tôt possible et agir en conséquence. Si besoin de la nourriture humidifiée sera ajoutée dans la cage de la souris. Si un animal se trouve dans un état grave imprévu, celui-ci sera mis à mort pour éviter toute souffrance.

Choix des espèces

Le modèle murin a été choisi pour plusieurs raisons : Les souris se reproduisent rapidement, ce qui permet d’avoir assez d’animaux pour l’étude en peu de temps. Le fonctionnement des poumons et du système immunitaire chez la souris est proche de celui de l’humain, ce qui rend les résultats plus utiles pour la recherche médicale. Notre équipe est déjà formée et expérimentée dans le travail avec les souris de laboratoire. C’est l’animal pour lequel on dispose du plus grand nombre d’outils scientifiques pour étudier les tissus, l’inflammation et les SPMs. Cette lignée de souris génétiquement modifiées est la seule à reproduire le phénotype pulmonaire des personnes atteintes de mucoviscidose.

4 000 souris vont être utilisées, chacune recevant jusqu'à 32 instillations dans l'œil, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Selon la cohorte, la cornée est râpée de son épithélium sous anesthésie, une toxine bactérienne est instillée, ou les glandes lacrymales sont retirées chirurgicalement pour installer une sécheresse oculaire durable. Le porteur annonce comme effets attendus une inflammation de la cornée, des irritations, des brûlures et une sécheresse oculaire d'intensité variable, y compris avec les agents censés soulager. Les tests comportementaux sont nommés, exploration et sensibilité mécanique et chimique de la cornée, et les retombées pour les patients restent au stade de l'identification de composés "prometteurs" quand l'atteinte oculaire des souris, elle, est le point de départ du protocole.

Objectifs

La douleur oculaire est un symptôme d'alerte en réaction à une inflammation ou un traumatisme, affectant les différentes parties de l’œil. La douleur oculaire est remarquable par la variabilité de l'intensité qu'elle peut générer, allant d'une simple gêne oculaire à une douleur intense, voire insupportable. Les douleurs chroniques de la surface oculaire, au-delà de la souffrance exprimée par les patients, entraînent une altération de la qualité de vie. On estime que près de plus d’un patient sur 2 est gêné lors de ses activités quotidiennes. Ces douleurs peuvent être liées à diverses pathologies, telles que des maladies inflammatoires ou infectieuses, des troubles neurologiques et des interventions chirurgicales oculaires peuvent être la cause sous-jacente de douleur cornéenne chronique. La cornée, tissu le plus innervé de l’organisme, est l’un des générateurs de douleur les plus puissants. Parmi les pathologies oculaires, la sécheresse oculaire est une pathologie liée à une diminution de la production de larmes ou à une altération de leur composition, entraînant des lésions de la surface oculaire et des nerfs cornéens. Les symptômes sont variés et incluent une sensibilité accrue à la lumière (photophobie), des douleurs, des picotements, une sensation de brûlure oculaire. Ces manifestations s’accompagnent d’une atteinte de la vie quotidienne : troubles du sommeil, anxiété et dépression. La sécheresse oculaire et les douleurs de la surface oculaire représentent aujourd’hui l’un des premiers motifs de consultation en ophtalmologie soulignant l’urgence d’une meilleure compréhension de leurs mécanismes physiopathologiques. C’est dans cette perspective que nous avons entrepris d’en étudier les bases biologiques et les pistes thérapeutiques potentielles. Cette étude vise à évaluer les effets analgésique et anxiolytique de divers agents pharmacologiques à visée antalgique, administrés par instillation oculaire sur différents modèles de douleur oculaire développés chez la souris. La douleur oculaire, en particulier dans sa forme chronique, demeure aujourd’hui largement dépourvue de traitements efficaces. Ce projet permettra de comparer plusieurs agents pharmacologiques, à différentes concentrations, afin d’identifier les composés les plus prometteurs pour le développement de nouvelles thérapies ciblées contre la douleur oculaire chronique.

