Procédures modérées

Toutes tuées pour prélever leurs organes, 800 souris transgéniques vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune subit l'ablation de l'extrémité de la queue pour établir son génotype, puis une injection quotidienne pendant sept jours. Le porteur indique que les souris de plus de 90 jours développent des signes de douleur et choisit pour cette raison d'étudier les stades qui précèdent, à 30, 60 et 90 jours, quand l'atteinte s'installe sans encore se voir. Sur le remplacement, il affirme que les modèles cellulaires ne reconstituent pas la diversité des neurones moteurs et des fibres musculaires associées.

Objectifs

Le système neuromusculaire permet de respirer, marcher, manger, sourire. Les muscles squelettiques et les neurones associés s’atrophient au cours du vieillissement, lors d’hospitalisation prolongée, au cours du cancer, et dans nombreuses myopathies d’origine génétique. Dans ce dernier cas les interactions entre les neurones et les fibres musculaires se détériorent conduisant à des défauts de contraction des myofibres. Différents modèles de souris génétiquement modifiées permettent de mieux comprendre les propriétés des différents types de fibres musculaires et de neurones et de leur environnement, et du dialogue entre les neurones et les fibres musculaires. L’objectif principal de cette étude sera de caractériser les interactions nerf-fibres musculaires, d’identifier les mécanismes mis en jeu dans le maintien de l’axe neuromusculaire.

Bénéfices attendus

Mieux comprendre les bases du système neuromusculaire, et d’en comprendre ses atteintes est un enjeu majeur. Cette étude sur la vulnérabilité neuromusculaire devrait aussi permettre de mieux comprendre les bases moléculaires qui contrôlent la formation de l’appareil neuromusculaire, en fonction des muscles étudiés. En effet mieux comprendre les interactions entre neurones et fibres musculaires dans le but de caractériser, grâce à des approches techniques innovantes, de nouveaux gènes qui contrôlent son intégrité est essentiel pour un jour permettre de guérir les malades atteints de défauts nuromusculaires. En conclusion, les études menées amélioreront nos connaissances sur les propriétés de l’axe neuromusculaire, en prenant en compte les neurones, et la fibre musculaire.

Procédures

Sur animaux vigiles : le prélèvement unique d'une biopsie de l'extrémité de la queue pour génotypage (5 secondes). L'injection quotidienne sur 7 jours, durée de 30 secondes.

Impact sur les animaux

Une douleur légère et de courte durée est occasionnée lors de la biopsie de l’extrémité de la queue des animaux en vue de leur génotypage. Une douleur passagère et de courte durée est occasionnée lors des contentions et injection en IP, geste qui dure 30 secondes. Avant 90 jours, les douleurs observées chez les souris sont souvent discrètes et difficiles à évaluer objectivement. À ce stade, l’atteinte motrice initiale peut s’accompagner de légers inconforts musculaires, mais la douleur n’est pas un symptôme majeur ou invalidant.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort afin de prélever les organes pour des analyses.

Remplacement

Le modèle de souris mime les interactions entre neurones et muscles chez l'homme, et renseigne de manière unique sur le dialogue et les les propriétés de l'interaction nerf-muscle. Les modèles cellulaires ne permettent pas à ce jour de comprendre la diversité de ce dialogue et ne permettent pas de reconstituer la diversité des types de neurones moteurs permettant le mouvement et des fibres musculaires associées.

Réduction

Nous prélèverons le maximum de tissus sur les animaux mis à mort, pour éviter l’utilisation ultérieure de nouveaux lots d’animaux. Les effectifs sont déterminés et les résultas analysés avec des tests statistiques adaptés.

Raffinement

Le milieu est enrichi d’une roue d’activité. Les animaux sont surveillés 2 fois par semaine par le porteur du projet. Nous nous efforçons à chaque instant de raffiner nos procédures afin de garantir le bien-être des animaux grâce à une surveillance attentive et des soins adaptés. Les animaux de plus de 90 jours développent des signes de douleur, aussi nous nous intéresserons aux stades de dévelopement qui précèdent P90, stades asymptomatiques avant que les animaux développent des signes de douleur. Cette période est instructive car c’est pendant cette période que se met en place progressivement un phénotype. Néannmoins si nous observons des signes de souffrance chez les animaux avant ce stade P90, les animaux recevront une analgésie pendant 48h. Des points limites ont été définis, et en absence d'amélioration les animaux seront mis à mort.

Choix des espèces

Les muscles et les nerfs moteurs humains sont bien conservés chez la souris, qui est de ce fait un bon modèle. Le modèle de souris permet d’accéder à tous les acteurs qui contrôlent la formation des muscles et des nerfs moteurs associés, sa diversité et sa physiopathologie. Les souris à 30 jours (1 mois), 60 jours (2 mois) et 90 jours (3 mois) sont utilisés pour mieux comprendre le dialogue entre les différents muscles et leurs nerfs moteurs associés.

Pour démontrer le rôle d'un gène exprimé dans des cellules non neuronales du cervelet, deux lignées de souris reproduisant l'ataxie spinocérébelleuse de type 1 et l'ataxie de Friedreich sont utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. 360 souris sont concernées par ce volet. Chacune subit un prélèvement de tissu à l'oreille, une chirurgie d'une heure sous anesthésie pour injecter un vecteur dans le cervelet, puis des séries de tests comportementaux répétés jusqu'à cinq fois, et une partie d'entre elles une dernière chirurgie d'injection de fixateur. 52 femelles sont réutilisées pour la reproduction avant d'être tuées, les 308 autres tuées pour prélèvement de tissus. Les tests comportementaux, que le porteur qualifie d'indolores et sans dommage durable, ne sont jamais nommés.

Objectifs

Les ataxies cérébelleuses sont un groupe de maladies neurodégénératives caractérisées par des troubles de la marche, une perte d'équilibre et de coordination motrice. Ces troubles sont causés par la dégénérescence des neurones du cervelet. Du fait de la faible prévalence de ces maladies, la mise en place d'études cliniques s'est avérée difficile et, à ce jour, aucun traitement curatif n'est disponible et très peu de médicaments sont proposés aux patients. Au fil des années, des modèles murins reproduisant les symptômes de plusieurs formes d'ataxie cérébelleuse ont été développés. Chaque modèle reproduit les principales caractéristiques génétiques, la dégénérescence cellulaire et les symptômes observés chez les patients. Au sein de ce projet multi-établissement (effectués dans 4 établissements utilisateurs, nommés ici EU1/EU2/EU3/EU4) nous avons sélectionné deux modèles murins d'ataxie cérébelleuse pouvant servir de paradigme pour ce groupe de maladies : l'ataxie spinocérébelleuse de type 1 (SCA1) et l'ataxie de Friedreich (AF). En fait, ces maladies couvrent l'hétérogénéité de ce groupe en termes de mode de transmission, de type de mutation génétique et de fonction de la protéine mutée. Nous avons récemment réalisé une analyse du cervelet afin d'identifier les principaux dysfonctionnements impliqués dans ces maladies. Nous avons constaté que la perte neuronale peut être influencée par des anomalies de certains types cellulaires non neuronaux qui contribuent au bon fonctionnement des neurones. Parmi ces anomalies, nous avons identifié un gène dont l'expression est plus faible chez les souris malades que chez les souris saines, dans les deux modèles de maladie. Ce projet vise donc à rétablir l'expression de ce gène au même niveau que chez les souris saines afin de démontrer son rôle dans la maladie. Dans cette optique, nous injecterons dans le cervelet de souris anesthésiées un vecteur portant un fragment génétique destiné à augmenter l'expression du gène spécifiquement dans un type particulier de cellules non neuronales, avant l'apparition des symptômes. En surveillant le comportement des souris et en réalisant des analyses moléculaires et histologiques ultérieures, nous espérons améliorer ou retarder l'apparition des symptômes chez les souris injectées. En complément, la seconde partie de notre projet tend à démontrer que la diminution d’expression de ce gène à elle seule suffit à faire apparaître les symptômes moteurs de la maladie chez des souris saines.

Bénéfices attendus

Par la modulation d'un gène spécifique et la combinaison de tests comportementaux, d'analyses histologiques, moléculaires et biochimiques, ce projet vise à élucider le rôle des cellules non neuronales dans l'ataxie cérébelleuse. Plus précisément, grâce à deux modèles murins paradigmatiques d'ataxie cérébelleuse, nous cherchons à démontrer la fonction cruciale d'une protéine produite par les cellules non neuronales pour protéger la fonction neuronale et ainsi prévenir les symptômes neurologiques. Ce projet pourrait prouver l'intérêt de ce gène pour le développement de futurs médicaments applicables à plusieurs types d'ataxies cérébelleuses.

