Procédures modérées

Quarante heures d'isolement en cage individuelle sans enrichissement, vingt heures sur grille pour récolter urines et selles, un jeûne avant chacun des huit prélèvements de sang : 3 450 souris subissent ces procédures, classées en souffrance modérée, toutes tuées pour prélever tissus et sang. Un régime enrichi en cholestérol et en acides biliaires leur fait développer des calculs biliaires, avec inflammation du foie, sensibilité accrue à la douleur abdominale et jaunisse possibles, chez des souris génétiquement modifiées qui développent déjà spontanément la maladie. Le porteur qualifie ces complications hépatiques et intestinales de modérées tout en choisissant ce modèle pour étudier des stades plus avancés et plus sévères de la maladie. Il revendique le nombre minimal d'animaux, et cette version du projet en ajoute 1 650 à l'autorisation initiale.

Objectifs

La formation de calculs biliaires peut entrainer des dysfonctions biliaires, hépatiques et intestinales importantes, notamment une inflammation sévère du foie qui peut elle-même entrainer un hépatocarcinome ou autrement appelé cancer du foie. Le but de ce projet est de modéliser ces dysfonctions en provoquant la formation de calculs biliaires et ainsi pouvoir tester l’efficacité de candidats médicaments. L'AJOUT D'UNE PROC2DURE NECESSITE UNE MODIFICATION DU PROJET INITIAL AUTORISE AVEC AJOUT DE 1650 SOURIS.

Bénéfices attendus

Ces études permettront de valider ou non des traitements limitants le développement de calculs biliaires et donc l’apparition des complications hépatiques et intestinales associées.

Procédures

Les composés à tester/de référence seront administrés une à deux fois par jour par toutes voies possibles sur animal vigile ou anesthésié. L'administration dure environ 1 minute sur animal vigile. 8 prélèvements de sang seront réalisés au cours de la vie de l’animal afin de suivre des paramètres biologiques ou l’élimination des produits testés. Un prélèvement de sang dure environ 2 minutes par animal. Dans le cas de prélèvements de sang visant à quantifier des paramètres métaboliques, les animaux seront mis à jeun 4h maximum avant le prélèvement. A maximum 4 étapes, nous mesurerons divers paramètres urinaires et fécaux (récolte pendant 20h par l’intermédiaire de cages à métabolisme). A maximum 2 étapes, nous mesurerons la composition corporelle (2 min sur animal vigile), la consommation énergétique (40h en cage individuelle sans enrichissement sur animal vigile), la force musculaire (5 minutes sur animal vigile).

Impact sur les animaux

1) La mise sous régime enrichi en cholestérol et en acide biliaire, va accentuer la formation de calculs biliaires. 2)Les traitements : le geste de traitement réalisé à répétition génère un stress chronique. Après chaque geste technique, l’état de l’animal sera surveillé. 3) Les mises à jeun (4h) lors des prélèvements de sang peuvent être une source de stress. 4)Durant les récoltes urinaires, les animaux seront isolés et hébergés sur grille pendant 20h. 5)Les mesures de consommation énergétiques impliquent un isolement pendant 40h, ce qui induit un stress à l'animal. 6)Les souris génétiquement modifiées développent spontanément une pathologie chronique. Ces évolutions de la maladie peuvent entrainer des modifications du comportement général, telles que : baisse d’activité, poil terne, diminution de la prise alimentaire ou perte de poids, augmentation possible de la sensibilité à la douleur abdominale ou à l’inconfort lié à l’inflammation chronique, une jaunice dans le sang.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés pour récupération de tissus et de sang, et évaluation de critères d’efficacité des composés (histologie, immuno-marquages et expression de gènes, paramètres métaboliques...)

Remplacement

Des projets de cultures ainsi que de co-cultures cellulaires sont de plus en plus développés pour tenter de mimer les différents organes. Ce seront des alternatives à l'utilisation de l'animal, notamment pour les études de screening, de toxicité et d'efficacité sur l’organe cible. Cependant, ces modèles ne sont encore suffisamment développés et ne sont pas un miroir suffisamment fiable de ce qu'il se passe dans la complexité de l’organisme. Les dysfonctions associées à la formation de calculs biliaires notamment au niveau du foie et de l’intestin ne peuvent être envisagées et reproduites que dans un système in vivo pour le moment.

Réduction

Toutes les procédures nécessaires à la caractérisation de la pathologie et de sa résolution seront réalisées sur le même animal afin de réduire le nombre d'animaux inclut dans l'étude. Une analyse statistique permettra d'utiliser le nombre minimal d'animaux tout en assurant la robustesse des résultats.

Raffinement

Plusieurs types d'enrichissements seront placés dans les cages hébergeant les animaux. L'état des animaux sera contrôlé quotidiennement, le poids corporel, la prise alimentaire et la prise hydrique seront mesurés par du personnel compétent afin de s'assurer de leur bien-être. Si un animal présente des signes de stress ou de douleur, il sera pris en charge par l'équipe zootechnique et la structure du bien-être animal. Des soins tels que : hydratation et mise en place de nourriture dans la litière si nécessaire seront effectués. Si l'animal présente une rougeur ou plaies cutanées, par exemple, un protocole de soin sera effectué (nettoyage / désinfection / cicatrisation). Une grille de score spécifique est mise en place, si l'état de l'animal ne s'améliore pas, les expérimentateurs compétents excluront l'animal de l'étude et l'euthanasieront.

Choix des espèces

La souris développe des calculs biliaires sous régime lithogénique entrainant des complications hépatiques et intestinales de façon modérée. La souris génétiquement modifiée est dépourvue de certains transporteurs, ce qui engendre une accumulation de lipides dans le foie et une accumulation d’acides biliaires dans la circulation sanguine et dans la bile. En utilisant ce modèle génétiquement modifié et prône à développer des calculs biliaires, cela nous permet d’exacerber l’effet du régime lithogénique et donc d’étudier des stades plus avancés et plus sévères de la maladie. Les animaux sont mis sous régime à l’âge de 6 semaines, ce qui correspond à l’âge de maturité sexuelle.

