Procédures modérées

112 porcs charcutiers vont être utilisés, tous tués à 110 jours, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils reçoivent un transpondeur sous la peau, une à deux injections vaccinales intramusculaires et trois prises de sang de 10 ml, avec fièvre, baisse d'appétit et lésions musculaires possibles au point d'injection. La mise à mort sert à examiner l'encolure pour mesurer les dégâts locaux laissés par les adjuvants testés. Le porteur présente ces essais comme une recherche de meilleure tolérance pour la santé et le bien-être des animaux non-humains, et détaille aussitôt les gains attendus en croissance, en productivité et en homogénéité des lots.

Objectifs

L’objectif du projet est d’évaluer l’innocuité et l’efficacité de différentes formulations adjuvantes chez le porc charcutier. L’antigène utilisé (APP) présente un profil d’innocuité déjà bien établi. En revanche, l’association de cet antigène avec certains adjuvants peut induire des lésions locales, superficielles et/ou musculaires, susceptibles d’entraîner une réforme de l’animal. Le test de nouveaux adjuvants vise à diminuer ces effets. En termes d’efficacité, il est établi que les quantités d’anticorps spécifiques de l’APP sont directement associés à l’efficacité vaccinale. Le suivi de ces paramètres constitue donc des indicateurs pertinents pour l’évaluation de l’efficacité des nouveaux candidats adjuvants dans le cadre de ce projet.

Bénéfices attendus

Une meilleure tolérance et efficacité sont sans cesse recherchées pour améliorer la santé et le bien-être animal. L’optimisation des adjuvants vise avant tout à renforcer la réponse immunitaire, en stimulant plus efficacement les défenses naturelles de l’animal et en favorisant une production d’anticorps durable et protectrice. En parallèle, une meilleure immunité contribue à diminuer l’incidence des maladies cliniques et subcliniques, améliorant la croissance, la productivité et l’homogénéité des lots. Enfin, des animaux mieux protégés nécessitent moins de traitements antibiotiques, participant ainsi à la réduction de l’usage des antimicrobiens et à la lutte contre l’antibiorésistance

Procédures

Tous les actes se feront sur animal vigile : Pose de transpondeurs sous-cutanés (1 fois par animal, durée de l'acte moins de 2minutes), Injection d'un vaccin une à deux fois en fonction des groupes à J0 et J28 ( durée de l'acte moins de 2 minute par animal), prélèvements sangins à J0, J27 et J80 : 10ml (Durée de l'acte mois de 5 minutes par animal, contention comprise)

Impact sur les animaux

Les nuisances attendues concernent principalement le stress induit par la manipulation et la contention des animaux, la douleur ainsi que les éventuels hématomes associés aux prélèvements sanguins, et la douleur liée aux injections intramusculaires. Des effets indésirables transitoires (fièvre, baisse de l’appétit) peuvent également survenir à la suite des injections. Par ailleurs, une gêne ou une douleur passagère peuvent être observées lors de l’implantation du transpondeur.

Devenir

Les animaux sont maintenus sous surveillance dans leur zone d'hébergement durant toute la procédure, jusqu'à leur mise à mort à J110. Un examen macroscopique des sites d'injection est alors réalisé au niveau de l'encolure. Le prélèvement de cette zone étant terminal, il ne permet pas le maintien en vie des individus.

Remplacement

Les modèles in vitro et ex vivo permettent aujourd’hui d’obtenir des informations précieuses sur les mécanismes immunologiques de base, mais ils ne peuvent pas reproduire l’ensemble de la complexité de la réponse immunitaire d’un organisme vivant. Les adjuvants agissent à plusieurs niveaux : activation de l’immunité innée, recrutement cellulaire au site d’injection, présentation de l’antigène, induction de la mémoire immunitaire… Ces processus impliquent une interaction dynamique entre cellules, tissus et médiateurs circulants, qu’aucun modèle in vitro ne peut entièrement reproduire. Les réactions locales (inflammation, nécrose, granulome) et systémiques (fièvre, baisse d’appétit, altération du comportement) ne peuvent être observées que chez l’animal entier. Ces effets sont essentiels à mesurer pour garantir le bien-être animal et la sécurité du vaccin avant toute application en élevage.

Réduction

Des études antérieures ont établi qu'un effectif minimal de sept animaux par groupe est nécessaire pour garantir la fiabilité statistique des résultats.

Raffinement

Le raffinement proposé repose sur plusieurs points essentiels destinés à optimiser le bien-être des animaux tout au long de l’expérimentation : 1. Conditions d’hébergement : Les animaux seront hébergés en loges sur caillebotis, équipées de chaînes et de balles servant de jouets d’enrichissement. Ils auront un accès permanent à l’eau (ad libitum) et seront nourris deux fois par jour (matin et soir). Chaque loge comprendra une zone de repos propre, distincte de la zone d’alimentation, afin de favoriser le confort et le comportement naturel des animaux. 2. Interventions et habituation Toutes les interventions seront réalisées dans le calme, avec récompense alimentaire à la clé pour limiter le stress. Une habituation progressive au jus de pomme sera mise en place dès la semaine précédant le début de l’expérimentation, afin de faciliter notamment la troisième prise de sang, identifiée comme la plus sensible. 3. Suivi sanitaire et critères de vigilance Les animaux feront l’objet d’une surveillance biquotidienne. Les paramètres suivants seront systématiquement suivis et consignés dans les données expérimentales : température, réactions au site d’injection et signes allergiques. Pour chaque critère, ainsi que pour le comportement général de l’animal, une grille de référence définit des points limites gradés et les actions de soins associées

Choix des espèces

L'objectif du projet est de tester des adjuvants pour la mise au point de vaccins porcins donc nous testons ces adjuvants sur l'espèce porcine. Les porcs seront utilisés de l'âge de 42 jours (jeune porc en croissance) à 152 jours pour coller à ce qui se fait en élevage. La primo injection du vaccin se fait souvent assez jeune (ici à 42 jours) avec un rappel 28 jours plus tard. Nous conservons les animaux jusqu'à 152 jours pour avoir un suivi de 110 jours après la primo-injection et ainsi vérifier l'innocuité du produit testés.

La production d'un médicament antirejet vendu dans plus de 80 pays repose sur 235 000 lapins, tous tués, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal reçoit deux injections immunisantes, subit deux prélèvements sanguins à l'artère de l'oreille en boîte de contention, puis un prélèvement intracardiaque sous anesthésie qui dure une dizaine de minutes et le tue. Le porteur reconnaît que ces ponctions répétées provoquent une anémie de deux à six jours. Il affirme qu'aucun modèle ne peut remplacer le lapin pour produire ces anticorps et rappelle que l'espèce est celle inscrite au dossier d'autorisation de mise sur le marché, ce qui verrouille le choix autant que la biologie.

Objectifs

Ce projet consiste en la production du principe actif d'un produit biologique à usage thérapeutique dit "life saving". Le médicament est un immunosuppresseur sélectif utilisé principalement pour prévenir ou traiter le rejet de greffe après une transplantation d’organe. Il s'inscrit dans un contexte de santé publique mondiale.

Bénéfices attendus

Le bénéfice de ce projet vise à produire le principe actif d’un médicament essentiel, distribué dans plus de 80 pays et reconnu comme un traitement vital pour de nombreux patients. Destiné à un usage hospitalier, ce médicament agit comme un immunosuppresseur sélectif, jouant un rôle clé dans la prévention et le traitement des rejets d’organes greffés, tant avant qu’après l’intervention chirurgicale. Le médicament est considéré comme un médicament « life saving », c’est-à-dire indispensable à la survie des patients greffés. Par ailleurs, ce médicament est également utilisé pour soigner l’aplasie médullaire. Classé parmi les médicaments critiques par l’Union européenne, il fait l’objet d’une obligation de stock minimal de quatre mois afin de garantir la continuité de l’approvisionnement et éviter toute rupture pour les patients.