Procédures

Les animaux de ce projet seront soumis à un prélèvement de tissus à l’oreille unique, procédure prenant environ 5 secondes au sein de l’EU1 et de l’EU2. Par la suite, un traitement sera administré par une intervention chirurgicale unique durant 1 heure et qui sera réalisée sous anesthésie et analgésie au sein de l’EU3. Des tests comportementaux, dont la durée totale est de 15 minutes, seront réalisés sur les animaux (au maximum 3 répétitions par test, EU3). En fonction du traitement reçu, ces tests seront réalisés soit 1 fois sur les animaux soit 5 fois (au maximum). Pour finir, une partie des animaux recevra une dernière chirurgie avec injection d’un fixateur sous anesthésie et analgésie pour prélèvements d’organes (intervention prenant 10 minutes au sein de l’EU4).

Impact sur les animaux

Un des deux modèles murins de ce projet commence à perdre du poids à partir de 20 semaines d’âge accompagné de symptômes ataxiques. Le second modèle de ce projet ne présente pas de symptômes ataxiques avant 9 mois mais à partir de 4 à 5 mois des symptômes légers de défaut de coordination motrice sont visibles lors de tests comportementaux. Les tests comportementaux ne sont pas invasifs, sont indolores et n’impliquent qu’un court et léger stress ne causant donc aucun dommage durable aux animaux. La procédure chirurgicale d’injection est accompagnée des mesures d’anesthésie et analgésie nécessaires en amont et lors de l’opération. Il est toutefois possible que les animaux soient soumis à de la douleur post-opératoire pendant les jours suivant la procédure. En prévision de cela, nous optons pour un traitement analgésique post-opératoire pour tous les animaux ayant reçu une injection.

Devenir

Les animaux utilisés dans ce projet sont des organismes génétiquement modifiés qui ne peuvent être replacés ou relâchés. Une partie des animaux produits (femelles) sera réutilisée pour reproduction au sein d’un projet d’élevage déjà en place dans l’EU2 avant mise à mort. Le reste sera étudié puis mis à mort pour prélèvement de tissus et analyses histologiques, moléculaires et biochimiques.

Remplacement

Ce projet comprenant un axe d’études comportementales, il n’est pas possible de se passer du modèle animal. De plus, il n’est pas possible à l’heure actuelle de reproduire en culture cellulaire des réseaux neuronaux complexes comme ceux que nous allons étudier.

Réduction

Toutes les procédures ont été conçues pour réduire au minimum le nombre d’animaux utilisés, sans compromettre la fiabilité des résultats des expériences. Les analyses statistiques ont été prévues en amont pour déterminer les tailles d’effectifs adéquates. De plus, afin de minimiser le nombre d’animaux, les mêmes individus seront utilisés pour les analyses comportementales, histologiques, moléculaires et biochimiques Des animaux des 2 sexes seront utilisés car l'ataxie spinocérébelleuse de type 1 et l’ataxie de Friedreich affectent de manière égale les mâles et les femelles. Ceci nous permet de générer moins d’animaux pour former nos groupes expérimentaux.

Raffinement

Le transport court des animaux entre les différents établissements utilisateurs sera réalisé à pied et de préférence en début de journée, pour limiter l’impact sur la phase de repos des animaux, dans une cage fermée placée dans un double emballage opaque et fermé. Les animaux seront habitués à l’expérimentateur avant le début des manipulations pour minimiser leur stress. Nous utiliserons des méthodes de contention peu stressantes, comme des tunnels ou le fait de simplement prendre les souris dans la paume de la main au lieu de les prendre par la queue. Les animaux seront aussi habitués aux dispositifs pour tests comportementaux en amont de la réalisation des tests. De plus, nous effectuons un marquage temporaire de couleur à la base de la queue avec un feutre non toxique afin de différencier plus facilement les souris sans avoir besoin de contention pour les identifier lors du comportement. Les animaux seront surveillés tout au long de l’étude à l’aide d’une liste de points limites adaptés et précoces. Pour la prise en charge de la douleur péri-opératoire, nous avons mis en place un protocole analgésique complet accompagné d’une grille de score adaptée pour surveiller le bon rétablissement des animaux. En complément, une grille de score est mise en place afin de surveiller l’état de santé des animaux et de pouvoir mettre en place un traitement précoce et adapté à l’apparition de symptômes.

Choix des espèces

Dans ce projet, nous avons choisi d'utiliser des modèles murins parce que ces derniers présentent des similitudes anatomiques et physiologiques avec le tissu humain : les mêmes types de cellules avec une organisation tissulaire similaire. Ces similitudes entre le cerveau de la souris et celui de l'homme sont cruciales pour disposer de connaissances solides qui pourront être transférées à l'avenir pour soigner l'homme. Il n'existe pas encore d'outils cellulaires capables de récapituler l'état de développement et la complexité de la structure du cerveau animal. La souris est actuellement l’animal de laboratoire sur lequel nous disposons des plus nombreux outils génétiques et moléculaires pour travailler. Les deux modèles utilisés au sein de ce projet sont déjà bien caractérisés ce qui nous permet de prévoir et gérer l’apparition des symptômes ataxiques ainsi que de tester un traitement par modulation génique avant apparition des symptômes. Les tests comportementaux seront effectués à l’âge où les symptômes ataxiques sont significativement visibles afin de mesurer l’efficacité de notre traitement.

Trois anesthésies générales de deux à deux heures trente en quatre à six jours, une injection de manganèse dans l'abdomen sous endoscopie et trois injections intraveineuses à la jugulaire attendent chaque brebis. 24 brebis au maximum vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. Le porteur prévoit un effectif majoré "pour pallier les pertes éventuelles liées aux longues anesthésies successives", tout en indiquant n'avoir observé aucun effet néfaste du manganèse lors de l'expérience pilote, après avoir rappelé sa neurotoxicité à forte dose chez l'être humain. Les brebis sont tuées sous anesthésie parce que la durée de persistance du manganèse dans leur organisme reste inconnue, ce qui interdit toute réutilisation.

Objectifs

L’objectif est de mettre en place la technique d’Imagerie par Résonnane Magnétique du manganèse in vivo à l'échelle du cerveau entier chez l’ovin. Les propriétés paramagnétiques du manganèse (Mn2+) permettent son utilisation comme agent de contraste pour l'IRM (MEMRI : IRM du ManganEse). C’est un composé qui pénètre et s'accumule dans les neurones actifs, donc sa concentration intracellulaire est le reflet direct de l'activité neuronale. Cette technique permet de visualiser les changements du cerveau en réponse à des stimulis. La dynamique du Mn2+ (biodisponibilité, pharmacocinétique) dépend de l'espèce, il est donc nécessaire de réaliser des mises au point sur le cerveau d’ovin. Une première expérience pilote a été réalisée sur 5 animaux ; cette expérience nous a permis de déterminer la dose minimale de Mn2+ à utiliser. Nous avons également observé les zones de diffusion du Mn2+ 24h post administration. Il est nécessaire de compléter et d’affiner ces résultats, notamment en analysant des points de cinétique qui manquent à notre analyse : les temps 48, 72 et 96 heures post-administration de manganèse. Dans le cadre de cet avenant, nous souhaitons réaliser l’acquisition d’images IRM supplémentaires pour 6 animaux à 1 temps long, à 22 jours post administration de manganèse. Pour cela, six brebis seront donc anesthésiées 1 fois de plus, à distance de leur dernière anesthésie. MODIFICATION : NOUS DEMANDONS L'AJOUT DE 4 ANIMAUX SUPPLEMENTAIRES POUR APPORTER DES PREUVES SOLIDES SUR LA FAISABILITE ET LA RESOLUTION DE LA TECHNIQUE DEVELOPPEE, EN UTILISANT UNE STIMULATION COMPORTEMENTALE POSITIVE.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra d’établir la fenêtre temporelle optimale pour l’acquisition du meilleur contraste en IRM MEMRI. Après injection, la concentration du manganèse augmente graduellement dans les tissus du cerveau, puis sa détection atteint un plateau, persiste pendant plusieurs heures et ensuite décroit. C’est la fenêtre correspondant au plateau qu’il s’agit de déterminer chez l’ovin. Une fois cette fenêtre temporelle définie, nous pourrons réaliser les expériences d’IRM fonctionnelle. Les mises au point des conditions de dose et temps dans cette expérimentation préliminaire bénéficieront à des appels à projet ultérieurs. Ce projet est une étape clé dans la mise en œuvre des études d’IRM fonctionnelle chez les ovins en utilisant une approche MEMRI par réhaussement de manganèse.