Toutes tuées pour prélever rate, ganglions, foie et muscles, 632 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles portent une forme de la maladie de Pompe qui provoque une faiblesse musculaire progressive, une toxicité cardiaque et une espérance de vie raccourcie. Elles reçoivent un produit de thérapie génique, jusqu'à quatorze prélèvements de sang, des injections d'immunosuppresseurs et des tests mensuels de force musculaire, celles qui perdent plus de 20 % de leur poids étant mises à mort. Le porteur affirme que "seuls les animaux sont capables de mimer la complexité de la réponse immune" et qu'aucune méthode substitutive n'existe.

Objectifs

L’émergence des produits de thérapie génique basés sur l’utilisation de vecteur viraux apporte aux patients un espoir de traitement pour les maladies génétique. Cependant, les réponses immunitaires dirigées contre le vecteur ou la protéine qu’il exprime représentent un obstacle majeur qui limite l’efficacité thérapeutique, nécessitant ainsi la mise en place de stratégies d’immunosuppression adaptées. La maladie de Pompe est une affection génétique héréditaire causée par un déficit en alpha-glucosidase acide (GAA) entrainant une accumulation pathologique du glycogène (forme de stockage du sucre) dans les cellules et provoque une faiblesse musculaire et des problèmes respiratoires. L’unique traitement actuel, l’injection de GAA produite en laboratoire, est limité par l’apparition d’anticorps et ne permet pas d’éviter la mortalité chez les patients les plus atteints. La thérapie génique utilisant des vecteurs a montré son efficacité pour traiter cette pathologie. Toutefois, la réponse immunitaire induite par ce traitement pourrait compromettre son efficacité. En effet, notre système immunitaire a pour fonction de préserver l’intégrité de notre organisme en neutralisant les éléments qui viendraient perturber trop fortement l’équilibre maintenu avec notre environnement. Il est ainsi logique que l’administration d’un vecteur viral puisse pâtir d’une réponse immunitaire qui tente de contrôler voire d’éliminer les éléments nouveaux qui sont produits, telle la GAA. Notre objectif est d’analyser dans un modèle de souris malade comment certaines caractéristiques des vecteurs influent sur la réponse immune, quelles sont les conséquences de cette réponse en termes d’efficacité thérapeutique et d’effets indésirables et enfin de déterminer comment la co-administration d’immunosuppresseurs pourrait permettre de mieux contrôler cette réponse immune délétère.

Bénéfices attendus

Des médicaments à base de vecteurs viraux arrivent sur le marché et/ou sont en test clinique pour traiter la maladie de pompe. Cependant, quelques rares effets indésirables et graves sont apparus, dont la cause serait une réponse immune. L’objectif de ce projet est d’analyser l’influence de divers éléments du vecteur modifiés en laboratoire sur la réponse immune et l’efficacité thérapeutique. Cela permettra de déterminer les règles qui déterminent pourquoi le système immunitaire se met à répondre au vecteur dans telle ou telle condition. Outre l’aspect scientifique novateur, deux bénéfices principaux sont attendus : 1) la conception de médicaments de thérapie génique plus sûrs pour les patients, moins susceptibles de générer des effets indésirables, 2) des approches d’immunosuppression plus adaptées et moins lourdes pour les patients.

Procédures

Les souris recevront une injection du médicament de thérapie génique. Les animaux vigiles seront ensuite suivis sur une période allant de 3 à 12 mois avec : 1) Prélèvements de sang hebdomadaires sur 1 mois, puis mensuels entrainant une douleur légère passagère de 20 secondes (14 fois maximum pour les procédures les plus longues). 2) Tests comportementaux qui permettent d’évaluer la force musculaire, mensuellement à partir de 3 mois. Les tests fonctionnels entrainent un léger stress de quelques minutes. Une seconde injection d’agents déclencheurs de la réponse immune sera également administrée. Le temps de suivi sera choisi en fonction des résultats des premiers points de temps et déterminera le nombre total de prélèvements et tests de force. Les souris recevront X injections additionnelles de molécules immunosuppressives : durée (quelques jours à quelques semaines selon les molécules administrées.). Le temps de suivi sera choisi en fonction des résultats de la partie 1.

Impact sur les animaux

Injections répétées durant 5 secondes maximum entrainant une légère douleur passagère. Les tests fonctionnels entrainent un léger stress de quelques minutes. Le modèle murin de la maladie de pompe entraine une faiblesse musculaire progressive entrainant une toxicité cardiaque et une espérance de vie plus courte (représentatif de la pathologie chez les patients) qui devrait être corrigée grâce aux traitements testés

Devenir

L’étude de la réponse immunitaire passe par l’analyse des cellules du système immunitaire dans différents tissus (sang, rate, ganglions, foie…) et l’analyse de l’efficacité du traitement de thérapie génique (sur les muscles notamment). L’analyse de ces tissus (sauf le sang) ne peut se faire que sur animaux préalablement euthanasiés. De ce fait, dans chaque procédure, les animaux seront tous euthanasiés.

Remplacement

Des expériences en laboratoire ont permis de ne sélectionner que les candidats médicaments fonctionnels les plus prometteurs. De plus, les molécules cibles de la réponse immune seront sélectionnées grâce à des outils informatiques de prédiction adaptés. Néanmoins, les réponses immunes sont la résultante d’interactions complexes impliquant de multiples types cellulaires et se déroulant dans plusieurs organes (rate, ganglions lymphatiques, moelle osseuse, foie, muscle etc…) et avec des cinétiques particulières. Ainsi, seuls les animaux sont capables de mimer la complexité de la réponse immune et il n’existe pour le moment aucune méthode substitutive.