Procédures

Il s'agit d’injections intra-veineuse et sous-cutanée, de prélèvements sanguins au niveau de l'artère à l'oreille sur des animaux vigiles sur lesquels une contention est assurée pendant toute la durée du prélèvement. Les différentes étapes sont les suivantes : - Étapes d’immunisation : Chaque animal vigile va recevoir une injection d’une suspension immunisante en 2 fois. Une première injection en sous-cutanée pour une durée de 1 minute, puis une deuxième injection 14 jours plus tard en intra-veineuse sur une durée de 1 à 2 minutes. - Phase de prélèvements sanguins : Un premier prélèvement sanguin est réalisé au niveau de l’artère médiane de l’oreille sur animal vigile placé dans une boîte à contention pour une durée moyenne de 5 à 6 minutes. Une fois le prélèvement terminé, de la colle chirurgicale est appliquée au niveau du point de prélèvement pour assurer l’hémostase. Le deuxième prélèvement est à l’identique du premier (au niveau de l’artère médiane de l’oreille sur animal vigile pour une durée moyenne de 5 à 6 minutes avec application de colle chirurgicale pour assurer l’hémostase. - Prélèvement terminal : Après une injection sur animal vigile par voie intra-veineuse d’un produit anesthésique (la contention dure environ 1 minute pour effectuer cette opération), l’animal alors sous anesthésie générale est prélevé par voie intracardiaque jusqu’à la mort de l’animal. Cette étape de prélèvement terminal dure environ 10 minutes.

Impact sur les animaux

Le protocole de production prévoit plusieurs étapes successives chez les animaux ; à savoir, 2 étapes d’immunisation, 2 étapes de prélèvements sanguins et 1 dernière étape de prélèvement intracardiaque : 1 - Étapes d’immunisation : Les animaux vont recevoir deux injections pour stimuler le système immunitaire. Une première injection en sous-cutanée d’une suspension cellulaire, puis une deuxième administrée 14 jours plus tard en intra-veineuse. Ces injections se font dans un délai court et peuvent provoquer une légère douleur au point d’injection (liée à la pénétration de l’aiguille et à la pression exercée lors de l’injection). La douleur est généralement immédiate et de courte durée. Elle est minimisée par l’utilisation d’aiguilles adaptées à la taille de l’animal et par la réalisation des injections par du personnel formé. 2 - Phase de prélèvements sanguins : deux ponctions sanguines sont réalisées au niveau de l’artère médiane de l’oreille. La ponction entraîne une douleur légère et brève, liée à la piqûre de l’aiguille. Les animaux peuvent manifester des signes de stress lors de la contention et de la ponction. Ces réactions sont généralement limitées et ne persistent pas après la fin de la procédure. Un petit hématome peut survenir au point de ponction, mais il est généralement minime et se résorbe spontanément en quelques heures. 3 - Prélèvement terminal : Il est effectué par voie intracardiaque sous anesthésie générale. L’induction du produit anesthésique par voie intraveineuse peut provoquer une douleur légère et brève. Ces prélèvements sanguins peuvent induire une anémie (avec une durée comprise entre 2 et 6 jours). Une étude menée en interne en 2023, basée sur la mesure et le suivi du taux d’hématocrite, a permis de démontrer que cette anémie reste légère à modérée.

Devenir

À l’issue de la procédure, l'ensemble des animaux seront mis à mort lors de la prise de sang terminale par voie intracardiaque sous anesthésie générale.

Remplacement

À ce jour, aucun modèle alternatif ne permet de remplacer le lapin pour la production d’anticorps polyclonaux destinés à la fabrication du principe actif du médicament en raison de la complexité et de la diversité épitopique requise. En effet, la diversité et la quantité d’anticorps générés par cet animal offrent une compatibilité optimale avec un large panel de patients greffés, et ce à l’échelle mondiale. Cette complexité immunologique ne peut être reproduite par les méthodes de production in vitro actuelles. Le médicament cible plus de 80 épitopes distincts des cellules immunitaires, induisant ainsi chez le patient une immunosuppression à la fois puissante et prolongée, essentielle pour prévenir les rejets de greffe.

Réduction

La procédure expérimentale mise en œuvre a été définie dans un objectif d’optimisation du rendement en sérum par animal utilisé, tout en assurant l’obtention d’un sérum présentant la concentration requise en anticorps polyclonaux. La réalisation de prélèvements sanguins répétés, effectués dans le respect des exigences réglementaires et sous contrôle du bien-être animal, permet d’accroître la quantité moyenne de sérum collectée par animal. Cette stratégie contribue ainsi à la production d’une quantité accrue de médicament à partir d’un nombre équivalent d’animaux utilisés. Enfin, le protocole prévoit l’utilisation de lapins mâles et femelles (lapins issus de l’élevage et lapins reproducteurs réformés), permettant l’inclusion de l’ensemble des animaux élevés au sein de l’établissement et participant à l’optimisation de l’utilisation des animaux conformément aux principes réglementaires en vigueur.

Raffinement

Les lapins sont hébergés dans des cages conformes aux exigences réglementaires, avec une densité adaptée et une stabilité des groupes sociaux. Un enrichissement environnemental adapté est en place : notamment avec des galets à ronger en cellulose, une stimulation sensorielle contrôlée (radio) ainsi que des plateformes de repos. Dans la mesure du possible, un maintien des groupes constitués précocement est assuré afin de limiter l’agressivité interindividuelle. Un suivi quotidien des animaux est assuré par du personnel qualifié, formé et régulièrement habilité. Des fiches de suivi individualisées permettent de consigner les soins apportés et de documenter l’évolution de l’état de santé de chaque animal. Un suivi renforcé est mis en place durant les phases de prélèvements prévues par le protocole expérimental. L’évaluation de la souffrance animale est réalisée quotidiennement à l’aide d’un poster mis à disposition en zone d’expérimentation. Toute manifestation de souffrance dépassant ces seuils entraîne l’arrêt immédiat de l’expérimentation pour l’animal concerné. Lors de la réalisation du prélèvement intracardiaque, une anesthésie générale est effectuée avec une solution de xylazine et de kétamine adaptée au poids. Enfin, lors des prélèvements sanguins au niveau de l’artère auriculaire, une application de colle chirurgicale est réalisée.

Choix des espèces

D'autres espèces animales pourraient être utilisées (exemples : cheval, chèvre...) mais le lapin est l'animal le plus approprié parce qu'il réunit à la fois faciliter d'élevage, facilité de maintien du statut sanitaire EOPS et facilité de prélèvement et d'atteinte du volume de sérum nécessaire. De plus, le lapin est l'espèce enregistrée par les Autorités de Santé Publique Internationales dans le dossier d'Autorisation de Mise sur le Marché du médicament à fabriquer. On utilise exclusivement des animaux en bon état physique et bonne santé apparente pesant au minimum 2,8 kg et âgés de 14 semaines minimum au moment de la première immunisation. Il s'agit d'un âge optimal pour avoir un lapin suffisamment mâture immunologiquement et suffisamment gros pour supporter les prélèvements de sang.

Injectées ou gavées chaque jour pendant dix semaines, 190 souris porteuses de la mutation de la progéria sur un seul chromosome subissent ensuite des prélèvements sanguins sous anesthésie, des mesures de composition corporelle, des tests d'agrippement et des échocardiographies, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le porteur change de modèle par rapport à ses études précédentes et présente ce choix comme un rapprochement des conditions humaines, tout en indiquant qu'il rendra la constitution des groupes plus simple et rapide. Les souris perdent du poids et de la force musculaire à partir de 32 semaines, pour une survie moyenne d'environ 47 semaines. Toutes sont tuées à l'issue pour prélever leurs tissus, celles utilisées pour les croisements étant tuées au plus tard à six mois.

Objectifs

Ce projet fait suite à des études qui visaient à évaluer l’efficacité in vivo d’une molécule sur un modèle murin de la Progéria (Hutchinson-Gilford Progeria Syndrome, HGPS), maladie génétique extrêmement rare qui se déclare dès l’enfance et conduit à un vieillissement prématuré et une mortalité précoce. Nos études ont été réalisées sur un modèle souris portant la mutation responsable de la pathologie sur les 2 chromosomes, récapitulant le tableau moléculaire et clinique de la pathologie humaine, avec notamment un tableau clinique post-natal évoluant en quelques semaines (premiers signes cliniques à 9 semaines d'âge), permettant de tester rapidement l’efficacité d’une molécule sur plusieurs paramètres. Grâce à ce modèle, nous avons pu obtenir des données pré-cliniques dans plusieurs organes d’intérêt et définir les doses minimales permettant d'obtenir un effet thérapeutique. Cela n’aurait pas été possible avec le modèle ne portant la mutation que sur un seul chromosome, qui ne présente les premiers signes cliniques qu'à l'âge de 41-43 semaines. Cependant, la mutation n'est présente que sur un seul chromosome en clinique humaine. Il nous semble donc pertinent d’utiliser le modèle souris avec la mutation sur un seul chromosome pour nous rapprocher davantage des conditions humaines. L’utilisation de ces souris présente plusieurs avantages : 1) La constitution des groupes de souris sera plus simple et rapide; 2) Le tableau clinique est moins sévère en début de vie, réduisant les impacts sur les animaux; 3) Les quantités de protéines toxiques étant moins importantes, il sera possible de comparer plus facilement différentes voies d'administration, tout en réduisant le nombre d'animaux nécessaires, les doses et fréquences de traitement ayant été ajustées en fonction des études préliminaires.

