Procédures modérées

Maintenus autour de 90 % de leur poids pour les motiver, 192 rats sont entraînés une heure par jour, cinq jours sur sept, pendant quatre mois. Vient ensuite une chirurgie d'une heure trente pour implanter des électrodes dans deux régions du cerveau, puis une semaine de récupération, deux semaines de réentraînement et un mois d'enregistrement pendant la tâche, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le porteur qualifie de faible l'impact de la restriction alimentaire sur le bien-être des rats, tout en indiquant qu'elle doit leur laisser "une légère sensation de faim". Tous sont tués à la fin pour que leur cerveau soit analysé.

Objectifs

La perception du temps est essentielle pour planifier et coordonner de manière optimale ses actions et donc adopter un comportement pertinent. Ce projet visera à identifier et étudier les réseaux neuronaux responsables de la planification et du contrôle temporel des actions chez le rat. Sur la base de données récentes, nous faisons l’hypothèse d’un réseau neuronal de trois structures cérébrales qui va requérir, dans un premier temps, une prise d’information temporelle qui sera ensuite évaluée en tant qu’erreur et permettra l’ajustement de la production temporelle. Grâce à l’enregistrement des neurones de ces structures lors d’une tâche comportementale temporelle, nous chercherons à caractériser la signature neuronale d’un tel comportement et des erreurs faites.

Bénéfices attendus

Ce projet apportera une information précieuse sur les réseaux neuronaux impliqués dans la planification et le contrôle temporel des actions. De plus ce projet s’articule dans une recherche transversale plus vaste menée par notre équipe, qui permettra de transposer les résultats obtenus chez le rat, chez l’homme et nous permettra, grâce aux enregistrements neuronaux précis, de guider nos investigations chez l’homme. Outre son intérêt en recherche fondamentale, ce projet devrait aussi fournir des indications précieuses en recherche translationnelle. En effet, chez les personnes avec troubles du spectre autistique (TSA), on observe un déficit d’évaluation des performances temporelles sans altération de la production temporelle. Notre connaissance de ces mécanismes d’évaluation nous permettra ainsi de mieux comprendre les TSA.

Procédures

Dans ce projet, tous les rats seront entraînés à réaliser une tâche comportementale qui nécessite un apport de nourriture contrôlé (4 mois) à raison d’une séance d’une heure par jour au moins 5 jours sur 7 puis subiront une intervention chirurgicale sous anesthésie générale (durée environ 1h30) pour implanter des électrodes dans deux régions d’intérêt. Après une semaine de récupération, ils seront ré-entrainés à la même tâche comportementale (2 semaines) puis enregistrés pendant la réalisation de cette dernière (un mois).

Impact sur les animaux

La tâche comportementale n’est pas stressante en soi, mais nécessite que l’animal ait une certaine motivation pour explorer l’environnement et chercher le renforcement positif (récompense alimentaire). Pour être au plus près du comportement naturel et favoriser la motivation, nous procéderons à une alimentation contrôlée, en donnant la nourriture immédiatement après la séance comportementale en quantité suffisante de façon à ce qu’il n’y ait pas de reste de nourriture le lendemain, mais que l’animal ait une légère sensation de faim garantissant la motivation des animaux à obtenir une récompense alimentaire. Cependant, pour amorcer leur motivation à effectuer la tâche, les animaux seront restreints dans les premiers jours de la tâche comportementales de façon à les maintenir autour de 90% de leur poids. Le poids de l’animal est vérifié quotidiennement juste avant la tâche (donc au moment le plus éloigné de la dernière ration) et la quantité de nourriture est ajustée si le poids descend en dessous de 90% deux jours consécutifs. La nourriture sera ensuite progressivement augmentée de manière à ce que les rats réatteignent leur poids de forme théorique. Cette restriction temporaire est en partie compensée par la nourriture obtenue au cours de la tâche comportementale et impacte très peu leur bien-être. Un autre point de vigilance concerne la chirurgie. La chirurgie d’implantation des électrodes est faite sous antalgique et anesthésie générale, mais présente un risque de diminution du bien-être animal dans les moments/jours qui suivent la chirurgie (inconfort, fatigue et parfois douleur).

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure (pour analyse des cerveaux).

Remplacement

Ce projet de recherche fondamentale s’inscrit dans le champ des Neurosciences comportementales. En effet, l’évaluation comportementale et neurobiologique de la planification temporelle d’actions nécessite l’utilisation d’organismes entiers et vivants. L'utilisation d'animaux dans ce projet est nécessaire car nous ne pouvons pas déterminer les codes neuronaux sous-tendant le comportement sans faire appel à l’implantation d’électrodes qui ne peut se faire chez des sujets humains. De plus, les espèces d'invertébrés n'ont pas la capacité pour les comportements décisionnels étudiés dans ce projet et, à l'heure actuelle, ces comportements n'ont été démontrés que chez les mammifères et les oiseaux. De même, l’approche neurocomputationelle faisant appel à la modélisation est utile, mais complémentaire des approches invasives in vivo permettant de vérifier la véracité des modèles prédictifs. Dans ce contexte il demeure nécessaire d’avoir recours à l’expérimentation animale.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés sera minimisé autant que possible grâce à l’étude de plusieurs paramètres chez le même animal. Nous avons calculé le nombre de rats minimal par groupe pour obtenir des résultats significatifs et exploitables, en tenant compte de la perte de certains animaux (comportement temporel instable, perte à la chirurgie, mauvaise localisation des électrodes). Pour l’ensemble des données, une analyse statistique consistant pour l’essentiel à une analyse de la variance sera effectuée.

Raffinement

Après quelques jours d’acclimatation à leur arrivée dans l’animalerie, les rats sont manipulés et pesés quotidiennement au moins une semaine avant le début de l’entraînement à la tâche comportementale, afin de les habituer à l’expérimentateur et de laisser les rats s’habituer à la quantité contrôlée de nourriture. Pour la procédure chirurgicale, des protocoles appropriés d’analgésie et d’anesthésie seront appliqués. Le suivi postopératoire sera effectué quotidiennement par l’expérimentateur ou les zootechniciens pour s’assurer de la récupération complète des rats. Des points limites associés à des actions sont identifiés pour le cas où les mesures de prises en charge de la douleur et de l’inconfort pouvant résulter de l’étape chirurgicale ne seraient pas suffisantes. Une grille de score (fournie en annexe) sera utilisée pour évaluer la douleur et l’inconfort des animaux notamment pendant le suivi post-opératoire. Concernant la mise à mort, nous utilisons une overdose d’euthanasiant et vérifions que les réflexes sont abolis avant de procéder au prélèvement du cerveau. Nous avons aussi optimisé les équipements comportementaux pour permettre aux animaux porteurs d’implants cérébraux de se mouvoir avec le maximum de confort (mangeoire de haute taille). De plus nous avons dessiné et imprimé à l’imprimante 3D des supports d’implants cérébraux améliorant là aussi le confort des animaux en réduisant les possibilités d’accroches dans l’environnement de test. L’enrichissement des rats implantés est aussi modifiée (maison en carton à la place des tunnels de plastique) pour empêcher les rats de se faire mal en se coinçant l’implant. Nous réduirons au maximum les techniques douloureuses ou stressantes. Chaque animal sera suivi tout au long de l’expérience afin de détecter tout indicateur de souffrance et déterminer si besoin l’arrêt de l’expérimentation en accord avec le SBEA (Structure chargée du Bien Etre des Animaux) et les conseils vétérinaires.