Réduction

(1) Afin d’utiliser un minimum d’animaux nous permettant de répondre à la problématique posée, nous avons utilisé une approche statistique pour calculer le nombre d’animaux nécessaire pour obtenir un résultat significatif. Ce nombre est respecté pour chaque procédure. (2) Dès que possible, nous effectuerons un suivi longitudinal de la réponse immune par prélèvement de sang sur les mêmes individus, ainsi que de la force musculaire sur animal vigile. Sur x point de temps, cela réduit le nombre d’animaux utilisés d’un facteur x. (3) De plus, nous analysons le maximum de tissus post-mortem afin de collecter le maximum d’informations sur chaque animal.

Raffinement

Durant les expériences, nous utiliserons des méthodes expérimentales adaptées par exemple lors des prélèvements de sang (anesthésie préalable, application éventuelle d’une compresse pour stopper d’éventuels saignements) ou lors de l’administration des produits (administration d’anesthésiques), suivi vigilant de l’état des animaux. L’endormissement plus ou moins profond de l’animal permet la réalisation du geste expérimental sans que celui-ci ne bouge et puisse se blesser. Après toute intervention, les animaux seront observés avec attention de façon quotidienne. Si des signes d‘inconfort ou de douleur venaient à apparaitre, l’animal sera surveillé plus fréquemment et pesé. En absence d’amélioration sur une semaine, ou en cas de perte de poids supérieure à 20% du poids initial, la souris sera mise à mort.

Choix des espèces

Le model murin de la maladie de Pompe est un excellent moyen de déterminer l’efficacité thérapeutique de notre candidat puisque les souris n’ayant pas de GAA présente une forme pathologique proche de celui observé chez l’homme : absence de GAA dans l’organisme, accumulation du glycogène, diminution de la force musculaire et une réponse immunitaire contre la GAA est observée en cas d’injection de constructions immunogéniques. Lors de nos précédentes études, nous avons démontré qu’il était possible de traiter ces symptômes via l’injection d’un de nos vecteurs. En fonction des disponibilités, les animaux seront utilisés entre 3 et 8 semaines d’âge, âge auquel le système immunitaire est mature.

Pour tester si un composé injectable modifie le comportement des cellules immunitaires attirées par une tumeur, 640 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent cinq injections sur animal vigile, dont celles qui provoquent le cancer et celles de l'immunothérapie associée, le porteur n'attendant "aucune nuisance particulière" dans ce modèle de cancer au-delà du stress de la préhension. Les groupes comptent vingt souris, et le projet s'arrête si aucune différence significative n'apparaît entre traitement et témoin. Sur le remplacement, le porteur affirme avoir besoin d'un "organisme entier et autonome", ni les modélisations mathématiques ni les systèmes in vitro ne reproduisant selon lui la circulation des cellules immunitaires entre organes.

Objectifs

L'apparition d'une inflammation attire les cellules du système immunitaire. Dans le cancer, ces cellules peuvent empêcher la réponse immunitaire contre les cellules tumorales. Nous avons découvert l’un des mécanismes contrôlant le comportement des cellules immunitaires et réussi à augmenter l’efficacité d’un traitement anti-tumoral par blocage de points de contrôles immunitaires, dans un modèle de cancer chez la souris. Nous avons mis au point in vitro un composé injectable qui pourrait modifier le comportement de ces cellules immunitaires. Le but de ce projet est de tester ce composé dans une situation physiologique in vivo, et en particulier pour le traitement du cancer. Ce travail constitue la première étape pour le développement de cette nouvelle piste thérapeutique qui pourrait déboucher sur de nouveaux traitements dans le cancer.

Bénéfices attendus

Grâce à ce projet, nous pourrons faire avancer de manière conséquente le développement d'une nouvelle approche thérapeutique afin d'améliorer l'efficacité des thérapies anti-cancer.

Procédures

Tous les animaux vigiles subiront une injection pour tester notre composé (quelques secondes) et des injections supplémentaires pour induire le modèle de cancer et pour le traitement par immunothérapie (4 injections supplémentaires, quelques secondes).

Impact sur les animaux

Les nuisances attendues sont : stress lié à la préhension (légère et rapide) et douleur légère liée à la piqure. Aucune nuisance particulière n'est attendue dans le modèle de cancer.

Devenir

A l'issue de la procédure, les animaux seront mis à mort (fin de l'expérience ou pour analyses post-mortem).

Remplacement

Nous avons identifié in vitro et dans des souris génétiquement modifiées une cible thérapeutique intéressante. Afin d’évaluer le potentiel de cette stratégie, nous devons à présent utiliser un modèle animal représentant un organisme entier et autonome. Il n’existe pas de méthode alternative pour réaliser ce travail qui nécessite l’analyse de tissus entiers. La dynamique de l'inflammation, des cellules immunitaires recrutées ainsi que les interactions et le recrutement potentiel de cellules d’autres organes sont des conditions qui ne peuvent pas être adéquatement reproduites in vitro. De plus, le système immunitaire est un système dynamique dont les acteurs évoluent entre différentes localisations au sein de l’organisme selon des flux très précis. Ni les modélisations mathématiques, ni les systèmes in vitro ne permettent de reproduire cela, ceci nous oblige donc à utiliser des animaux afin de tester notre stratégie thérapeutique dans un système physiologique complexe. Des expériences in vivo sont donc nécessaires pour compléter les découvertes obtenues in vitro. De plus, l’utilisation de modèle animal reste indispensable pour pouvoir aborder la phase d’application de nos découvertes en clinique.

Réduction

Le nombre de souris à utiliser a été calculé à l’aide d'un logiciel statistique, pour obéir aux minima nécessaires à des analyses statistiques valides, condition nécessaire pour une interprétation biologique des résultats. Le nombre de souris par condition est de 20 afin que les résultats obtenus puissent présenter une puissance statistique suffisante. Si nous mettons en évidence une différence significative entre le traitement et le contrôle, nous poursuivrons les analyses. Dans le cas contraire, le projet s'arrêtera.

Raffinement

Les animaux seront maintenus dans des groupes de plusieurs individus dans un environnement enrichi. Dans chaque procédure, les animaux seront surveillés tous les jours pour l’état général, afin d’assurer leur bien-être et pour surveiller les éventuels signes de douleur, de souffrance ou de stress. Des soins spécifiques seront mis en place si nécessaire, tels que l'injection de solution réhydratante en cas de déshydratation. Les animaux seront pesés et évalués au minimum deux fois par semaine grâce à une grille de score pour éviter la souffrance inutile des animaux.