Bénéfices attendus

Les douleurs chroniques de la surface oculaire entraînent des symptômes variés et incluent une sensibilité accrue à la lumière (photophobie), des douleurs, des picotements, une sensation de brûlure oculaire. Au-delà de la souffrance exprimée par les patients, une altération de la qualité de vie (troubles du sommeil, anxiété et dépression). On estime que plus d’un patient sur deux est gêné dans ses activités quotidiennes. La sécheresse oculaire et les douleurs de la surface oculaire représentent aujourd’hui l’un des premiers motifs de consultation en ophtalmologie soulignant l’urgence d’une meilleure compréhension de leurs mécanismes physiopathologiques. C’est dans cette perspective que nous avons entrepris d’en étudier les bases biologiques et les pistes thérapeutiques potentielles. Ce projet permettra d’identifier des agents pharmacologiques au travers de modèles précliniques et d’applications topiques, ciblant directement la surface de l’œil, afin de soulager ou de traiter la douleur oculaire. En effet, les mécanismes cellulaires et moléculaires sous tendant la douleur oculaire sont encore peu connus et sont considérés comme des pistes d’exploration thérapeutiques.

Procédures

Une première cohorte des animaux vigile recevra une instillation biquotidienne pendant 7 jours d’un conservateur de collyre et d’un agent pharmacologique (deux administrations par jour, espacées de 4 heures). Une seconde cohorte d’animaux sera soumise à une desépithélialisation cornéenne unique (1min), réalisée sous anesthésie et analgésie (1 fois pendant 10 minutes). Une instillation (quelques secondes) de toxine bactérienne sera effectuée lors de la chirurgie, puis une seconde 2 jours plus tard sur animal vigile. Parallèlement les animaux auront des instillations biquotidiennes d’un agent pharmacologique, (soit 2 fois par jour espacées de 4h, sur 5 jours). Une troisième cohorte sera dédiée au modèle d’exérèse des glandes lacrymales. Les animaux seront sous anesthésie générale et analgésie (anti-douleur) 1 fois pendant 15 minutes. Ils recevront des instillations biquotidiennes répétées d’un agent pharmacologique (2 fois par jour, sur 14 jours) sur animal vigile. Tous les animaux seront soumis à des contentions manuelles brèves (quelques secondes) nécessaires pour l’instillation des composés et à la réalisation des tests comportementaux suivants : test d’exploration (2 fois, 10min par animal pour les 3 modèles), test de sensibilité mécanique cornéenne (4 fois, 30 sec par animal : pour le 1er et le 3ème modèle et 2 fois, 30 sec par animal pour le 2ème modèle), test de sensibilité chimique cornéenne (1 instillation, 1 fois, 30 secondes par animal pour le 1er et le 2nd modèle et 4 instillations 4 fois, pendant 30 secondes par animal pour le 3ème modèle). Le nombre total d’instillations par animal s’élève à 29 pour le premier modèle (1ère cohorte), à 13 pour le second modèle (2nde cohorte) et à 32 pour le troisième modèle (3ème cohorte). L’imagerie de la surface oculaire sera réalisée sous anesthésie générale (5 minutes et 4 fois au total pour tous les animaux du projet.

Impact sur les animaux

Certaines administrations d’anesthésiques ou d’analgésiques peuvent aussi induire un stress transitoire de courte durée (maximum 30 sec, lié à l’insertion de l’aiguille et à la contention de l’animal), ainsi qu’une légère douleur. L'anesthésie peut entraîner un risque cardio-respiratoire, d’hypothermie, et dans de rare cas une mortalité. Les chirurgies peuvent entraîner une perte de sang durant l’opération, une perte de poids, des infections et des douleurs oculaires durant la période postopératoire. Les instillations des agents non thérapeutiques biquotidiennes induisent un stress de courte durée liée à la contention manuelle et à l'instillation (30 sec). La chirurgie et les instillations biquotidiennes des agents non thérapeutiques pour la mise en place des modèles étudiés, entraîneront une inflammation de la cornée, des irritations ou brûlures, une sècheresse oculaire voire une inflammation d’intensité variable. Les instillations des agents thérapeutiques et des solvants peuvent induire un stress de courte durée liée à la contention manuelle et à l'instillation (30 sec), mais également peuvent entraîner une inflammation de la cornée, des brûlures, une sècheresse oculaire voire une inflammation d'intensité variable.