Choix des espèces

D’une façon générale, les rongeurs sont un bon modèle d’étude des circuits neuronaux des processus cognitifs, largement conservés le long du phylum. De plus, de nombreuses épreuves comportementales spécifiques permettent de modéliser chez le rongeur des aptitudes cognitives complexes. Les rats ont été sélectionnés pour ce projet car la littérature sur l’apprentissage temporel, dont nos propres publications, est majoritairement basée sur des études chez le rat, fournissant une base de connaissances solide. Les analyses anatomiques et fonctionnelles dans ces expériences s'appuient sur une richesse de connaissances sur la structure anatomique et la neurochimie du rat. Par ailleurs, le rat est généralement considéré comme ayant des capacités cognitives plus évoluées que la souris et la taille supérieure du rat nous permet de réaliser des interventions plus spécifiques au niveau central. Ce modèle animal est donc le plus approprié à la fois pour les études comportementales et neurobiologiques. Nous utilisons pour ce projet de jeunes adultes âgés de trois mois environ au début des expériences. Des rats jeunes adultes (~3 mois) seront utilisés pour s’assurer que le cortex préfrontal et sa connectivité soient matures dès le début de l’apprentissage de la tâche comportementale.

Une chirurgie du crâne de vingt à quarante-cinq minutes sous anesthésie, pour injecter dans le cerveau : 288 souris vont la subir, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées ensuite pour que leur cerveau soit découpé en coupes. Les animaux sont opérés à trois âges, dont les cinq premiers jours de vie, ce qui implique aussi des femelles gestantes dans le protocole. Le porteur indique que l'incision peut être douloureuse et provoquer, exceptionnellement, une hémorragie cérébrale, une infection ou une déshydratation. Il annonce l'observation du comportement des souris pour repérer des signes proches de l'autisme ou des crises d'épilepsie, sans nommer aucun des tests employés, et fixe l'effectif à 288 sur la seule base d'un "logiciel spécialisé".

Objectifs

Ce projet fait partie d’un programme de recherche plus large qui combine plusieurs approches, allant de l’étude des cellules en laboratoire à l’analyse du comportement. Avant d’utiliser des animaux, de nombreuses expériences ont été réalisées sur des neurones cultivés en laboratoire, afin de réduire au maximum leur utilisation. Cependant, pour comprendre comment le cortex cérébral se forme et comment des neurones qui fonctionnent mal s’intègrent dans un cerveau déjà développé, il est nécessaire d’avoir recours à des animaux, car ces phénomènes ne peuvent pas être reproduits entièrement en laboratoire

Bénéfices attendus

L’objectif de ce projet est de mieux comprendre l’origine de certaines malformations du cerveau qui apparaissent pendant son développement et qui peuvent entraîner, plus tard, des troubles du comportement comme l’autisme ou l’épilepsie. Pour cela, nous utilisons une technique qui permet de désactiver un gène précis dans certains neurones du cerveau d’animaux, à différents moments de leur développement. Ce type de manipulation ne peut pas être réalisé uniquement sur des cellules en laboratoire. Cette approche nous permettra d’étudier le rôle de ce gène dans la formation et le bon fonctionnement des neurones. Par la suite, nous observerons aussi le comportement des animaux pour comprendre comment l’absence de ce gène peut conduire à des signes proches de l’autisme ou à des crises d’épilepsie. À l’heure actuelle, il n’existe pas d’autre méthode permettant d’étudier ces questions sans utiliser d’animaux. À long terme, ce travail apportera des informations importantes pour mieux comprendre comment apparaissent les troubles neurodéveloppementaux. Il aidera également les chercheurs à développer des outils plus précis pour étudier l’autisme et l’épilepsie, par exemple en repérant des marqueurs biologiques qui pourraient permettre de mieux évaluer les risques ou de suivre l’évolution de ces pathologies.

Procédures

Une seule procédure chirurgicale réalisée sous anesthésie d'une durée de 20 à 45 minutes maximum.

Impact sur les animaux

Pour accéder aux structures du cerveau des souris, nous devons recourir à la chirurgie. Cette chirurgie peut être douloureuse au niveau de la tête (zone incisée), induire exceptionnellement une hémorragie cérébrale, une douleur post-opératoire, une infection, une baisse de température des souris ainsi qu’une déshydratation des yeux et de l'animal.

Devenir

Les résultats attendus de ce projet nécessitent de réaliser des analyses histologiques ou électrophysiologiques sur des coupes de cerveaux. Les animaux seront donc mis à mort à l'issue de l'unique procédure de ce projet.

Remplacement

Ce projet s’intègre dans un projet plus global combinant différents travaux de recherche complémentaires allant de l’étude biochimique ou électrophysiologique au comportement. De nombreuses études « in-vitro » ont donc été effectuées au laboratoire sur des neurones en culture en amont de l’utilisation d’animaux pour limiter au maximum leur utilisation. Néanmoins, l'étude de la formation du cortex cérébral et l'intégration des neurones dysfonctionnels dans un réseau de neurones matures nécessite l'utilisation d'animaux.

Réduction

Pour réduire le nombre de femelles gestantes utilisées, nous avons choisi de n’utiliser qu’un groupe d’animaux contrôle pour nos deux études. Le nombre minimal d’animaux par groupe a été estimé grâce à un logiciel spécialisé.

