Procédures modérées
Essais de faisabilité, de sécurité et d’efficacité de dispositifs médicaux innovants
- Recherche appliquée
- Autres troubles humains
- Cancers
- Troubles cardiaques
- Troubles gastrointestinaux
- Troubles sensoriels
- Troubles urogénitaux
250 porcs vont être utilisés pour tester des prototypes de dispositifs médicaux, 150 dans des procédures menées sous anesthésie et tués avant tout réveil, 100 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Les organes visés vont de l'œsophage au cœur en passant par le foie, le pancréas, la trachée ou les vaisseaux sanguins, la liste étant donnée comme non exhaustive, et la description des actes tient en une phrase : anesthésie, chirurgie ou endoscopie, imagerie par rayons X ou IRM. Deux à quatre séries d'essais sont annoncées par dispositif avant la version finale, et tous les animaux sont tués pour analyse des tissus. Le porteur affirme que dès lors que les objectifs scientifiques peuvent être atteints sur des modèles non vivants, "le recours à l'animal vivant sera refusé".
Objectifs
Ce projet vise à répondre à des demandes d’évaluation préclinique de dispositifs médicaux innovants, au préalable d’essais cliniques ou bien de leur commercialisation. Selon le code de la santé publique (article L5211-1), on entend par dispositif médical, « tout instrument, appareil, équipement, matière, produit, à l’exception des produits d’origine humaine, ou autre article utilisé seul ou en association, y compris les accessoires et logiciels nécessaires au bon fonctionnement de celui-ci, destiné par le fabricant à être utilisé chez l’homme à des fins médicales et dont l’action principale voulue n’est pas obtenue par des moyens pharmacologiques ou immunologiques ni par métabolisme, mais dont la fonction peut être assistée par de tels moyens. Constitue également un dispositif médical le logiciel destiné par le fabricant à être utilisé spécifiquement à des fins diagnostiques ou thérapeutiques ». Ce projet vise à couvrir de façon générale plusieurs types de dispositifs, qui sont généralement des prototypes, préalablement testés sur des modèles non vivants, qui sont ensuite améliorés à l’issue des essais réalisés sur l’animal. Généralement, deux à quatre itérations sont nécessaires pour aboutir au dispositif dans sa conception finale. Les organes ciblés par les DM sujets aux tests pourront être : œsophage, estomac, intestin, duodénum, rectum, foie, pancréas, reins, rate, trachée, poumons, cœur, vaisseaux sanguins, peau, muscles, organes génitaux ou associés (liste non exhaustive). Des imageries pré-opératoires, per-opératoires et post-opératoires pourront être effectuées afin de préparer, réaliser et contrôler au mieux la procédure chirurgicale. Pour cela, des images par rayons ionisants, imagerie fluorescente, magnétique ou par ultrasons pourront être acquises, avec ou sans produit de contraste.
Bénéfices attendus
Ce projet vise tester des prototypes de dispositifs médicaux innovants, afin de permettre l’amélioration de leur design qui réduira les risques de complications médicales. Chaque dispositif inclut dans ce projet aura ses bénéfices propres. De façon générale, et sur la base de notre expérience des cinq années passées, les dispositifs testés dans ce cadre ont pour objectifs d’améliorer le traitement de patients.
Procédures
Les animaux seront anesthésiés et soumis à une procédure chirurgicale ou endoscopique, pouvant impliquer une imagerie par rayons X et/ou par IRM.
Impact sur les animaux
Les effets indésirables pour les animaux sont liés à l’anesthésie (nausée, désorientation, hypothermie, irritation trachéale) et à l’intervention en elle-même, et varient selon la voie d’abord et les organes ciblés.
Devenir
Tous les animaux sont mis à mort afin de prélever les tissus traiter à but d'analyses macro et microscopiques.
Remplacement
Pour chaque dispositif, il sera vérifié que tous les tests pouvant être effectués sur des modèles non vivants auront été faits. Cela inclue des modélisations informatiques, des tests sur banc d’essai, modèles inertes et organes explantés. Dès lors que les objectifs scientifiques peuvent être atteints par ces moyens, le recours à l’animal vivant sera refusé.
Réduction
Les interventions seront réalisées par des médecins experts de leur domaine, réduisant le risque d’échec et, avec lui, le nombre d’animaux nécessaires pour chaque protocole d’étude. Chaque test sera réalisé sur un effectif réduit d’animaux (2 à 6), avant d’engager une étude plus complète, après avis d’experts et amélioration du dispositif et/ou de la procédure
Raffinement
Les porcs sont maintenus en groupe social dans un environnement contrôlé en température et hygrométrie. Ils reçoivent une alimentation adaptée à leurs besoins, de l’eau à volonté, des jouets et dispositifs favorisant leurs comportements naturels comme le fouissage et mâchouillement. Un temps d’acclimatation avec douche tiède, promenade et distribution de récompenses permet l’habituation des animaux à l’homme et aux manipulations. L’environnement sonore en animalerie est aussi apaisé par la diffusion de musique. Une équipe compétente composée de zootechniciens, vétérinaire et médecins assure au quotidien l’entretien, la surveillance et les soins des animaux. La Structure en charge du bien-être animal accompagne la mise en œuvre des procédures. Avec le vétérinaire désigné, elle conseille les responsables du projet dans l’amélioration de leurs pratiques en faveur du bien-être des animaux et de l’application des 3R. Le protocole prévoit des procédures mini-invasives réalisées sous anesthésie générale. Les animaux en suivi post-opératoire seront soumis à un suivi clinique quotidien, par du personnel qualifié, sous couverture antalgique dès que nécessaire. Une grille d’évaluation de la douleur est établie au cas par cas, avec la conduite à tenir en cas de complications. Des points limites sont définis pour arrêter la procédure en cas de souffrance. Une vidéosurveillance 24h/24 permet un suivi visuel des comportements en animalerie et une intervention rapide du vétérinaire en cas d’anomalie.
Choix des espèces
Parmi les différentes espèces animales, le porc est souvent l’espèce de choix pour les études impliquant de la chirurgie en raison de sa grande taille et de ses similitudes anatomiques avec l'Homme. En effet, la taille des organes comparables à celle de l’Homme permet d’utiliser les mêmes instruments (endoscopes, matériel de navigation vasculaire, de chirurgie) qu’en clinique. De nombreux paramètres physiologiques sont également similaires (pression sanguine, fonctionnement des organes, composition de la peau et des muscles, etc). L’ensemble de ces atouts facilite l’évaluation des dispositifs médicaux dans un contexte proche de leur utilisation finale. Le choix du poids et du stade de développement de l’animal se fera au cas par cas, selon les objectifs scientifiques associés au dispositif testé. De façon générale, des porcs juvéniles ou jeunes adultes, entre 20 et 90 kg au moment de commencer l’étude, conviennent. La taille des organes des porcs à ces stades de croissance correspond déjà à ce qui peut être observé en clinique chez l’homme, il offre les repères anatomiques recherchés par le praticien et permet d’utiliser les mêmes équipements et matériels chirurgicaux que chez le patient. Dans certains cas, en particulier pour les suivis supérieurs à 3 mois, le modèle « mini-porc » (15-30 kg) pourra être retenu pour ses caractéristiques de croissance plus faible. Ce modèle de cochon « miniature » permet en effet de suivre sur du long terme un dispositif in situ sans qu’il soit trop impacté par la croissance rapide de certains organes (le porc « standard » Large White peut prendre jusqu’à 800g par jour). Pour les porcs Large White/Landrace, la durée de survie maximale a été fixée à 6 mois afin de limiter les contraintes zootechniques liées à la manipulation d’animaux pouvant dépasser les 100kg. Un dépassement de ces critères devra être validé par la SBEA, qui s’assurera que toutes les conditions sont réunies pour assurer l’hébergement des animaux dans le respect de leur bien-être.
Caractérisation de l’infection par le pteropine orthoreovirus et de la réponse anticorps associée dans un modèle murin
- Recherche appliquée
- Diagnostic des maladies
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
Les souris qui perdent plus de 20 % de leur poids sont tuées, celles qui en perdent plus de 10 % passent sous surveillance renforcée. 160 souris vont être utilisées, dont 40 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, et toutes sont tuées pour prélever et analyser leurs organes. Le virus est déposé dans leurs narines, puis certaines subissent une prise de sang par semaine pendant trois ou six semaines, toujours sous anesthésie, avant une chirurgie terminale. Le porteur attend des difficultés respiratoires sévères et rattache l'étude à l'analyse future de sérums humains prélevés en Asie du Sud-Est, ce pteropine orthoreovirus transmis par les chauves-souris restant peu documenté.
Objectifs
Les virus zoonotiques émergents constituent une menace croissante pour la santé publique, notamment dans les zones où le contact entre les humains et les animaux est de plus en plus fréquent. Les pteropine orthoreovirus (PRV) peuvent être transmis par les chauves-souris, probablement par l’intermédiaire d’aliments contaminés, peuvent infecter l’humain et provoquer des infections respiratoires aiguës, principalement en Asie du Sud-Est. Une particularité de ces virus est leur capacité à provoquer de la fusion entre cellules. Ce phénomène est commun à plusieurs virus émergents reconnus comme prioritaires par l’Organisation mondiale de la santé. Toutefois, l’impact de la formation de ces cellules fusionnées dans la gravité de l’infection chez l’animal reste encore mal compris. Il en est de même pour la réponse immunitaire. Ce projet s’articule autour de deux axes principaux : 1. Etudier l’infection par ce virus, sa pathogénicité, la dose virale, et ses manifestations dans les poumons des souris infectées. 2. Évaluer la réponse anticorps antivirale des souris.
Bénéfices attendus
Le pteropine orthoreovirus (PRV) est un pathogène émergent encore peu étudié. A terme, en utilisant ce modèle de virus, cette étude permettra une meilleure compréhension des infections virales, ainsi que leur impact sur les maladies associées. Elle fournira également des informations importantes sur la réponse anticorps antivirale. Ces études permettront d’optimiser une méthode de détection de la réponse anticorps qui sera utilisée pour analyser des échantillons de sérum provenant de cohortes humaines de personnes infectées par ce virus en Asie du sud-Est. Ces travaux apporteront des données sur ce virus, mais aussi, plus largement, sur tous les virus exploitant des mécanismes analogues. Ces connaissances pourraient ouvrir la voie à de nouvelles stratégies de ciblage de ces virus, permettant ainsi de mieux lutter contre les épidémies futures. Par ailleurs, les données obtenues avec cette étude sur le modèle souris (notamment la dose infectieuses et la pathogénèse) faciliteront les études ultérieures consacrées à de potentielles perspectives thérapeutiques contre ce virus.
Procédures
- Infection des souris par le virus. Procédure courte de quelques minutes par ajout de liquide sur les narines. - Prise de sang (quelques secondes) unique, précédée d’une anesthésie, pour tous les animaux au début de l’étude. - Prise de sang (quelques secondes) 1 fois par semaine pendant 3 semaines (3 fois, 30 souris), ou pendant 6 semaines (6 fois, pour 30 souris), précédée d’une anesthésie, pour les animaux destinés à l’étude de la réponse anticorps antivirale. - 1 procédure terminale chirurgicale de mise à mort précédée d’une anesthésie et d’une analgésie. 1 fois, pour tous les animaux, procédure rapide de quelques minutes, sans réveil.
Impact sur les animaux
- Inconfort et douleur de courte durée liées aux injections et aux prélèvements sanguins. - Perte de poids jusqu’à 20%, problèmes respiratoires, difficultés respiratoires sévères liés à l’infection.
Devenir
L’intégralité des animaux seront mis à mort, nécessaire pour le prélèvement et l’analyse des organes.