Choix des espèces

La souris est le modèle de choix car la physiologie de la souris est proche de celle de l’Homme. D’autre part les mécanismes immunitaires sont bien caractérisés chez la souris, ce qui en fait un modèle particulièrement adapté pour étudier les cellules immunitaires. Les souris seront utilisées à l'âge adulte (de 8 à 12 semaines) afin que les souris aient fini leur croissance, et que les résultats ne soient pas affectés à cause de modifications dues à un âge trop avancé des animaux

Le protocole dépend du candidat médicament et de la durée de traitement demandée, dix substances devant être évaluées sur cinq ans. 80 chiens adultes vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacun est anesthésié une à deux heures pour l'implantation chirurgicale d'un cathéter intraduodénal relié à une chambre sous-cutanée ou la pose d'une sonde nasogastrique, puis subit jusqu'à douze prélèvements sanguins en 24 heures et des administrations répétées pendant des jours ou des semaines, avec un hébergement en box individuel estimé à deux semaines. Le porteur retient le chien pour son anatomie digestive proche de celle de l'humain et pour sa taille, qui autorise des cathéters permanents et des prises de sang répétées, et prévoit de réutiliser ces animaux après accord du vétérinaire.

Objectifs

L’administration intraduodénale est une méthode permettant d’administrer une substance directement dans la première portion de l’intestin grêle, en contournant la dégradation gastrique. Cette voie est utilisée en pharmacologie expérimentale, en nutrition entérale, et dans certains protocoles thérapeutiques vétérinaires. Cependant, les techniques d’accès au duodénum (utilisation temporaire d’une sonde nasoduodénale ou pose d’un cathéter à demeure) présentent des variations méthodologiques importantes, souvent non standardisées. Le présent projet vise à décrire la mise en oeuvre de deux approches pour réaliser les administrations intraduodénales. Même si les 2 approches permettent la réalisation de plusieurs administrations duodénales chez le même animal, la première approche (sonde naso-gastrique) est d'avantage envisagée dans le cas d'études nécessitant des traitements répétés de courte durée (probablement 2 semaines maximum). La seconde approche (cathéter intraduodénal relié à une chambre sous cutanée de type Access port) est d'avantage envisagée pour des taritements répétés chroniques (au delà de 2 semaines). L'obectif de ce projet est donc double. Il permettra de déterminer la faisabilité technique, la stabilité post-opératoire, la tolérance clinique, la reproductibilité et la sécurité des administrations. Ce projet permettra également d'étudier la pharmacocinétique de 10 substances d'essais évalulées, sur 5 ans, dans chacune des deux techniques.

Bénéfices attendus

La voie intra-duodénale permet aux éléments testés de contourner l'estomac et de les diriger vers l'intestin grêle, afin d’éviter l’inactivation du candidat médicament par l'acidité gastrique, le retard d’absorption, et les interactions avec le contenu gastrique. Cette voie d’administration est ainsi couramment utilisée lors d’études de pharmacocinétiques (absorption intestinale pure), pour l’administration de nutriments ou médicaments sensibles à l’acidité gastrique et l’évaluation de l’effet de substances sur la muqueuse intestinale. Ce projet pemettra d'établir les profils pharmacocinétiques de candidats médicaments. Ce projet nous fournira également des données expérimentales permettant de définir et de choisir, en fonction du candidat médicament et de la durée du traitement, la meilleure approche pour assurer les administration intra-duodénales chez le chien. De plus, le projet contribuera à diminuer la douleur et le stress des animaux dans les futurs protocoles et des essais répétés et d’optimiser les conceptions expérimentales futures. Ce projet contribuera également à l'amélioration du bien-être animal grâce à l’optimisation des soins anesthésiques, antalgiques et postopératoires.

Procédures

Les animaux seront anesthésié (généralement entre 1 et 2 heures) et subiront une intervention chirurgicale afin de placer un dispositif permettant de délivrer des candidats médicaments dans le duodénum. Après réveil et une période de récupération (de 2 à 7 jours selon la technique utilisée), des prélèvements sanguins veineux seront réalisés après administration de la substance à évaluer (12 prélèvements maximum sur 24 heures; volume et fréquence adaptés à l'espèce) elon les bonnes pratiques vétérinaires. La durée de la procédure de prélèvement est de quelques secondes. Les administrations intraduodenales sont effectuées selon les bonnes pratiques vétérinaires. La durée de la procédure d’administration devrait être inférieure à une minute. Les administrations peuvent être uniques ou répétées pendant plusieurs jours ou plusieurs semaines, en fonction des spécificités du candidat traitement. La fréquence des administrations (exemple : journalière, hebdomadaire) est variable et également adaptée à la spécificité des substances testées. Pour que les animaux soient au calme pendant la phase de réveil post-chirurgicale, de faciliter les soins et protéger le dispositif d'administration, ils seront hébergés en box individuel (estimation 2 semaines maximum). Un enrichissement sera mis en place et les animaux seront hénergés à proximité de congénères (maintien visuel, olfactif et auditif avec les congénères).

Impact sur les animaux

La phase de chirurgie sous anesthésie (et mise à disposition de ration journalière de nourriture après le réveil), la phase de réveil post-chirurgicale, l'hébergement individuel (estimée à 2 semianes maximum), les administrations ou les prélèvements sanguins (sous contention légère) peuvent entrainer un stress ou une douleur légère.

Devenir

Les animaux pourront être réutilisés après l’approbation du vétérinaire.