Procédures

Entre 12 animaux et 20 animaux subiront les gestes techniques, 20 est un nombre maximal prévu pour pallier les pertes éventuelles liées aux longues anesthésies successives. Les animaux subiront 3 anesthésies sur une durée de 4 jours pour 6 à 10 animaux maximum, et 5 jours pour 6 à 10 animaux maximum, pour passage à l'IRM. La 1ère anesthésie durera 2h30, les 2 autres 2h. Ils recevront également une injection intra-péritonéale sous anesthésie générale. Ils subiront 3 injections par voie intraveineuse à la jugulaire pour induire les anesthésies (durée totale contention comprise d'une minute). LES 4 ANIMAUX SUPPLEMENTAIRES SUBIRONT 3 ANESTHESIES SUR UNE DUREE DE 6 JOURS. LA 1ERE ANESTHESIE DURERA 30 MINUTES, LES 2 AUTRES 2H. ILS RECEVRONT EGALEMENT UNE INJECTION INTRA-PERITONEALE SOUS ANESTHESIE GENERALE. ILS SUBIRONT 3 INJECTIONS PAR VOIE INTRAVEINEUSE A LA JUGULAIRE POUR INDUIRE LES ANESTHESIES (DUREE TOTALE CONTENTION COMPRISE D'UNE MINUTE).

Impact sur les animaux

Bien qu’il soit un élément nécessaire au bon fonctionnement de l’organisme, le manganèse est cependant neurotoxique à forte dose. Chez l’homme, il provoque maux de tête, insomnies, pertes de mémoire, instabilité émotionnelle, dystonie, tremblements, troubles du langage et des troubles de la marche. Pour chaque anesthésie les animaux pourront subir un stress lors de la manipulation. Un hématome peut apparaître lors de l’induction de l’anesthésie par voie intraveineuse.

Devenir

A la suite des acquisitions, tous les animaux seront mis à mort toujours sous anesthésie générale. En effet, ils ne pourront pas être réutilisés car nous ne savons pas combien de temps le manganèse reste dans l'organisme des animaux. POUR LES 4 ANIMAUX SUPPLEMENTAIRES DEMANDES LES CERVEAUX SERONT PRELEVES A L'ISSUE DU PROJET.

Remplacement

Cette étude d‘imagerie cérébrale permettant de déterminer la fenêtre d’acquisition optimum pour obtenir le meilleur contraste IRM, ET DE PROUVER L'EFFICACITE DE LA TECHNIQUE SUITE A UNE STIMULATION COMPORTEMENTALE, ne peut être réalisée qu’in vivo. Il est en effet impossible d’étudier ou de reproduire ces expériences in vitro et encore moins in silico. Ce projet est un prérequis pour développer l’approche d’imagerie MEMRI qui permettra, ultérieurement, de mettre en place des projets longitudinaux, avec des nombres restreints d’animaux expérimentaux.

Réduction

Ce projet, qui concerne 12 animaux expérimentaux (24 animaux maximum) est nécessaire car il complétera et affinera les résultats obtenus lors d’une précédente expérience. L’évolution temporelle de la concentration de Mn2+ dans le cerveau d’ovins a été déterminée 24h, 72h et 120h après son administration. Les points 48h et 96h n’ont pas été étudiés et sont indispensables pour déterminer la fenêtre d’acquisition optimum pour obtenir le meilleur contraste. Nous avons planifié l’expérience de manière à acquérir des images IRM à deux temps post-administration de Mn2+ pour chaque animal, ce qui réduit considérablement le nombre d’animaux. Nous pensons qu’avec 4 temps d’analyse post-administration de Mn2+ et 6 animaux (10 animaux maximum) par temps (6 animaux imagés aux temps 24h et 72h et 6 animaux imagés aux temps 48h et 96h post-administration de Mn2+), la disponibilité du manganèse dans le cerveau des ovins au cours du temps pourra être modélisée par un ingénieur expert en pharmacologie. La taille de nos effectifs (6 individus par traitement expérimental) nous permettra de réaliser des analyses statistiques. Le choix des tests dépendra de la distribution des données et de l’homogénéité des variances (tests paramétriques ou non paramétriques). LA MODIFICATION CONCERNE 4 ANIMAUX EXPERIMENTAUX. ELLE PERMETTRA D’APPORTER UNE REPONSE CLAIRE (OUI/NON) SUR LA FAISABILITE DE LA TECHNIQUE TESTEE, SUITE A UNE STIMULATION POSITIVE FORTE. AU COURS DE CE PROTOCOLE, 3 ANESTHESIES SUCCESSIVES SONT PREVUES. LE NOMBRE DE 4 ANIMAUX NOUS PERMETTRA DE NE PAS RE-ENDORMIR UNE BREBIS SI SON REVEIL PRECEDENT A ETE TROP COMPLIQUE.

Raffinement

Pour limiter les stress liés à la manipulation des brebis, les 12 brebis (20 maximum) seront regroupées pour rester ensemble toute la durée de l’expérience et former ainsi un groupe social stable. Deux semaines avant les expériences, les manipulateurs iront quotidiennement approcher les brebis, les toucher et évoluer parmi elles pour établir un contact et lors de chaque visite, nous leur donnerons à chacune une poignée de granulés comme renforcement positif, ce qui participera à leur habituation. Nous n’avons pas observé d’effet néfaste de l’administration intra péritonéale de manganèse à la dose utilisée lors de l’expérience pilote, néanmoins, les brebis feront cette fois aussi, l’objet d’une surveillance accrue dans la période qui suivra l’administration de Mn2+, et ce jusqu’à l’anesthésie pour l’imagerie suivante. Au cours de cette période, l’apparition de tremblements, les difficultés de déplacement, la prise alimentaire seront particulièrement surveillés. Nous serons attentifs à la survenue de signes de mal être (position des oreilles, port de la tête, prostration). Dans le cas où de tels signes apparaitraient, un traitement analgésique sera administré. Nous avons opté pour une administration sous endoscopie du manganèse qui permet de nous assurer de la qualité de l’injection en intrapéritonéale ainsi que de la progressivité de l’injection : sous anesthésie générale, nous pouvons adopter une vitesse d’injection réduite susceptible de limiter l’apparition d’effets indésirables. Les animaux expérimentaux seront maintenus dans des conditions adaptées aux herbivores, litière de paille et foin ad libitum. Ils seront manipulés dans le calme par des agents expérimentés. Les animaux arriveront sur la plateforme 3 jours avant le début de l’expérimentation, pour s’habituer à l’environnement. Avant l’anesthésie, et pour réduire la météorisation et assurer quand même leur confort, ils auront accès à du foin de bonne qualité en quantité limité avec abreuvement adlibitum. Les brebis seront maintenues sous O2 à la fin de chaque anesthésie pour améliorer la qualité et la rapidité du réveil. Dès que l’animal présentera les premiers signes de déglutition ou de clignement des paupières, il sera extubé.

Choix des espèces

L’espèce ovine sera utilisée dans ce protocole car cette approche d’imagerie MEMRI sera utilisée pour étudier les circuits cérébraux impliqués dans les interactions sociales et sexuelles dans cette espèce. Un lot homogène de brebis de 18 mois sera utilisé, car nous souhaitons que cette approche soit validée dans les conditions où les animaux ont terminé leur développement. Dans un premier temps, cette approche sera développée chez les brebis car ce sont elles qui sont présentes majoritairement en élevage. Elle sera ensuite transférable (dose de MnCl2+ et temps de diffusion de manganèse jusqu’à la phase plateau) chez les béliers. Un essai avec quelques individus sera réalisé plus tard pour la validation chez les mâles. Aucune différence dans la distribution cérébrale du manganèse dans le cerveau entre les mâles et les femelles n’est cependant attendue.

192 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, tous tués à l'issue pour prélever leur cerveau. Un cathéter intraveineux leur est implanté à demeure sous anesthésie, puis ils enchaînent cinquante séances quotidiennes d'auto-administration de cocaïne de trois heures chacune, et dix séances de mesure de choix où des impulsions électriques servent de punition. Le but déclaré est de comprendre comment une consommation répétée devient incontrôlable, pour mieux prévenir et traiter l'addiction chez l'être humain. Sur le remplacement, le porteur affirme qu'aucun test in vitro ou in silico ne permet cette recherche et qu'il n'est donc "pas envisageable d'utiliser des méthodes de substitution à l'animal entier".