Bénéfices attendus

Ce projet nous permettra : - d’obtenir une preuve de concept in vivo que la nouvelle approche thérapeutique envisagée est efficace sur plusieurs signes cliniques prédictifs du cours de la pathologie humaine, dans un modèle de souris portant la mutation sur un seul chromosome; - d’établir une relation pharmacocinétique/pharmacodynamique de la molécule thérapeutique et de comparer les résultats obtenus avec ceux obtenus dans le modèle étudié précédemment, portant la mutation sur les 2 chromosomes. A plus long terme, ce projet se poursuivra par un développement thérapeutique de cette molécule visant à obtenir une preuve clinique de son efficacité chez l’homme, avec pour objectif final de proposer un traitement efficace pour les patients atteints de Progéria.

Procédures

Injections ou gavage oral (1X/jour ou 1X/semaine, sur une durée maximale de 10 semaines; durée de chaque administration: environ 1min). Prélèvements sanguins (sous anesthésie, durée 3-5 min par prélèvement). Mesure de la composition corporelle, méthode non-invasive (3 fois; durée 3 min). Test d'agrippement, méthode non-invasive (3 fois; durée 5 min). Analyse cardiaque par échocardiographie en combinant l'ECG (3 fois, sous anesthésie; durée 15 minutes)

Impact sur les animaux

Le modèle animal utilisé présente de nombreux signes cliniques retrouvés dans la pathologie humaine. Les souris portant la mutation sur un seul chromosome présentent un léger décrochage dans les courbes de poids à partir de 32 semaines, puis une perte de poids plus importante à partir de 41-43 semaines, accompagnée d'une baisse de la force musculaire et d'une diminution de la fréquence cardiaque. La moyenne de survie de ces souris est de 47 semaines environ d'après la littérature. Après raffinement, notamment l'ajout de nourriture en gel, la perte de poids devrait être limitée, sachant que les procédures seront réalisées avec des animaux de moins de 43 semaines, donc avant apparition des signes cliniques sévères (à 45 semaines). Les animaux subiront des injections, induisant une douleur légère de courte durée; ou des gavages, de douleur légère de courte durée liée à la contention et pouvant potentiellement entrainer des irritations; des pesées, sans douleur hormis la préhension pour sortir l'animal de la cage (test non invasif); des prélèvements sanguins, de douleur légère, pouvant potentiellement entrainer une baisse du volume sanguin; des mesures de la composition corporelle, de douleur très légère liée à la contention (test non invasif); des tests d'agrippement, de douleur très légère liée à l'agrippement en soi sur une grille (test non invasif); et des analyses cardiaques par echocardiographie ou ECG, de douleur légère liée à l'anesthésie.

Devenir

Les animaux expérimentaux seront euthanasiés en fin de procédure afin de collecter les tissus pour des analyses protéiques. Les animaux utilisés pour réaliser les croisements seront gardés en vie, puis euthanasiés à l'age de 6 mois maximum.

Remplacement

Notre projet s’inscrit dans la continuité d’une étude in vitro menée sur des cellules de patients HGPS. Cependant, ce modèle cellulaire ne permet pas d’explorer l’intégralité des mécanismes métaboliques qui peuvent avoir lieu dans un organisme. Le passage au modèle in vivo est donc une étape indispensable avant d’envisager un essai thérapeutique chez l’Homme. Il nous est nécessaire de disposer d'un organisme entier pour pouvoir mieux comprendre la pathologie de la progéria. Le seul mammifère modèle de la maladie qui nous permet de réaliser des essais pré-cliniques en vue d’une mise en œuvre d’essais thérapeutiques chez l’Homme est la souris. Il existe aussi un modèle de porc, cependant, le phénotype de ce second modèle est moins documenté dans la littérature et la mise en place d’une telle étude serait plus complexe. Le choix de l’espèce est donc le plus approprié à l’objectif de l’étude proposée.

Réduction

Le nombre d’animaux a été limité au minimum nécessaire pour obtenir des résultats d’efficacité et de pharmacocinétique interprétables. Dans ce sens la cohorte destinée à l’évaluation de différentes voies d'administration comporte 8 animaux par groupe. L’estimation du nombre d’animaux par groupe nécessaire a été réalisée sur le critère principal suivant : comparaison du niveau moyen de progérine entre chaque groupe de traitement. La deuxième cohorte destinée à l’observation plus tardive d’un phénotype clinique mesurable comporte 10 animaux par groupe. Durant cette étude, nous allons générer des données paramétriques (poids, glycémie, paramètres sanguins, paramètres cardiaques), qui seront analysées à l'aide de tests statistiques adéquats (mesures simples ou répétées). Pour l’ensemble des cohortes, le nombre d’animaux utilisés a ainsi été optimisé pour permettre d’observer un effet du traitement.

Raffinement

Nous suivrons l'état général des animaux, le toilettage, la posture, la présence de vocalisation, l’apparence physique. Tous ces items nous permettront de décider de l'atteinte de points limites le cas échéant pouvant entrainer l’euthanasie de l'animal pour éviter toute souffrance. En cas de rixe entre animaux, nous pourrons être amenés à isoler l'individu dominant pour éviter toute lésion. L’animal blessé sera sorti de la procédure temporairement (si on arrive à le soigner) ou définitivement et il sera alors mis à mort. Le cas échéant, des soins locaux par spray cutané seront attribués. Si une douleur est présente, un antalgique pourrait être administré selon les recommandations vétérinaires. Les animaux seront pesés chaque semaine et observés quotidiennement. Afin de maintenir un état nutritionnel correct, nous utiliserons, si nécessaire, une alimentation sous forme de gel, facile à ingérer par les souris afin d’éviter toute malnutrition. Lors des prélèvements sanguins, une compensation du volume prélevé sera effectuée avec du sérum physiologique.

Choix des espèces

Le modèle murin est le seul modèle envisageable pour tester des approches thérapeutiques dans le cadre de la pathologie HGPS, puisqu’il s’agit d’une maladie génétique qui a été modélisée sur la souris. Le modèle que nous utilisons récapitule à la fois la mutation génétique de la maladie, ainsi que la majorité des caractéristiques cliniques et de l’évolution de la pathologie observée chez l’Homme. Une seule autre espèce génétiquement modifiée existe, il s’agit d’un modèle de porc. Cependant, le phénotype de ce second modèle est moins documenté dans la littérature et la mise en place d’une telle étude serait plus complexe. Le choix de l’espèce est donc le plus approprié à l’objectif de l’étude proposée. Nous utiliserons des males portant la mutation sur un chromosome, agés de 8 semaines a minima pour générer les cohortes expérimentales. Les animaux seront traités de l’âge de 5 à 9 semaines, dans les études de pharmacocinétique et d'évaluation de l'effet du traitement sur la quantité de progérine. Nous utiliserons des animaux de 32-43 semaines pour évaluer l'effet du traitement sur les symptomes cliniques qui commencent à apparaitre à 41-43 semaines environ, hormis un léger décrochage dans la courbe de poids qui peut être noté à partir de 32 semaines.

Souris porteuses de maladies génétiques par construction et souriceaux nouveau-nés composent les groupes de ce projet, la souche étant choisie selon le modèle pathologique visé. 3 450 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Les injections peuvent être répétées chaque semaine pendant 24 semaines, les chirurgies durent de 30 minutes à une heure, et les prélèvements sanguins peuvent atteindre deux par jour sur 48 heures. Le porteur signale que manipuler les nouveau-nés peut entraîner leur rejet par la mère et que les injections provoquent œdèmes et réactions inflammatoires locales, avant la mise à mort qui permet d'analyser muscles, cœur, cerveau, foie, rein et moelle épinière.

Objectifs

Notre équipe développe des molécules innovantes pour la thérapie génique et la modulation de l’expression des gènes. Nos efforts se concentrent sur des maladies génétiques, notamment neuromusculaires, neurodégénératives et des épilepsies infantiles. Ces maladies sont particulièrement difficiles à traiter, car elles exigent que le médicament atteigne l'ensemble du corps ou atteignent le cerveau et la moelle épinière. Notre objectif est d’identifier les médicaments les plus efficaces et adaptés à chaque type d’organe, afin que ces thérapies puissent, un jour, être utilisées chez les patients.