Raffinement

Pour limiter au maximum la douleur et la souffrance des animaux, plusieurs mesures de bien-être sont mises en place. Les jeunes souris de moins de 3 semaines restent avec leur mère dans une cage contenant du matériel pour faire un nid. À partir de 3 semaines, les mâles et les femelles sont séparés et placées en petits groupes dans des cages possédant tous les matériaux nécessaires pour qu’ils puissent se cacher et construire un nid. Les animaux sont observés chaque jour par l’expérimentateur et/ou le personnel animalier. Leur comportement, leur état général, leur capacité à manger ainsi que l’état de leur pelage sont vérifiés. Toute anomalie est immédiatement notée dans un registre en ligne accessible aux personnes responsables du bien-être animal, ce qui permet une réaction rapide si nécessaire. Un échange quotidien entre le personnel animalier et l’expérimentateur garantit une prise de décision rapide en cas de problème. Pendant la chirurgie, les souris sont placées sous anesthésie générale et reçoivent un traitement antidouleur avant et après l’intervention. Après l’opération, elles sont surveillées deux fois par jour pendant 72 heures, y compris le week-end. L’équipe vérifie alors que la plaie cicatrise correctement, que l’animal mange bien, reste vif et, pour les adultes, qu’il est capable de reconstruire son nid. Si un signe anormal apparaît, une personne en charge du bien-être animal examine immédiatement l’animal et décide des mesures à prendre, en lien avec le vétérinaire référent. Si malgré ces mesures l’état de l’animal ne s’améliore pas, une mise à mort sera pratiquée de façon rapide et sans douleur, selon les méthodes autorisées. Cette décision est prise par le porteur du projet en accord avec la vétérinaire, ou directement par la vétérinaire si l’instructeur n’est pas disponible.

Choix des espèces

Nous avons choisi d’utiliser la souris car son cerveau présente des similitudes importantes avec celui de l’être humain, ce qui permet d’étudier plus efficacement le développement cérébral. De plus, la majorité de nos expériences en laboratoire ont déjà été réalisées sur des neurones de souris, et notre équipe maîtrise bien les techniques chirurgicales nécessaires chez cet animal. Dans ce projet, nous étudierons trois périodes clés du développement du cerveau : juste après la naissance (entre 0 et 5 jours), pendant la croissance (entre 14 et 21 jours) et à l’âge adulte.

Pour savoir où le SARS-CoV-2 se cache dans l'organisme après la guérison apparente, 12 macaques à longue queue vont être infectés puis tués, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal subit environ quarante-cinq anesthésies générales, quarante-cinq prélèvements de sang, trente écouvillonnages du nez et de la trachée, vingt lavages broncho-alvéolaires, dix ponctions de moelle osseuse et huit retraits de ganglions lymphatiques. Le porteur annonce aussi deux injections de molécules qui imitent une infection bactérienne, destinées à réveiller le virus "endormi", et décrit fièvre, douleurs musculaires, anémie et saignements de nez parmi les suites attendues. La surveillance repose sur une grille de score déjà employée dans le service, les animaux étant tués en fin de projet pour analyser moelle osseuse, ganglions, rate et intestin.

Objectifs

Le Covid long touche environ une personne sur dix après une infection par le virus responsable du Covid-19, le SARS-CoV-2. Il entraîne des symptômes qui persistent plusieurs mois après la guérison initiale, comme une grande fatigue, des troubles de la mémoire ou encore des douleurs multiples (thoraciques, musculaire ou articulaire, céphalées…etc). Les causes précises de ce syndrome restent encore mal comprises. Plusieurs pistes sont étudiées : une inflammation prolongée, un dérèglement du système immunitaire, des déséquilibres hormonaux ou encore la présence persistante du virus dans l’organisme. Pour mieux comprendre ces mécanismes, nous utilisons un modèle animal primate, le macaque cynomolgus, dont les réponses à l’infection à SARS-Cov-2 sont proches de celles de l’humain. Ce modèle permet d’étudier en détail l’évolution de l’infection sur le long terme. Grâce à lui, il a été découvert que le virus, même s’il n’est plus détecté par les tests tels que les écouvillons nasaux, peut rester caché pendant 6 à 18 mois dans les poumons dans certaines cellules immunitaires, les macrophages. Nous avons aussi observé que certaines cellules du système immunitaire, les cellules NK (pour “natural killer”), peuvent s’adapter pour mieux combattre ce virus caché. Une sous-population particulière de ces cellules, les “NK adaptatives”, semble jouer un rôle clé dans le contrôle de l’infection persistante. Ce projet de recherche se poursuit aujourd’hui autour de trois grandes questions : 1/ Où le virus se cache-t-il à long terme ? Nous voulons savoir si les macrophages des poumons sont les seuls refuges du virus, ou si d’autres cellules, dans d’autres organes comme l’intestin, peuvent aussi l’héberger durablement. 2/ Quel est le rôle du système immunitaire ? Nous étudierons si l’état du système immunitaire au moment de l’infection influence la capacité à éliminer le virus. Nous chercherons aussi à comprendre comment les cellules NK adaptatives se développent et agissent. 3/Le virus peut-il se réveiller ? Enfin, nous testerons si ce virus "endormi" peut se réactiver plus tard, par exemple en cas d’infection bactérienne, et provoquer de nouveaux symptômes. Ces recherches visent à mieux diagnostiquer le Covid long et à poser les bases pour développer, à terme, un traitement curatif.

Bénéfices attendus

Une des hypothèses avancées pour le Covid long est que le virus pourrait persister discrètement dans l’organisme, sans être complètement éliminé par le système immunitaire. Dans ce projet de recherche, l’objectif est de mieux comprendre où et comment le virus peut rester caché dans le corps. Les cellules et tissus jouant un rôle de “réservoirs” viraux – comme les poumons, l’intestin, les ganglions lymphatiques ou la moelle osseuse – seront identifiés et étudiés. Leur nombre, leur activité anti-virale et leur évolution dans le temps seront analysées. Une attention particulière sera portée aux macrophages des poumons et aux cellules NK, capables d’éliminer les cellules infectées. On s’intéressera aussi aux facteurs immunitaires (c’est-à-dire l’ensemble des réactions et des cellules de nos défenses naturelles qui permettent de combattre une infection) et aux facteurs épigénétiques (c’est-à-dire les mécanismes qui modifient l’activité de nos gènes sans changer l’ADN) qui peuvent influencer la capacité du corps à éliminer durablement le virus. Pour cela, nous utiliserons un modèle animal primate, le macaque cynomolgus. Grâce à lui, après une infection par le SARS, la dynamique du virus peut être observée dans plusieurs organes et sur une longue période, ce qui ne peut être réalisé chez l’humain. Nous testerons une approche innovante qui consiste à injecter une molécule modulatrice de la réponse immunitaire qui imite une infection bactérienne. L’objectif est de vérifier si, dans ces conditions, le virus encore présent dans l’organisme mais « endormi » peut se réactiver, sans qu’il y ait réellement de nouvelle infection. Plusieurs avancées sont attendues grâce à ce projet : • Une meilleure compréhension de la persistance virale, des mécanismes d’échappement au système immunitaire, et des conditions de réactivation du virus. • La mise en évidence du rôle des cellules NK dites "adaptatives" dans le contrôle de l’infection à long terme. • L’identification de nouvelles cibles thérapeutiques pour développer des antiviraux ou des immunothérapies. • La détection de marqueurs sanguins utiles au diagnostic du Covid long et à la sélection des patients pour de futurs essais cliniques. Ce projet permettra une avancée majeure dans la compréhension et la prise en charge du Covid long, tout en enrichissant les connaissances scientifiques sur les infections chroniques et l’immunité.