Objectifs

L’addiction aux drogues est une maladie qui se traduit par une perte de contrôle : la personne continue de consommer malgré les conséquences négatives sur sa santé, sa vie sociale ou professionnelle. Cette perte de contrôle n’apparaît pas chez tout le monde, mais peut survenir chez certaines personnes après une consommation prolongée. Elle est due à des interactions complexes entre la drogue et le fonctionnement du cerveau. Pour mieux prévenir et traiter l’addiction, il est essentiel de comprendre ce qui rend certaines personnes plus vulnérables que d’autres. Des recherches suggèrent que la prise répétée de drogue pourrait conduire à des habitudes de consommation qui peuvent devenir pathologiques, si bien qu'une personne continue de consommer même si elle sait que cela lui fait du mal. Cependant, on ne sait pas encore précisément comment ces habitudes peuvent évoluer vers une consommation compulsive, c’est-à-dire incontrôlable. Ce projet de recherche vise à mieux comprendre comment la répétition de certains comportements peut conduire à une perte de contrôle. Plus spécifiquement, l’objectif est de vérifier si certains individus sont plus enclins que d’autres à former des habitudes de consommation qui peuvent ensuite devenir compulsives. L’objectif final est de mieux comprendre les mécanismes cognitifs de l’addiction pour pouvoir, à terme, améliorer la prévention et les traitements.

Bénéfices attendus

Ce projet de recherche pourrait permettre de mieux comprendre pourquoi certaines personnes deviennent dépendantes à la drogue et n’arrivent plus à s’arrêter, même si elles en souffrent. En identifiant les mécanismes cognitifs qui transforment une consommation volontaire en une habitude incontrôlable, nous espérons trouver de nouvelles façons de prévenir l’addiction avant qu’elle ne s’installe, et de développer des traitements plus efficaces pour aider les personnes déjà dépendantes.

Procédures

Sur animaux anesthésiés : - chirurgie d’implantation de cathéter (durée : 15minutes par animal,) pour permettre l’auto-administration. Sur animaux vigiles : - 50 sessions d’auto-administration de cocaine (1 session / jour, 3 heures par session,). - 10 sessions de mesure de choix (1 session / jour, 5 minutes par session).

Impact sur les animaux

Les nuisances attendues pour cette procédure sont : Chirurgies : inconfort transitoire au réveil ; implantation d’un cathéter intraveineux à demeure : risques d’infection ou démangeaisons ; Impulsions électriques légères lors des tests de punition. Stress généré lors des différentes manipulations.

Devenir

Tous les animaux, à l’issue des procédures seront mis à mort afin de prélever le cerveau pour étudier les mécanismes neurobiologiques impliqués dans la compulsion à consommer de la drogue.

Remplacement

Ce type de recherche, visant à comprendre les bases du comportement habituel, peut uniquement être menée sur un animal vivant. Après vérification, il n’a pas été trouvé de test in vitro ou in silico permettant d’effectuer cette recherche et il n’est donc pas envisageable d’utiliser des méthodes de substitution à l’animal entier.

Réduction

Les effectifs sont calculés et optimisés de manière à utiliser un minimum d’animaux tout en conservant une grande puissance statistique. Il faut également que la taille d’effectif soit suffisante pour tenir compte de la variabilité interindividuelle. Ainsi, nous utiliserons un maximum de 192 animaux sur 5 ans pour répondre à nos objectifs.

Raffinement

Toutes les phases du projet seront réalisées par des personnels expérimentés et compétents. Le bien-être des animaux est pris en compte à chaque étape par une surveillance régulière des animaux selon une grille de suivi de bien-être animal qui aide dans le suivi des points limites et des critères d’intervention et d’arrêt. En effet, ses points limites gradés précis sont définis dans une grille de suivi (perte de poids, apparence, comportement de l’animal). Un animal atteignant un des points limites définis nécessitant une intervention est pris en charge sans délai. Le bien-être des animaux est pris en compte à chaque étape avec une pesée 3 fois par semaine. Dès leur arrivée à l’animalerie et pour toute la durée du projet, les animaux seront hébergés à deux par cage en conditions normales (température et humidité contrôlées, cages ventilées) et en cycle inversé avec un enrichissement dans la cage fourni par l’animalerie (stick ou pièce de bois à ronger pour assouvir leur besoin naturel de ronger ; balle de jeu) et accès à l’eau et à la nourriture ad libitum. Les procédures débuteront après une période d’acclimatation de 10 jours minimum.

Choix des espèces

Le rat est l’animal le plus utilisé pour l’étude de l’addiction dans les modèles animaux. Les rats ont des réponses aux drogues/récompenses naturelles qui sont similaires à celles de l’Homme et ils peuvent apprendre à s’auto-administrer toutes les drogues abusées par l’Homme, de façon spontanée. Dans cette étude, nous utiliserons des rats « jeunes adultes » de 7-8 semaines au début du projet, pour faciliter l’apprentissage et pour pouvoir effectuer des expériences de longue durée sans facteur de déclin cognitif lié au vieillissement.

Neuf tests comportementaux répartis sur deux semaines, deux gavages de glucose, une injection d'insuline, dix-neuf prélèvements de sang et un jeûne pouvant aller jusqu'à seize heures sont infligés à 96 souris génétiquement modifiées, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Toutes sont tuées pour prélever cerveau, pancréas, foie, intestin et contenu du cæcum. L'étude cherche à établir si le fond génétique modifie la réponse des souris au fructose, étape que le porteur présente comme préalable à une future étude sur les mécanismes d'action. Les neuf tests censés mesurer l'anxiété, l'humeur dépressive et la mémoire ne sont pas nommés.

Objectifs

La consommation de fructose a fortement augmenté au cours des dernières décennies, notamment par le biais des produits alimentaires ultratransformés et par les boissons sucrées. Plusieurs études ont montré l’impact négatif de cette surconsommation sur la santé (obésité, diabète de type 2, etc.), troubles de l’humeur (anxiété, dépression). On ne sait pas comment le fructose provoque ces effets néfastes. Dans l’intestin grêle, il est peu absorbé par rapport au glucose. Son excès provoque sa présence en quantités anormales dans le gros intestin et y altère la flore bactérienne. Ce phénomène est amplifié chez près de la moitié de la population qui présente des problèmes d’absorption intestinale du fructose, pathologie encore mal diagnostiquée. Des travaux préliminaires sur la souris montrent que les cellules immunitaires du cerveau sont activées par l’excès de fructose indiquant un état inflammatoire néfaste à long terme. De plus, des tests de comportement révèlent un état dépressif de ces animaux. Mais on ne sait pas si le fructose agit directement sur le cerveau ou/et si ses effets sont la conséquence d’un dysfonctionnement intestinal ou sanguin. Cette étude va nous permettre de déterminer si les différences génétiques ont un impact sur les effets du fructose chez la souris.

Bénéfices attendus

Les résultats de ce projet permettront d’évaluer dans quelle mesure le fond génétique des souris et leurs conditions d’hébergement influencent leur réponse au fructose, tant sur le plan comportemental que physiologique. Ces données sont cruciales pour mettre en place une étude sur les mécanismes d’action du fructose.

Procédures

Tous les animaux seront soumis à des tests de comportement durant 5 à 20 minutes pour permettre d’analyser des comportements émotionnels et de mémoire : 4 tests différents répartis sur 4 jours une semaine (jour de repos le mercredi) et 5 tests différents répartis sur 5 jours une autre semaine. Trois semaines sépareront les 2 semaines de tests. Au cours du protocole expérimental, les animaux vigiles seront soumis à 2 reprises à un test de tolérance au glucose et une fois à un test de résistance à l’insuline. Ils recevront au total 2 gavages de glucose et 1 injection d’insuline pour un suivi de la glycémie pendant 2 heures (glycémie mesurée à 7 et 5 temps différents par prélèvement d’une goutte de sang d’une durée inférieure à 10 secondes, soit un total de 19 prélèvements). Les gavages et injections ne durent qu’une dizaine de secondes, maximum 20 secondes. Les animaux seront mis à jeun 16 heures maximum une fois, et 6h deux fois, une fois 4h, puis 2h en fin de protocole. Un prélèvement sanguin sera effectué une fois, d’une durée d’environ 20 secondes.

Impact sur les animaux

Les animaux seront soumis à un stress sur des temps très courts au cours de la contention nécessaire lors des gavages et des prélèvements (moins de 20 secondes). Les animaux seront soumis à un stress durant les tests de comportement (10 minutes maximum). Les animaux seront soumis à une légère douleur lors des prélèvements sanguins. Les souris seront soumises à des périodes de jeûne (16 heures, 6 heures et 4 heures) ce qui n’entraine qu’une diminution modérée de la glycémie et aucune hypoglycémie.