Remplacement

En amont des tests in vivo, des tests in silico ou in vitro peuvent être envisagés (ou même requis d'un point de vue réglementaire) afin d'évaluer la tolérance locale des candidats médicaments. Cependant, même si ces tests peuvent apporter des données préliminaires ou complémentaires (permettant ainsi un tri des substances à étudier, et donc réduisant de fait le nombre d'animaux utilisés), ils ne peuvent entièrement suppléer les modèles animaux car ils ne permettent pas d’évaluer la pharmacocinétique et les effets dans un environnement biologique et physiologique intact comme cela est possible chez l’animal.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisé pour chaque étude a été optimisé de façon à obtenir des données suffisantes pour interpréter les résultats de façon correcte, évitant ainsi une répétition des études. Le nombre d’animaux utilisés pour chaque étude sera optimisé de façon à intégrer dans une même expérience la relation dose-concentration/effet (si plusieures doses sont testées). Dans la mesure du possible (dépend de la durée d'action de la ou des substances testées), plusieurs doses d'une même substance (ou de substances différentes), ainsi qu'un contrôle négative et/ou positif (si nécessaire) peuvent être testés chez le même animal à des jours différents, réduisant ainsi le nombre d'animaux utilisés. Dans le cas des études de pharmacocinétique, un groupe de traitement comprend classiquement entre 3 et 6 animaux (nombre basé sur les standard des études de pharmacocinétiques).

Raffinement

Le raffinement des méthodes expérimentales pour réduire au maximum la souffrance animale est mis en œuvre grâce à l'utilisation de points limites clairement établis, permettant d'euthanasier tout animal présentant des signes de douleur, de souffrance ou d'angoisse dépassant le cadre de l'étude. En cas de doute sur l’état général de l’animal, une évaluation approfondie sera réalisée quotidiennement jusqu'au retour aux paramètres physiologiques normaux (ou attendus) ou jusqu’à atteinte des points limites. De plus, suite à la phase de chirurgie, un formulaire interne spécifique à l’espèce sera complété. Il intègre une évaluation de l’appétit, du poids, de l’attitude, de l’activité, et du comportement général de l’animal, ainsi que l’évaluation du comportement vis-à-vis de la zone de chirurgie et de la réaction lors de la palpation de la zone de chirurgie. Ce formulaire d’évaluation de la douleur permet de prendre les bonnes décisions en évitant toute souffrance animale. Il est aussi mis en place un enrichissement complet dans l'hébergement des animaux (e.g. litière, plateformes, bacs de repos, jouets et musique, présence de congénères...). Pour les phases chirurgicales, les animaux sont anesthésiés et analgésiés, le programme d’anesthésie et d’analgésie étant défini par un vétérinaire, afin de réduire au maximum toute douleur ou sensation de souffrance. De plus, la phase de chirurgie est raffinée au maximum, par la mise à disposition d’oxygène ou air ambiant à concentration ajustable, de tapis chauffants et/ou de lampes chauffantes et de soins pré- et post-opératoires complets. Ce projet est en développement dans notre établissement utilisateur, et une évaluation interne impliquant la cellule de bien-être animal sera demandée afin de vérifier et adapter (si nécessaire) la catégorie éthique et les méthodes de raffinement.

Choix des espèces

Le chien présente une anatomie gastro-intestinale (taille, pH intestinal, motricité) et un temps de transit plus proches de l'humain que ceux des petits rongeurs, facilitant ainsi l'extrapolation des résultats. La taille du chien permet également la pose de cathéters intraduodénales permanents ainsi que des prélèvements sanguins répétés (sans saignées excessives) afin d'établir une courbe pharmacocinétique complète. Chiens adultes, conformément à la littérature scientifique et aux pratiques dans les études de pharmacocinétiques.

Ovariectomisées pour une partie d'entre elles, puis opérées pour recevoir un fragment d'utérus hors de l'utérus, 384 souris subissent des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Suivent dix semaines d'injections hormonales hebdomadaires, des injections de traitement en intraveineuse, jusqu'à neuf échographies sous anesthésie et trois nuits de seize heures passées seules pour observer si elles construisent encore un nid. Le porteur décrit une douleur chirurgicale modérée mais prolongée, des douleurs abdominales pendant les semaines de développement des lésions et un stress supplémentaire lié à l'isolement nocturne. Des points limites déclenchent la mise à mort des souris dont la douleur n'a pas pu être corrigée, les autres étant tuées à la fin pour prélever les lésions.

Objectifs

L'endométriose est une maladie gynécologique inflammatoire qui touche plus de 10 % des femmes en âge de se reproduire (190 millions). Elle se caractérise par la présence anormale de tissus/lésions endométrial(e)s en dehors de l'utérus. Cette maladie touche plusieurs organes situés dans l’abdomen. Huit à dix ans sont généralement nécessaires afin de détecter cette maladie. L'endométriose a un impact considérable sur la qualité de vie des femmes et sur l'économie mondiale (environ 80 milliards de dollars par an). Les traitements disponibles actuellement servent uniquement à diminuer les symptômes mais ne soignent pas cette maladie. Dans certains cas, les lésions peuvent être retirées par chirurgie cependant 30 % des femmes opérées ont de nouvelles lésions dans les 5 ans post chirurgie. La progression de la maladie et de ces lésions endométriales se rapproche de ce qui est observé dans le développement des cancers comme le développement anarchique de cellules en dehors de leur organe d’origine. Récemment, une protéine connue pour son implication dans le développement du système nerveux a été identifiée pour jouer un rôle potentiel dans l’endométriose. Notre objectif est de tester un nouvel anticorps permettant de bloquer cette protéine et de voir les effets potentiels de ce traitement sur le développement des lésions endométriales.

Bénéfices attendus

En 2022, la France a décrété la lutte contre l’endométriose comme cause nationale. Ce projet fait partie du consortium national de recherche sur l’endométriose (dans le cadre du PEPR Santé des femmes, santé des couples). Cette demande d’expérimentation a pour objectif de tester l'efficacité d’une nouvelle thérapie afin d’améliorer le bien-être des femmes atteintes d’endométriose et également d'accroître les connaissances sur cette maladie.