Devenir

Des prélèvements et analyses post-mortem sont nécessaires ce qui implique l’euthanasie des animaux par une procédure réglementaire à la fin de chaque procédure. Tous les animaux de ce projet seront euthanasiés.

Remplacement

L’induction et l’étude de la douleur oculaire nécessite un organisme entier. A ce jour, il n’existe aucun système ex vivo ou in vitro permettant d’évaluer la douleur qui est une expérience sensorielle et émotionnelle. En outre, ce projet vise à évaluer les effets antalgiques de composés, nécessitant des expériences comportementales et également des évaluations ex vivo de certains marqueurs biologiques qui nécessitent l’analyse de tissus préalablement prélevés sur animaux euthanasiés. Ce projet ne peut donc être réalisé que chez l’animal. Bien que les questions soulevées par ce projet visent à mieux comprendre les mécanismes physiopathologiques mis en jeu au cours de cette pathologie chez l’Homme, il est d’abord nécessaire d’élucider ces points clés à travers l’utilisation d’un modèle rongeur. De plus, une veille bibliographique réalisée confirme qu’à l’heure actuelle, aucun modèle in silico n’existe pour répondre à ces questions.

Réduction

Dans le respect du principe de réduction, le projet a été conçu pour limiter au maximum le nombre d’animaux utilisés, avec un effectif total n’excédant pas 4 000 sur 5 ans. Plusieurs structures seront prélevées sur chaque animal (cornée, ganglion trigéminal, cerveau) afin d’optimiser les données obtenues par animal. L’estimation du nombre d’animaux à inclure repose sur des études antérieures de l’équipe utilisant des approches expérimentales comparables, ainsi que sur des calculs de puissance statistique, indispensables pour garantir une interprétation fiable et robuste des résultats.

Raffinement

Les animaux seront hébergés dans des conditions optimisées pour réduire leur stress et conformes à la réglementation en vigueur. Ils seront pris en charge uniquement par du personnel formé et expérimenté, et des professionnels s’occuperont de leur hébergement, de leur manipulation et des éventuelles interventions chirurgicales. La proximité entre les lieux d’hébergement et le laboratoire permet de réagir rapidement si un animal a un problème de santé. Le bien-être des animaux sera suivi quotidiennement grâce à un système d’identification et à un suivi informatisé partagé entre les équipes. Ils seront observés tous les jours, y compris les week-ends et les jours fériés, et leur santé et leur niveau de douleur seront régulièrement évalués selon des critères validés par des experts en bien-être animal. Toutes les interventions pouvant provoquer inconfort ou stress seront réalisées sous anesthésie, avec un traitement contre la douleur avant, pendant et après la procédure. Si un animal présente un problème grave, l’intervention sera immédiatement arrêtée et des mesures appropriées seront prises pour éviter toute souffrance inutile.

Choix des espèces

Les souris sont couramment utilisées dans les études précliniques, notamment pour mieux comprendre la douleur oculaire. Dans ce projet, la souris constitue le modèle animal de choix car les yeux et leur cerveau sont assez similaires à ceux de l’humain, et il existe des outils génétiques avancés spécialement adaptés à cette espèce. Des souris adultes, mâles et femelles, seront utilisées. Certaines sont des souris « classiques » tandis que d’autres ont été élevées pour permettre le suivi de certaines cellules inflammatoires. Ces modifications n’entraînent pas de troubles connus et n’affectent pas le bien-être des animaux. Les animaux seront accueillis à l’animalerie à l’âge adulte et bénéficieront d’une période d’adaptation avant le début des procédures. Toutes les expérimentations dureront peu de temps, entre une et trois semaines maximums, ce qui signifie que les animaux n’auront pas plus de 11 semaines à la fin des procédures.