Procédures

Les interventions seront réalisées sous anesthésie générale (45 fois environ, 30 minutes, tous les animaux) et seront regroupés pour limiter les anesthésies. Les différentes interventions dans ce projet sont : - Infection par le virus SARS-CoV-2 (une fois, 15 min, tous les animaux, - Injection de molécules modulatrices de la réponse immunitaire (deux fois environ, 5 min, tous les animaux) - Prélèvements de sang (45 fois environ, 5 min, tous les animaux) - Prélèvement de moelle osseuse (10 fois environ, 10 minutes, tous les animaux) - Retrait de ganglions lymphatiques périphériques (8 fois environ, 20 minutes, tous les animaux) - Ecouvillonnages nasaux et trachéaux (30 fois environ, 2 minutes, tous les animaux) - Lavage broncho-alvéolaire (20 fois environ, 20 minutes, tous les animaux)

Impact sur les animaux

Plusieurs nuisances ou effets indésirables peuvent survenir selon le type d’intervention : Nuisances suite à l’infection : Symptômes respiratoires (pneumonie légère à modérée, difficultés respiratoires transitoires, toux légère), fièvre et comportement de fatigue, anorexie transitoire ou diminution de l’appétit avec plus ou moins des pertes de poids mineures, déshydratation. Ces symptômes se résolvent spontanément dans les deux premières semaines qui suivent l’infection. Nuisances suite à l’injection de molécules modulatrices de la réponse immunitaire : Fièvre et comportement de fatigue, douleurs musculaires (tremblements, difficultés locomotrices), anorexie transitoire ou diminution de l’appétit, déshydratation, activation de la réponse immunitaire. Nuisances suite aux prélèvements de sang, moelle osseuse, et anesthésies répétées : Diminution de l’appétit avec plus ou moins des pertes de poids mineures, anémie transitoire (légère à modérée), hématome au niveau du site du prélèvement, infection cutanée dans les jours qui suivent le prélèvement. Nuisances suite aux lavages bronchoalvéoaires: Toux, difficultés respiratoires légère juste après le geste. Nuisances suite aux écouvillons nasotracheaux: Saignement nasal (léger à modéré). Nuisances suite à l’hébergement individuel : L’hébergement en individuel peut entrainer un stress. Après infection et pendant environ 4 semaines, ils seront hébergés en modules individuels permettant des interactions sociales pour limiter la surinfection virale. Nuisances possibles suite à l’exérèse de ganglions : Réaction locale au site d’incision : gonflement, suintement de la plaie rare, durée de 1 à 5 jours.

Devenir

Les animaux seront euthanasiés en fin de projet afin de pouvoir analyser tous les organes où sont activées les NK et macrophages (moelle osseuse, ganglions lymphatiques, rate, intestin…)

Remplacement

Pour mieux comprendre comment le virus du Covid-19 (SARS-CoV-2) peut rester présent dans l’organisme sur le long terme, il est essentiel d’étudier ce phénomène dans un organisme vivant. Les expériences faites uniquement sur des cellules isolées, ne permettent pas de reproduire la complexité d’un corps entier. Elles ne reflètent pas non plus le comportement réel des cellules dans leur environnement naturel. C’est pourquoi des études sont menées sur des modèles animaux. Le macaque est l’un des plus adaptés pour ce type de recherche, car il est très proche de l’humain sur le plan biologique. Il possède les mêmes récepteurs cellulaires d’entrée pour le virus), ce qui permet au SARS-CoV-2 d’infecter ses organes de manière similaire à ce qui est observé chez l’humain, qu’il s’agissent des poumons, des intestins, des ganglions lymphatiques ou encore de la moelle osseuse. Grâce à ce modèle, la persistance du virus, l’emplacement de ses réservoirs dans l’organisme et l’évolution des réponses immunitaires peuvent être étudiés dans la durée. De plus, des prélèvements peuvent être réalisés dans différents organes, ce qui n’est pas possible chez l’humain.

Réduction

Le nombre d’animaux est réduit au minimum nécessaire à une analyse statistique fiable des résultats par des tests adaptés aux petits échantillons. L’élaboration et l’analyse des résultats de cette étude est réalisée en collaboration avec une équipe de Bioinformatique et Biostatistique. Les tissus prélevés à l’euthanasie seront mis à disposition pour d’autres études.

Raffinement

Anesthésies/ Toutes les interventions et les prélèvements seront réalisées sous anesthésie générale pour éviter d’éventuelles douleurs. Si possible, les prélèvements seront groupés lors d’une seule et même anesthésie. Si des troubles alimentaires apparaissent suite aux anesthésies répétées, une diversification/complémentation alimentaire sera instaurée. Prélèvements / Ils consistent en des prélèvements de sang, de moelle osseuse et des exérèses de ganglions périphériques. Les volumes de sang et de moelle osseuse prélevés seront réduits au minimum. Si des réactions locales apparaissent, un traitement symptomatique pourra être instauré. Exposition au virus / Après exposition aux virus SARS-CoV2, une grille de score sera utilisée pour le suivi de l’infection chez l’animal. Elles ont déjà été établies et utilisées au sein de notre département et assure un bon suivi de l’état de santé des animaux après infection et permet d’alerter les vétérinaires en cas de besoin. Administration des molécules modulatrices de la réponse immunitaire / Si des réactions locales apparaissent suite à l’administration des modulateur, une désinfection et une analgésie locale pourront être appliquées sur décision du vétérinaire. Hébergement individuel / Les animaux sains seront hébergés en groupe sauf avis contraire des vétérinaires ; les animaux infectés seront hébergés en modules individuels permettant des interactions sociales avec un enrichissement augmenté (distribution 2 fois/semaine d’enrichissements destructibles ou sachet surprise au lieu d’1 pour les hébergements en groupe). Cet hébergement individuel est nécessaire pour limiter la surexposition virale. Suite à l’exposition et une fois la production virale terminée (4 semaines maximum), ils seront remis en groupe sociaux. Observations Les animaux seront observés quotidiennement. Des points limites sont prévus et le vétérinaire de l’installation sera alerté en cas d’apparition de signes cliniques inattendus afin d’adapter le suivi et les soins aux animaux.