Bénéfices attendus

L’objectif principal de notre projet est d’identifier une ou plusieurs molécules thérapeutiques susceptibles d’être utilisées dans de futurs essais cliniques pour le traitement des maladies génétiques. Les bénéfices attendus de ce projet sont donc de pouvoir sélectionner les molécules atteignant au maximum les organes ciblés avec le moins d’effets secondaires.

Procédures

Chaque animal est soumis à un seul type d'injections avec une seule et même molécule afin d’évaluer le meilleur transport dans les organes ciblés. Les injections se feront en moins de 1 minute et pourront être répétées chaque semaine pendant 24 semaines maximum. Les chirurgies dureront entre 30 minutes et 1 heure. Les injections chroniques prennent 5 minutes et pourront être répétées toutes les 2 semaines, sur une période maximale de 24 semaines. Les animaux pourront également être soumis à des prélèvements sanguins (durée du prélèvement : 1 minute, 2 fois par jour maximum, sur 48h maximum).

Impact sur les animaux

La manipulation des nouveau-nés peut entrainer leur rejet par la mère. Les injections sous la peau induisent un stress et une douleur légère de courte durée aux animaux, quel que soit leur âge, et peuvent entraîner certains effets indésirables, tels que la formation d’œdèmes et des réactions inflammatoires locales. Chez les jeunes souriceaux, selon leur localisation, les injections peuvent induire une douleur modérée sur de courte période. La chirurgie peut entrainer une douleur post opératoire modérée et de courte durée.

Devenir

En fin de projet, tous les animaux seront mis à mort afin d’analyser les différents tissus (muscles squelettiques, cœur, cerveau, foie, rein, cerveau, moelle épinière ...).

Remplacement

La recherche en bioinformatique de molécules et les analyses réalisées sur des cellules de malades permettent d’effectuer une première sélection. Cependant, aucun modèle cellulaire ne peut remplacer complètement un organisme vivant. Il est donc indispensable de mener ces études dans un modèle animal, la souris, qui permet d’évaluer des paramètres essentiels tels que la distribution du traitement dans les tissus ciblés et sa durée de vie.

Réduction

Dans le cadre de ce projet, notre objectif principal est de déterminer la distribution des molécules, c’est-à-dire de mesurer leur répartition dans différents tissus. Le nombre d’animaux a été réduit au strict minimum nécessaire pour obtenir des résultats représentatifs et fiables. Nous avons utilisé un outil informatique pour calculer le nombre d’animaux nécessaires.

Raffinement

La fréquence des injections pourra être réduite si les résultats initiaux indiquent une accumulation suffisante et une demi-vie prolongée de la molécule. De la nourriture en gelée sera mise à disposition dans les cages des individus jeunes, fragiles ou ayant subi une procédure, afin de faciliter leur prise alimentaire. De plus, toutes les interventions douloureuses seront précédées de l'administration d’un antidouleur et se feront sous anéesthésie. Un suivi, accompagné d’une grille d’évaluation, sera assuré tout au long de la procédure et des mesures seront prises afin d'éviter toute souffrance inutile (utilisation de points limites ou critère d’arrêt précoce). Chez les souriceaux, le temps passé hors du nid sera strictement limitée. Des précautions spécifiques seront mises en œuvre pour éviter un rejet maternel.

Choix des espèces

Nous travaillerons sur des souris, car elles présentent une grande similitude génétique avec l’humain (environ 95 % de conservation des gènes). De plus, il existe des modèles pathologiques des maladies que nous ciblons avec nos molécules. Ces modèles permettront ensuite de tester l’efficacité des molécules thérapeutiques. La souche employée sera choisie en fonction du modèle pathologique spécifique, parmi les différentes souches existantes. Nous utiliserons à la fois des souris adultes et des nouveau-nés, afin de tester nos molécules à des stades de développement correspondant à la période précédant ou accompagnant l’apparition des symptômes des maladies sur lesquelles nous travaillons.

Provoquer un accident vasculaire cérébral chez la souris sert ici à entraîner des doctorants en neurosciences au geste chirurgical, le projet étant déclaré à finalité exclusivement éducative. 140 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées 48 heures après l'opération. Chaque animal subit deux chirurgies sous anesthésie séparées par 55 minutes d'occlusion de l'artère cérébrale moyenne, et peut ensuite présenter une démarche rigide, une asymétrie corporelle, une baisse d'activité motrice et une perte de poids de 5 à 10 %. Un formateur encadre deux à trois étudiants qui pratiquent après démonstration, et le porteur justifie ces 140 mises à mort par le fait qu'une meilleure maîtrise du geste réduira le nombre d'animaux que ces étudiants utiliseront plus tard.

Objectifs

L’accident vasculaire cérébral (AVC) ischémique ne provoque pas seulement une lésion directe du cerveau, mais entraîne également d’importantes perturbations du système immunitaire. Ce phénomène, appelé affaiblissement des défenses immunitaires induit par l’AVC, augmente la sensibilité aux infections, telles que la pneumonie post-AVC, et aggrave le pronostic des patients. Les organes périphériques — notamment la moelle osseuse, la rate, les poumons et le foie — jouent un rôle essentiel dans cette réponse systémique. Comprendre les modifications immunitaires survenant dans ces organes après un AVC est crucial pour développer des stratégies thérapeutiques visant à limiter cet affaiblissement immunitaire. Afin d’étudier plus précisément les mécanismes moléculaires impliqués dans ces altérations du système immunitaire, nous réaliserons une occlusion transitoire de l’artère cérébrale moyenne chez la souris. Quarante-huit heures plus tard, les animaux seront euthanasiés et les organes prélevés pour des analyses moléculaires. Le cerveau sera également utilisé pour des analyses d’imagerie cellulaire à haute résolution. Nous proposons de former de nouveaux chercheurs sur cette thématique. Le projet a un objectif exclusivement éducatif et s’inscrit dans le cadre d’une formation destinée aux doctorants en neurosciences.

Bénéfices attendus

Nous proposons de former de nouveaux chercheurs à cette méthode chirurgicale, qui permet d’étudier l’impact de l’accident vasculaire cérébral ischémique sur les organes périphériques. Une meilleure maîtrise de cette technique leur permettra de réduire le nombre d’animaux utilisés lorsqu’ils réaliseront ce type d’expérimentations dans le cadre de leurs travaux de recherche.

Procédures

Les souris seront anesthésiées et suivront une chirurgie(durée : environ 20 minutes). 55 minutes plus tard, ils seront réanesthésiés et suivront une deuxième chirurgie (durée : 10 minutes). Deux jours plus tard, les animaux seront euthanasiés, et leur cerveau et les organes périphériques seront prélevés.

Impact sur les animaux

Après une occlusion d’une heure, les souris peuvent présenter un pelage mal entretenu, une démarche rigide, une diminution de l’activité motrice ainsi qu’une asymétrie corporelle (comportement de rotation, inclinaison d’un côté lorsqu’on tient l’animal par la queue, flexion du membre antérieur controlatéral). Une diminution du réflexe des vibrisses peut également être observée. Après 48 heures, une perte de poids comprise entre 5 et 10 % peut survenir. Nuisances liées aux injections d’anesthésiques et d’analgésiques : Les souris seront soumises à une anesthésie gazeuse, entraînant un stress léger lié à l’induction anesthésique. À la suite des injections, les nuisances attendues sont une douleur post-injection et un stress associé à la contention. Nuisances liées à la chirurgie : Douleur ou inconfort liés à la cicatrisation de la plaie.

Devenir

A l’issue de toutes les expériences, les animaux seront euthanasiés et leur cerveau sera prélevé

Remplacement

Nous souhaitons analyser l’impact de l’accident vasculaire cérébral ischémique sur plusieurs organes périphériques. Dans ce contexte, le recours à un modèle animal est indispensable, car ces interactions systémiques ne peuvent être reproduites de manière pertinente in vitro.

Réduction

L’expertise de nos instructeurs sur ces modèles garantit que le nombre d'animaux utilisés est minimisé par une pratique toujours de haute qualité dès le départ. Ce projet a aussi pour but de former les étudiants afin qu’ils soient en mesure de réaliser au mieux les procédures qu’ils auront apprises et transmettre ainsi ces techniques dans leur laboratoire d’origine. Une meilleure connaissance des nouvelles techniques de chirurgie et d'imagerie leur permettra de réduire le nombre d’animaux utilisés lorsqu’ils voudront réaliser ces techniques pour leurs besoins de recherche. Le nombre d'animaux est adapté à nos objectifs éducatifs. Nous devons démontrer et mettre en pratique les procédures pendant nos formations. Lors de la formation, les instructeurs réalisent une démonstration de la procédure puis les étudiants auront l’occasion de pratiquer la procédure sous-couvert des instructeurs.