Devenir

L'ensemble des animaux sera mis à mort afin de prélever et analyser certains tissus (cerveau, pancréas, foie, intestin et contenu de caecum).

Remplacement

L’étude des comportements de type anxieux et dépressif, des performances cognitives ne peut être faite que sur des animaux vivants, tout comme l’étude des effets physiologiques d’un changement de consommation alimentaire. Il n’existe pas de modèle in vitro pouvant les remplacer. Enfin, les analyses tissulaires doivent être réalisées sur des organes entiers qui tiennent compte de l’anatomie réelle qui existe chez les individus, en particulier le cerveau constitué d’un réseau de voies nerveuses encore impossible à reproduire.

Réduction

Le nombre d’animaux sera réduit au maximum en se basant sur des articles scientifiques qui ont montré par le biais de tests statistiques des différences entre plusieurs groupes. D’après de précédentes études, 12 animaux par groupe expérimental semblent nécessaires pour obtenir des résultats rigoureux suite aux tests comportementaux.

Raffinement

Pour réduire au maximum le stress des animaux, une semaine avant le début du protocole, ils seront habitués à être pris de leur cage au moyen d’un tunnel en plastique et à être manipulés pour les gestes de contention. Un suivi visuel quotidien des animaux sera opéré et leur poids sera mesuré 1 fois par semaine. Des points limites ont été mis en place et seront appliqués pour limiter au mieux la souffrance des animaux.

Choix des espèces

Le modèle utilisé est la souris, qui est un mammifère comme l’Homme. Les tests de glycémie et de comportement sont bien connus chez ces rongeurs et nous pourrons comparer nos résultats à ceux d’études antérieures. Elles seront étudiées à l’âge adulte (10 semaines) pour reproduire la malabsorption intestinale du fructose observée chez l’Homme lorsque la flore intestinale est mature et évaluer leur santé mentale. Nous utiliserons des animaux génétiquement modifiés qui seront nécessaires pour la poursuite de notre projet, où le transporteur au fructose sera invalidé spécifiquement dans le cerveau ou l’intestin afin de déterminer si l’effet du fructose est du à son action directe au niveau du cerveau ou à sa malabsorption au niveau intestinal.

1 530 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une ou deux injections provoquant la présence de bactéries dans le sang, puis cinq prélèvements sanguins étalés sur quatre à dix jours selon la procédure, avant récupération de leurs organes. Le bénéfice annoncé, l'identification de nouvelles cibles thérapeutiques face à la résistance aux antibiotiques, reste au conditionnel, quand les atteintes décrites sont l'inconfort des injections et des prélèvements répétés et une perte de poids liée aux infections. L'effectif de 1 530 animaux tient en une phrase, justifié par des "calculs statistiques" dont le détail n'est pas donné.

Objectifs

Les maladies infectieuses sont responsables d’un grand nombre de décès dans le monde et représentent la troisième cause de mortalité en France, avec un impact sanitaire et économique majeur. Les bactéries dites « pathogènes » sont à l’origine de la majorité de ces maladies, soit par leur simple présence dans les tissus infectés, soit par la production de molécules qui déclencheront une réponse immunitaire. L’inflammation est un mécanisme naturel qui permet à l’organisme de se défendre contre les infections. Mais lorsqu’elle est mal contrôlée ou excessive, elle peut contribuer à des déficits immunitaires et des cancers. Une bonne connaissance des phénomènes de contrôle de cette inflammation est donc indispensable pour la protection de l’hôte contre les microbes. L’objectif de ce projet est d’identifier les systèmes impliqués dans la défense de l’organsime contre l’infection. Une étude de la littérature, ainsi que des résultats préliminaires obtenus in vitro sur cellules, ont mis en évidence le rôle de certaines protéines dans la réponse immunitaire contre les bactéries. Nous souhaitons donc confirmer le niveau d’implication de ces protéines dans la bactériémie (présence de bactéries dans le sang) induite chez la souris.

Bénéfices attendus

Du fait de l’étendue actuelle et à venir de la résistance aux antibiotiques, le développement de nouveaux médicaments dans le traitement des maladies infectieuses est crucial. Une meilleure compréhension des mécanismes mis en jeu dans ces échanges entre l’hôte et le pathogène devrait permettre d’identifier de nouvelles cibles pour de nouvelles applications thérapeutiques dans la prise en charge des patients atteints d’infections bactériennes.

Procédures

Les animaux subiront des injections : selon les procédures 1 injection, ou 2 injections espacées de 15 jours. Ils subiront également des prélèvements sanguins à différents temps post injection : 5 prélèvements étalés sur 4 jours ou 5 prélévements étalés sur 10 jours en fonction de la procédure. La durée de chaque intervention n’excède pas une dizaine de secondes. A la fin de l'expérimentation, tous les animaux seront mis à mort.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables attendus sont : un léger inconfort produit par les injections intra-veineuses et les prélèvements de sang répétés, et une perte de poids possible liée aux infections.

Devenir

Les animaux utilisés dans cette demande seront infectés, et leurs organes récupérés après leur mise à mort. Ils ne pouront donc pas être réutilisés.

Remplacement

Des expériences préliminaires ont été réalisées in vitro afin d’identifier au préalables les acteurs du dialogue entre la bactérie et l’hôte. Ces résultats doivent maintenant être confirmés in vivo.

Réduction

Le nombre d’animaux nécessaires à la réalisation de ce projet est basé sur des calculs statistiques permettant de déterminer le nombre minimal d’animaux à utiliser pour avoir des résultats robustes et fiables.

Raffinement

Après infection et/ou toute intervention, ils seront surveillés quotidiennement par les responsables du projet afin de détecter toute apparition de signes de souffrance durables non reliés à l’infection. Le cas échéant les animaux seraient plus particulièrement surveillés et si les symptômes se prolongeaient au-delà de 24 heures, les animaux concernés seraient mis à mort.

Choix des espèces

Le modèle souris est largement décrit dans la littérature comme modèle d'étude pertinent de l'infection in vivo. De plus, les systèmes de défense contre les bactéries pathogènes sont très conservés de la drosophile aux mammifères, et en particulier, les réponses cellulaires de l'hôte vis-à-vis du pathogène sont très similaires entre la souris et l'homme. Nous utiliserons des animaux âgés de 6 à 8 semaines.

Marquées avec des perles de couleur, soumises deux fois par jour pendant un mois à un courant de 50 cm/s, puis injectées de puromycine et tuées vingt-cinq minutes plus tard : 60 truites arc-en-ciel vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. L'objectif déclaré est de relier l'exercice de nage à l'activité des cellules à l'origine des fibres musculaires, avec des recommandations attendues pour les pisciculteurs sur la gestion du débit d'eau en élevage. La description des atteintes ramène l'effort à un courant intense de dix minutes, quand le protocole annonce deux séances quotidiennes sur un mois. Les truites sont tuées pour prélever muscle et foie, et le porteur précise que des échantillons de ces mêmes individus alimenteront un autre projet.

Objectifs

L’objectif scientifique de ce projet est d’évaluer chez les poissons les effets de l’exercice physique sur les cellules à l'origine des fibres musculaires— en termes d’activité et de nombre — et de les relier aux variations de taille et de nombre des fibres musculaires. Nous pourrons également déterminer dans quelle mesure l'activité physique chez la truite altère l'activité respiratoire des cellules et la production des protéines, et étudier le lien entre ces deux processus.

Bénéfices attendus

Dans le cadre de ce projet, il sera possible de déterminer si l’exercice appliqué durant la phase exponentielle de croissance influence l’activité des cellules nécessaires à la formation des fibres musculaires, lesquelles jouent un rôle déterminant dans le potentiel de croissance ultérieur des animaux. Par ailleurs, les connaissances acquises permettront d’élaborer des recommandations à destination des pisciculteurs concernant la gestion du débit d’eau dans les systèmes d’élevage, dans le but d’optimiser la croissance musculaire et la qualité des produits.

Procédures

Après un marquage externe à l'aide de perles de couleur, 20 animaux seront soumis à un courant d'eau de 50 cm/s, 2 fois par jour, pendant 1 mois. Ensuite les animaux seront injectés avec de la puromycine puis euthanasiés 25 min plus tard pour réaliser des prélèvements de tissus (foie et muscle).

Impact sur les animaux

Les animaux seront soumis à un courant intense (50cm/s) pendant 10 minutes, ce qui peut induire un stress transitoire. Bien que cet effort soit intense, il est de courte durée, et les animaux devraient s'habituer à ce changement soudain de courant.

Devenir

A l'issue de la procédure, les animaux seront euthanasiés puisque nous devons prélever des échantillons de muscle et de foie pour des analyses histologiques et biochimiques.