Procédures

Les animaux subiront 1 ou 2 interventions chirurgicales sous anesthésie et analgésie parmi elles ; pour une partie des souris une ovariectomie (20 min/souris) qui vise à retirer les ovaires afin de contrôler la production d’hormones sexuelles, et pour toutes les souris une intervention permettant d’induire l’endométriose (selon 2 méthodes d’induction différentes ; soit la première 5 min/souris, soit la deuxième 15-20 min/souris). Les souris ovariectomisées recevront une injection hebdomadaire d’hormone en sous-cutanée pendant 10 semaines. Les injections sous-cutanées nécessitent une contention d’environ 30 secondes et les injections intraveineuses (pour les traitements) une contention de maximum 2min. Les souris subiront un test de comportements spontané pour lequel elles seront individualisées sur une nuit (16h) afin de voir leur capacité à former un nid reflétant leur bien-être. Ce test sera réalisé 3 fois au total.

Impact sur les animaux

Au sein de ce projet, les animaux seront soumis à différentes nuisances. La première des nuisances aura pour origine les procédures chirurgicales mais les douleurs post-chirurgies sont diminuées par la mise en place d'une analgésie spécifique et d’un suivi fréquent permettant de l’ajuster en cas de besoin. L'anesthésie des animaux peut entrainer une détresse légère et une courte hypothermie. La chirurgie peut entrainer une douleur modérée mais prolongée. Les souris subiront différentes manipulations chaque semaine pour des pesées et des traitements (injections sous-cutanées et/ou intraveineuses) et le suivi du développement des lésions par échographie (au maximum 9 fois). Ces manipulations peuvent entraîner du stress durant le temps des contentions ainsi que pour l'anesthésie (endormissement et réveil). Durant les semaines de développement de la maladie, il est possible que des douleurs abdominales apparaissent également. Les souris subiront un test de comportements spontané pour lequel elles seront individualisées sur une nuit (16h) pouvant induire un stress supplémentaire et ce test sera réalisé 3 fois (au départ puis sur les dernières semaines de suivi avec 1 semaine d’intervalle).

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort pour collecter les tissus, puisqu'il faudra analyser les lésions générées par l'endométriose et comparer les différents groupes de traitements.

Remplacement

L’endométriose est une maladie qui fait intervenir de nombreux processus cellulaires et de nombreuses interactions tissulaires entre organes. En effet, l’endométriose est une maladie qui a pour origine la présence de tissu endométrial en dehors de l’utérus. Le seul moyen de l’étudier est donc de mimer la pathologie dans un contexte « corps entier » en apportant expérimentalement un fragment d’utérus là où il ne devrait pas être. Il n’existe à ce jour aucun modèle alternatif en culture cellulaire ou autre.

Réduction

Le nombre de groupes et l’effectif de chaque groupe d’animaux ont été réduits au maximum, en se basant sur la littérature et l’utilisation de tests statistiques. Les observations sur la taille et le volume des lésions endométriales et l’amélioration du bien-être des animaux seront analysés avec des méthodes statistiques appropriées, avec des groupes de 12 souris chacun. Les tests utilisés permettent de vérifier si le traitement a un effet réel sur le développement des lésions. La procédure est séparée en 2 lots d’animaux, le second lot ne sera réalisé que dans le cas où le premier lot a montré un effet sur le développement des lésions ou le bien être des animaux.

Raffinement

Les souris ont une période d’habituation aux expérimentateurs qui vont suivre le protocole. Les souris seront élevées et hébergées par groupes, avec un milieu enrichi pour améliorer leur bien-être (maison en carton, coton). Tout au long de notre expérience, le suivi rigoureux des animaux (pesées, suivi post-opératoire etc.) plusieurs fois par semaine permettra la recherche de tout signe de souffrance. Des points limites adaptés sont mis en place au- delà desquels, si aucun moyen de correction de la douleur n’a été efficace, les souris sont mises à mort. Les procédures de chirurgie et les injections sont réalisées par du personnel qualifié afin de réduire au maximum le temps de manipulation et le stress des animaux avec anesthésie et analgésiques adaptés dès que nécessaire. Des mesures de confort sont mises en place : éléments de nidification supplémentaires, tapis chauffant pendant l’anesthésie, nourriture semi- liquide en cas de perte de poids, gel protecteur pour les yeux, et enrichissement des cages après les injections.

Choix des espèces

La souris présente l’avantage d’être très similaire à l’homme que ce soit anatomiquement, physiologiquement et génétiquement. En effet, plus de 98% de ses gènes sont identiques à ceux de l’homme. Cette proximité physiologique et génétique permet de récapituler les évènements cellulaires observés chez l’homme et donc de l’utiliser comme modèle d’étude. Dans notre cas, le modèle d’endométriose murin permet de se retrouver dans des conditions physiologiques très proches de celles observées chez les patientes atteintes d’endométriose. De plus, la protéine étudiée n'est pas exprimée dans certaines espèces mais on retrouve une forte ressemblance entre la forme humaine de cette protéine et la forme murine, justifiant encore l'usage des souris. Les souris utilisées dans ce projet sont des souris femelles vierges d’au moins 8 semaines, possédant un utérus mature et fonctionnel.

Des furoncles couvrant une certaine surface du corps déclenchent la mise à mort de l'animal, selon la grille à sept critères du projet. 273 truites arc-en-ciel vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles sont infectées par la bactérie de la furonculose puis observées deux fois par jour jusqu'à l'apparition de lésions cutanées, d'hémorragies ou d'une septicémie pour les formes les plus graves, les survivantes étant tuées par surdosage d'anesthésique et exsanguination. Le porteur justifie l'absence de relâcher par l'impossibilité sanitaire de remettre en circulation des poissons infectés, et rattache l'étude aux pertes économiques de la pisciculture, la truite arc-en-ciel étant l'espèce de poisson la plus élevée en France.