Raffinement

Nos mesures mises en place pour réduire la douleur pendant les actes expérimentaux impliquent une induction et un suivi de l'anesthésie, une mise en place d'analgésie et une installation tout au long des interventions chirurgicales d’un contrôle de la température par tapis chauffant. Les animaux opérés seront observés par l’expérimentateur pendant la période qui suit le réveil (2h) ainsi que pendant les deux jours suivants. L'évaluation des points limites se fera selon une grille d'évaluation incluant le poids de l'animal, l'état de la plaie, l'état du pelage, les déficits neurologiques et les signes de douleur. Selon le score obtenu, les souris pourront recevoir une injection d’un antalgique, et de l’aliment hydraté pourra être ajouté au fond de la cage. Des points limites suffisamment prédictifs et spécifiques au projet seront définis et appliqués. Après leur arrivée dans notre animalerie, les animaux suivront une période d’acclimatation d’une semaine avant le début des procédures. Les sessions de formation sont encadrées par un formateur pour deux à trois étudiants, garantissant ainsi un accompagnement individualisé et un apprentissage optimal des procédures.

Choix des espèces

La souris est une espèce de choix pour les études sur le système nerveux central des vertèbres. L'organisation du système nerveux central de cette espèce est assez proche de celle de l'homme, ce qui permet une extrapolation des résultats obtenus chez cette espèce à l'espèce humaine. Cela contribue à mieux comprendre les mécanismes à une échelle cellulaire ainsi qu’au niveau des circuits neuronaux. Nous utilisons le modèle souris qui est l'espèce de rongeur permettant d'obtenir aisément des animaux modifiés génétiquement. Le projet sera réalisé sur des animaux agés de plus de 6 semaines, ce qui correspond à l’âge adulte pour ces espèces. Leur poids et leur taille sont stabilisés, et la taille du cerveau homogène pour une bonne reproductibilité des procédures chirurgicales.

Déplacées à pied entre quatre établissements utilisateurs, dans une cage fermée glissée dans un double emballage opaque, les souris de ce volet passent d'un site à l'autre selon l'étape du protocole. 360 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, pour tester la modulation d'un gène de cellules non neuronales dans deux modèles d'ataxie cérébelleuse. Prélèvement de tissu à l'oreille dans les deux premiers établissements, chirurgie d'une heure et injection d'un vecteur dans le cervelet dans le troisième, tests comportementaux répétés jusqu'à cinq fois, puis injection d'un fixateur dans le quatrième pour une partie des animaux. 52 femelles rejoignent un projet d'élevage pour la reproduction avant d'être tuées, les 308 autres sont tuées pour prélèvement de tissus.

Objectifs

Les ataxies cérébelleuses sont un groupe de maladies neurodégénératives caractérisées par des troubles de la marche, une perte d'équilibre et de coordination motrice. Ces troubles sont causés par la dégénérescence des neurones du cervelet. Du fait de la faible prévalence de ces maladies, la mise en place d'études cliniques s'est avérée difficile et, à ce jour, aucun traitement curatif n'est disponible et très peu de médicaments sont proposés aux patients. Au fil des années, des modèles murins reproduisant les symptômes de plusieurs formes d'ataxie cérébelleuse ont été développés. Chaque modèle reproduit les principales caractéristiques génétiques, la dégénérescence cellulaire et les symptômes observés chez les patients. Au sein de ce projet multi-établissement (effectués dans 4 établissements utilisateurs, nommés ici EU1/EU2/EU3/EU4) nous avons sélectionné deux modèles murins d'ataxie cérébelleuse pouvant servir de paradigme pour ce groupe de maladies : l'ataxie spinocérébelleuse de type 1 (SCA1) et l'ataxie de Friedreich (AF). En fait, ces maladies couvrent l'hétérogénéité de ce groupe en termes de mode de transmission, de type de mutation génétique et de fonction de la protéine mutée. Nous avons récemment réalisé une analyse du cervelet afin d'identifier les principaux dysfonctionnements impliqués dans ces maladies. Nous avons constaté que la perte neuronale peut être influencée par des anomalies de certains types cellulaires non neuronaux qui contribuent au bon fonctionnement des neurones. Parmi ces anomalies, nous avons identifié un gène dont l'expression est plus faible chez les souris malades que chez les souris saines, dans les deux modèles de maladie. Ce projet vise donc à rétablir l'expression de ce gène au même niveau que chez les souris saines afin de démontrer son rôle dans la maladie. Dans cette optique, nous injecterons dans le cervelet de souris anesthésiées un vecteur portant un fragment génétique destiné à augmenter l'expression du gène spécifiquement dans un type particulier de cellules non neuronales, avant l'apparition des symptômes. En surveillant le comportement des souris et en réalisant des analyses moléculaires et histologiques ultérieures, nous espérons améliorer ou retarder l'apparition des symptômes chez les souris injectées. En complément, la seconde partie de notre projet tend à démontrer que la diminution d’expression de ce gène à elle seule suffit à faire apparaître les symptômes moteurs de la maladie chez des souris saines.

Bénéfices attendus

Par la modulation d'un gène spécifique et la combinaison de tests comportementaux, d'analyses histologiques, moléculaires et biochimiques, ce projet vise à élucider le rôle des cellules non neuronales dans l'ataxie cérébelleuse. Plus précisément, grâce à deux modèles murins paradigmatiques d'ataxie cérébelleuse, nous cherchons à démontrer la fonction cruciale d'une protéine produite par les cellules non neuronales pour protéger la fonction neuronale et ainsi prévenir les symptômes neurologiques. Ce projet pourrait prouver l'intérêt de ce gène pour le développement de futurs médicaments applicables à plusieurs types d'ataxies cérébelleuses.

Procédures

Les animaux de ce projet seront soumis à un prélèvement de tissus à l’oreille unique, procédure prenant environ 5 secondes au sein de l’EU1 et de l’EU2. Par la suite, un traitement sera administré par une intervention chirurgicale unique durant 1 heure et qui sera réalisée sous anesthésie et analgésie au sein de l’EU3. Des tests comportementaux, dont la durée totale est de 15 minutes, seront réalisés sur les animaux (au maximum 3 répétitions par test, EU3). En fonction du traitement reçu, ces tests seront réalisés soit 1 fois sur les animaux soit 5 fois (au maximum). Pour finir, une partie des animaux recevra une dernière chirurgie avec injection d’un fixateur sous anesthésie et analgésie pour prélèvements d’organes (intervention prenant 10 minutes au sein de l’EU4).

Impact sur les animaux

Un des deux modèles murins de ce projet commence à perdre du poids à partir de 20 semaines d’âge accompagné de symptômes ataxiques. Le second modèle de ce projet ne présente pas de symptômes ataxiques avant 9 mois mais à partir de 4 à 5 mois des symptômes légers de défaut de coordination motrice sont visibles lors de tests comportementaux. Les tests comportementaux ne sont pas invasifs, sont indolores et n’impliquent qu’un court et léger stress ne causant donc aucun dommage durable aux animaux. La procédure chirurgicale d’injection est accompagnée des mesures d’anesthésie et analgésie nécessaires en amont et lors de l’opération. Il est toutefois possible que les animaux soient soumis à de la douleur post-opératoire pendant les jours suivant la procédure. En prévision de cela, nous optons pour un traitement analgésique post-opératoire pour tous les animaux ayant reçu une injection.

Devenir

Les animaux utilisés dans ce projet sont des organismes génétiquement modifiés qui ne peuvent être replacés ou relâchés. Une partie des animaux produits (femelles) sera réutilisée pour reproduction au sein d’un projet d’élevage déjà en place dans l’EU2 avant mise à mort. Le reste sera étudié puis mis à mort pour prélèvement de tissus et analyses histologiques, moléculaires et biochimiques.

Remplacement

Ce projet comprenant un axe d’études comportementales, il n’est pas possible de se passer du modèle animal. De plus, il n’est pas possible à l’heure actuelle de reproduire en culture cellulaire des réseaux neuronaux complexes comme ceux que nous allons étudier.