Remplacement
Des approches utilisant des cellules en culture sont menées en parallèle et permettent d’orienter les hypothèses expérimentales, d’optimiser les protocoles et ainsi de réduire autant que possible le nombre d’animaux utilisés. Des études in vitro ont été menées, toutefois, ces modèles ne permettent pas de reproduire la complexité d’une infection systémique, ni les interactions tissulaires, ni la réponse immunitaire associée, nécessaires pour répondre aux objectifs du projet. Ainsi, ces études utilisant des animaux permettront de compléter les résultats déjà obtenus.
Réduction
La réduction à 5 animaux par groupe permet de réduire au maximum le nombre d’animaux utilisés tout en assurant un nombre suffisant pour permettre d’émettre des conclusions sur les résultats obtenus en utilisant des tests statistiques. Le nombre d’animaux a été évalué à l’aide d’outils statistiques. Des études menées en parallèle sur des cellules en culture permettent d’orienter l’étude, réduisant ainsi le nombre d’animaux. Les expérimentations seront réalisées sur des souris mâles et femelles afin de détecter un éventuel effet sexe-dépendant sur les paramètres étudiés. Bien que ce choix augmente le nombre d’animaux nécessaires, il est indispensable pour garantir la robustesse scientifique des résultats et assurer leur validité pour les deux sexes. Les résultats impliqueront l’utilisation de tissus provenant des poumons, qui seront traités afin d’être conservés. Sous cette forme, ils seront facilement réutilisables pour des analyses ultérieures, limitant l’utilisation d’animaux supplémentaires.
Raffinement
Afin de réduire le stress lié à l’environnement, 2 semaines d’acclimatation précéderont les premières manipulations des souris, et ces dernières seront ensuite habituées à être manipulées. Les mâles hébergés ensemble proviendront d’une même fratrie afin d’éviter les comportements agressifs, le stress et les blessures. Bien que chacune des procédures de ce projet puisse occasionner des effets néfastes pour les animaux dus aux infections par le virus, chaque animal fera l’objet d’une surveillance attentive et régulière tous les jours via une grille d’observation standardisée, permettant une détection précoce des signes de détresse dans le but de minimiser toute douleur et/ou souffrance et d’optimiser le bien-être animal. Des points limites spécifiques et précoces seront mis en place. Les animaux avec une perte de poids supérieure à 10% feront l’objet d’une surveillance accrue. Si des animaux atteignent une perte de poids supérieure à 20%, ils seront mis à mort. En cas de difficulté à s’alimenter suite à l’infection, un gel nutritif pourra être ajouté à l’alimentation, et une hydratation sous-cutanée pourra être réalisée. Les animaux seront chauffés en cas d’hypothermie lors des procédures impliquant de l’anesthésie, ou causée par l’infection.
Choix des espèces
Le modèle murin a été choisi car il a déjà été montré que celui-ci est sensible aux infections par le virus utilisé pour ces expériences, et sont donc plus susceptibles de fournir des résultats exploitables. D’autre part, celles-ci figurent parmi les modèles les plus couramment utilisés en recherche. Ainsi, les données obtenues dans cette étude pourront être utilisées pour des études ultérieures utilisant ce modèle. Les procédures seront réalisées sur des souris adultes, au moins âgées de 7 semaines. Celles-ci seront commandées à un âge de 5 semaines de manière à intégrer une période d’acclimatation suffisante avant le début de l’étude. D’autre part, les souris adultes ont un système immunitaire mature, essentiel pour étudier la réponse immunitaire et la pathogénicité virale. Enfin, l’utilisation d’animaux adultes limite les variations inter-individuelles des résultats liées au développement.
Etude de la biodistribution et de la cinétique d’un vecteur AAV chez des souris saines
- Recherche appliquée
- Troubles musculosquelettiques
- Troubles nerveux
Une injection unique de vecteur AAV ou de sérum physiologique, un prélèvement sanguin sous anesthésie, puis pour une partie d'entre elles un analgésique, un anesthésique profond et une perfusion intracardiaque qui les tue : 168 souris saines suivent ce parcours. Les procédures impliquent un niveau de souffrance léger à modéré. Le porteur ramène l'ensemble des nuisances attendues à une douleur légère liée à la piqûre. Toutes sont tuées pour prélever les tissus qui permettront de comparer où se distribue chacun des deux vecteurs de thérapie génique dans le corps.
Objectifs
A ce jour, de nombreuses maladies génétiques ont été identifiées, avec des profils très variés en termes d’âge d’apparition des symptômes, de sévérité et de pronostic vital. La thérapie génique est une approche thérapeutique prometteuse pour ces pathologies, en permettant l'introduction d'une copie fonctionnelle du gène défectueux dans les cellules affectées grâce à des transporteurs. À ce jour, ces transporteurs, les vecteurs adéno-associés (AAV), utilisés en clinique sont majoritairement d’origine naturelle. Bien que les AAV aient démontré leur efficacité dans plusieurs essais cliniques, leur distribution non spécifique, correspondant à la présence du vecteur dans des organes ou tissus non concernés par la thérapie, limite la précision du traitement ce qui réduit leur capacité à atteindre efficacement les tissus concernés par la maladie. Cette faible spécificité nous contraint à l'injection de fortes doses de vecteur, ce qui entraîne un coût très important de production et un plus haut risque d'effets secondaires, notamment des réponses immunitaires ou des toxicités dans le foie, comme cela a été observé dans plusieurs essais cliniques de thérapie génique utilisant des AAV. Il est désormais essentiel, dans le domaine de la thérapie génique, de développer des vecteurs AAV optimisés avec un ciblage précis et restreint, permettant de ne pas cibler des tissus qui ne nécessitent pas d'être traités. Le but de notre projet est de comparer un nouvel AAV optimisé, que l'on appellera AAVx, à un AAV naturel connu pour son ciblage important des muscles et du système nerveux central. Nous comparerons la distribution globale dans l’organisme de ces deux AAVs après une injection intraveineuse administrée à des doses différentes. Nous cherchons à déterminer si notre vecteur d’intérêt présente une efficacité supérieure, une action plus rapide et une spécificité accrue par rapport à un vecteur AAV d’origine naturelle. Si l’AAVx cible efficacement les muscles et le système nerveux central, sans pénétrer dans les organes dont le foie, il serait un très bon candidat dans le cadre du développement d’un traitement de thérapie génique pour des maladies génétiques neuromusculaires.
Bénéfices attendus
Cette étude permettrait d’identifier un vecteur AAV de seconde génération (AAVx) afin de traiter des maladies génétiques affectant les muscles et le système nerveux central en réduisant les effets secondaires observés dans certains essais cliniques. En effet, si l’AAVx se révèle efficace pour atteindre ces tissus, tout en évitant de cibler des organes tels que le foie, cela permettrait de réduire la dose administrée et de limiter le risque de toxicité du foie ainsi que la réponse immunitaire.
Procédures
Tous les animaux subiront une injection unique d’un traitement (un vecteur ou une solution saline servant de contrôle), qui durera maximum 2 minutes par souris. Un prélèvement sanguin sera réalisé sur animaux vivants anesthésiés, une seule fois et durera maximum 5 minutes par souris. Avant la mise à mort par perfusion intracardiaque terminale d’une partie des animaux, ceux-ci recevront une injection sous-cutanée d’un analgésique, puis une injection intrapéritonéale d’un anesthésique profond. Chaque injection durera maximum 2 minutes par souris.
Impact sur les animaux
Les injections et les prélèvements sanguins peuvent occasionner une douleur légère liée à la piqûre.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés à la fin de la procédure afin de pouvoir prélever des tissus qui nous permettront de comparer l’efficacité des deux vecteurs transporteurs de thérapie génique.
Remplacement
Notre vecteur AAV d’intérêt a été sélectionné par un test cellulaire en laboratoire grâce à sa capacité à pénétrer dans des cellules de muscles et de neurones, en comparaison avec des vecteurs AAV d’origine naturelle connus pour leur forte affinité pour les muscles et le système nerveux central. Cependant, ces travaux, réalisés sur un système cellulaire simple composé d’un type cellulaire unique n’est pas suffisant. Nous avons également pu déterminer que notre vecteur d’intérêt est capable de pénétrer dans les cellules musculaires après une injection réalisée directement dans le muscle, mais cela ne nous permet pas de déterminer la distribution globale de ce vecteur dans l’organisme après une injection intraveineuse (la disponibilité du vecteur dans chaque tissu), ni s’il est capable de pénétrer dans le système nerveux central. Pour cela, nous avons besoin d’un organisme complexe, tel que la souris.
Réduction
Le nombre minimal d’animaux dont nous aurons besoin dans notre étude, afin d’observer des différences en termes de distribution globale entre les deux vecteurs AAV étudiés, a été défini à l’aide de calculs statistiques.
Raffinement
Afin de raffiner nos études, les animaux seront hébergés dans des cages enrichies à l’aide de coton et de bâtons à ronger dans un environnement exempt d’organismes pathogènes. Les prélèvements sanguins seront réalisés sous anesthésie générale pour limiter le stress de l’animal lié à l’acte et assurer son immobilité. Pour augmenter le confort des animaux après anesthésie gazeuse, du gel oculaire pourra être appliqué pour éviter le dessèchement des tissus. Une demi-heure avant la perfusion intracardiaque, un analgésique sera injecté en sous-cutané, ce qui permettra de soulager les douleurs intenses éventuelles. Les souris seront ensuite anesthésiées par administration d’un mélange de deux anesthésiques, dont l’un possédant également des propriétés analgésiques. L’animal sera placé sur un support chauffant tout au long de l’anesthésie.
Choix des espèces
Les souris ont été choisies comme animaux modèles car elles partagent une grande partie de leur physiologie et de leur génétique avec l’humain, ce qui permet d’obtenir des données transposables et elles possèdent des organes et systèmes similaires (foie, cœur, système nerveux central, muscles), ce qui est essentiel dans ce projet pour évaluer la biodistribution des vecteurs après administration par voie intraveineuse. La biodistribution d’un vecteur AAV correspond à l’étude de sa répartition dans l’organisme après administration, afin d’identifier les organes qui reçoivent le vecteur et d’en quantifier la présence, au-delà de ou des organe(s) cible(s) visé(s) par la thérapie. Cette analyse est indispensable pour vérifier l’absence ou la très faible diffusion vers des organes non concernés par la thérapie, notamment les organes sensibles tels que le foie ou la rate. L’âge des animaux correspond à la phase de jeune adulte. Cet âge garantit la maturité des organes ce qui réduit la variabilité interindividuelle et assure la reproductibilité des résultats. De plus, de nombreuses pathologies génétiques neuromusculaires se manifestent dès la période juvénile, donc le choix d’administration des souris à 4 semaines est pertinent pour une future utilisation du vecteur d’intérêt dans un contexte pathologique.
Étude du renouvellement intestinal au cours du développement et en conditions inflammatoires chez la souris
- Formation professionnelle
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système gastrointestinal
Des souriceaux de 8 jours, séparés de leur mère, sont nourris de lait artificiel par sonde gastrique quatre fois par jour et exposés à l'hypoxie 10 minutes trois fois par jour, pendant trois jours. Les souris adultes reçoivent un traitement dans leur eau de boisson sucrée pendant trois cycles de 5 jours, ou une injection ou un gavage unique d'un composé chimique après 4 heures de jeûne. 599 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour le prélèvement de leur intestin, 328 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré et 271 un niveau sévère. Le but déclaré est d'étudier le renouvellement de l'intestin au cours du développement et en conditions inflammatoires, avec des applications que le porteur dit "potentielles" pour les patients. Aucun des composés administrés n'est nommé, et les effets déclarés, une "légère perte de poids", de "potentielles diarrhées" et du stress, n'expliquent pas le classement de 271 souris en souffrance sévère.