Objectifs

La furonculose est une maladie bactérienne des Salmonidés causée par la bactérie Aeromonas salmonicida subsp. salmonicida. Elle entraîne des pertes économiques importantes en raison de sa forte mortalité lors des formes suraiguës et des lésions cutanées qu’elle provoque dans les cas aigues à chroniques. La maladie est saisonnière et se déclare pour toutes les classes d’âges des poissons particulièrement en période estivale. Les signes cliniques et la mortalité peuvent varier entre les souches, soulignant l’importance de mieux comprendre l’expression de leur virulence pour aboutir à des vaccins protégeant contre les formes les plus mortelles. Des travaux in vitro réalisés sur 46 souches isolées d’élevages piscicoles touchés par la furonculose montrent des différences d’expression de facteurs de pathogénicité notamment la couche A. Certaines souches expriment toutes (100% des colonies) ce facteur à partir d’un même clone (A+) alors que d’autres non (A-). Enfin, d’autres souches montrent deux sous-populations produisant ou non la couche A (A±). L’objectif est d’étudier si ces différences peuvent expliquer les variations de signes cliniques observés en élevage et ainsi proposer de nouveaux antigènes dans le cadre du développement de nouveaux vaccins mais également permettre la distinction au sein des populations pathogènes pour le diagnostic en élevage.

Bénéfices attendus

La compréhension du pouvoir pathogène d’A. salmonicida salmonicida permettra de proposer de nouvelles approches diagnostic pour distinguer la virulence des souches isolées en élevages piscicoles et adapter le recours à un traitement mais aussi de contribuer à optimiser les vaccins sur le terrain en sélectionnant des souches possédant des antigènes pertinents pour améliorer la protection des truites.

Procédures

Les animaux seront soumis à une infection expérimentale en condition contrôlée. Les animaux vigiles seront suivis quotidiennement. Ceux morts en raison de l’infection ou nécessitant une mise à mort sur la base des points limites décrits en 3.3.6.3. seront anesthésiés puis mis à mort par surdosage d’anesthésique accompagnée d’une exsanguination. En fin d’expérimentation, les animaux survivants seront également mis à mort selon la procédure préalablement décrite ci-avant. Toutes les manipulations seront réalisées sous anesthésie, par des personnes expérimentées, en possession du niveau "concepteur" ou de niveau "applicateur" de la formation expérimentation animale", et formées aux gestes techniques nécessaires à la procédure

Impact sur les animaux

L’étude du pouvoir pathogène des différentes populations bactériennes nécessite d’infecter des poissons pour mieux le comprendre. Le déclenchement de la maladie peut aboutir à des signes cliniques pouvant entrainer de la souffrance chez les animaux (furoncles superficiels jusqu’à hémorragie et septicémie pour les formes les plus graves). Sept critères d’observation ont été choisis pour évaluer la souffrance des animaux avec pour chacun des niveaux) de gravité (de la condition normale à l’état dégradé de l’animal. A chacun de ces niveaux est affecté un score dont la somme permet de définir un seuil d’intervention pour augmenter la fréquence de surveillance des animaux voire de les mettre à mort pour certains points limites individuels comme la présence de furoncles sur une superficie de l’animal.

Devenir

L'euthanasie des poissons est prévue en fin de protocole, pour des raisons notamment sanitaires (impossibilité de relâcher ou de réutiliser des poissons potentiellement infectés par A. salmonicida)

Remplacement

L’objectif du projet étant de comparer le pouvoir pathogène de différentes souches d’A. salmonicida salmonicida, cela ne peut se faire uniquement sur animaux vivants. Bien que des modèles cellulaires de truites existent, ils ne permettent pas de valider l’apparition de signes cliniques tels que les furoncles ni d’évaluer le taux de mortalité.

Réduction

Dans l’étude préliminaire, nous limiterons le nombre d’animaux en testant 3 souches uniquement (A+, A-, A. Ainsi, l’expérimentation préliminaire contiendra 3 groupes test et 1 groupe contrôle. Chacun contiendra 31 animaux en duplicat, soit 62 animaux par groupe au total. Ce nombre a été calculé en utilisant un outil statistique qui nous permettra d’obtenir des résultats exploitables tout en minimisant le nombre d’animaux utilisés dans l’expérimentation.

Raffinement

Une observation quotidienne des poissons est assurée. Lors des procédures de challenge infectieux, les poissons font l’objet d’une observation deux fois par jour, chaque jour, de manière systématique avec des seuils d’alarme définis pour la température et l’oxygène. Une photopériode de 12h de jour et 12h de nuit sera respectée en lien avec le rythme de poissons, ainsi que des enrichissements pour leur permettre de se cacher et réduire le stress. Enfin, les points limites ont été définis sur la base de 7 critères pour lesquels sont attribués 4 niveaux d’observation (de l’état normal à dégradé de l’animal) avec des scores pour chacun. La somme de ces scores permet de définir un seuil d’intervention pour augmenter la fréquence de surveillance des animaux. Cinq de ces critères ont également un niveau d’observation pouvant conduire à la mise à mort de l’animal indépendamment des autres critères car ils peuvent être à l’origine d’une souffrance animale à eux seuls.

Choix des espèces

La truite arc-en-ciel est un hôte naturel d'Aeromonas salmonicida salmonicida. C'est de plus l'espèce de poisson la plus élevée en France et donc pour laquelle il est essentiel de mieux comprendre le processus infectieux pour améliorer le diagnostic, la thérapeutique et les approches vaccinales. Les truites utilisées seront de 20 à 30g. La furonculose est une maladie que l'on observe à différents stades d'élevage (alevins, truites portions = 200-250g et grosse truite > 1kg)

700 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, chacune recevant jusqu'à 63 administrations et quatre prélèvements sanguins. Une colite chronique leur est provoquée par un composé chimique ajouté trois semaines durant à l'eau de boisson, avec diarrhées, sang dans les selles et douleurs abdominales, et chaque souris est hébergée seule alors que le porteur reconnaît des animaux sociaux. Le projet aligne dix études sur cinq ans pour tester des composés en développement contre les maladies inflammatoires de l'intestin. Les retombées annoncées pour les patients passent par des essais cliniques et une autorisation de mise sur le marché qui restent au conditionnel, quand l'inflammation infligée est programmée.