Réduction

Toutes les procédures ont été conçues pour réduire au minimum le nombre d’animaux utilisés, sans compromettre la fiabilité des résultats des expériences. Les analyses statistiques ont été prévues en amont pour déterminer les tailles d’effectifs adéquates. De plus, afin de minimiser le nombre d’animaux, les mêmes individus seront utilisés pour les analyses comportementales, histologiques, moléculaires et biochimiques Des animaux des 2 sexes seront utilisés car l'ataxie spinocérébelleuse de type 1 et l’ataxie de Friedreich affectent de manière égale les mâles et les femelles. Ceci nous permet de générer moins d’animaux pour former nos groupes expérimentaux.

Raffinement

Le transport court des animaux entre les différents établissements utilisateurs sera réalisé à pied et de préférence en début de journée, pour limiter l’impact sur la phase de repos des animaux, dans une cage fermée placée dans un double emballage opaque et fermé. Les animaux seront habitués à l’expérimentateur avant le début des manipulations pour minimiser leur stress. Nous utiliserons des méthodes de contention peu stressantes, comme des tunnels ou le fait de simplement prendre les souris dans la paume de la main au lieu de les prendre par la queue. Les animaux seront aussi habitués aux dispositifs pour tests comportementaux en amont de la réalisation des tests. De plus, nous effectuons un marquage temporaire de couleur à la base de la queue avec un feutre non toxique afin de différencier plus facilement les souris sans avoir besoin de contention pour les identifier lors du comportement. Les animaux seront surveillés tout au long de l’étude à l’aide d’une liste de points limites adaptés et précoces. Pour la prise en charge de la douleur péri-opératoire, nous avons mis en place un protocole analgésique complet accompagné d’une grille de score adaptée pour surveiller le bon rétablissement des animaux. En complément, une grille de score est mise en place afin de surveiller l’état de santé des animaux et de pouvoir mettre en place un traitement précoce et adapté à l’apparition de symptômes.

Choix des espèces

Dans ce projet, nous avons choisi d'utiliser des modèles murins parce que ces derniers présentent des similitudes anatomiques et physiologiques avec le tissu humain : les mêmes types de cellules avec une organisation tissulaire similaire. Ces similitudes entre le cerveau de la souris et celui de l'homme sont cruciales pour disposer de connaissances solides qui pourront être transférées à l'avenir pour soigner l'homme. Il n'existe pas encore d'outils cellulaires capables de récapituler l'état de développement et la complexité de la structure du cerveau animal. La souris est actuellement l’animal de laboratoire sur lequel nous disposons des plus nombreux outils génétiques et moléculaires pour travailler. Les deux modèles utilisés au sein de ce projet sont déjà bien caractérisés ce qui nous permet de prévoir et gérer l’apparition des symptômes ataxiques ainsi que de tester un traitement par modulation génique avant apparition des symptômes. Les tests comportementaux seront effectués à l’âge où les symptômes ataxiques sont significativement visibles afin de mesurer l’efficacité de notre traitement.

Une biopsie de la queue, quatre prélèvements sanguins et jusqu'à sept injections par animal, puis un diabète déclenché par une molécule synthétique : 3 040 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Les manipulations commencent dès l'âge de dix jours, et les animaux qui présentent déjà des signes de la maladie sont mis à mort. L'objectif déclaré est une thérapie cellulaire, des cellules injectées venant compenser un défaut immunitaire. La maladie n'est nommée nulle part dans la description, réduite à "la maladie métabolique d'intérêt", pas davantage que les cellules thérapeutiques ou la molécule qui déclenche l'hyperglycémie.

Objectifs

L’objectif de ce projet est de développer une thérapie cellulaire contre contre le diabète, une maladie métabolique pour laquelle il n’existe actuellement pas de traitement permettant une guérison des patients. Le développement d’une thérapie pour cette maladie est important car elle est de plus en plus fréquente, en particulier chez les enfants, et affecte très négativement la qualité de vie des individus atteints. Il a été montré que certaines cellules fonctionnaient de manière anormale dans cette maladie. Il est donc possible que l’injection de cellules compensant pour ces défauts puissent guérir cette maladie. Dans ce projet, nous utiliserons un modèle de souris développant cette maladie pour mieux caractériser les mécanismes impliqués dans cette maladie, et pour développer une thérapie cellulaire. Les résultats obtenus doivent permettent de développer une thérapie cellulaire pour cette maladie chez l’humain.

Bénéfices attendus

Le bénéfice attendu est le développement d'une thérapie cellulaire pour la maladie métabolique d'intérêt.

Procédures

Identification d'un animal : 1 fois ~10 secondes et 1 fois ~5 secondes. Prélèvement sanguin : 4 fois ~15 secondes. Anesthésie (lors de la mise à mort): 1 fois ~15 minutes. Injections de deux types: répétées (7 fois) ~10 secondes/injection ou 1 fois ~45 secondes. Ces interventions se font sur animaux vigiles.

Impact sur les animaux

Injection intra-péritonéale = douleur légère, de courte durée et localisée. Injection intra-veineuse = douleur légère, de courte durée et localisée. Contention dans un tube adapté à la taille de la souris pouvant induire un léger stress de manière transitoire. Prélèvement sanguin = douleur légère, de courte durée et localisée. Biopsie caudale = douleur modérée, de courte durée et localisée. Identification = douleur légère, de courte durée et localisée. Nuisance liée au modèle : développement du diabète immuno-dépendant: hyperglycémie.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort pour collecte des tissus d'intérêt.

Remplacement

Pour étudier la physiopathologie du de la maladie métabolique d'intérêt, seuls les modèles souris sont capables de refléter la complexité de la maladie et notamment les interactions entre les cellules circulant dans le sang et l'organe métabolique cible. Une veille bibliographique sera mise en place pour éviter toute répétition d’expérimentation bien menée sur les plans scientifiques et méthodologiques. Les molécules qui seront utilisées pour produire les cellules thérapeutiques ont été soumises à de nombreux tests pour sélectionner les plus prometteuses. Le protocole de production de ces cellules thérapeutiques a été optimisé.

Réduction

Des prélèvements auront lieu pour des analyses histologiques, de biologie cellulaire et moléculaire afin d’extraire le maximum de données de chaque expérimentation. Des approches sophistiquées d’analyse ont été établies pour réduire le nombre d’animaux à utiliser pour obtenir un maximum d’information. Un nombre minimal et homogène d’animaux par étude est utilisé afin d’exploiter de façon rigoureuse et efficace les résultats des expériences et afin d’avoir un nombre d’animaux suffisant pour réaliser une analyse statistique. Nos effectifs seront déterminés et nos résultats analysés avec des tests statistiques adaptés.

Raffinement

Le protocole d'induction de la maladie métabolique été raffiné et permet de ne pas utiliser d'immunisation mais seulement une injection de molécule synthétique afin de réduire la souffrance des souris. Dans ce projet, ce protocole sera raffiné davantage pour minimiser la dose de molécule synthétique à injecter. L’induction simultanée de la maladie chez les animaux permet un suivi plus précis des animaux en cours de procédure et permet une détection précoce pour éviter toute souffrance. Nous avons établi pour chaque procédure des points limites qui permettent d'éviter toute souffrance indésirable des souris. Les animaux sont hébergés par groupe de 5 par cage maximum et ne sont jamais isolés. Des objets sont ajoutés dans leurs cages pour enrichir leur environnement. Ils sont observés tous les jours par le personnel de l'animalerie formé au bien-être animal, et les expérimentateurs.

Choix des espèces

La souris est le plus petit mammifère permettant d’étudier le développement de la maladie métabolique d’intérêt. C’est également l’espèce dont la connaissance génétique approfondie permet les modifications nécessaires à la création d’un modèle présentant des caractéristiques biologiques proches de celles de l’humain. Ce modèle expérimental permet de tester une approche thérapeutique pouvant être rapidement appliquée chez l’Homme. Par ailleurs, la large gamme d’outils disponibles pour analyser précisément les réponses observées fait de la souris l’espèce la plus appropriée pour ces recherches. Les animaux sont utilisés à partir de l’âge de dix jours pour réaliser les gestes d’identification ainsi que les prélèvements nécessaires à certaines analyses. À partir de quatre semaines, un prélèvement sanguin est effectué afin de confirmer les caractéristiques génétiques des individus. Cet âge est choisi pour garantir que les animaux aient une taille suffisante et que ces manipulations puissent être réalisées sans compromettre leur bien-être. Entre sept et quatorze semaines, les souris peuvent recevoir un traitement destiné à induire la maladie étudiée, période correspondant à une phase de maturité adaptée à l’analyse des mécanismes impliqués. Les animaux présentant déjà des signes de la maladie seront mis à mort.