Objectifs
La régénération et le renouvellement tissulaire sont orchestrés par les cellules souches, qui se différencient et s'auto-renouvellent. L'équilibre entre l'auto-renouvellement, la prolifération et la différentiation dépend du microenvironnement des cellules souches. Ici, nous utilisons un tissu à fort renouvellement, l'intestin et ses cellules souches résidentes, comme modèle pour étudier la régénération.
Bénéfices attendus
Les découvertes issues de ce projet de recherche fera progresser significativement notre compréhension de la biologie intestinale et d'offrir des applications translationnelles potentielles pour améliorer les résultats pour les patients dans divers contextes médicaux.
Procédures
Les souris seront soumises à un traitement dans l'eau de boisson sucrée pendant 5 jours sur 3 cycles, une seule courte injection d'un composé chimique pendant 15 secondes ou un seul gavage d'une minute d'un composé chimique après un jeun de 4 heures. Une petite quantité de sang sera prélevée quelques minutes avant la fin de la procédure sous analgésie et anesthésie générale Les jeunes souris seront nourries de lait artificiel par gavage 4 fois par jour (1 minute) pendant 3 jours consécutifs et exposées à de l'hypoxie (10 min) 3 fois par jour pendant 3 jours.
Impact sur les animaux
La séparation de la mère et les épisodes d'hypoxie bien que courts peuvent être source de stress pour les souris. Le gavage par sonde adaptée à la taille de l'animal est considéré comme inconfortable mais non douloureux. Les souris seront soumises à un protocole induisant une légère perte de poids et des potentielles diarrhées. L'injection peut engendrer une douleur modérée mais locale. Le sang sera prélevé sous analgésie et anesthésie générale.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure pour prélèvement d'intestin et analyses dans le cadre de notre étude.
Remplacement
L'intestin est un organe complexe impliquant de nombreux composants : bactéries, circulation sanguine et lymphatique, neurones, muscles et système immunitaire. Le but de ce projet est d'identifier le rôle des cellules souches dans l'homéostasie, le développement et la régénaration de l’intestin. Réduire le projet à un système in vitro pourrait nous priver de découvertes pertinentes liées à la complexité des interactions systémique présentes dans l'intestin et il est donc essentiel d'étudier les cellules dans leurs conditions physiologiques.
Réduction
Nous utilisons autant que possible des animaux de mêmes portées afin de limiter la variabilité. Chaque souris fera l'objet de multiples analyses et les tissus prélevés seront exploités pour plusieurs types d'expériences, maximisant ainsi les données obtenues par animal. Nous utilisons des modèles cellulaire qui permettent de reproduire partiellement l'intestin en culture. Enfin, des outils statistiques seront systématiquement appliqués pour déterminer le nombre minimal de souris nécessaire et assurer la signification statistique de nos résultats.
Raffinement
L'introduction par voie orale de composé chimique ou de lait est fait avec une sonde et un volume adapté à la taille de l'animal. Les injections sont faites avec une aiguille adaptée à la taille de l'animal. Le sang sera prélevé sous analgésie et anesthésie générale. Pour limiter la perte de poids, les souris ont à disposition de la nourriture humidifiées pendant toute la durée du traitement. Les jeunes souris sont gardées dans un incubateur pour maintenir leur température corporelle à 37°C. Les épisodes d'hypoxie sont courts et limités au minimum et se font en présence de poches de gel chaudes. Les animaux sont gardés en groupe dans un environnement enrichi, surveillés et pesés tous les jours et manipulés par des zootechniciens et manipulateurs formés. Une grille de score pour évaluer l'état général des souris est mise en place et en cas d'atteinte de points limites irréversible, l'animal sera immédiatement mis à mort.
Choix des espèces
La souris de laboratoire est un modèle largement reconnu et particulièrement avantageux pour nos recherches car des protocoles mimant la régénération tissulaire et les maladies inflammatoires de l'intestin ont été établis et validés. Enfin, la grande similarité génétique, métabolique et immunitaire de la souris avec l'Homme, notamment au niveau de son système intestinal, en fait un excellent modèle translationnel, promettant des avancées inestimables pour la compréhension des fonctions intestinales en santé comme en maladie. Nous utiliserons des souris adultes de 8 à 14 semaines pour étudier les maladies chroniques intestinales affectant les adultes et des jeunes souris de 8 jours pour étudier les maladies inflammatoires touchant les jeunes enfants.
Impacts directs et multigénérationnels d’obésogènes et de perturbateurs métaboliques chez le xénope
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
Vingt xénopes adultes nagent six mois dans une eau contenant un mélange de six perturbateurs endocriniens, puis reçoivent deux injections hormonales à vingt heures d'intervalle pour être reproduits. Avec leurs descendants sur deux générations et 1 728 larves, 1 828 animaux sont concernés, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger pour la quasi-totalité. Le porteur écrit que les concentrations employées ne provoquent pas de stress connu, après avoir indiqué que ces substances peuvent entraîner une surmortalité et des malformations de la colonne vertébrale. Les mâles sont tués au moment de la ponte pour prélever leurs testicules, les femelles après récupération des œufs, et toutes les larves après prélèvement de leur cerveau.
Objectifs
Des études récentes suggèrent que les effets transgénérationnels induits par des polluants tels que les perturbateurs endocriniens (PE) sont impliqués dans le déclin des populations d’amphibiens en altérant la capacité des animaux à se reproduire. Ce projet a pour ambition d’étudier les effets d’une exposition à un mélange de 6 PE présents dans le milieu naturel utilisés à des concentrations environnementales tout au long de la vie des animaux de la 1ère génération, puis les répercussions transgénérationnelles de cette exposition sur les 2 générations suivantes non exposées chez l’espèce Xenopus tropicalis. Les effets seront évalués à chaque génération en regardant l’impact de cette perturbation sur le développement et le comportement de la descendance des animaux exposés (première génération) et non exposés (les 2 générations suivantes). Les effets au niveau thyroïdien et au niveau du développment des animaux, en particulier les effets neuro-développementaux, ainsi que les effets sur la reproduction et la transmission des effets entre génération seront étudiés. Ces animaux seront comparés à des animaux élevés dans les mêmes conditions mais non exposés aux PE, comme contrôles.
Bénéfices attendus
Ce projet vise à mieux comprendre les impacts des perturbateurs endocriniens (PE) obésogènes sur les amphibiens et leur conséquence dans le déclin de leurs populations. D'un point de vue scientifique, la recherche générera de nouvelles connaissances et technologies dans les domaines de la physiologie animale, de la perturbation endocrinienne, de l'épigénétique et de l'écotoxicologie. D'un point de vue global, la protection de la biodiversité et de la santé humaine est essentielle. Le concept "EcoHealth" est aujourd’hui mis en avant dans nos sociétés. Sous plusieurs aspects, notre projet s'inscrit parfaitement dans ce concept. Toutes les données générées par ce projet multidisciplinaire seront disponibles pour les organisations qui gèrent la biodiversité ou sont impliquées dans l'évaluation des risques chimiques (OFB, ANSES) et aideront les décideurs à protéger la qualité de l'environnement naturel et à améliorer la santé des écosystèmes.
Procédures
Les xénopes adultes de la première génération (F0) seront exposés à un mélange de 6 perturbateurs endocriniens dilués dans l’eau des aquariums durant 6 mois. Les xénopes adultes des 2 générations suivantes (F1 et F2) seront maintenus en eau normale durant 3 mois. Toutes les reproductions des animaux seront réalisées au cours de ces périodes. Pour la fécondation in vitro, les animaux adultes males et femelles reçoivent deux injections d’hormone à 20 heures d’intervalle. Ces étapes ne durent pas plus de 30 secondes à chaque fois. Les femelles commencent à pondre environ 2 heures après la seconde injection. Les mâles sont euthanasiés à ce moment pour prélever leurs testicules. Les femelles sont soumises à un massage doux pendant 1 à 2 minutes pour récupérer les œufs qui seront fécondés par leur mise en présence avec une solution contenant les spermatozoïdes. Dans le cas de non ponte, les femelles pourront être de nouveau stimulées en respectant un repos minimum de 2 mois entre deux stimulations. Les larves obtenues des descendances des 3 générations produites seront élevées jusqu’à la fin du développement larvaire puis soumis à ce stade à un test de comportement (analyse de la mobilité sur une période de 12 minutes).
Impact sur les animaux
Les concentrations du mélange de perturbateurs endocrinien (PE) utilisées sont celles des normes de qualité environnementales. Il se peut cependant que les effets des PE puissent entrainer une surmortalité ou des malformations. Au stade larvaire des déformations de la colonne vertébrale sont décrites comme pouvant survenir lors d’un stress. Nous effectuons une stimulation hormonale sur femelles vigiles. Les nuisances attendues sont essentiellement de type inconfort/stress et douleur légère et transitoire. Une douleur légère et transitoire peut être induite par l'injection.
Devenir
Tous les adultes males et femelles utilisés pour réaliser les fécondations in vitro seront euthanasiés en fin de procédure. Des tissus seront récupérés pour analyse. L’ensemble de ces animaux étant destiné à une étude multigénérationnelle suite à l’exposition de la première génération à un mélange de perturbateurs endocriniens, il n’est pas possible de réétuliser ces animaux en raison de cette exposition. Toutes les larves utilisées pour étudier les effets direct et transgénérationel du mélange de 6 perturbateurs endocriniens sont euthanasiés en fin de procédure. Des prélèvements d’organes (cerveaux) seront réalisés sur chaque larve en vu de faire des analyses immunologique et d’expression de gène sur ces animaux pour regarder les effets neurodéveloppementaux de l’exposition aux perturbateurs endocriniens.
Remplacement
Les outils informatiques permettant de faire des prédictions ne peuvent pas reproduire toute la complexité d’un organisme vivant. De la même façon, les expériences réalisées sur des cellules en laboratoire (tests in vitro) ne tiennent pas compte du fonctionnement global, notamment des effets hormonaux ou du développement, qui ne peuvent être observés que chez un animal entier. Dans notre étude, nous cherchons à comprendre comment un mélange de substances peut perturber le système hormonal. Ce type de phénomène dépend des interactions entre plusieurs organes, ce qui ne peut pas être étudié uniquement sur des cellules isolées. C’est pourquoi une approche « in vivo », c’est-à-dire sur des animaux vivants, est nécessaire. Nous avons choisi d’utiliser des grenouilles, car notre objectif est d’évaluer l’effet d’un mélange de produits tel qu’il pourrait exister dans leur environnement naturel. Cette méthode permet d’obtenir des résultats plus fiables et représentatifs des conditions réelles d’exposition.
Réduction
Le projet concerne 1828 animaux. 100 grenouilles adultes (20 animaux de la génération F0, 40 animaux de la génération F1 et 40 animaux de la génération F2) seront utilisées. Pour chaque étape, nous utilisons 5 mâles et 5 femelles afin de réaliser différents types de croisements. Un prélèvement d’organes (cerveau, thyroide…) sur les individus euthanasiés sera effectué. Au total, 1728 larves seront utilisées dans le projet. Ce chiffre correspond à 480 larves par génération, multipliées par 3 expériences répétées (soit 1 440 larves). Nous ajoutons une marge de 20 pour cent pour tenir compte de la mortalité naturelle des têtards. Le nombre de larves utilisé est le nombre minimal pour ne pas mettre en péril les manipulations et avoir des résultats statistiquement fiables : - Pour le comportement, un minimum de 20 animaux testés par condition experimentale est nécessaire pour mesurer une mobilité interprétable et comparable. - Pour l’analyse immunologique, 10 animaux par condition experimentale permettront de tester plusieurs marqueurs immunologiques pour observer les effets du mélange de perturbateurs endocriniens sur le développement neuronal. - Pour l’analyse de l’expression des gènes, 10 animaux par condition experimentale permettront de disposer de suffisamment de materiel génétique (cerveaux) et d’avoir suffisamment de réplicats biologiques pour les analyses. Le nombre de réplicats techniques permettra de prendre en compte la variabilité inter-experimentation généralement associée aux études réalisées sur les animaux vivants. La taille des effectifs a été établie avec un calcul de puissance afin de prendre en compte la robustesse des résultats tout en limitant le nombre d’animaux. La comparaison des groupes sera réalisée via des tests statistiques permettant une interprétation fiable des résultats.