Remplacement

L'objectif du projet étant de déterminer l'impact des de l'exercice sur la plasticité des cellules nécessaires à la formation in vivo de fibres musculaires, cela implique nécessairement de réaliser des tests sur animaux vivants.

Réduction

Pour réduire le nombre d'animaux, nous avons construit un couloir de nage de petite taille pour maintenir une densité optimale et un effectif de 30 poissons/bac pour éviter les comportements agressifs. Avec cette quantité, nous pouvons prélever 20 poissons à chaque prélèvement ce qui est suffisant pour atteindre les objectifs scientifiques de l'étude et détecter des différences de plasticité des cellules souches musculaires. Par ailleurs, des échantillons de ces mêmes animaux seront utilisés dans le cadre d'un autre projet, évitant ainsi l'utilisation d'animaux additionnels.

Raffinement

Les animaux seront élevés dans un environnement optimal pour l’espèce (photopériode, qualité d’eau, densité). Les paramètres physico-chimiques de l’eau (température, O2, pH) seront également régulièrement contrôlés. L’ensemble des transferts et manipulations sera réalisé dans les plus brefs délais afin de limiter au maximum la durée d’émersion et le stress induit par la capture. Le marquage des animaux et les injections seront réalisés sous anesthésie. Les dispositifs expérimentaux seront installés à proximité immédiate des bassins d’élevage afin de réduire les temps de transfert. Une grille d'évaluation du bien-être animal a été mise en place et des points limites adaptés ont été définis.

Choix des espèces

La truite arc-en-ciel est une espèce robuste dont l’élevage, la croissance et la reproduction sont bien maîtrisés en pisciculture. Il s’agit d’une espèce d’intérêt agronomique puisqu’elle représente 95% de la production française piscicole en eau douce. Elle est par ailleurs un modèle biologique largement diffusé dans la communauté scientifique (>50 000 références). C’est une espèce avec une très grande plasticité de croissance. Nous allons utiliser des poissons de 10g car c'est durant cette période que la croissance est exponentielle et avec la plus grande plasticité.

Huit passages au scanner sous anesthésie et huit sessions de suivi de la démarche par animal, sur les huit semaines qui suivent l'opération : 36 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, tous tués à l'issue. Un défaut osseux de 2 mm est percé dans un fémur après ouverture des tissus musculaires et cutanés, pour évaluer la combinaison de deux biopansements déjà testés séparément lors d'un projet précédent. Le porteur indique que la douleur postopératoire peut s'accompagner d'une perte de poids, d'une baisse de mobilité et d'une agressivité accrue envers les congénères pendant la première semaine. Il présente cette étude comme un moyen de réduire ensuite le nombre de rats soumis à un modèle de fracture fémorale complète, qu'il décrit lui-même comme plus invasif et plus douloureux.

Objectifs

Le projet vise à évaluer le potentiel de biopansements actifs (scaffolds) et de différents enrichissements sur l'étude de la cicatrisation osseuse. À la suite d’une lésion osseuse, un processus complexe de régénération se met en place. Dans ce contexte lésionnel, une solution innovante permet d'améliorer la régénration osseuse : les scaffolds. Ces biomatériaux offrent une matrice dont les propriétés physico-chimiques guident et stimulent la croissance cellulaire, favorisant ainsi la reconstruction progressive du tissu osseux. Leur potentiel peut encore être renforcé grâce à l’ajout de molécules bioactives, capables d’accélérer et d’amplifier le processus de cicatrisation. Dans ce volet, le projet souhaite étudier le pouvoir cicatrisant de deux biopansements combinés sur le tissu osseux. Ceux-ci ont déjà été testés et validés par le passé lors d'un précédent projet, de façon indépendante et sans enrichissement. Nous souhaitons aujourd’hui tester leur pouvoir cicatrisant en les combinant sur un modèle plus représentatif des contraintes mécaniques que peut subir le tissu osseux.

Bénéfices attendus

Ce projet ambitionne de valider la combinaison de deux biopansements innovants capables de stimuler fortement la cicatrisation osseuse, y compris dans des contextes lésionnels sévères. Ainsi, deux pansements testés lors d'un précédent projet et qui se sont révélés efficaces sur la régénération du tissu osseux indépendamment, ont été retenus afin d’être combinés sur ce projet pour leur propriétés respectives. Le bénéfice final attendu de ce projet sera la mise au point d'un biopansement combiné capable d'accélérer la réparation de défauts sévères.

Procédures

Les animaux seront soumis aux interventions suivantes : 1- Procédure chirurgicale osseuse (30 min) sous anesthésie volatile (30 min) avec deux injections sous-cutanées pour l'analgésie et l'antibiothérapie (10 secondes chacune) ; Tonte et aseptie (5 min), ouverture des volets cutanés et musculaires (5 min) avec exposition du fémur (5min). Un défaut osseux sera réalisé dans l'un des deux fémurs (5 min). Les volets musuclaires puis cutanés seront refermés à l'aide de fils chirurgicaux (10 min). Les animaux seront mis dans une chambre de réveil pour faciliter le retour à l'état vigile (30 min). Sur les jours suivants la chirurgie, l'antibiothérapie sera poursuivie sur deux jours (2 injections sous-cutanées) et de nouvelles injections d'analgésique seraient réalisées en cas d'apparition de signes de douleur (10 sec). 2- Suivi de la locomotion par un appareil de suivi de la démarche rongeurs toutes les semaines pendant 8 semaines (8*15 min par animal) sans qu'aucune contrainte ne leur soit réalisée. 3- Suivi de la régénération osseuse par imagerie Scanner sous anesthésie volatile (isoflurane) toutes les semaines pendant 8 semaines (8*15 min par animal). 4- Mise à mort terminale avec récupération des tissus en fin d'étude (30 min).

Impact sur les animaux

L'induction des défauts osseux circuclaires de 2mm au niveau des fémurs de rats vont premièrement nécessiter une anesthésie (volatile) et des injections sous-cutanées d'analgésiques. L'anesthésie peut entrainer une hypothermie qui sera à surveiller. Par la suite, ces défauts osseux qui seront induits sont susceptibles d’entraîner des niveaux de douleur modérés. Les nuisances cliniques attendues comprennent notamment une perte de poids et/ou déshydration, une diminution de la prise alimentaire, une diminution de la mobilité, une augmentation du stress (notamment visible par les aspects corporels) ainsi qu’une potentielle agressivité accrue envers les congénères. Des signes d’infection et/ou d’inflammation pourraient également survenir (membre chaud, rouge, glonflé,…) et seront surveillés. Ces manifestations apparaitront principalement au cours de la première semaine suivant la chirurgie et vont tendre à s’atténuer progressivement au fil des semaines.

Devenir

Une mise à mort des animaux est prévue en fin de procédure pour la récupération des fémurs afin de réaliser leur analyse en histologie.

Remplacement

Les biopansements ici testés ont déjà fait l’objet de tests in vitro et in vivo par le biais d'un précédent projet sur le calvarium de rats. Afin de vérifier le potentiel cicatrisant de la combinaison de ces deux pansements sur un modèle plus sévère, et répondre à cette hypothèse scientifique, un nouveau modèle in vitro serait insuffisant. Ainsi, un modèle animal est ici nécessaire afin d’étudier le processus de cicatrisation osseuse dans son ensemble, avec les contraintes que ce tissu peut subir au sein d’un organisme vivant (inflammation locale, vascularisation, remodelage, …). Ceci permettra de garantir la validité, la robustesse et la transposabilité des résultats, condition essentielle pour le développement d’outils thérapeutiques réellement applicables en médecine humaine.

Réduction

Cette étude sera dédiée à la caractérisation de la cicatrisation osseuse dans un modèle de fracture légère. Les données obtenues permettront de valider l'intérêt de ce nouveau biopansement combiné, d’optimiser les paramètres expérimentaux et, surtout, de réduire significativement le nombre de rats utilisés sur le modèle de fracture fémorale complète plus invasive et douloureuse qui viendra compléter cette étude. Ainsi, cette approche progressive contribue directement à limiter l’exposition des animaux aux procédures les plus contraignantes, conformément au principe de Réduction des 3R. Un nombre de 36 rats est prévu sur la procédure, incluant 18 mâles et 18 femelles. Ce nombre a été réduit au maximum afin d’apporter à minima 3 données sur chacun des temps de l’étude tout en gardant une significativité des résultats.