Choix des espèces

Pour mieux comprendre comment le virus du Covid-19 (SARS-CoV-2) peut rester dans le corps après une infection, nous utilisons un modèle animal proche de l’humain : le macaque cynomolgus. Ce primate partage de nombreuses caractéristiques biologiques avec l’être humain, notamment les récepteurs que le virus utilise pour entrer dans les cellules. Cela signifie que l’infection se développe chez ce modèle animal de manière très similaire à ce qui est observé chez l’humain, en touchant notamment les poumons, les intestins, les ganglions lymphatiques et la moelle osseuse. Ce modèle permet de suivre l’infection sur le long terme, dans des conditions très contrôlées : nous pouvons choisir précisément la dose de virus administrée et simuler certaines maladies associées (comorbidités), par l’injection de molécules modulatrices de la reponse immunitaire, comme cela se produit chez certains patients humains. Des prélèvements réguliers dans différents organes (sang, ganglions, moelle osseuse) sont possibles sur plusieurs mois, ce qui permet d’observer l’évolution du virus, d’identifier ses "cachettes" dans le corps (appelées réservoirs) et de mieux comprendre les réactions du système immunitaire dans le temps. Ce modèle permet aussi d’étudier le sang pour y repérer des signes spécifiques (biomarqueurs) de la présence du virus dans les différents organes. Ces informations pourraient ensuite être utilisées pour améliorer le diagnostic du Covid long chez l’humain, sans devoir effectuer de prélèvements invasifs. Les recherches se concentrent uniquement sur des modèles animaux adultes. En effet, leur système immunitaire est déjà totalement développé, ce qui permet d’obtenir des résultats plus fiables et comparables à ceux d’adultes humains. Cela aide à mieux comprendre les mécanismes de défense qui fonctionnent — ou échouent — face au virus, et pourquoi il peut parfois persister longtemps dans l’organisme. En résumé, le modèle macaque cynomolgus adulte est aujourd’hui l’un des plus pertinents pour faire progresser la recherche sur la persistance du SARS-CoV-2 et mieux prendre en charge les personnes souffrant de Covid long.

Tuées pour que leur cerveau soit découpé en tranches et observé au microscope, 4 330 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ce volet du projet porte sur une chirurgie d'injection virale de trente minutes à une heure et une implantation d'une à deux heures par animal. Suivent quatre semaines d'électrophysiologie, à raison de deux séances d'une heure par jour au maximum, la tête maintenue immobile, pour observer comment le cortex traite les informations captées par les vibrisses. Le porteur affirme qu'aucun modèle in vitro ou in silico ne peut convenir, le cerveau devant rester "intact" et l'animal éveillé au moment précis de l'attention.

Objectifs

Ce projet cherche à comprendre comment le cerveau perçoit le toucher et localise les objets dans l’espace. Pour cela, nous utilisons les vibrisses très sensibles des souris, qui leur servent à explorer leur environnement, comme nos mains. Nous pensons que certaines zones du cerveau intègrent différentes informations pour adapter la perception tactile selon la situation. Pour tester cette idée, nous observerons l’activité des neurones grâce à l’imagerie et à des enregistrements électriques chez des souris entraînées à effectuer des tâches tactiles. Nous utiliserons aussi des techniques pour activer ou désactiver certains neurones de manière ciblée. Ces recherches pourraient aider à mieux comprendre et traiter certains troubles sensoriels, comme ceux observés dans l’autisme ou chez les personnes amputées. Le projet se déroule dans deux EU.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra une compréhension approfondie des mécanismes cellulaires et des circuits corticaux impliqués dans la perception tactile. Il visera à identifier les contributions spécifiques de différentes populations neuronales — excitatrices, inhibitrices et cholinergiques — ainsi que des systèmes neuromodulateurs dans le traitement de l’information sensorielle. L’étude mettra en évidence la manière dont le cortex somatosensoriel adapte ses calculs en fonction du contexte et des exigences de la tâche, tout en apportant de nouvelles connaissances sur la maturation des circuits corticaux durant les premiers jours de vie. Ceci représentera des nouvelles pistes pour comprendre les hallucinations tactiles : Par exemple, les sensations fantômes chez les amputés ou certains troubles de la perception dans la schizophrénie. Ciblage de circuits spécifiques pour la neuromodulation : À terme, cela pourrait appuyer le développement de traitements personnalisés par stimulation cérébrale ou thérapies ciblées

Procédures

EU1/2 Procédure chirurgicale pour injection de virus : Fréquence: 1 chirurgie par animal, durée: entre 30min et 1H, - procédure chirurgicale avec implantation : Fréquence: 1 chirurgie par animal, durée: entre 1H et 2H EU2/2 Électrophysiologie in vivo sur animal 1H pendant 4 semaines (2 sessions maximum par jour par animal)

Impact sur les animaux

Le stress sera limité avec une habituation progressive à l'expérimentateur. Toutes les procédures ont été régulièrement utilisées en laboratoire. Les expérimentateurs auront une solide expérience dans l'exécution des procédures. Les effets indésirables attendus sur les animaux comprennent: 1/ un risque de douleur durant la chirurgie et douleur aiguë lié à la récupération post-chirurgie implantatoire, ce risque est compensé par l’analgésie. 2/ un risque d'infection lié aux chirurgies et aux implants 3/ un risque de stress à court terme induit par notre paradigme expérimental de tête restreinte

Devenir

Mise à mort pour prélèvement et réalisation de tranches aigues pour l'electrophysiologie ou pour la microscopie

Remplacement

Ce projet vise à comprendre les mécanismes qui sous-tendent une fonction cognitive complexe : l’attention tactile. Le cerveau doit donc être intact pour que les connections entre les différentes aires cérébrales soient maintenues et que nous puissions étudier leur interactions réciproques. De plus, nous étudions les mécanismes neuronaux qui sont engagés au moment précis de l’attention. Le projet ne peut donc se faire que sur des animaux vivants éveillés. Cependant, la tâche comportementale est totalement non douloureuse et non stressante, et la chirurgie sera réalisée sur des souris anesthésiées dont le niveau de souffrance est contrôlé pharmacologiquement. La souris est une espèce de choix pour étudier le système nerveux central des vertébrés, qui fournit des informations largement transférables à l'homme. Par conséquent, aucun des modèles in vitro ou in silico ne peut être utilisé ici

Réduction

La solidité de nos hypothèses de travail vérifiées par nos études précédentes, le caractère innovant des méthodes utilisées (imagerie chronique), ainsi que la qualité de la mise en oeuvre des procédures (basée sur une expertise reconnue de l'expérimentateur) permettront de réduire significativement le nombre d'animaux. Le nombre d'animaux a été déterminé par une approche statistique appropriée

Raffinement

Le bien-être des animaux sera pris en compte tout au long du projet : logement sur des racks ventilés, dans des cages adaptées, enrichissement de l'environnement (matériel de nidification et tunnels) et points limites adaptés pour éliminer ou réduire toute douleur. Nous utilisons des anesthésiques et analgésiques adaptés aux procédures de chirurgie. L'expérimentateur a une forte expérience pour toutes les procédures proposées.