Raffinement
Les protocoles d’exposition permettent de reproduire les conditions naturelles (exposition dans l’eau) pour confirmer et transposer les résultats obtenus à court terme sur le terrain. Ce mode d’exposition est non invasif et n’induit pas de souffrance, contrairement à l’injection dans l’abdomen souvent utilisée en toxicologie. Les grenouilles sont élevées dans des aquariums contenant de l’eau filtrée, déchlorée, oxygénée et maintenue à une température de 26 degrés. Des capteurs mesurent en continu la température, le pH et la qualité de l’eau. Les aquariums sont aménagés avec des tubes, plantes, billes, même si les animaux préfèrent rester au fond. Les déchets et restes de nourriture sont retirés chaque jour, et les parois nettoyées toutes les deux semaines. Avant toute expérience, les animaux s’acclimatent à leur environnement pendant un mois. Ils sont nourris trois fois par semaine à satiété, avec des granulés et des vers de vase. La manipulation s’effectue à la main ou à l’épuisette, sans mouvement brusque. Leur comportement et leur état de santé sont suivis tout au long des protocoles grâce à une grille d’observation. Les concentrations de perturbateurs endocriniens utilisées correspondent aux normes environnementales et ne provoquent pas de stress connu. Toutefois, en cas de signe de stress, le traitement est suspendu et les animaux euthanasiés. Lors des fécondations in vitro, les injections peuvent entraîner de légères douleurs. Les Xenopus sont sortis de l’eau uniquement le temps de l’injection puis isolés dans un bac d’eau déchlorée jusqu’au lendemain. Chez les femelles la ponte est repérée grâce à la dilatation du cloaque, et les œufs non fécondés sont recueillis par massage doux. Les femelles qui ne réagissent pas ne sont pas utilisées. Après la ponte, elles sont replacées en aquarium isolé pendant 48 heures avec surveillance de l’alimentation. Les expérimentateurs observent quotidiennement les animaux. Les points limites de stress déclenchant une euthanasie incluent : perte d’appétit, mouvements anormaux, apathie, dégradation de la peau, état de choc, inconscience ou blessures.
Choix des espèces
Le choix de l’espèce Xenopus tropicalis est justifiée par trois raisons majeures : 1) son temps de génération court pour un amphibien (environ 10 mois du stade œuf à adulte mature) permet l’étude de l’effet de polluants tels que les perturbateurs endocriniens sur plusieurs générations 2) c’est une espèce non invasive ni en danger ou voie d’extinction et qui est facile à maintenir en laboratoire. C’est un modèle déjà étudié dans notre laboratoire et 3) Le xénope est un vertébré tétrapode non-mammifère et un modèle important pour l’étude du développement des vertébrés. Le génome de Xénopus tropicalis montre d’importante similitude avec le génome humain et c’est une espèce sur laquelle les études sur le génome sont aisées. Les animaux adultes seront utilisés afin d’être reproduits sur 3 générations pour obtenir à chaque génération une descendance qui sera utilisée pour faire une analyse multigénérationnelle des effets de l’exposition des animaux de la première génération à un mélange de perturbateurs endocriniens. Les larves obtenues pour chaque reproduction seront utilisées à un stade qui se situe à la fin du développement larvaire, car à ce stade, les organes sont bien différenciés, ce qui permet d’étudier la physiologie et la morphologie des animaux. Sur ces larves, un test comportemental (par une analyse de leur mobilité à chaque génération) et une analyse des tissus neuronaux après euthanasie et prélèvement des cerveaux seront réalisés, dans le but de voir les effets neurodéveloppementaux de l’exposition aux perturbateurs endocriniens à travers les différentes générations.
Effet de la cortistatine sur les dommages induits par l’AVC
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
- Système nerveux
Une artère cérébrale bouchée pour provoquer un AVC, une thrombolyse vingt minutes plus tard, une injection de traitement au bout de 24 heures : 96 souris subissent cette séquence, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles passent ensuite une ou deux séances d'IRM et des tests de récupération fonctionnelle de cinq minutes, avant d'être tuées pour prélever leur cerveau. Le porteur ramène les nuisances attendues à des signes de douleur dans les premières heures et à un affaiblissement passager de la patte avant gauche. Il justifie le choix de la souris par la proximité de sa circulation cérébrale avec celle de l'humain et, autant, par le volume de travaux déjà publiés sur ce modèle.
Objectifs
L'accident vasculaire cérébral (AVC) est l'une des principales causes d'invalidité et de décès dans le monde. L’AVC ischémique (AI) représente environ 85% des AVC, il est majoritairement causé par une thrombose ou une embolie entrainant une diminution de l’afflux sanguin vers le cerveau. Peu après l'apparition de l'AI, des phénomènes d’hypoxie et inflammatoires entrainent une dégénérescence neuronale et l’ouverture de la barrière hématoencéphalique (BHE), responsable de l’infiltration des cellules immunitaires dans le parenchyme cérébral. La cortistatine (CST) est un neuropeptide avec des effets inhibiteurs sur l'activité neuronale. Elle est principalement exprimée dans le système nerveux central, où elle joue un rôle dans la modulation de l'excitabilité neuronale, du sommeil et de l'inflammation. Dans le contexte de l’AVC ischémique, la CST présente un intérêt particulier en raison de ses propriétés neuroprotectrices et anti-inflammatoires. Elle pourrait atténuer les lésions cérébrales en limitant la réponse inflammatoire et en réduisant l’excitotoxicité. Étudier son rôle dans l’AVC ischémique pourrait donc ouvrir la voie à de nouvelles approches thérapeutiques ciblant les cascades de dommages secondaires. Dans ce projet, nous examinerons les effets de l’administration de la CST sur le volume de lésion, les déficits comportementaux, les phénomènes d’activation endothéliale et d’ouverture de la BHE à la phase aiguë (2 jours) et subaiguë (7 jours) post-AVC.
Bénéfices attendus
Étudier le rôle de la cortistatine dans l’AVC ischémique, ce qui pourrait ouvrir la voie à de nouvelles approches thérapeutiques ciblant les cascades de dommages secondaires.
Procédures
Tous les animaux subiront une ischémie cérébrale +/- Thrombolyse à 20 minutes +/- Traitement (injection intrapéritonéale) à 24 heures après l’occlusion artérielle. Les animaux utilisés pour la procédure 1 (48 souris) auront à J2 et J7 une évaluation par IRM (durée
Impact sur les animaux
Chirurgie AVC : Certains animaux peuvent montrer des signes de douleur dans les premières heures après la chirurgie. Un affaiblissement transitoire de la patte avant gauche (correspondant à la zone cérébrale lésée par l'AVC) qui disparaît dans la première semaine après l'AVC.
Devenir
A l'issue de toutes les procédures, les animaux seront mis à mort pour récupération de leur cerveau pour analyses ultérieures.
Remplacement
Les procédures expérimentales ne peuvent pas être remplacées par d'autres méthodes expérimentales n'impliquant pas l'utilisation d'animaux vivants car des techniques de remplacement ne sont pas susceptibles d'apporter le même niveau d'information. Nous avons sélectionné le modèle présentant le meilleur compromis entre pertinence scientifique et sensibilité de l’espèce. La souris est l’espèce animale la plus étudiée dans l'étude de la réponse immunitaire en post-AVC au niveau du cerveau. La physiopathologie est donc globalement établie, ce qui nous permettra d’interpréter nos résultats de manière fiable. L’ensemble des acquis et des connaissances dont nous disposons rend cette espèce particulièrement intéressante dans le cadre de notre étude.
Réduction
Nous utiliserons le nombre minimal d’animaux afin de souscrire au principe de réduction. Le nombre d’animaux utilisé est déterminé en fonction de la spécificité/sensibilité des méthodes utilisées, de nos travaux précédemment publiés, de la littérature et de tests statistiques de puissance avec calcul de la taille d’effet par un test d de Cohen. Le calcul du nombre de souris comprend un pourcentage de perte (15%). De plus, l'utilisation de techniques d'imagerie non invasives permet de réduire le nombre d'animaux utilisés.
Raffinement
Afin de souscrire au principe de raffinement, les animaux seront anesthésiés et analgésiés durant chaque procédure. Les expériences seront réalisées en respectant les règles de bonnes pratiques de laboratoire pour le respect des animaux. Nous avons indiqué pour chaque procédure expérimentale les points limites adaptés, suffisamment prédictifs et précoces pour permettre de limiter la douleur à son minimum. Le bien-être des animaux sera suivi quotidiennement par l’expérimentateur pendant toute la durée du projet. Nous avons raffiné dans notre laboratoire nos techniques et nos protocoles pour pouvoir suivre les souris de façon longitudinale, ce qui rajoute de la robustesse à nos résultats car chaque animal est son propre contrôle et permet, à long terme, de réduire le nombre de souris utilisées. Les animaux seront hébergés dans des cages standards répondant aux normes européennes actuelles (Directive 2010/63/UE). Pour éviter de stresser les animaux, les cages seront isolées de tout bruit extérieur et l'accès à l'eau et à la nourriture sera ad libitum. Des dômes de cellulose et des carrés de cotons seront placés dans chaque cage. Enfin, une importance particulière sera apportée au bien-être des animaux. Tout sera mis en œuvre pour réduire l'angoisse, la souffrance et la douleur de chaque animal, pouvant être occasionnées pendant le projet. Les principes éthiques et les standards de raffinement seront utilisés jusqu'à la mise à mort de l'animal.
Choix des espèces
La souris (Mus musculus) est l’espèce animale qui a été la plus étudiée dans le domaine des neurosciences vasculaires et en immunologie. L’anatomie et la physiologie de la circulation cérébrale sanguine de la souris sont bien connues et sont semblables par leurs grands traits à celles de l’homme. Les propriétés tissulaires des artères cérébrales sont identiques chez l’homme et la souris. Le fonctionnement du système immunitaire de la souris se rapproche de celui de l'homme. L’ensemble des connaissances et des acquis dont nous disposons au laboratoire et dans la littérature rend cette espèce particulièrement intéressante pour étudier la dynamique de microglie dans les AVC ischémiques. Les souris utilisées seront âgées de 8 à 12 semaines et auront un poids d'environ 30 g. Nous réaliserons nos modèles sur des adultes afin de pouvoir pratiquer sur des animaux du même stade de développement que ceux utilisés en majorité dans les modèles d’AVC. Les animaux (souris C57Bl/6) utilisés seront âgés de 8 à 12 semaines et auront un poids d'environ 20 g. Nous réaliserons nos modèles sur des adultes afin de pouvoir pratiquer sur des animaux du même stade de développement que ceux utilisés en majorité dans les modèles d’AVC.
Identification de molécules thérapeutiques pour stopper la perte de vision et d’audition chez un modèle murin atteint du syndrôme de Wolfram (MODIFICATION)
- Recherche appliquée
- Troubles sensoriels
- Recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
Tuées à l'issue des tests pour que leurs organes soient analysés, 960 souris atteintes d'un modèle du syndrome de Wolfram vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une injection intrapéritonéale par jour pendant quinze jours consécutifs, puis passent un test de vision de trente minutes sur animal vigile et deux explorations fonctionnelles sous anesthésie, dont un test d'audition d'une heure. Ces souris perdent la vue et l'audition et développent un trouble vestibulaire qui les rend hyperactives, au point que le porteur remplace les abris en matériau dur par du carton pour qu'elles ne se blessent pas. Il conclut que tous ses tests d'exploration fonctionnelle sont indolores.