Raffinement

Raffinement de la technique chirurgicale : Des cadavres de rats issus de précédents projets ont été utilisés par le personnel de l’animalerie pour des sessions d’entraînement afin d’affiner et de sécuriser les gestes chirurgicaux de cette procédure. Raffinement des soins pré-per-post opératoires : Tous les rats seront induits en chambre d’induction puis maintenus sous anesthésie gazeuse à l’isoflurane sur un plateau chauffant. Ils recevront également une injection sous-cutanée d'analgésique afin d’assurer une prise en charge optimale de la douleur et seront également mis sous antibiothérapie .Après la chirurgie osseuse, l’animal sera placé dans une chambre de réveil offrant des conditions optimales afin de faciliter un retour à l’état vigile dans un environnement sécurisé et confortable. Au cours des premières heures et jours post-opératoires, la surveillance des rats sera renforcée afin de permettre une prise en charge rapide et adaptée dès l’apparition des premiers signes de souffrance. En cas de détection de signes de souffrance, une administration d'analgésique sera effectuée afin de soulager efficacement la douleur des rats. De plus, de l’hydrogel sera ajouté dans chacune des cages afin de faciliter l’hydratation des rats et de contribuer à réduire leur inconfort post-opératoire. Par la suite, les animaux subiront une surveillance quotidienne, permettant d’intervenir le plus rapidement en cas d’apparition de signes de douleur / stress.

Choix des espèces

Le rat est largement utilisé dans la recherche preclinique, notamment sur les modèles chirurgicaux orthopédiques. La souche de rat choisie est réputée robuste et facilement manipulable, ce qui nous permettra un suivi clinique facilité. D’autre part, les structures anatomiques osseuses sont suffisamment proches de celles de l'homme et assez grandes pour être opérées et pour réaliser une perforation de 2mm dans l'un des deux fémurs. Une revue en cours de publication sur le critical-size defect ainsi que les entraînements ex vivo ont permis de déterminer que des rats âgés de 15 semaines constituent le modèle le plus adapté afin d’étudier la régénération osseuse. En effet, à ce stade de développement, la croissance osseuse est fortement réduite (stade adulte) ce qui réduit les interactions avec l’étude. De plus, les fémurs à 15 semaines, que ce soit chez les mâles ou les femelles, présentent la taille suffisante pour les modèles chirurgicaux réalisés.

Pour construire un atlas vasculaire cérébral et automatiser le recalage entre imagerie par résonance magnétique et imagerie ultrasonore, 66 rats de six à huit semaines vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacun passe une heure d'IRM sous anesthésie avec pose d'un cathéter veineux, puis, vingt-quatre à soixante-douze heures plus tard, une chirurgie d'amincissement du crâne suivie sans réveil de l'imagerie ultrasonore, jusqu'à trois heures en tout. Une partie des rats reçoit en plus une injection de lipopolysaccharide dans le cerveau, pour provoquer une inflammation locale. La méthode sera mise à disposition des utilisateurs de la plateforme d'imagerie, et le porteur indique que des animaux de réforme pourront servir à la mise au point des protocoles.

Objectifs

L’imagerie ultrasonore ultrarapide est une technique récente d’imagerie qui permet d’étudier l’activité cérébrale, grâce à la mesure des changements de volume sanguin dans les vaisseaux qui irriguent le cerveau. En combinaison avec un agent de contraste ultrasonore (sous forme de microbulles injectées dans la circulation, la technique permet de créer des images haute résolution de la microcirculation. Cependant ces images offrent un contraste uniquement vasculaire, sans autre repère anatomique que les vaisseaux intra-cérébraux dans le champ de vue de la sonde ultrasonore. L’acquisition comme l’analyse de ces images requiert de pouvoir repérer les régions anatomiques cérébrales depuis un référentiel, qui ne contient en général aucune information vasculaire. Actuellement la méthodologie d’analyse des données ultrasonores reste très insatisfaisante car l'alignement des images vasculaires avec les images anatomiques (obtenues en IRM) est réalisé manuellement, avec un contrôle visuel de leur adéquation. C'est une source d'imprécision majeure dans la quantification des données. L’objectif est donc de développer une méthodologie robuste, reproductible et automatique de recalage des modalités d’imagerie ultrasonore et IRM.

Bénéfices attendus

Il s’agit d’un développement méthodologique qui permettra d’exploiter de manière plus fiable les données d’imagerie cérébrale ultrasonore acquise chez le rat. Plus généralement, l’intégration de cette modalité, qui permet l'enregistrement de l'activité cérébrale chez des animaux anesthésiés mais aussi vigiles, dans des projets exploitant l’imagerie médicale, sera facilitée. La méthodologie de recalage des modalités d’imagerie du cerveau par résonance magnétique (IRM) et ultrasonore (fUS/ULM) sera mise à disposition de tous les utilisateurs de la plateforme, et pourra, le cas échéant, être adaptée à la souris. Enfin une nouvelle classe d’agents de contraste ciblés sera évaluée, ouvrant la voie à une imagerie ultrasonore moléculaire, ce qui constituerait une nouveauté scientifique. A terme, cette technique d’imagerie pourra être utilisée pour l’évaluation de nouveaux agents de contraste ou médicaments à visée humaine.

Procédures

Les animaux seront soumis à une session d’imagerie par résonance magnétique (1 heure au maximum), sous anesthésie générale, avec pose d’un cathéter veineux. Entre 24h et 72h après, ils subiront une chirurgie consistant en un amincissement du crâne, nécessaire pour l’imagerie ultrasonore, qui sera réalisée dans la foulée (3 heures au maximum, pour l’ensemble, sans réveil de l’animal), avec pose d’un cathéter veineux. En outre certains animaux, auront préalablement subi une intervention chirurgicale consistant en une injection intracérébrale, réalisée 24 à 72h avant la première session d’imagerie. Le délai minimal entre chaque session (imagerie ou chirurgie) est de 24h, le délai maximal est porté à 72h pour tenir compte du week-end.

Impact sur les animaux

L'injection intracérébrale peut entraîner une douleur locale ainsi qu’une gêne transitoire susceptible d’affecter temporairement la prise alimentaire. L’induction de l’anesthésie par voie gazeuse peut être source de stress pour les animaux. Il sera nécessaire de poser un cathéter veineux caudal afin d’administrer des produits de contraste, ce qui constitue une source supplémentaire d’inconfort ponctuel. Préalablement à l’acquisition des images en ultrasons, les animaux subiront une chirurgie consistant en un amincissement du crâne, susceptible d’entraîner des douleurs.

Devenir

Mise à mort

Remplacement

Les développements méthodologiques en imagerie cérébrale doivent être réalisés sur des animaux vivants. En effet, seule l’expérimentation in vivo permet de tester et de valider ces approches dans des conditions physiologiques réelles, où interviennent des paramètres tels que la circulation sanguine, la respiration, l’activité cérébrale et les réactions biologiques de l’organisme.

Réduction

Des animaux de réforme pourront être utilisés pour la mise au point des protocoles d’imagerie. Des animaux de même âge et poids seront utilisés pour la construction de l'atlas vasculaire cérébral, et chaque animal sera mis à profit de manière optimale en subissant à la fois un examen d’imagerie IRM et ultrasonore. Ceci limite considérablement la variabilité et donc le nombre total d’animaux nécessaire. Pour l'évaluation de nouveaux agents de contraste "intelligents" ( car ciblant des protéines particulières), des groupes expérimentaux réduits au minimum (3-4 animaux) seront utilisés pour mener une comparaison exploratoire entre les deux modalités d’imagerie.

Raffinement

L’imagerie est réalisée sous anesthésie générale gazeuse. Lors de l’induction de l’anesthesie, une lampe infrarouge est utilisée pour réchauffer la boite et limiter la perte de température corporelle. Les chirurgies sont réalisées sous anesthésie générale gazeuse, avec supplémentation en oxygène, un traitement anti-douleur adapté, une thermorégulation continue, une hydratation sous-cutanée, et un monitoring respiratoire. Les groupes sociaux sont conservés (pas d'isolement en dehors de la période d'anesthésie). Le modèle animal d’inflammation cérébrale locale provoquée par l’injection intracérébrale de lipopolysaccharide (LPS) est utilisé car il est moins invalidant pour les animaux que d’autres modèles inflammatoires aigus (comme ceux mimant un accident vasculaire cérébral ou une sclérose en plaques). De plus les méthodes d’imagerie ciblées apportent une grande sensibilité de détection, ce qui permet de limiter à la fois la quantité de LPS injecté et la durée de suivi longitudinal.