Irradiation du corps entier pour 192 d'entre elles, injection intraveineuse dans la queue sur animal vigile pour 864, injections intrapéritonéales répétées sur plusieurs semaines pour 432 : 4 950 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles sont infectées par une bactérie ou un virus, puis exposées à un second événement infectieux ou cancéreux pour observer ce que devient leur immunité pulmonaire. Le porteur écrit que "les procédures n'entrainent pas de douleur résiduelle", tout en prévoyant une ou plusieurs injections de morphinique selon les scores relevés dans la grille de surveillance. Le dépôt d'un brevet figure parmi les finalités annoncées.

Objectifs

Notre laboratoire a montré que suite une infection bactérienne pulmonaire, une cicatrice immunitaire se mettait en place, avec l’apparition d’une population de globules blancs associés au tissu. Nous avons montré que ces cellules jouaient un rôle majeur dans la défense anti-cancéreuse pulmonaire. Les objectifs du projet sont 1) de comprendre les mécanismes qui permettent à ces cellules de rester dans le poumon après une infection bactérienne ou virale et 2) de comprendre leur rôle dans la réponse immunitaire à un 2ème évènement inflammatoire (infectieux ou cancéreux).

Bénéfices attendus

Notre projet nous permettra d’améliorer nos connaissances de l’immunité pulmonaire. Ce projet nous aidera à comprendre les modifications induites par la cicatrice immunitaire pulmonaire créée lors de la 1ère infection sur les fonctions des globules blancs et les conséquences de ces modifications au cours d’une 2ème infection ou dans un modèle de cancer pulmonaire. Ceci nous permettra en finalité la valorisation (brevet) et la mise en place de traitements adaptés pour lutter contre le cancer et les infections bactériennes et virales.

Procédures

Tous les animaux de ce projet sont soumis à une injection sous anesthésie générale. 192 des animaux sont soumis à une administration unique par voie intraveineuse sous anesthésie générale. 192 animaux sont soumis à une irradiation sur corps entier. La moitié des animaux sont soumis à une ou plusieurs injections intrapéritonéales sous anesthésie générale. 864 animaux sont soumis à une injection intra-veineuse par voie caudale sur souris vigile. 432 animaux sont soumis à plusieurs injections intrapéritonéales sous anesthésie générale sur plusieurs semaines. Tous les gestes sont de courte durée (au maximum 1 minute) et pour les souris anesthésiées, le réveil est quasiment instantané. En fonction de l’état général des souris et si nécessaire, une ou plusieurs injections sous-cutanées d’analgésiques peuvent être réalisées.

Impact sur les animaux

Les modèles d’infections respiratoires aigües induisent des effets indésirables transitoires 2-3 jours après l’infection bactérienne ou 8-9 jours après l’infection virale. L’administration par la trachée ou par voie intra-veineuse peut entraîner une légère gêne aux animaux.

Devenir

Tous les animaux utilisés dans cette étude seront mis à mort à la fin de chaque procédure pour prélèvement d’organes et analyse des modifications immunologiques.

Remplacement

Les paramètres étudiés dans ce travail ne peuvent être aujourd’hui remplacés par des procédures in vitro et le recours à l’utilisation de modèles animaux est indispensable. Les multiples interactions entre les cellules nous obligent à utiliser les modèles animaux pour appréhender ces phénomènes dans leur globalité.

Réduction

LLe nombre de souris a été réduit au minimum afin de permettre une analyse statistique fiable des résultats. Le nombre indiqué est un nombre maximum de souris et toutes ne seront pas forcément utilisées. Une partie des analyses sera conditionnée aux résultats obtenus sur l’étape d’avant.

Raffinement

Les souris sont hébergées en groupe sociaux harmonieux (n≤5) dans des cages enrichies avec des frisottis, de taille normalisée. Les animaux ont un accès libre à l’eau et à la nourriture. Sauf mention contraire, l’état général des souris est évalué quotidiennement. Un tableau d’évaluation des points limites adapté aux modèles a été mis en place. Les procédures n’entrainent pas de douleur résiduelle. En fonction des scores obtenus, une ou plusieurs injections de morphinique seront réalisées. Afin de limiter la douleur consécutive à l’administration intratrachéale, la sonde de gavage de 24G est préalablement enduite d'un antalgique afin d’anesthésier localement la trachée.

Choix des espèces

Les modèles murins d’infections sont des modèles fiables et reproductibles. Les résultats issus de ces modèles peuvent être transposés à l’homme avec une très bonne correspondance des résultats trouvés à la fois en médecine humaine et en expérimentation animale pour les datas déjà générées dans ce projet de recherche.

Une échographie par semaine sous anesthésie, deux IRM d'une heure chacune, une imagerie optique et un prélèvement sanguin hebdomadaires : 3 900 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Des cellules tumorales pancréatiques leur sont injectées sous la peau ou implantées chirurgicalement dans le pancréas, avant les chimiothérapies hebdomadaires et les produits de thérapie génique. Le porteur décrit une douleur liée à la croissance tumorale qui apparaît dans les 12 à 48 heures après l'implantation puis s'intensifie, avec une perte de poids pouvant atteindre 20 %. Le choix se porte sur des lignées immunodéficientes permettant la greffe de tumeurs humaines, que le porteur présente comme des approches de référence en préclinique.

Objectifs

Le cancer du pancréas (adénocarcinome canalaire) représente la troisième cause de mortalité par cancer dans les pays occidentaux. Son pronostic reste très défavorable, en raison de l'absence de biomarqueurs permettant un diagnostic précoce et du manque d'alternatives thérapeutiques efficaces lorsque la chirurgie curative n’est pas possible. Les chimiothérapies actuelles n’offrent qu’un bénéfice limité en termes de survie, et les thérapies ciblées ou immunothérapies n’ont pas encore démontré d’impact clinique significatif. Dans ce contexte, notre équipe mène depuis plusieurs années des recherches fondamentales et translationnelles, avec pour objectifs de mieux comprendre les mécanismes d’initiation de la maladie, d’identifier les patients à risque ou porteurs de lésions précoces, de surmonter la résistance aux traitements et de développer des stratégies thérapeutiques personnalisées.

Bénéfices attendus

Notre recherche vise à mieux comprendre le cancer du pancréas afin de développer des traitements plus efficaces et mieux adaptés à chaque patient. Nous étudions les mécanismes à l’origine du développement de la tumeur et de sa résistance aux traitements, en particulier le rôle des gènes, des protéines et de leurs interactions. Nous nous intéressons également à de nouvelles approches thérapeutiques, comme l’utilisation de virus capables de cibler spécifiquement les cellules cancéreuses, ainsi qu’au développement de tests de diagnostic non invasifs à partir de biomarqueurs présents dans le sang. L’objectif est de transformer ces découvertes en solutions thérapeutiques innovantes et personnalisées, avec l’espoir d’améliorer à terme la prise en charge des patients atteints de cancer du pancréas.

Procédures

Sur la période considérée, les souris recevront une injection sous-cutanée de cellules tumorales pancréatiques. D’autres feront l’objet d’une implantation de cellules tumorales directement dans le pancréas, réalisée par voie chirurgicale. La transplantation sera réalisée en une seule intervention par animal, sous anesthésie générale, pour une durée d’environ 15 à 20 minutes. Un traitement antidouleur adapté sera administré afin de prévenir et de réduire toute douleur après l’opération. Les chimiothérapies seront administrées une fois par semaine, pour une durée maximale de trois semaines, par voie intrapéritonéale, intraveineuse ou sous-cutanée, en fonction des propriétés de la molécule testée. Les produits de thérapie génique seront administrés soit directement au niveau de la tumeur, soit par voie intraveineuse ou intrapéritonéale, en fonction du type de vecteur utilisé et des objectifs de l’étude. Lorsque nécessaire pour garantir la précision du geste et le bien-être des animaux, les administrations seront réalisées sous anesthésie et en présence d’antalgique. Dans certains cas, des prélèvements sanguins pourront être réalisés chez des animaux vigiles au cours du développement tumoral. Ces prélèvements servent à détecter des signes précoces de la maladie, à mieux comprendre la progression du cancer et à suivre l’efficacité de traitements expérimentaux. Ils seront limités à un seul prélèvement avant l’apparition de la tumeur, puis à une fréquence maximale d’un prélèvement hebdomadaire pendant la durée de l’expérimentation. Un suivi régulier de la croissance tumorale sera assuré par imagerie non invasive. Des échographies seront réalisées une fois par semaine sous anesthésie générale légère. Des examens d’imagerie par résonance magnétique (IRM) seront effectués sous anesthésie générale à deux reprises : avant administration du traitement puis 1 à 2 semaines après. Chaque examen d’IRM durera environ une heure. Un suivi complémentaire par imagerie optique (environ 5 minutes) pourra également être réalisé avant traitement puis hebdomadairement. L’ensemble des animaux fera l’objet d’une surveillance clinique régulière incluant l’évaluation de l’état général, du poids et de la taille tumorale. Des points limites prédéfinis seront appliqués afin d’éviter toute souffrance inutile, et les animaux atteignant ces critères seront retirés de l’étude et euthanasiés selon des méthodes réglementaires.