Sortis du bassin d'élevage sur une civière, anesthésiés par diffusion d'anesthésique dans les branchies, ouverts pour recevoir une marque acoustique dans l'abdomen, 14 esturgeons européens de 17 ans subissent des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. L'opération dure moins de dix minutes. Ces individus sont nés et ont grandi en captivité, et le projet sert à savoir si un lâcher tardif permet à des géniteurs potentiels de rejoindre les frayères, la marque devant les suivre pendant cinq ans. Le porteur écarte tout remplacement au motif que l'expérience porte sur l'espèce elle-même, et juge l'effectif faible mais acceptable au vu de la rareté de l'esturgeon européen. Les 14 poissons sont ensuite relâchés dans le milieu naturel.

Objectifs

Dans le cadre des programmes de repeuplement, on relâche de préférence des poissons jeunes afin que leur temps passé en captivité (où il y a des risques de domestication) soit limité, facilitant ainsi leur adaptation au milieu naturel. Toutefois, la survie des jeunes poissons, issus de relâchés ou sauvages, peut être très faible, car ils sont plus sensibles aux conditions environnementales et à la prédation. Afin d’améliorer la survie post-lâcher, des individus plus âgés et plus grands peuvent être déversés mais la question se pose de savoir si ces individus vont adopter un comportement adapté au milieu naturel et s’ils vont savoir rejoindre les frayères pour se reproduire et ainsi participer à relancer la dynamique de la population. Pour ce projet, dédié au suivi du programme de repeuplement de l’esturgeon européen, nous avons l’opportunité de relâcher des individus nés et élevés en captivité à un âge avancé afin de documenter leurs déplacements vers les zones de frayères potentielles et ainsi identifier si un lâcher tardif est pertinent ou non. Nous prévoyons donc de lâcher dans le milieu naturel 14 individus subadultes nés et élevés en captivité. Il s’agit d’équiper ces individus avec des marques acoustiques longues durées (env. 5 ans) et de détecter leurs déplacements grâce à un réseau d’hydrophones qui sera mis en place dans le milieu naturel pendant cette durée pour documenter la période de migration de reproduction. La marque acoustique sera placée dans leur abdomen, sous anesthésie générale. Ce projet de recherche est complémentaire à un précédent dans lequel la même pose de marques est autorisée sur des esturgeons européens capturés dans leur milieu naturel et libérés ensuite.

Bénéfices attendus

Le suivi dans le milieu naturel du devenir de ces individus lâchés à un âge avancé (géniteurs potentiels) nous permettra de tester s’il est pertinent de relâcher des individus à ce stade (déplacements avérés et fréquentation des frayères) ou si ce n’est pas pertinent (aucune détection des déplacements, pas de retour dans les fleuves) pour participer à relancer une dynamique de population en milieu naturel.

Procédures

Il sera procédé à un marquage intrapéritonéale de chacun des poissons,sous anesthésie ; la durée de cette opération est inférieure à 10 minutes.

Impact sur les animaux

Pendant la procédure expérimentale correspondant à la chirurgie, les individus peuvent subir un stress dû à la manipulation : transfert du bassin d’élevage au bassin d’anesthésie puis du bassin d’anesthésie vers la civière de marquage. La procédure de marquage étant réalisée sous anesthésie, nous nous attendons à un stress très limité. De même, pendant le transport et la phase d’acclimatation au site de lâcher, les individus peuvent subir un stress.

Devenir

Les poissons seront relâchés dans le milieu naturel, le but du projet étant de caractériser leur comportement post-lâcher.

Remplacement

Aucun remplacement ne peut être envisagé car l’expérience porte sur l’espèce considérée.

Réduction

Nous prévoyons de marquer 14 individus en captivité avant de les relâcher dans le milieu naturel. Il s’agit d’une opportunité de documenter le devenir de poissons lâchés à un âge avancé. Ce nombre est faible, cependant, au vu de la rareté de l’espèce, il nous semble acceptable pour avoir de premiers éléments de réponses et décider s’il y a un intérêt à équiper et relâcher d’autres individus de grande taille dans le futur.