Objectifs

Les maladies chroniques de l’intestin, comme la maladie de Crohn et la rectocolite hémorragique, touchent plusieurs millions de personnes dans le monde, et leur fréquence augmente, surtout dans les pays industrialisés et chez les jeunes adultes. Cette augmentation résulte d’une combinaison de facteurs génétiques, environnementaux, alimentaires et liés au mode de vie. Les traitements existants sont encore limités et une partie des patients ne répond pas aux médicaments actuels ou perd leur efficacité avec le temps. Cela montre l’importance de développer de nouvelles solutions pour réduire l’inflammation et améliorer la santé intestinale. Le projet utilise un protocole standardisé et prévoit 10 études sur cinq ans. L’objectif est de tester l’efficacité de nouveaux composés susceptibles de réduire l’inflammation de l’intestin. Les résultats permettront de mieux comprendre leur fonctionnement et, si les résultats sont positifs, de poursuivre leur développement pour un usage chez l’homme.

Bénéfices attendus

La présente étude devrait permettre de mettre en évidence l’efficacité de composés d’intérêt thérapeutique en cours de développement pour réduire la colite, et d’apporter une confirmation de leur mode d’action. En cas d’efficacité avérée, ces composés pourront être testés ultérieurement dans le cadre d’études cliniques et pourraient, à terme, obtenir une autorisation de mise sur le marché.

Procédures

Les animaux seront soumis aux interventions suivantes : 1) Administration des traitements (7 administrations lors de l'habituation et 56 administrations lors de la phase de traitement : < 1 minute). 2) Hormis pour les 10 souris du groupe expérimental contrôle du modèle de colite, les animaux seront exposés à trois reprises pendant une semaine à un composé chimique induisant une inflammation du colon via leur eau de boisson (3 semaines). 3) Manipulations par les expérimentateurs pour des mesures de poids corporel deux fois par semaine avant traitement et quotidiennement pendant l'ensemble de la période de traitement (durée des pesées < 1 minute). 4) Prélèvements sanguins (4 prélèvements sanguins par souris : 5 minutes).

Impact sur les animaux

Le modèle utilisé est un modèle de colite chronique chez la souris. La concentration du composé chimique employée permet d’induire une colite légère. Cette concentration est inférieure à celle utilisée dans les modèles de colite aiguë afin de tenir compte du caractère chronique du modèle et de la répétition des phases d’exposition à ce composé. Dans ce contexte, les souris peuvent présenter des épisodes de diarrhée, parfois accompagnés de la présence de sang dans les selles, ainsi que des douleurs abdominales. Les différentes procédures réalisées au cours de l’étude, telles que les administrations, ainsi que les pesées quotidiennes à l’état éveillé, peuvent être sources de stress ou d’inconfort. Enfin, l’hébergement individuel, bien que nécessaire pour le bon déroulement du protocole, constitue également une contrainte pour les souris, qui sont des animaux sociaux.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés à l'issue de la procédure. En effet, l'étude implique des analyses biochimiques et histologiques sur les colons et les rates qui doivent ainsi être collectés à l'issue de la procédure.

Remplacement

L’utilisation d’animaux à des fins scientifiques est justifiée dans ce projet, car il n’existe actuellement aucune méthode de substitution permettant d’étudier l’impact d’un composé sur l’inflammation du côlon sans recourir à un animal de laboratoire. Les inflammations chroniques de l’intestin sont des maladies complexes faisant intervenir plusieurs mécanismes biologiques, notamment inflammatoires et immunitaires.Des modèles alternatifs, comme les tests in vitro, sont utilisés en amont pour évaluer l’efficacité potentielle des composés. Toutefois, l’étude sur l’animal entier demeure indispensable afin de mieux comprendre les effets globaux du composé et constitue une étape nécessaire avant toute demande d’autorisation pour la réalisation d’études cliniques chez l’humain.

Réduction

Le nombre d'animaux utilisés a été calculé et rationalisé à partir de l'expérience acquise par notre laboratoire sur l'analyse des paramètres d'intérêt. Le nombre de 15 animaux par groupe a été défini comme le minimum nécessaire pour mettre en évidence une différence statistiquement significative sur les paramètres étudiés, en tenant compte de l’hétérogénéité du modèle employé. Un total de 70 souris sera utilisé, réparties en 1 groupe de 10 souris (groupe contrôle du modèle) et 4 autres groupes de 15 animaux chacun. Le groupe contrôle du modèle a été réduit à 10 animaux, puisqu’il ne présente pas de colite, ce qui réduit la variabilité des mesures.

Raffinement

Le modèle animal utilisé est un modèle d’inflammation du côlon chez la souris, induite par l’administration d'un composé chimique, largement décrit et validé dans la littérature scientifique. Le protocole a été conçu afin de limiter au maximum le stress et la souffrance des animaux, et des points limites adaptés ont été définis. La dose du composé chimique utilisée a été réduite par rapport aux modèles de colite aiguë, afin de tenir compte des administrations répétées et de limiter la sévérité de l’inflammation. Les animaux feront l’objet d’un suivi quotidien à l’aide de grilles d’évaluation standardisées permettant d’identifier précocement tout signe de souffrance ou d’aggravation de la colite. En cas d’atteinte de seuils prédéfinis, un traitement antalgique sera administré afin de prévenir toute douleur. Si l’inflammation devenait trop sévère, l’animal concerné serait retiré de l’étude. Les animaux seront hébergés individuellement pour les besoins du protocole, tout en conservant des contacts visuels et olfactifs avec leurs congénères. Un enrichissement renforcé de l’environnement sera mis en place, comprenant des briquettes de bois adaptées aux rongeurs, des abris en carton et du matériel de nidification.

Choix des espèces

Le modèle animal utilisé est un modèle d’inflammation colique induite par administration d'un composé chimique chez la souris qui est très bien caractérisé dans la littérature et couramment utilisé dans le cadre d'études précliniques. Les animaux seront réceptionnés à 7 semaines d'âge et les traitements débuterons à 9 semaine d'âge. Cela correspond à un stade de jeune adulte mimant la population cible majoritaire des inflammations chroniques de l'intestin chez l'humain.