Choix des espèces

Les développements méthodologiques visés utilisent des appareils d’imagerie dédiés aux rongeurs. Le projet est mis en oeuvre chez le rat, pour bénéficier d’une imagerie cérébrale mieux résolue en raison de la plus grosse taille de cerveau en comparaison avec la souris. La méthodologie sera entièrement adaptable chez la souris, si besoin. Les animaux auront entre 6 et 8 semaines (jeunes adultes) : la maturité cérébrale sera atteinte, l’os crânien suffisamment développé et robuste, et le poids suffisant (250-300g) pour la mise en place d’un cathéter veineux caudal pour l’injection des agents de contraste.

Plus petites, dotées d'un cerveau plus petit, les souris double mutantes de ce projet peinent à se déplacer et à communiquer avec le reste de la portée, et leur mortalité augmente vers trois semaines de vie. 942 souris vont être utilisées dans des procédures déclarées d'un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour prélever le cerveau, à des stades allant de l'embryon à vingt jours de vie. Le porteur écrit pourtant qu'elles "ne subiront aucune procédure expérimentale". Tout animal délaissé par sa mère ou sans poche à lait visible pendant vingt-quatre heures est tué, et les collectes s'arrêtent à vingt jours pour devancer la mortalité.

Objectifs

Notre recherche est orientée vers l’étude de la physiopathologie des maladies neuro-développementales d’origine génétique. Des mutations dans de nombreux gènes ont été identifiées chez des patients avec des troubles du neurodéveloppement. Notre objectif est de comprendre le rôle de ces gènes dans les cellules du système nerveux central et les mécanismes physiopathologiques associés à ces maladies. Plusieurs patients avec des troubles du neurodéveloppement présentent une mutation dans le gène d’intérêt. La protéine issue de ce gène (gène 1) forme un complexe avec une autre protéine (encodée par le gène 2). Ce complexe est indispensable au décodage de certains gènes. Notre collaboration avec des généticiens et d’autres équipes de recherche a permis de mettre en avant l’importance du gène d’étude dans le développement du cerveau. La technique utilisée lors de ces précedentes études nous a permis de moduler l’expression dans une partie des cellules de cortex (environ 1%) et de visualiser un défaut de migration. Nous souhaitons à présent moduler cette expression dans toutes les cellules du cortex pour comprendre les mécanismes impliqués dans les troubles du neurodeveloppement. Afin d’avoir toute la population de cellules du cortex à analyser (et non 1% comme les expériences précédentes), nous avons étudié des souris cKO (Knock-Out conditionnel, c’est-à-dire que le gène d’intérêt est absent uniquement dans le cortex des souris) soit pour le gène 1 soit pour le gène 2. Ces souris ne présentent aucune anomalie au niveau du cerveau. Nous souhaitons à présent étudier les souris cKO pour les deux gènes du complexe (perte de l’expression des gènes 1 et 2 simultanément), ici encore en limitant l’excision des gènes au cortex cérébral des souris. Cette étude permettra de comprendre par quels mécanismes moléculaires le complexe influe sur le développement du cortex.

Bénéfices attendus

Notre étude permettra de comprendre la fonction du complexe étudié dans le neurodéveloppement et les mécanismes par lesquels sa déplétion conduit à des troubles du neurodéveloppement, plus précisément au niveau moléculaire.

Procédures

Ils ne subiront aucune procédure expérimentale.

Impact sur les animaux

Les animaux mutants sont plus petits et ont un cerveau plus petit. Ils pourront avoir du mal à se déplacer et à communiquer avec le reste de la portée, notamment dans le cas des études post-natales. Vers 3 semaines après la naissance, les animaux présentent une mortalité qui semble augmentée d’après nos premières données préliminaires. Dans ce projet, nous n’étudions pas les animaux agès de plus de 3 semaines.

Devenir

Tous les animaux sont mis à mort à la fin du projet afin de prélever les cerveaux et de réaliser les analyses sur ceux-ci.

Remplacement

L’utilisation de l’expérimentation animale pour nos travaux est rendue nécessaire par la complexité de l’environnement du cortex cérébral en développement qui ne peut pas totalement être recréé par des approches in vitro. Nous incluons d’ailleurs dans cette étude des méthodes de culture cellulaire, mais qui nécessitent tout de même des embryons « donneurs ». Le développement du cerveau est très bien caractérisé chez la souris, ce qui nous permet de déterminer efficacement les effets de l’altération de gènes sur le développement embryonnaire cortical.

Réduction

Notre projet est composé de trois études dont la première a pour but de déterminer les stades clés pour les études suivantes, afin de limiter le nombre de stades étudiés en détail et de limiter le nombre d’animaux générés. De plus, nous allons combiner les analyses de protéines et d’ARN sur une même portée (1 hémisphère pour chaque étude au lieu du cerveau entier). Nous utilisons les test statistique adaptés afin d’évaluer différents paramètres chez les animaux portant la mutation par rapport aux contrôles (embryons non porteurs de la mutation de la même portée). Nous avons aussi adapté le nombre de portées à analyser en fonction des expériences à réaliser.

Raffinement

Nous prenons en compte avec la plus grande attention le bien être de nos animaux. L’élevage et la reproduction de nos animaux se font dans un environnement contrôlé permettant une réduction du stress pour l’animal, notamment avec l’ajout de nid et de tunnel dans les cages d’hébergement. La mise à mort est faite par du personnel qualifié. Pour les animaux à 3 semaines de vie (21-22 jours après la naissance), bien qu’ils soient plus petits et aient un cerveau plus petit, nous n’avons jusqu’à présent pas détecté de signe de détresse ou de souffrance. Aucun point limite (maigreur, absence de lait maternel dans l’estomac) n’a été constaté dans les premières portées. Nous faisons toutefois nos collectes les plus tardives à 20 jours de vie, avant l’apparition de la mortalité. Nous effectuons le prélèvement pour le génotypage en post-mortem pour éviter une douleur inutile. En post-natal, pour les animaux étudiés le jour de la naissance ou à 6 jours de vie : nous comptons les nouveaux nés à la naissance et nous nous assurons qu’ils sont bien en groupe dans le nid, attestant que la mère s’occupe de tous ses petits. Tout animal délaissé sera euthanasié pour éviter hypothermie et hypoglycémie. 3 fois par semaine, nous apportons une attention particulière aux points limites suivants : i) l’absence de prise alimentaire par observation de la poche à lait : tout animal sans poche à lait visible pendant 24h est euthanasié ; ii) cyanose: les animaux étant glabres jusqu’à 6 jours de vie, nous observons la couleur de la peau : tout animal cyanosé est euthanasié. Entre 6 et 20 jours de vie: Nous surveillons l’attitude de la mère et tout animal délaissé sera euthanasié pour éviter hypothermie et hypoglycémie. L’apparence du pelage des petits est également un bon indice du soin apporté par la mère. Nous avons noté une taille des nouveaux nés double mutants plus petite (mais de corpulence normale, c’est-à-dire qu’ils ne sont pas anomalement maigres), des cerveaux plus petits et des animaux moins vifs. Le point limite étant une perte anormale de poids, les animaux sont pesés 3 fois par semaine. Si une perte de poids ou un état de maigreur est observé, l’animal est euthanasié. Les animaux ne réagissant pas à une stimulation lors de l’ouverture du nid sont euthanasiés.

Choix des espèces

Nous avons choisi la souris pour étudier les gènes impliqués chez des patients souffrant de troubles neurodéveloppementaux. Les étapes du développement du cerveau sont très bien caractérisées chez la souris, ce qui nous permet de voir les effets des mutations dans des gènes impliqués dans les maladies neurodéveloppementales chez l’homme. Cet animal de petite taille avec environ 8 embryons par portée est couramment modifié génétiquement, ce qui nous permet de mimer les mutations observées chez l’homme. De plus la culture de cellules souches neurales et la culture primaire de neurones à partir de cortex murins sont des techniques bien établies au laboratoire. Selon nos études préliminaires, les très jeunes embryons mutants (avant 2/3 de gestation) ne présentent aucune différence avec les embryons sauvages. A la naissance, nous notons une taille légèrement inférieure et juste avant le sevrage, cette taille ainsi que la taille du cerveau, sont très inférieures chez les double cKO. A deux semaines de vie, on observe également une diminution de la taille (corps et tête) chez les animaux avec une seule copie d’un des deux gènes. Nous souhaitons dans un premier temps étudier tous les stades du développement du cerveau afin de déterminer précisement la dynamique d’apparition des phénotypes et d’identifier le timing précis auquel réaliser la caractérisation moléculaire qui permettra de comprendre les mécanismes qui mènent à l’apparition des phénotypes : stades embryonnaires 14.5 jours, 15.5 jours, 16.5 jours et 18.5 jours post-fécondation et stades postnataux jour de la naissance et 6, 14 et 20 jours de vie. Dans les études suivantes, nous étudierons plus en détail uniquement les stades clé.