Choix des espèces

La souris est une espèce de choix pour les études sur le système nerveux central des Vertébrés. L’organisation du système central de cette espèce est assez proche de celle de l’homme, ce qui permet une extrapolation des résultats obtenus chez cette espèce à l’espèce humaine pour mieux comprendre les mécanismes cellulaires à l'échelle comportementale. Les propriétés du néocortex de la souris ont de nombreuses similitudes avec le néocortex des autres mammifères, y compris les humains. Cela rend les enseignements tirés de l'étude des tissus de la souris largement transférables à l’homme. Les injections de virus seront réalisées sur des animaux de 0 semaine à 6 mois. Le reste des procédures expérimentales sera réalisé sur des animaux de de plus de 5 semaines ce qui correspond chez cette espèce à l’âge adulte où l’animal est en pleine capacité d’apprentissage. Leur poids et leur taille sont stabilisés, et la taille du cerveau est homogène garantissant ainsi une bonne reproductibilité des sites d'injection et/ou d’implantation.

Pour comparer des molécules biosourcées à un traitement de référence contre l'obésité, 200 souris mâles sont rendues obèses par un régime gras pendant dix à quinze semaines, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, et toutes tuées à l'issue. Chacune subit treize prélèvements de sang obtenus en coupant un millimètre du bout de sa queue, neuf à quinze injections sous la peau, et des gavages de solution sucrée qui peuvent irriter la gorge. S'y ajoutent six privations d'eau de six heures, trente-six heures au total, et des isolements de quatre heures deux fois par semaine pour mesurer leurs préférences alimentaires. L'enjeu déclaré est de retenir l'une des deux molécules candidates pour la production pharmaceutique et le passage aux essais cliniques.

Objectifs

Des études montrent que l’obésité modifie le goût et augmente la préférence pour les graisses alimentaires. Pour y remédier, des composés d’origine naturelle ont été synthétisés pour diminuer la consommation des graisses alimentaires et augmenter la satiété. L’objectif de cette étude est de comparer l’effet des composés synthétisés à partir d’un ingrédient d’origine naturelle à un traitement de référence contre l’obésité sur la gestion de l’alimentation et du poids. Elle vise également à fournir des données comparatives entre différents molécules biosourcées. Les principaux buts de l’étude sont : 1. Évaluer l’impact des molécules biosourcées sur les préférences alimentaires chez des souris. 2. Comparer l’effet des molécules biosourcées à celui du traitement de référence et voir si leur combinaison aide à maintenir une perte de poids durable chez des souris obèses. 3. Vérifier si les molécules biosourcées peuvent prévenir la reprise de poids après l’arrêt d’un traitement contre l’obésité.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de comparer des molécules biosourcées par rapport à un traitement existant et de les évaluer en tant que traitement adjuvant ou d’entretien dans la gestion du poids. Nous évaluerons également des molécules biosourcées B et C et validerons l’un d’eux (B ou C) pour la production pharmaceutique et la réalisation des études cliniques.

Procédures

Les souris sous régime (obésogène ou standard), seront pesées hebdomadairement et subiront : - une mesure de glycémie toutes les deux semaines pendant 10-15 semaines (prélèvement d’une goutte de sang environ : technique de mesure peu invasive nécessitant une simple contention pendant 1 minute), - un isolement ainsi qu’une privation d’eau pendant 6 heures avant chaque test de préférence entre deux choix, à raison de 3 tests par semaine pendant 2 semaines (soit 6 périodes de restriction hydrique, totalisant 36 heures). Une privation d’eau de 6 heures sera également appliquée avant la réalisation du test pour mesurer leur réaction au sucre (test de tolérance au glucose). Pour la mesure du taux de sucre dans le sang, chaque souris subira 5 à 8 prélèvements. Les souris seront soumises à un test de tolérance au sucre impliquant une brève contention pour l’administration du sucre par gavage, suivie de cinq prélèvements sanguins de faible volume réalisés au niveau de la queue sous anesthésie locale. Un prélèvement sanguin d’un volume important sera réalisé sous anesthésie générale juste avant la mise à mort (elle aussi réalisée sous anesthésie générale). Après le décès de l’animal, certains de ses organes seront prélevés.

Impact sur les animaux

- Les souris recevront une alimentation pouvant les rendre obèse (grosse) et provoquer un certain inconfort. Mais cette période ne durera que le temps nécessaire pour voir si les substances testées fonctionnent, soit entre 10 et 15 semaines (incluant 2 semaines sans subir aucun protocole pour s’habituer à leur nouvel environnement et entre 8 et 13 semaines de test). Cela permet de limiter au maximum les effets désagréables pour les souris. - Les souris peuvent ressentir un peu de stress à cause de certaines manipulations. Par exemple, elles peuvent recevoir entre 9 et 15 petites piqûres sous la peau, ou plusieurs petites prises de sang au niveau de la queue : entre 5 et 8 pour mesurer le sucre dans le sang, et 5 autres pendant un test de tolérance au sucre (pour voir comment leur corps réagit au sucre) qui dure 2 heures. Elles peuvent aussi être mises seules dans une cage pendant 4 heures, deux fois par semaine, pendant 2 semaines, pour un test sur leurs préférences alimentaires. - Pour faire les tests, on doit prélever un peu de sang aux souris, environ la taille d’une petite goutte. Pour cela, on coupe un petit bout du bout de leur queue, à peine un millimètre, ce qui peut leur faire un peu mal et parfois provoquer une petite infection, mais c’est surveillé de près. Au total, chaque souris aura 13 prises de sang : 8 pour suivre l'apparition du diabète, faites toutes les deux semaines, et 5 autres pendant un test pour voir comment leur corps réagit au sucre. - Les administrations par la bouche de solution sucrée induisent un stress chez les animaux et sont susceptibles de provoquer une irritation au niveau de la gorge.

Devenir

À la fin de l’expérience, les animaux seront mis à mort pour pouvoir prélever des tissus et des organes nécessaires aux analyses scientifiques. Ces examens, notamment ceux qui regardent les cellules et les organes au microscope, ne peuvent pas se faire sur un animal vivant. La mise à mort est faite sous anesthésie générale pour que les animaux ne ressentent ni douleur ni stress.

Remplacement

L’obésité est une maladie qui touche plusieurs parties du corps en même temps et qui modifie la façon dont l’organisme utilise les graisses, les sucres et contrôle l’appétit. Pour comprendre tous ces changements, il faut les étudier dans un corps vivant, car ils dépendent de la communication entre les organes. Ainsi, les modèles cellulaires ne peuvent pas entièrement remplacer l’utilisation d’animaux vivants pour cette étude. En effet, bien que des résultats aient été obtenus sur des cellules en laboratoire, cela ne suffit pas pour comprendre les réactions complexes du corps, comme la manière dont il perçoit les saveurs et réagit à ce qu’il mange. C’est pourquoi on a besoin d’étudier ces effets chez des animaux vivants.