Objectifs
Le syndrome de Wolfram est une maladie multi-organe caractérisée par des diabètes ,une surdité , une cécité, et des signes neurologiques. A ce jour, aucun traitement pour lutter contre la progression de cette maladie n’existe. L'objectif principal de ce projet de recherche est de déterminer le potentiel thérapeutique de cinq composés chimiques sur les pertes visuelles et auditives de ce modèle murin de la maladie. MODIFICATION: ce projet prévoyait, initialement, le test de cing composés chimiques. Un nouveau composé a été identifié et semble plus prometteur que les précédents, faisant passer le nombre de composés à tester à six.
Bénéfices attendus
Les stratégies thérapeutiques dans le syndrome de Wolfram sont actuellement basées sur la prévention et le traitement des complications pour améliorer le bien-être des patients. Aucun traitement n'est disponible pour arrêter la progression de cette maladie. Ce projet va permettre, d'apporter une preuve de concept d'efficacité de composés développés/cédés par des chimistes sur un modèle murin de la maladie.
Procédures
Les gestes techniques à réaliser lors de ce projet sont les suivants : identification par marquage à l'oreille - injection en intrapéritonéal sur animal vigile - tests fonctionnels d'évaluation de la vision et de l'audition sous anesthésie et sur animal vigile. Chaque animal sera identifié une fois. Les injections quotidiennes en intrapéritonéales seront effectués pendant 15 jours consécutifs. Un test de vision sur animal vigile sera effectué à un mois (test de 30min). Les animaux seront anesthésiés 2 fois, à 3 jours d'intervalle pour les tests d'exploration fonctionnelle (test de surdité, test d'une heure et test de vision, test de 30min).
Impact sur les animaux
Les effets attendus seront "légers" à "modérés". La procédure d'identification peut engendrer du stress. Les souris vont développer en plus de la cécité et de la perte d'audition, un trouble vestibulaire qui entraine une hyper activité et qui peut générer un inconfort des souris Les animaux seront sous surveillance quotidienne. Une feuille de suivi a été mise en place afin de garantir le bien être animal. Les animaux présentant au moins un des points limites seront systématiquement euthanasiés. Les injections en intrapéritonéal n'entrainent généralement pas de complication. Si l'animal présentait une perte de poids importante, ou un mauvais état du pelage, les injections seraient interrompues. Tous nos tests d'explorations fonctionnelles sont indolores.
Devenir
A l'issue de la procédure, les animaux seront euthanasiés et leurs organes collectés pour procéder aux analyses permettant la compréhension des mécanismes mis en jeu.
Remplacement
L'utilisation de modèle murin du syndrome de Wolfram pour ce projet est indispensable car ce modèle est le seul recours mammifère autre que l'humain à présenter les symptomes de ces pathologies rapidement permettant l'élaboration d'un traitement curatif. L’utilisation de modèles animaux demeure essentielle pour décrypter le vivant. Aucune alternative à ce jour ne peut s'y substituer totalement. Même si les méthodes in vitro ou in silico jouent un rôle important dans de nombreux projets de recherche, elles ne permettent pas, seules, de comprendre et de reproduire les interactions multiples au sein d’un organisme vivant.
Réduction
Notre expérience de plus de 20 années de mesures fonctionnelles chez la souris (vision et audition), nous montre que des lots de 10 animaux par groupe sont nécessaires et suffisants pour assurer des tests statistiques fiables. Les mêmes lots d'animaux seront utilisés pour des tests de vision et d'audition afin de réduire le nombre total d'animaux, sans impacter sur leur bien être. Enfin les analyses biochimiques et histologiques seront réalisées sur les mêmes animaux.
Raffinement
Nous procéderons à l'enrichissement du milieu avec accès à des maisons en carton et des carrés de coton afin de créer un environnement sécurisant permettant la création d'un nid. Les animaux seront manipulés tous les jours afin de créer une habituation diminuant ainsi le stress quotidien que peut représenter la présence de l'expérimentateur. L'état des animaux sera suivi régulièrement avec une surveillance journalière. En plus des procédures habituelles d’hébergement, une attention particulière sera portée à la litière des animaux. Si une augmentation de la production d'urine à la suite du développement d'un diabète est constatée, le fond de cage sera renouvelé plus fréquemment. Pour limiter l’agitation des souris présentant un syndrome vestibulaire, l’enrichissement sera renforcé dans les cages. Enfin, pour éviter que les souris présentant un syndrome vestibulaire ne puissent se blesser, les abris utilisés pour enrichir les cages seront en carton et non en matériau dur.
Choix des espèces
La pathologie du syndrome de Wolfram est une pathologie multiorgane où les altérations neurosensorielles s'accompagnent de signes neurologiques, cognitifs et endocrinologiques. Un modèle rongeur permet de caractériser les signes d'altérations sensorielles (vision, audition) et d'ainsi tester le potentiel thérapeutique d'une ou plusieurs molécules thérapeutiques. L'injection de molécule à tester sera réalisée tous les jours, pendant 2 semaines consécutives. Des tests d'audition et de vision seront réalisés à un mois, age auquel les souris perdent la vision et l'audition, afin d'évaluer l'efficacité de ces molécules sur les pertes neurosensorielles du modèle souris du syndrome de Wolfram.
Evaluation préclinique de produits de santé pour la prévention des séromes
- Recherche appliquée
- Cancers
- Troubles musculosquelettiques
- Tests réglementaires
- Autres tests de tolérance et d’efficacité
Pour tester des dispositifs censés éviter l'accumulation de liquide après une ablation du sein, 450 rats subissent une mastectomie chirurgicale de 60 à 90 minutes, puis l'implantation du dispositif pendant plusieurs semaines. Les procédures impliquent un niveau de souffrance modéré et tous les rats sont tués, l'analyse histologique des tissus étant présentée comme la méthode de référence. Échographies répétées sous anesthésie courte, pansements, hébergement individuel jusqu'à quatorze jours, hématomes, œdèmes et douleurs post-opératoires figurent parmi les effets attendus. Le nombre d'études dépend, écrit le porteur, des demandes formulées par les fabricants de dispositifs médicaux, à raison d'environ une étude par an sur cinq ans.
Objectifs
Le sérome, complication fréquente après une chirurgie mammaire (jusqu’à 85 % après mastectomie), résulte de la formation d’un espace vide sous-cutané favorisant l’accumulation de liquide. Cela entraîne inconfort, soins prolongés et risques infectieux pour les patients. Ce projet vise à évaluer la tolérance (sécurité) ainsi que la performance (ou efficacité) de dispositifs médicaux visant à réduire cet espace et parsuite réduire l'accumulation de liquide. Ces produits destinés à être mis en contact avec le corps humain doivent être préalablement testés pour garantir le bon rétablissement des patients après chirurgie, et pour garantir leur efficacité lors de l'utilisation clinique. La réglementation exige de prouver l'efficacité des produits de santé et de réduire au minimum le risque de réactions indésirables avant de proposer un produit sur le marché. Compte-tenu de la complexité des mécanismes de régulation d'un organisme vivant, le recours au modèle animal est nécessaire pour répondre aux objectifs du projet.
Bénéfices attendus
Ce projet vise à garantir, avant la mise sur le marché, que l’utilisation du produit de santé n’altère ni l’état clinique ni la sécurité des patients, conformément aux exigences des autorités réglementaires. Cette démarche s’inscrit dans une volonté de garantir un niveau élevé de protection de la santé et de la sécurité, pour les patients. Les résultats obtenus à l’issue des études seront intégrés aux dossiers de soumission auprès des autorités de santé compétentes, en vue de la mise sur le marché ou du maintien de l’autorisation du produit à court terme. Le nombre d’études et de dispositifs testés dans le cadre de ce projet dépend directement des demandes formulées par les fabricants de dispositifs médicaux. Toutefois, il est raisonnablement anticipé la réalisation d’environ une étude par an, ce qui correspondrait au développement et à l’évaluation de cinq nouveaux dispositifs sur une période de cinq ans.
Procédures
Les animaux seront soumis à une intervention chirurgicale consistant à une mastectomie (retrait de la glande mammaire) visant à reproduire un modèle de formation de sérome post-chirurgical (présence de liquide dans l’espace laissé vide après retrait de la glande mammaire) visant à reproduire un modèle de formation de séromes post-chirurgical (présence de liquide dans l’espace laissé vide après retrait de la glande mammaire). Un dispositif visant à réduire cette formation de liquide est implanté dans l’espace créé et est laissé chez l’animal pendant plusieurs semaines. La durée de la chirurgie est estimée entre 60-90 minutes selon la complexité du modèle. Toutes les interventions sont réalisées sous anesthésie générale (inhalée ou injectable) et accompagnées d’une analgésie pré- et post-opératoire adaptée. Des examens d’imagerie non invasifs (échographie) pourront être réalisés pour évaluer la présence et le volume du sérome, avec une anesthésie courte ( 4 semaines), étant donné qu’il s’agit d’un examen court et non invasif, cet examen pourra être renouvelé chaque semaine selon les besoins, à condition que l’animal soit en bon état général.
Impact sur les animaux
Les nuisances ou effets indésirables pouvant survenir chez les animaux sont les suivants : - Stress lors des manipulations pour l’anesthésie et pouvant aller jusqu’à 14 jours si présence d’un pansement et mise en place d’un hébergement individuel - Douleur suite à la chirurgie. – Gêne modérée : En cas de mise en place de pansements ou de dispositifs de protection post-opératoires, pouvant limiter temporairement la mobilité ou provoquer une gêne locale - Perte de poids ou d’appétit liée aux effets de l’anesthésie, de la chirurgie et/ou du dispositif implanté, à court terme - Hématome, œdème ou sérome non résorbé au niveau du site opératoire, pouvant entrainer une gêne locomotrice en plus de la douleur.
Devenir
Afin de répondre aux objectifs scientifiques du projet, des observations post-mortem sont indispensables. Pour cela, des prélèvements ciblés des tissus sont réalisés afin de procéder à des analyses histologiques, qui constituent la méthode de référence pour détecter des effets locaux tels que l’inflammation, la fibrose ou la nécrose. D'autres examens spécifiques sur les tissus prélevés, comme une observation macroscopique ainsi que la mesure du volume de sérome peuvent aussi etre réalisées. Compte tenu de la nature des interventions et des objectifs du projet, il n’est pas possible de maintenir les animaux en vie après la phase expérimentale. L’euthanasie est donc pratiquée conformément aux normes éthiques et réglementaires en vigueur.
Remplacement
L’utilisation de modèles animaux reste indispensable dans le cadre de l’évaluation préclinique des dispositifs médicaux, car requis par les exigences réglementaires. À ce jour, aucune méthode alternative validée (In-Vitro ou In-silico) ne permet de reproduire de manière fiable les conditions mécaniques et biologiques nécessaires à l’étude de la performance et de la tolérance locale de dispositifs destinés à un usage humain, en particulier dans le contexte de la prévention ou du traitement du sérome. La formation de sérome est un phénomène complexe impliquant des interactions mécaniques, tissulaires et immunitaires, difficilement reproductible in vitro. Les modèles cellulaires ne permettent pas de simuler la dynamique de l’espace vide sous-cutané, ni les processus de drainage, d’inflammation ou de cicatrisation associés. Donc le mécanisme de formation du sérome, complication fréquente après une chirurgie mammaire, reste difficile à modéliser. Les modèles animaux offrent ainsi une approche essentielle pour étudier ce phénomène dans des conditions réalistes. Parmi les espèces disponibles, le rat représente un modèle pertinent pour ce type d’étude en raison de sa taille adaptée, de sa bonne tolérance aux procédures chirurgicales, et de la disponibilité de données comparables dans la littérature scientifique.