Raffinement

Pour la manipulation entre les bassins (élevage/anesthésie/réveil) les individus seront maintenus et transportés dans des civières spécifiques adaptées à la taille des animaux. Le marquage se déroulera à proximité du bassin d’élevage afin de limiter la durée et la distance de manipulation. Les individus seront anesthésiés et surveillés de l’anesthésie au réveil (surveillance des différentes étapes de l’endormissement, des battements operculaires, du comportement de nage). Pendant la chirurgie, les individus seront placés sur le dos dans une civière en V dotée d’un matelas humide, et une dose sédative d’anesthésique sera diffusée au travers des branchies ; leur corps sera maintenu humide. Les manipulations seront effectuées par du personnel qui est habitué à travailler avec l’espèce en question et qui dispose des formations adaptées en terme d’expérimentation animale et de chirurgie sur les poissons en général et cette espèce en particulier.

Choix des espèces

L’étude porte sur l’esturgeon européen (Acipenser sturio), une espèce protégée qui bénéficie d’un programme national d’actions en faveur de sa restauration. Les poissons impliqués sont des subadultes ; l’objet du projet étant de suivre le comportement des individus de cette catégorie lâchés après de nombreuses années en captivité dans le milieu naturel, il s’agit de caractériser leur devenir, notamment leurs déplacements pendant plusieurs années (5 ans) et d’identifier s’ils effectuent une migration de reproduction vers les fleuves où ils ont été relâchés. Les 14 individus sont âgés de 17 ans, car il s’agit de l’âge auquel l’espèce peut commencer à se reproduire et donc initier une migration de reproduction en milieu naturel.

Tous tués en fin de protocole pour le prélèvement du cœur et des tissus, 488 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une hypertension leur est induite par une mini-pompe implantée sous la peau sous anesthésie générale, puis leur fonction cardiaque est suivie par deux échocardiographies. Dans certains groupes, une mort encéphalique est provoquée sous anesthésie profonde, avec des perturbations physiologiques importantes attendues en péri-mortem. L'objectif est d'élargir les critères de sélection des donneurs de greffons cardiaques humains, et le porteur affirme qu'aucun modèle in vitro ne reproduit l'interaction entre état hypertendu, conservation du greffon et reperfusion, ce qui rend selon lui le recours au rat "nécessaire".

Objectifs

La transplantation du cœur est souvent limitée par le nombre de cœurs disponibles. Pour pallier cette pénurie, les médecins utilisent parfois des cœurs dits « à risque », provenant de donneurs plus âgés ou ayant certaines maladies, comme l’hypertension artérielle. L’hypertension artérielle peut provoquer un épaississement de la paroi du cœur, rendant le tissu plus fragile lors de la transplantation. En effet, le cœur subit deux étapes critiques : le prélèvement, lorsqu’il est privé d’oxygène, et la réimplantation, lorsqu’il est à nouveau oxygéné. Ces phases peuvent provoquer des dommages aux cellules cardiaques, surtout si le cœur est déjà affaibli. Au niveau cellulaire, certaines protéines, comme YAP1, aident le cœur à résister au stress et à survivre aux contraintes. Des recherches récentes montrent que réguler cette protéine pourrait protéger les cellules cardiaques et améliorer le fonctionnement des cœurs transplantés.

Bénéfices attendus

Ce projet a pour objectif d’évaluer, dans un modèle préclinique de rat hypertendu représentant des cœurs à critères élargis, comment une conservation contrôlée à température modérée (15–20 °C pendant 20 h), associée à une modulation ciblée d’une voie de signalisation spécifique, peut préserver la structure et la fonction du muscle cardiaque. L’ambition est de limiter les dommages cellulaires et tissulaires provoqués par la privation temporaire de sang (ischémie) et son rétablissement oxygéné (reperfusion) lors de la transplantation. L’hypertension chronique rend le cœur particulièrement vulnérable à ces lésions, aggravant la dysfonction du greffon et réduisant à la fois sa durée et la qualité de conservation. Les bénéfices attendus comprennent : • L’identification de nouvelles stratégies pharmacologiques ou combinatoires capables d’améliorer la tolérance des greffons cardiaques aux contraintes de la transplantation ; • La limitation de la perte fonctionnelle après greffe ; • L’élargissement potentiel des critères de sélection des donneurs, augmentant ainsi le nombre de cœurs disponibles. Enfin, ces résultats pourraient servir de base pour l’optimisation des solutions de conservation et le développement de traitements ciblés pour les greffons à critères élargis. Cette approche combinée devrait, à terme, améliorer la qualité des greffons, réduire les complications liées à l’ischémie-reperfusion et renforcer les résultats cliniques des transplantations cardiaques.