Impact sur les animaux

Les procédures expérimentales peuvent entraîner une altération de l’état général des animaux, se traduisant par des modifications comportementales (diminution ou augmentation de l’activité, agitation, agressivité, léchage excessif, automutilation), observables généralement dans les 24 à 72 heures suivant l’intervention ou l’administration expérimentale et pouvant persister de quelques heures à plusieurs jours selon la sévérité de l’atteinte et la réponse individuelle. Des changements de l’aspect physique (perte de poids atteignant 20 %, pilo-érection, variations de la température cutanée), peuvent apparaître de manière progressive entre 48 heures et plusieurs jours après le début de la procédure et se maintenir pendant plusieurs jours à une à deux semaines selon l’évolution clinique et la prise en charge mise en place. Des troubles moteurs peuvent survenir dans un délai de 24 à 96 heures selon la nature du protocole et durer de quelques heures à plusieurs jours. Des douleurs liées à l’implantation et à la croissance des tumeurs peuvent apparaître précocement dans les 12 à 48 heures suivant l’implantation, puis s’intensifier progressivement au cours des jours ou semaines suivants en fonction du développement tumoral. Par ailleurs, l’IRM est susceptible d’induire des effets indésirables indirects liés au stress et à la contention, ainsi qu’à l’anesthésie nécessaire à l’examen (hypothermie transitoire, dépression respiratoire, retard au réveil), ces effets étant généralement de courte durée et réversibles en quelques heures après la fin de l’examen. Des effets liés de manière plus générale au stress (anxiété, agitation), à l’anesthésie (hypothermie, dépression respiratoire, retard au réveil) et aux injections (douleur, réactions locales, inconfort transitoire) peuvent également contribuer à l’altération de l’état général des animaux, avec une durée habituellement limitée à quelques minutes à quelques heures pour les réactions aiguës, et jusqu’à 24 à 48 heures pour certaines réactions locales ou effets résiduels de l’anesthésie.

Devenir

La mise à mort des animaux en fin de procédure est indispensable afin de permettre des analyses comparatives post-mortem nécessaires à l’identification et à la compréhension des mécanismes antitumoraux mis en jeu. À l’issue de la procédure, des prélèvements biologiques multiples seront réalisés afin de maximiser les données obtenues à partir de chaque animal et de limiter le recours à de nouveaux animaux, conformément au principe de réduction. Les organes et tissus prélevés seront soit fixés, soit congelés. Les tissus fixés permettront la réalisation d’analyses histologiques et histochimiques destinées à évaluer l’architecture tissulaire, l’évolution tumorale et l’impact des traitements au niveau cellulaire. Les tissus congelés seront utilisés pour des analyses biochimiques, notamment l’étude de l’expression et de l’activation de protéines d’intérêt impliquées dans les voies antitumorales. Des prélèvements seront également effectués pour l’extraction d’ARN afin d’analyser les niveaux d’expression des gènes d’intérêt et de caractériser les mécanismes moléculaires modulés par les traitements. Des prélèvements sanguins seront réalisés et congelés afin de permettre l’analyse de paramètres circulants et de biomarqueurs reflétant la réponse systémique des animaux. L’ensemble des échantillons sera stocké et répertorié dans une base de données interne à l’équipe, assurant leur traçabilité et leur utilisation dans le cadre des analyses prévues par le projet.

Remplacement

Notre projet sur le cancer du pancréas utilise en priorité des modèles cellulaires et des organoïdes afin de limiter le recours aux animaux. Les cellules tumorales cultivées en laboratoire sont utilisées pour étudier les mécanismes moléculaires, identifier des biomarqueurs et tester de premières stratégies thérapeutiques. Les organoïdes, qui sont des structures tridimensionnelles dérivées de tumeurs, reproduisent mieux certaines caractéristiques des tumeurs humaines, notamment leur organisation et leur hétérogénéité. Ils permettent d’évaluer plus finement l’efficacité de traitements dans un système proche de la réalité biologique. Ces approches in vitro sont systématiquement utilisées pour sélectionner et valider les hypothèses avant toute expérimentation animale. Toutefois, certaines questions, comme l’étude des interactions avec le système immunitaire, la dissémination métastatique ou les effets globaux d’un traitement sur l’organisme, nécessitent l’utilisation de modèles murins. Notre recours à l'expérimentation animale est limitée aux situations où les modèles cellulaires et les organoïdes ne permettent pas de répondre à nos objectifs scientifiques.

Réduction

La taille des groupes de souris est déterminée à partir de nos données antérieures, de la littérature utilisant des modèles tumoraux comparables et d’une estimation statistique préalable. Celle-ci indique qu’un minimum de 6 à 8 animaux analysables par groupe est nécessaire pour détecter une différence biologiquement pertinente dans la progression tumorale. Afin de tenir compte de la variabilité inter-individuelle, de l’hétérogénéité de la prise de greffe, ainsi que d’éventuels décès ou arrêts anticipés pour raisons éthiques, un effectif majoré d’environ 10 % est prévu. Ainsi, 10 souris par groupe recevront une greffe tumorale expérimentale, permettant d’obtenir in fine 6 à 8 individus analysables sans devoir répéter l’étude. Ce dimensionnement garantit la robustesse statistique des résultats tout en respectant le principe de Réduction des 3R. Au cours de l’expérimentation, un maximum de mesures fonctionnelles et de paramètres biologiques sera réalisé de manière longitudinale et non invasive, sans compromettre la finalité scientifique. Les effets et paliers de douleur liés à l’évolution de la pathologie seront pris en compte, avec application stricte des critères d’arrêt et des mesures de bien-être animal. L’enrichissement de l’environnement et le maintien en groupes sociaux seront assurés tout au long de l’étude.

Raffinement

À leur arrivée, les animaux sont hébergés en salle d’acclimatation et bénéficient d’un examen clinique réalisé par un personnel compétent afin d’évaluer leur état général. Leur bien-être est ensuite surveillé quotidiennement tout au long de l’étude à l’aide d’une grille d’observation spécifique, sous la responsabilité de la structure en charge du bien-être animal. Les actes susceptibles d’induire une douleur (interventions chirurgicales, prélèvements, injections intratumorales) sont effectués par des opérateurs qualifiés, avec une gestion appropriée de la douleur et un suivi post-opératoire rigoureux. L’étude est interrompue lorsque les critères d’arrêt prédéfinis sont atteints, notamment en cas de volume tumoral excessif ou de signes de détresse, après avis du vétérinaire référent. Les déplacements entre les zones d’hébergement et les espaces expérimentaux sont organisés de manière à préserver la santé et le confort des animaux. Des mesures d’accompagnement, telles que l’analgésie ou un accès facilité à la nourriture, sont mises en œuvre si nécessaire. Toute manifestation de souffrance est évaluée par le responsable du projet en concertation avec le vétérinaire référent et peut conduire, le cas échéant, à une interruption anticipée de l’expérimentation, conformément aux points limites définis dans le protocole et précisés dans la grille de scoring associée.

Choix des espèces

La souris est le modèle le plus pertinent pour ce projet, en particulier les lignées immunodéficientes permettant les allo- et xénogreffes, qui sont des approches de référence en préclinique oncologique. Ces modèles reproduisent de manière fiable des aspects essentiels de la pathologie humaine et offrent une transposabilité pertinente vers la clinique. De plus, les protocoles expérimentaux sont bien établis, standardisés et partagés, ce qui assure la robustesse des résultats et permet de limiter le nombre d’animaux utilisés, conformément aux principes des 3R. Les animaux pourront être mis à l'étude à partir de 6 à 8 semaines d'âge car ils bénéficient d'un système immunitaire et métabolique matures. Ils seront donc commandés à l'âge de 5 semaines pour prendre en compte la phase d'acclimatation.