Réduction
La réglementation demande d’avoir à minima 10 produits implantés par condition. Afin de limiter le nombre d’animaux utilisés dans les études, plusieurs stratégies sont mises en œuvre : Mutualisation des groupes contrôle : Un même groupe témoin (utilisant un produit de référence) peut être utilisé pour comparer plusieurs groupes test recevant des produits différents. Études pilotes : Réalisées sur un nombre restreint d’animaux, elles servent à orienter les choix de développement (produit, matériel, technique chirurgicale) avant de passer à des études réglementaires plus étendues. Quand cela est possible ; implantation de plusieurs dispositifs sur le même animal réduisant de moitié le nombre d’animaux.
Raffinement
Les animaux sont hébergés en groupes sociaux compatibles afin de respecter leurs besoins comportementaux et de favoriser leur bien-être. Un hébergement individuel est uniquement instauré en cas de nécessité médicale, notamment en présence d’un pansement, et limité à la durée strictement nécessaire à la cicatrisation. Les installations permettent le maintien des contacts visuels, olfactifs et auditifs entre congénères. Des enrichissements adaptés à l’espèce sont fournis de manière systématique. L’environnement est contrôlé afin de limiter le stress (ambiance sonore adaptée, manipulation douce, surveillance régulière). Les procédures chirurgicales sont réalisées sous anesthésie générale associée à une analgésie préventive et multimodale, conformément aux bonnes pratiques vétérinaires, afin de prévenir toute douleur, souffrance ou détresse. La profondeur anesthésique et les paramètres respiratoires font l’objet d’une surveillance continue pendant toute la durée de l’intervention. Des mesures spécifiques sont mises en œuvre pour limiter les risques per- et post-opératoires : maintien de la température corporelle à l’aide d’un dispositif chauffant, protection oculaire, réalisation des actes en conditions aseptiques strictes sur une zone préparée, et administration d’un agent de réversion en fin d’intervention afin de favoriser un réveil rapide et sécurisé. Une analgésie post-opératoire adaptée est systématiquement mise en place et ajustée en fonction de l’évaluation clinique quotidienne des animaux. La durée du traitement est modulée selon l’état général et les signes de douleur observés.Les animaux sont observés au minimum quotidiennement par un personnel qualifié et toutes les observations sont tracées. La fréquence de suivi et la surveillance sont approfondies en cas de signes cliniques. Lors des examens d’imagerie, une anesthésie adaptée est administrée afin de garantir l’immobilité et le confort de l’animal. Une analgésie complémentaire peut être mise en œuvre si la situation clinique le justifie.
Choix des espèces
Le choix du rat comme modèle animal repose sur plusieurs critères scientifiques et réglementaires. Il est largement utilisé en recherche préclinique grâce à sa physiologie bien connue et sa facilité de manipulation, avec une littérature abondante facilitant la comparaison des résultats. Sa taille et son anatomie permettent de reproduire des modèles chirurgicaux pertinents, tels que la mastectomie et la création de poches sous-cutanées, utiles pour étudier la formation de séromes. Le rat permet également des évaluations quantitatives fiables, tant macroscopiques qu’histologiques, essentielles pour l’analyse de la biocompatibilité (sécurité et performance). Enfin, son utilisation est acceptée par les autorités réglementaires et il présente une transposabilité partielle aux conditions humaines, notamment en matière de cicatrisation et de réponse inflammatoire. Ces caractéristiques en font un modèle pour ce projet. Il n’y a pas de spécification dans les textes réglementaire, donc des animaux adultes seront privilégié. Si pour un projet spécifique, des animaux plus jeunes seraient nécessaire, le projet sera revu par la SBEA.
Détection par imagerie TEP et biodistribution de peptides radiomarqués au fluor-18 ou au cuivre-64 dans le pancréas de souris : application au diabète
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
Rendues diabétiques par une injection de streptozotocine, 360 souris reçoivent ensuite des peptides radiomarqués au fluor-18 ou au cuivre-64 et passent des examens d'imagerie TEP d'une heure sous anesthésie. Elles subissent jusqu'à dix prélèvements sanguins, un par semaine, également sous anesthésie générale, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Toutes sont tuées pour prélever leurs organes et vérifier ce que l'imagerie n'a pas su montrer. Le porteur qualifie cette imagerie de "totalement atraumatique et non invasive", tout en décrivant chez les mêmes souris hyperglycémie, urines abondantes, soif anormale et perte de poids provoquées par le diabète qu'il a induit.
Objectifs
Les ions métalliques sont impliqués dans de nombreux processus biologiques fondamentaux et sont des éléments essentiels pour la croissance et le développement de tous les organismes vivants. Les cellules régulent étroitement l’accumulation, le transport, la distribution et l’exportation de métaux, et une mauvaise régulation de la quantité d’ions métalliques peut être signe de pathologies comme les maladies cardiaques, le cancer et les maladies neurodégénératives. Le zinc revêt un intérêt particulier car il s'agit d'un micronutriment essentiel requis pour plus de 300 processus cellulaires différents. La teneur en zinc est particulièrement importante dans la prostate, le sein et surtout le pancréas. Une mauvaise régulation du zinc a été clairement associée aux cancers du pancréas ou au diabète même si son rôle n’est pas complètement compris. Dans ce projet, nous nous focalisons sur la variation de concentration en zinc au niveau du pancréas en cas de diabète dans des modèles de souris diabétiques. Nos collaborateurs dans ce projet ont développé un premier agent de contraste biocompatible en imagerie par résonance magnétique (IRM) qui a montré son intérêt dans la détection du zinc in vivo sur des pathologies de type diabète. Ils ont élargi la famille à d’autres agents de détection du zinc, plus sensibles. Ces agents doivent permettre d’une part de mieux caractériser et comprendre le rôle physiologique du zinc dans ces pathologies, et d’autre part, de pouvoir réaliser leur diagnostic précoce. Pour les besoins de notre étude, il est nécessaire de pouvoir détecter précisément la distribution de ces agents de contraste. L’IRM, bien que très sensible, ne permet pas d’y parvenir, contrairement à l’imagerie TEP (tomographie par émission de positons). Les agents de contraste seront donc radiomarqués ce qui permettra de quantifier leur biodistribution précise dans nos modèles.
Bénéfices attendus
Les bénéfices de ce projet seront multiples. Notre étude de biodistribution est indispensable pour d’une part valider l’utilisation de cette nouvelle famille d’agents de contraste IRM pour des futures applications de recherche (meilleure compréhension des mécanismes impliqués dans le diabète) et à terme cliniques avec l’espoir d’un réel diagnostic précoce.
Procédures
Le modèle de diabète sera obtenu par injection (d’une minute à deux minutes) d’une molécule chimique (une seule injection) de streptozotocine largement décrite dans la littérature scientifique et utilisée pour induire le diabète chez la souris. Sept jours après induction du diabète les agents de contraste radiomarqués seront injectés sur différents groupes de souris (un agent par souris) et des examens d’imagerie TEP seront réalisés : une première acquisition sera réalisée juste après injection et une deuxième acquisition sera réalisée 4 à 6 heures plus tard. Cette technique est totalement atraumatique et non invasive. Ces examens sont réalisés sous anesthésie et la température des animaux sera maintenue à 37°C tout le long de l’examen. Un examen dure environ 60 minutes. Des prélèvements de sang, une fois par semaine (10 secondes) avec un maximum de 10 prélèvements seront réalisés sur les souris sous anesthésie générale.
Impact sur les animaux
Des effets indésirables sont attendus au bout de 7 jours après injection de la molécule induisant le diabète et liés au développement du diabète : hyperglycémie, polyurie (quantité d’urine anormalement élevée et odeur particulière), polydipsie (soif anormalement élevée), perte de poids. Ce dernier effet sera monitoré tout au long de l’étude. Une attention particulière sera portée sur l’hygiène de la cage en raison de la polyurie des souris diabétiques. L’injection intraveineuse des agents de contraste provoque une douleur celle d’une piqure d’aiguille.
Devenir
Les souris sont mises à mort à la fin des procédures pour prélever certains de leurs organes. Cela permettra de réaliser des études complémentaires et de valider les résultats obtenus en imagerie TEP, notamment pour certains organes très petits qui sont parfois difficilement observables en imagerie.
Remplacement
Le modèle animal est fondamental dans notre cas, puisque l’étude préclinique en particulier d’induction du diabète et l’étude de l’efficacité d’agents de contraste ne peut se faire que sur un organisme vivant entier, étant donné que nous cherchons à comprendre la localisation et la concentration de plusieurs agents de contraste IRM. En l’état actuel, il n’existe pas de modèle alternatif permettant de reproduire la complexité d’un organisme vivant.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés sera strictement limité au minimum nécessaire pour garantir des résultats fiables. Il a été déterminé en s’appuyant sur les données disponibles dans la littérature et sur les résultats préliminaires du laboratoire. Seuls les animaux indispensables pour répondre aux objectifs scientifiques seront inclus. Les comparaisons entre groupes seront réalisées à l’aide de méthodes validées, qui permettent d’identifier des différences significatives tout en limitant le nombre d’animaux requis.
Raffinement
Pendant toute la durée de l’expérimentation, les souris seront hébergées par groupe sociaux de 5 dans les cages en portoir ventilé, avec un accès à l’eau et la nourriture ad libitum. Divers objets d'enrichissement du milieu seront à leur disposition (maison transparente rouge, granulés, bâtonnets de bois à ronger). Les souris auront une période d’acclimatation de 7 jours minimum avant le début des études TEP. Elles seront manipulées par du personnel formé et entraîné et observées quotidiennement afin de déceler toute souffrance, respecter leur bien-être et éviter au maximum la douleur au moment de l’expérimentation. L’hygiène de la cage sera contrôlée en raison de la polyurie des souris diabétiques (quantité d’urine et odeur particulière de l’urine). Le niveau des biberons sera contrôlé tous les jours en raison de la polydipsie des souris diabétiques. Des mesures adaptées seront mises en place pour éviter ou limiter la douleur, notamment par l’administration d’antalgiques lorsque cela est nécessaire. Enfin, des critères d’arrêt clairs seront définis : si un animal présente des signes de souffrance ou un état de santé dégradé, il sera retiré de l’expérimentation et pris en charge de manière appropriée. D’autre part, les injections et les expériences d’imagerie seront réalisées sous anesthésie.
Choix des espèces
Nous avons choisi la souris pour plusieurs raisons : 1. Le modèle de souris diabétique proposé est largement décrit et utilisé dans la littérature. 2. Le modèle pharmacologique est facile à mettre en œuvre ; 3. Le modèle est le plus homogène en termes de progression de la pathologie : les animaux répondent globalement de façon similaire et dans les mêmes temps, ce qui facilite leur utilisation dans une étude. La lignée de souris choisie est celle qui répond le mieux au modèle d’après la littérature. Le métabolisme du zinc est équivalente entre la souris et l’humain avec des quantités et la distribution tissulaire qui peuvent varier et dont nous allons prendre en considération. Des souris âgées de 8 semaines seront utilisées conformément aux études déjà publiées sur l’induction du diabète par streptozotocine. En effet, à cet âge, les souris ont atteint leur maturité, les résultats de l’étude ne sont donc pas influencés par le développement des souris.
Etude du rôle des jonctions serrées dans la progression du cancer du pancréas dans un modèle murin génétique.