Procédures

Le protocole s’étendra sur 4 semaines. Les animaux seront soumis à différentes interventions selon les groupes expérimentaux. L’hypertension artérielle sera induite par implantation sous-cutanée d’une mini-pompe, réalisée sous anesthésie générale (30–45 min). La fonction cardiaque sera suivie par deux échocardiographies non invasives (10–15 min), réalisées à 2 semaines d’intervalle sous anesthésie légère. Dans certains groupes, une mort encéphalique sera induite sous anesthésie générale profonde (30–60 min).

Impact sur les animaux

Les effets indésirables attendus concernent principalement : - Induction de l’hypertension : inconfort local et douleur transitoire au site opératoire, avec une mortalité péri-opératoire faible mais possible, liée à des complications anesthésiques ou chirurgicales. - Examens échographiques : stress léger et de courte durée lors de l’induction et du réveil. - Induction de la mort encéphalique sous anesthésiée : des perturbations physiologiques importantes sont attendues en peri-mortem.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés en fin d’expérimentation afin de permettre la récupération des organes et tissus pour les analyses fonctionnelles, cellulaires et moléculaires. L’euthanasie sera réalisée sous anesthésie générale profonde, conformément aux recommandations vétérinaires et aux normes éthiques, garantissant l’absence de douleur ou de souffrance.

Remplacement

Avant de recourir au modèle animal, la solution et la température optimale de conservation ont été testées sur des modèles cellulaires dans notre laboratoire, avec des résultats concluants. Cependant, aucun modèle in vitro ou alternative non animale ne permet de reproduire l’interaction dynamique entre l’état hypertendu, la conservation du greffon et la reperfusion, incluant les réponses systémiques, cellulaires et mitochondriales. Le rat est donc choisi comme modèle car il permet de reproduire de manière fiable et contrôlée l’hypertension induite par infusion d’Angiotensine II, ainsi que la physiopathologie complexe de la mort encéphalique. Cette approche est nécessaire pour répondre aux objectifs précliniques du projet et garantir la pertinence translationnelle.

Réduction

Le nombre d’animaux par procédure a été calculé à l’aide d’un logiciel de statistiques afin de déterminer le plus précisément possible le nombre minimal d'animaux permettant d'obtenir des résultats statistiquement exploitables. Par ailleurs, les animaux de la première étape du projet seront intégrés aux groupes contrôles de la suite du projet. Le projet est organisé par étape de validation successives et seuls les paramètres optimaux sont appliqués d’une étape à l’autre.

Raffinement

Afin de prévenir toute douleur ou souffrance, les injections et prélèvements seront effectués sous prémédication analgésique associée à une anesthésie locale. Les examens échographiques seront réalisés sous anesthésie générale afin de garantir l’absence de stress ou d’inconfort. Les interventions chirurgicales seront menées sous anesthésie générale, précédée d’une prémédication analgésique administrée par voie sous-cutanée. Des points limites spécifiques et adaptés à chaque type de procédure ont été définis, afin de garantir une prise en charge rapide en cas de signes de douleur, de détresse ou de complication.

Choix des espèces

Le rat est utilisé car ses cœurs isolés perfusés ont été largement étudiés et les voies de signalisation ciblées dans cette étude sont conservées chez l’homme. Les jeunes adultes (250–450 g) permettent de reproduire les altérations cardiovasculaires observées chez les patients hypertendus, offrant un modèle pertinent pour évaluer l’effet de la modulation des voies étudiées sur la fonction cardiaque et l’intégrité du tissu après conservation et reperfusion.