Réduction

En utilisant des cellules en laboratoire (in vitro), on a pu faire une partie des tests sans animaux. Cela nous permettra d’en utiliser moins pour comprendre comment les substances agissent dans le corps. 3. Le nombre d’animaux utilisé dans cette étude a été réduit au minimum tout en permettant d’obtenir des résultats scientifiques fiables. Après estimation, 8 souris par groupe sont nécessaires. Pour tenir compte de possibles effets du transport sur leur comportement, 2 souris supplémentaires sont ajoutées, soit un total de 10 animaux par groupe.

Raffinement

• Prise en charge et environnement : • Les souris seront hébergées en groupes dans des conditions habituelles de l’animalerie. Le calme sera maintenu dans la pièce, et les animaux seront surveillés lors des pesées (2 fois par semaine) ; • Du matériel d’enrichissement (pour la construction de nids) sera fourni en continu, avec un accès permanent à la nourriture et à l’eau ; • Pour réduire le stress lié aux manipulations, les souris seront habituées à la contention (par tunnel ou dans le creux des mains) quelques jours avant les expérimentations. • Gestion de la douleur : Pour limiter toute douleur ou souffrance, Les souris seront surveillées de près par l’équipe de recherche. Cela permettra d'intervenir rapidement en cas de problème et de garantir le bien-être des souris. Lors des tests pour mesurer le sucre dans le sang, une crème anesthésiante sera appliquée sur la queue des souris quelques minutes avant la petite coupure nécessaire pour prélever le sang. La zone sera aussi nettoyée avant et après avec un produit désinfectant. Le matériel utilisé sera désinfecté à chaque fois. Pour réduire l’inconfort et le stress lors de l’administration des substances par la bouche, des sondes souples et adaptées à la taille des souris seront utilisées. L’animal sera maintenu seulement quelques secondes, et l’expérimentateur est formé pour faire cette manipulation de façon douce et rapide. Pour assurer une hygiène optimale lors des interventions : • Le personnel portera une blouse jetable propre et des gants désinfectés à l’alcool 70 % ; • Les surfaces de travail seront nettoyées, un champ stérile sera utilisé, et les instruments seront stérilisés ; • La zone d’incision sera tondue et la peau désinfectée avant toute intervention. Des points limites adaptés seront également mis en place .

Choix des espèces

Du point de vue scientifique, la souris reste le modèle de choix dans l’étude de l’obésité car c’est un modèle qui est assez documenté, conduisant à l’apparition de syndrome métabolique comme chez l’homme. De même, la durée d’induction de l’obésité à partir de 8 semaines chez la souris est relativement courte, ce qui permet la création des groupes expérimentaux dans des délais raisonnables. D’un point de vue technique, la disponibilité des outils (Anticorps, kits de dosage etc …) contribue au choix de modèle de souris. Des souris mâles adultes âgées de 22 semaines seront utilisées dans cette étude. Certaines auront été rendues obèses en recevant une alimentation très grasse pendant plusieurs semaines. Pour évaluer leur état corporel, on utilise une méthode appelée Body Condition Score (BCS), qui donne une note de 1 à 5 (maigre à obèse) selon la quantité de graisse et de muscle. Cette estimation est faite en touchant doucement leur dos et leurs côtes. On utilise aussi un appareil de mesure spécialisé (appelé EchoMRI) pour avoir une estimation précise de la masse graisseuse. À la fin de l’étude, les animaux auront environ 37 semaines, un âge permettant d’observer les effets d’un régime riche en graisses sur le fonctionnement du corps à un stade avancé de leur développement.

Opérées en moins de vingt minutes sous anesthésie gazeuse, injectées jusqu'à cinq jours de suite, transférées d'un établissement à l'autre pour une lymphographie suivie de leur mise à mort, 1 050 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Presque toutes sont des femelles, le lipœdème ne touchant que les femmes. Le porteur cherche à étendre au lymphœdème primaire et au lipœdème une thérapie déjà développée pour le lymphœdème secondaire, qui doit passer en clinique en fin d'année. Pour ces 1 050 souris, la description des atteintes tient en une phrase, la formation de l'œdème, la chirurgie, l'imagerie et les injections provoquant des douleurs modérées et un léger stress.

Objectifs

Le lymphœdème est une pathologie chronique résultant d’une accumulation massive de lymphe et de tissu adipeux dans un membre. Il existe deux sortes de lymphœdème : primaire et secondaire. Le lymphœdème primaire est d’origine héréditaire, lié à des mutations génétiques. Plus de 30 gènes ont été identifiés comme étant associés au lymphœdème primaire. Le lymphœdème secondaire survient à la suite d’une lésion du système lymphatique, souvent après une chirurgie, une radiothérapie ou une infection. Bien que cette maladie affecte 250 millions de patients, il n’y a à ce jour aucun traitement disponible. Notre équipe a développé une thérapie pour le traitement du lymphœdème secondaire qui passera en clinique en fin d’année. Notre objectif est maintenant d’évaluer son efficacité sur le lymphœdème primaire. Environ 30 mutations génétiques ont été identifiées comme responsables du lymphœdème primaire. Nous nous concentrerons sur les mutations les plus fréquentes. Dans un deuxième temps, nous allons étendre l’application de la thérapie au lipœdème. Le lymphœdème et le lipœdème sont des affections distinctes, mais partagent plusieurs caractéristiques cliniques communes. Tous deux se caractérisent par un gonflement persistant des membres, affectant généralement les membres inférieurs. Il est important de noter que le lipœdème ne touche que les femmes et qu’il n’existe à ce jour aucune thérapie curative. Le projet se déroule dans deux Établissements Utilisateurs.

Bénéfices attendus

À ce jour, il n’existe aucune thérapie curative pour le lymphœdème primaire et le lipœdème. Cette étude permettra d’évaluer la possibilité d’étendre l’application de l’Apernavec au traitement de ces pathologies. Le lymphœdème primaire étant causé par différentes mutations, évaluer l’efficacité sur plusieurs d'entre elles permettra un champ d’application de la thérapie plus large.