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
180 souris développent un cancer du pancréas déclenché dès la naissance par modification génétique, dont 102 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Une partie est gavée cinq jours de suite, moins d'une minute par jour. Le porteur indique que le modèle peut entraîner stress et souffrance au stade terminal, avec pertes de mobilité et variations de poids importantes, et que certains animaux seront conservés jusqu'à douze mois. Toutes sont tuées, celles utilisées pour les croisements plus tôt afin de limiter le développement de la maladie, les autres pour prélever leurs tumeurs, au bénéfice d'une étude que le porteur présente comme une référence pour d'autres projets à venir.
Objectifs
Le cancer du pancréas est la 7ème cause de mortalité attribuable au cancer dans le monde. Malgré l’émergence de nouveau traitements au cours des dernières années, le cancer du pancréas demeure incurable à l’heure actuelle. Nos travaux précédents ont mis en évidence le rôle d’une protéine présente à la membrane des cellules cancéreuses dans plusieurs cancers et nous avons de bonnes raisons de croire que cette protéine joue également un rôle clé dans le cancer du pancréas. Notre objectif est d’évaluer ce rôle dans un modèle génétique de cancer du pancréas de la souris.
Bénéfices attendus
L’étude du rôle de notre protéine d’intérêt permettra de mettre en évidence des mécanismes important impliqués dans la progression tumorale. De plus, ce projet servira d’étude de référence, en complément d’autres projets visant à étudier l’effet de traitements ciblant notre protéine d’intérêt dans des modèles plus simples.
Procédures
Une partie des animaux seront traités pendant 5 jours. Les traitements seront réalisés par gavage sur animaux vigiles, une fois par jour, ce qui prend moins d’une minute à être réalisée.
Impact sur les animaux
Le traitement peut entrainer du stress lié à la contention. Le traitement peut engendrer une toxicité susceptible de causer de la douleur. Le modèle génétique de cancer peut entrainer du stress et de la souffrance au stade terminal de la maladie, associées à des prises ou des pertes de poids importante ou des pertes de mobilité.
Devenir
Tous les animaux de ce projet seront mis à mort. Les animaux utilisés à des fins de croisement seront mis à mort précocement, pour limiter de développement de la maladie. Les animaux utilisés pour l’étude seront mis à mort afin de collecter les tissues (tumeurs) qui seront utilisées pour des analyses ultérieures.
Remplacement
Les études portant sur la genèse du cancer dans un organe spécifique nécessitent des études sur animal vivant afin de reproduire l’interaction complexe entre toutes les cellules au cours du temps. Des modèles plus simples (culture cellulaire, organoïdes) ne peuvent pas être utilisés pour modéliser totalement des processus aussi complexes que la carcinogénèse.
Réduction
Notre projet permet de générer uniquement le nombre minimal d’animaux nécessaire . Les tailles d’effectifs ont été déterminées à priori grâce à un logiciel dédié afin d’obtenir des résultats statistiquement fiables et robustes. Les données obtenues grâce aux animaux de ce projet seront analysées avec des tests statistiques classiques.
Raffinement
Afin de raffiner au mieux notre méthodologie, le protocole expérimental est planifié en amont. L’environnement des animaux est enrichi avec des tubes de coton pour la nidification et des briques de tremble à ronger. Les animaux seront maintenus en groupe. Des points limites précoces ont été établis afin d’interrompre si nécessaire les procédures permettant de soustraire les animaux à toute douleur ou souffrance.. Avant les procédures le nécessitant, les souris seront puis habituées à la contention et aux méthodes d’administration.
Choix des espèces
Les souris sont de petits mammifères très proches de l’homme notamment du point de vue immunologique. Le modèle génétique proposé est très proche du cancer humain en termes de mutations de l’ADN. Il s’agit d’un modèle de référence du cancer du pancréas qui permet une pousse tumorale au site naturel de la maladie dans des animaux présentant un système immunitaire complet.,. Les femelles gestantes nécessaires au modèle seront gardées jusqu’à l’âge de 8 mois. Les mutations seront induites dès la naissance, en accord avec des études précédentes utilisant le même modèle et les animaux pourront être conservés jusqu’à un âge avancé de 12 mois.
Etude des effets d’une nouvelle méthode de radiothérapie
- Formation professionnelle
- Production de routine
- Recherche appliquée
- Cancers
- Troubles respiratoires
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système respiratoire
- Tests réglementaires
- Autres tests de tolérance et d’efficacité
- Toxicologie et autres tests de sécurité
Issues de sept lignées génétiquement modifiées, les souris de ce projet reçoivent jusqu'à cinq injections de tamoxifène pour activer leurs mutations avant d'être irradiées. Elles sont 7 548 au total, dont 3 192 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère et 180 dans des procédures menées sous anesthésie, tuées avant tout réveil. L'irradiation du thorax peut provoquer une inflammation pulmonaire puis une fibrose avec difficultés respiratoires, celle de l'abdomen du sang dans les selles, et l'injection de cellules tumorales des tumeurs suivies par imagerie sous anesthésie jusqu'à six fois. Toutes sont tuées pour analyses post-mortem. Interrogé sur le remplacement, le porteur recopie mot pour mot son argumentaire de réduction du nombre d'animaux, sans citer une seule méthode sans animaux.
Objectifs
De nouvelles méthodes de radiothérapie permettent de réduire ces effets secondaires tout en préservant une efficacité contre les tumeurs comparable aux traitements actuels. Afin de définir les meilleures conditions cliniques de ces nouveaux traitements de radiothérapie , il est nécessaire de i) poursuivre l’étude de la compréhension des mécanismes de ces nouvelles modalités de radiothérapie et ii) réaliser les études précliniques pour définir les meilleures conditions cliniques d’utilisation de ces nouveaux traitements. Pour cela, nous nous intéresserons aux effets de ces nouvelles méthodes de radiothérapie sur du tissu sain comme les poumons et l’intestin. Nous chercherons également à caractériser sur des tumeurs l’impact de ces nouvelles modalités de radiothérapie.
Bénéfices attendus
A l’issue de ce projet, nous aurons défini les conditions cliniques optimales d’une nouvelle méthode de radiothérapie. En cas de résultats positifs, ces paramètres d’irradiation seront intégrés aux futures machines de radiothérapie et permettront une amélioration des traitements par radiothérapie (i.e. moins d’effets secondaires, meilleure contrôle de la tumeur) pour les patients atteints de cancer.
Procédures
Dans un premier lot d’animaux, des animaux vigiles issus de sept lignées de souris génétiquement modifiées seront injectés par voie intrapéritonéale avec du tamoxifène. En fonction des lignées, les animaux recevront entre une et cinq injections de tamoxifène (durée du geste inférieure à 10 sec). Les animaux seront ensuite irradiés avec une nouvelle modalité de radiothérapie. Lors de l’irradiation, les animaux seront anesthésiés (1 fois au cours de l’expérience pendant une durée de 3 à 5 min) puis placés en contention sur un support d’irradiation. Les animaux seront ensuite suivis par imagerie scanner pour petit animal, à partir du 4ème mois après l’irradiation. Lors des séances d’imagerie, les animaux seront anesthésiés pendant une durée de 5 à 10 min. Chaque animal recevra, au maximum, 4 séances d’imagerie. Dans un deuxième lot, des animaux vigiles issus de quatre lignées génétiquement modifiées seront injectés avec un traitement. En fonction des lignées, les animaux recevront entre une et cinq injections de ttraitement (durée du geste inférieure à 10 sec). Dans un troisième lot, des cellules tumorales seront injectées aux animaux vigiles (1 fois au cours de l’expérience - durée du geste inférieure à 10 sec). Les animaux seront ensuite irradiés et suivi par imagerie pour petit animal. Lors des séances d’imagerie, les animaux seront anesthésiés pendant une durée de 5 à 10 min. Chaque animal recevra, au maximum, 6 séances d’imagerie. Dans un quatrième lot, des injections seront réalisées sur des animaux vigiles (1 fois au cours de l’expérience - durée du geste inférieure à 10 sec).
Impact sur les animaux
Lors de l’injection du produit, il est possible de ressentir une légère douleur ou une gêne pendant un court moment. Une petite perte de poids peut aussi survenir dans les 5 à 10 jours suivant le traitement. Trois rythmes d’injection seront testés : une seule injection, trois injections par semaine (par exemple lundi, mercredi et vendredi) et cinq injections par semaine. Chez les animaux recevant plusieurs injections, une perte de poids peut apparaître dans la semaine qui suit la fin du traitement. Pour l’étude de la toxicité sur les tissus sains : • Après une irradiation du thorax, les animaux peuvent présenter une inflammation des poumons entre 1 et 3 mois après le traitement. Si la toxicité est forte, cela peut évoluer vers une fibrose (envahissement du tissu pulmonaire) après 4 à 5 mois. Dans ce cas, une perte de poids et des difficultés à respirer peuvent apparaître. • Après une irradiation de l’abdomen, une perte de poids peut être observée dans les 10 à 15 jours suivants, ainsi que la présence possible de sang dans les selles. Pour étudier l’efficacité du traitement contre les tumeurs, les animaux recevront une injection de cellules tumorales. Ces cellules provoqueront le développement de tumeurs dans les poumons, dont la croissance sera suivie régulièrement par imagerie. Selon le degré d’envahissement du poumon, des difficultés respiratoires et une perte de poids peuvent apparaître. L’injection peut entraîner une douleur passagère. Pendant les séances d’irradiation, les souris seront anesthésiées avec de l’isoflurane, un gaz anesthésiant. Cela peut causer une gêne temporaire et sans conséquence durable. À court terme, des irritations de la peau (rougeurs, plaies, nécroses) peuvent survenir à cause du traitement.
Devenir
Les animaux sont mis à mort pour des analyses post-mortem.
Remplacement
Plusieurs mesures ont été prises pour réduire le nombre d’animaux à utiliser tout au long du projet : 1-Des études antérieures ont été réalisées au laboratoire afin de déterminer les doses optimales pour caractériser les effets biologiques de cette nouvelle méthode de radiothérapie. De la même manière, des études antérieures utilisant l’injection de cellules tumorales par voie intra-veineuse ont permis de déterminer la quantité de cellules à injecter, le délai de prise tumorale ainsi que l’évaluation de la pertinence des méthodes de suivi de la progression tumorale. 2-Les temps des prélèvements seront adaptés en fonction de la croissance tumorale et de la radiosensibilité de chaque lignée tumorale. 3-Du fait d’études pilotes antérieures, le nombre d’animaux par groupe est optimisé par un test de puissance statistique lors de la comparaison des différentes modalités de radiothérapie. 4-L’optimisation et l’utilisation d’un suivi du développement des complications par imagerie (scanner ou bioluminescence) permet de suivre les animaux tout en évitant de multiplier les prélèvements ainsi que le nombre d’animaux utilisés pour cette étude. 5-Les deux sexes seront étudiés ce qui permettra de réduire, dans le cas de lignées transgéniques, le nombre d’animaux à produire.
Réduction
Plusieurs mesures ont été prises pour réduire le nombre d’animaux à utiliser tout au long du projet : 1-Des études antérieures ont été réalisées au laboratoire afin de déterminer les doses optimales pour caractériser les effets biologiques de cette nouvelle méthode de radiothérapie. De la même manière, des études antérieures utilisant l’injection de cellules tumorales par voie intra-veineuse ont permis de déterminer la quantité de cellules à injecter, le délai de prise tumorale ainsi que l’évaluation de la pertinence des méthodes de suivi de la progression tumorale. 2-Les temps des prélèvements seront adaptés en fonction de la croissance tumorale et de la radiosensibilité de chaque lignée tumorale. 3-Du fait d’études pilotes antérieures, le nombre d’animaux par groupe est optimisé par un test de puissance statistique lors de la comparaison des différentes modalités de radiothérapie. 4-L’optimisation et l’utilisation d’un suivi du développement des complications par imagerie (scanner ou bioluminescence) permet de suivre les animaux tout en évitant de multiplier les prélèvements ainsi que le nombre d’animaux utilisés pour cette étude. 5-Les deux sexes seront étudiés ce qui permettra de réduire, dans le cas de lignées transgéniques, le nombre d’animaux à produire.
Raffinement
Pour la procédure d’évaluation des effets secondaires de la radiothérapie, une grille de score est mise en place pour évaluer de façon objective l’état des animaux. En particulier, nous évaluerons le poids de façon hebdomadaire, les difficultés respiratoires, le sang dans les fèces et l’isolement. Le suivi par imagerie sera également un point majeur de notre évaluation du développement de effets secondaires et du suivi de la progression tumorale. Nous pourrons ainsi décider d’augmenter la surveillance et minimer les gênes respiratoires chez les animaux. En particulier, le nombre et la taille des tumeurs seront des éléments importants et déterminants pour assurer le bien-être de l’animal. Pour les procédures incluant une irradiation, une anesthésie générale ainsi qu’une contention physique sur un support adaptée seront réalisées au moment de l’irradiation pour éviter tout inconfort et douleurs des animaux. Ces mesures permettront de minimiser le stress de l’animal induit par les traitements d’irradiation. Aucune douleur n’est attendue au moment de l’irradiation dans ces conditions.
Choix des espèces
La souris est le modèle classiquement utilisé dans les études de toxicité radio-induite car il présente plusieurs avantages : i) il s’agit d’un modèle préclinique pertinent pour la radiothérapie car les réponses moléculaires et cellulaires des tissus murins à l’irradiation sont comparables à celles observées chez l’Homme ii) la souris est un mammifère génétiquement proche de l’Homme iii) son usage en préclinique a permis de mettre au point un grand nombre de nouveaux traitements Nous utiliserons des souris adultes âgées de 8 semaines à 12 mois. Les organes étudiés sont alors matures, limitant les potentiels biais expérimentaux induits par l’irradiation d’organes à des stades de maturation différents. De plus, les animaux adultes supportent également mieux l’anesthésie et l’irradiation.
Développement d’un modèle expérimental animal chez la gerbille (Meriones unguiculatus) d’infection à Strongyloides spp pour la production d’antigène parasitaire à des fins de développement de tests sérologiques
- Recherche appliquée
- Diagnostic des maladies
- Maladies infectieuses
- Troubles gastrointestinaux
- Troubles immunitaires
Immunodéprimées par des injections répétées puis infectées par un ver parasite, par voie orale ou sous la peau, 450 gerbilles de Mongolie développent des diarrhées chroniques. Les procédures impliquent un niveau de souffrance modéré et toutes les gerbilles sont tuées, pour empêcher la dissémination du parasite dans l'environnement. L'objet est de récolter des antigènes parasitaires complets, destinés aux industriels qui développent des tests de dépistage de l'anguillulose. Le porteur écrit vouloir limiter le nombre d'animaux et prévoit une procédure pilote suivie d'une procédure de production, sans jamais expliquer d'où sort le chiffre de 450.
Objectifs
La strongyloïdose (également appelée anguillulose) est une infection humaine causée par un ver microscopique vivant dans l’intestin. L’espèce responsable chez l’Homme, Strongyloides stercoralis, toucherait entre 30 et 80 millions de personnes dans le monde. Chez la plupart des personnes, l’infection peut passer inaperçue ou provoquer des troubles digestifs modérés. En revanche, chez les patients dont le système immunitaire est affaibli, cette infection peut devenir très grave, se disséminer dans l’organisme et entraîner un risque de décès élevé en l’absence de traitement. Le diagnostic repose actuellement principalement sur des tests diagnostiques sanguins. Cependant, il n'existe pas à ce jour de test sanguin de confirmation suffisemment sensible et spécifique pour cette infection. Le développement d’un test diagnostique plus fiable nécessite l’obtention d’éléments du parasite dans leur forme complète et naturelle. Or, il n’est pas possible de maintenir durablement ce parasite en culture au laboratoire. La seule solution consiste donc à reproduire son cycle biologique chez l’animal. La gerbille est à ce jour le seul rongeur capable de permettre ce développement complet, comme l’ont montré des publications scientifiques récentes. Dans ce projet, après une diminution contrôlée des défenses immunitaires par un traitement adapté, les gerbilles seront infectées expérimentalement. L’infection entraîne principalement des troubles digestifs chroniques. Ce modèle permettra d’obtenir les éléments parasitaires nécessaires au développement d’un test diagnostique plus performant pour améliorer la prise en charge des patients.
Bénéfices attendus
Dans ce projet, nous proposons de reproduire sur un modèle animal (gerbille) un cycle biologique d'anguillulose (parasitose digestive) afin de produire des antigènes (Ag) naturels de ce parasite. Cette production d'Ag a été récemment publiée et, est un élément essentiel à la fabrication de tests de diagnostic de cette maladie humaine. Ces antigènes seront destinés aux professionnels de santé (industriels) qui développent des techniques de dépistage de cette parasitose. L’utilisation d’antigènes naturels améliore la sensibilité de ces tests par rapport aux antigènes recombinants. Les bénéfices attendus du projet seraient donc directs et immédiats : permettre la production de tests diagnostiques fiables (plus spécifiques et plus sensibles) de cette maladie et ainsi améliorer le diagnostic, la prise en charge et le traitement de patients humains infectés par ce parasite.
Procédures
Ce modèle expérimental comportera plusieurs étapes. Dans un premier temps, les défenses immunitaires des gerbilles seront temporairement diminuées à l’aide d’un traitement administré par injection. Cette étape est nécessaire pour permettre au parasite de se développer de manière comparable à ce qui peut être observé chez des patients dont le système immunitaire est affaibli. Le traitement sera administré à intervalles réguliers pendant la durée de l’expérience, en tenant compte de l’état de santé et de la tolérance des animaux. Dans un second temps, les gerbilles seront infectées par le parasite, soit par une injection sous la peau, soit par administration par voie orale. L’infection provoquera principalement des troubles digestifs, notamment des diarrhées. Enfin, les animaux feront l’objet d’une surveillance attentive. En cas de signes de déshydratation ou de perte de poids significative liés aux troubles digestifs, une prise en charge adaptée sera mise en place, notamment par l’administration d’un traitement dans l’eau de boisson afin de limiter le risque de complications.
Impact sur les animaux
Ce projet est conçu pour accorder une attention particulière au bien-être des animaux et à la prise en charge de toute douleur ou inconfort. Plusieurs effets indésirables peuvent survenir au cours de l’étude. Tout d’abord, la diminution temporaire des défenses immunitaires nécessite des injections régulières pendant une période limitée. Ces injections peuvent provoquer un inconfort transitoire. Le développement de l’infection peut entraîner des troubles digestifs, notamment des diarrhées, susceptibles d’être inconfortables ou douloureuses. Ces signes seront surveillés attentivement et soulagés par l’administration d’un traitement antidouleur adapté dans l’eau de boisson. Dans certains cas, une déshydratation ou une perte de poids peuvent apparaître. Ces situations seront détectées précocement grâce à un suivi rapproché. Si nécessaire, le traitement diminuant les défenses immunitaires sera ajusté afin d’améliorer rapidement l’état clinique des animaux. Plus rarement, une aggravation de l’infection peut survenir et entraîner des complications sévères. Les animaux feront alors l’objet d’une surveillance quotidienne renforcée afin d’adapter immédiatement leur prise en charge (ajustement du traitement, traitement complémentaire, ou arrêt de la procédure si l’état de l’animal l’exige). L’ensemble du protocole a été conçu pour limiter autant que possible la fréquence et l’intensité des effets indésirables, et pour garantir une intervention rapide en cas de dégradation de l’état de santé.
Devenir
Une mise à mort sera systématique, elle permettra d’empêcher le risque de dissémination du parasite dans l’environnement.
Remplacement
Pour produire les éléments du parasite nécessaires au développement d’un test diagnostique fiable, le recours à l’animal est indispensable. À ce jour, il n’existe pas d’alternative permettant d’obtenir ces éléments dans leur forme complète et en quantité suffisante. La gerbille est le modèle le plus adapté, car elle est capable de développer une infection chronique comparable à celle observée chez l’être humain, ce qui permet au parasite d’accomplir l’ensemble de son cycle biologique. Les techniques de laboratoire réalisées en dehors de l’animal, comme la culture en milieu artificiel ou les méthodes de biologie moléculaire, ne permettent pas de produire un parasite complet ni d’obtenir les quantités nécessaires. Ces approches restent limitées et ne reproduisent pas l’ensemble des caractéristiques naturelles du parasite. En conséquence, la production d’un antigène complet et exploitable pour le développement d’un test diagnostique ne peut actuellement être réalisée qu’à l’aide d’un modèle animal.
Réduction
Nous sommes contraints à une production importante d’Ag tout en limitant au maximum la gravité et la souffrance de cette infection expérimentale et le nombre d’animaux utilisés. Ce cycle a été publié récemment mais cela a été dans un contexte scientifique différent. Nous allons donc essayer de l’adapter et de l’optimisser pour réduire le nombre d’animaux et réduire aussi les effets indésirables associés. En conséquence, 2 procédures se suivront, la première pilote pour valider la faisabilité de ce projet et pour définir les conditions expérimentales optimales, la seconde, identique en selectionnant les conditions optimales par rapport à la première pour la production d’antigène en quantité pour le developpement de tests diagnostiques.
Raffinement
L’expérience acquise sur ce modèle d’étude (gerbille) nous permet de définir les mesures à mettre en œuvre afin d’optimiser le bien-être des animaux. Les gerbilles seront hébergées par groupes d’individus compatibles, par fratrie de 2 minimum, dans des conditions contrôlées et avec la mise en place d’un environnement enrichi (copeaux, matériel de nidification, bâtonnets à ronger). L'eau et la nourriture sont mises à disposition ad libitum. Aucun des animaux ou groupe d’animaux ne sera traité différemment de ses congénères. Une fiche de suivi sera rédigée pour chaque cage avec un suivi de signes comportementaux, physiques et physiologiques. Les soins/suivi et la procédure expérimentale seront réalisés par du personnel qualifié et permanent. En effet, les gerbilles ont le temps de se familiariser avec les manipulateurs spécialement affectés à leur suivi. La détermination de point(s) limite(s) bien définis, suffisamment précoces et prédictifs, permettra immédiatement de reconnaitre un animal en souffrance. Nous attacherons une grande importance à l’apparence physique externe et aux changements comportementaux des animaux. Dès lors que l’animal montre des signes de positivité à l’infection et de douleur (diarrhées symptomatiques), il sera traité par antalgique (paracétamol) et placé en armoire ventilé afin de ne pas stresser ses congénères non malades.
Choix des espèces
La gerbille est la seule espèce de petit rongeur connue à ce jour capable de reproduire l’ensemble du cycle naturel de ce parasite lorsque ses défenses immunitaires sont temporairement diminuées. Ce modèle permet le développement de l’infection principalement sous forme de troubles digestifs, sans autres manifestations cliniques majeures au préalable. La production des éléments parasitaires nécessaires au projet sera donc réalisée chez ces animaux, car aucune autre méthode ne permet actuellement d’obtenir un parasite complet dans des conditions comparables. Les gerbilles utilisées seront de jeunes adultes, mâles ou femelles. À cet âge, elles présentent un comportement stable, sont peu agressives et s’adaptent facilement à la manipulation, ce qui contribue à limiter le stress et à favoriser leur bien-être pendant l’étude.