Procédures

Dans l’EU 1/2, les animaux seront soumis à des injections en vigile ou sous anesthésie gazeuse qui auront une durée maximale de 2 minutes chacune. Les injections vigiles pourront être ponctuelles ou sur une semaine à raison de 1 injection par jour (soit 5 jours d’injections au total), chaque injection ne durera pas plus d’une minute. Les injections sous anesthésie seront au maximum de 2 tout au long du projet pour chaque animal. Ils pourront être aussi soumis à une intervention chirurgicale d'une durée inférieure à 20 minutes sous anesthésie gazeuse. Une analyse de la composition corporelle serait faite par imagerie et aura une durée maximale de 6 minutes. Dans l’EU 2/2, les animaux recevront une injection intrapéritonéale d’anesthésie en vue d’une lymphographie ainsi que la mise à mort.

Impact sur les animaux

La formation d’œdème, la chirurgie, le minispec ainsi que les injections vont engendrer des douleurs modérées et un léger stress sur l'animal.

Devenir

A l'issue de chaque procédure, certains animaux seront envoyés dans l’EU 2/2. Tous les animaux de la procédure seront mis à mort afin de prélever les organes nécessaires au projet.

Remplacement

Bien qu’il n’existe pas de modèle in vitro ou in silico reproduisant fidèlement la réponse immunitaire et tissulaire à une injection intradermique de l’Apernavec ainsi que des lentivecteurs codant pour les mutations, une phase préliminaire a été conduite sur des cultures cellulaires (kératinocytes et fibroblastes murins) pour évaluer la transduction et la cytotoxicité, limitant ainsi le recours aux animaux. Le choix s’est orienté vers l’espèce animale car il n’existe pas de modèle in vitro ou in silico reproduisant les paramètres physiologiques de la pathologie (réponse immunitaire, inflammation, formation d’œdème) nécessaires à la bonne évaluation de l’efficacité de l’Apernavec. Ces données permettront une étude plus fiable.

Réduction

Afin de réduire le nombre d'animaux utilisés dans le cadre de ce projet, nous utiliserons en grande majorité uniquement les femelles car ces pathologies touchent essentiellement les femmes. De plus, le nombre d'animaux utilises par groupe est réduit à son minimum sans compromettre les objectifs du projet. Le nombre de souris a été calculé par une analyse statistique rigoureuse afin de garantir la significativité des résultats tout en minimisant le nombre d’animaux utilisés. Les groupes expérimentaux sont restreints au strict nécessaire. Un lot contrôle (vecteur vide) est inclus afin d’évaluer l’effet de l’administration du vecteur indépendamment du gène muté qu’il contient. Toute mutation n'induisant pas d'effet pas d'effet pathologique ne sera pas retenue pour les tests d'efficacité de la thérapie afin de réduire le nombre d’animaux utilisés.

Raffinement

Les animaux sont placés en pièce d'acclimatation lors de leur arrivée à la zootechnie. Ils sont pris en charge par du personnel de la zootechnie compétent qui vérifie leur état et place de l'enrichissement (carre de coton, carton) dans les cages pour amoindrir le stress du transport et permettre aux animaux de faire un nid. Les animaux issus de différents cartons de transport ne sont jamais mélangés lors de la répartition dans les cages d'hébergement. Les animaux seront hébergés en cage de 4 ou 5 et seront acclimatés pendant une période de 5 jours avant de commencer tout protocole. Tout au long du protocole, le bien-être de l’animal est bien pris en compte avec enrichissement du milieu et les souris seront surveillées quotidiennement selon les directives européennes relatives à l'hébergement des animaux de laboratoire. De plus, pour chaque procédure chirurgicale, les souris sont maintenues sur des tapis chauffant et les conditions d’anesthésie générale avec analgésique sont réalisées pour une meilleure prise en compte de la douleur. L’injection est réalisée sous anesthésie afin de réduire la douleur. Toute souffrance anormale entraînera une euthanasie immédiate. Les techniques d’injection et de manipulation sont assurées par du personnel expérimenté afin de limiter le stress. Enfin, pour un meilleur raffinement, les souris à euthanasier seront placées dans une salle isolée du reste des souris et les manipulations post-euthanasies seront réalisées dans une troisième pièce. Les animaux seront transportés entre les deux établissements suivant une procédure de transport déclarée lors de l’agrément de l’établissement (cheminement et conditions de transport validés par signature d’une charte de transport).

Choix des espèces

Le choix de l’espèce s’est orienté vers la souris car les précédentes études menées sur l’Apernavec dans le lymphœdème secondaire ont été réalisées sur ces dernières. De plus, des lignées sur le même fond génétique précédemment établies dans l’équipe seront aussi utilisées pour les études sur le lipœdème en raison de leur pertinence scientifique. Le lymphœdème primaire et le lipœdème se caractérisent par une accumulation de tissus adipeux fibrotique dans les membres touchés. Ainsi, le modèle utilisé doit posséder un tissu adipeux suffisamment développé. Le choix s’est alors orienté vers des souris âgées de 10 à 12 semaines pour le lymphœdème primaire et de 5 à 12 semaines pour le lipœdème.

517 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, aucune ne se réveillant des actes chirurgicaux qu'elle subit. Chacune reçoit trois à quatre injections, dont certaines peuvent blesser l'œil ou provoquer des saignements internes, passe une heure sous anesthésie et subit une chirurgie de dix minutes, avant que le bout de sa queue soit sectionné pour mesurer son temps de saignement. Il s'agit d'évaluer un candidat antiplaquettaire associé aux traitements de référence, dont le porteur espère qu'il conservera leur efficacité en réduisant les hémorragies chez des millions de patients. Il écrit que ce traitement "n'augmente pas le risque de saignement", et décrit dans le même document une chirurgie et une section de la queue pouvant entraîner un saignement non contrôlé voire la mort de l'animal.

Objectifs

En France, les pathologies cardiovasculaires représentent la première cause de mortalité (environ 38% des décès) devant les cancers. Les complications majeures sont l’infarctus du myocarde et les accidents vasculaires cérébraux (AVC). Actuellement il existe plusieurs traitements de référence permettant de faire diminuer les risques. Toutefois, la prise de ces différents traitements comporte un risque majeur de saignement. Au vu de ce constat, il est aujourd’hui essentiel de découvrir de nouvelles approches thérapeutiques dirigées contre des cibles originales impliquées dans ces processus. Des travaux récents ont permis de découvrir une cible majeure à l’origine de pathologies cardiovasculaires. Cette cible est impliquée dans l'activation des plaquettes sanguines. Des résultats obtenus au sein du laboratoire ont permis de démontrer que l’association de ce traitement avec un médicament fluidifiant le sang permettait de renforcer l’action de cette molécule sur des plaquettes humaines. Les objectifs de ce projet sont d'évaluer ce potentiel traitement en combinaison, ou non, avec des traitements de référence afin de comparer leurs efficacités et déterminer la stratégie de combinaison la plus pertinente associée à un risque de saignement réduit. La réalisation de ce projet permettra de confirmer la pertinence de la stratégie thérapeutique associée à ce nouveau traitement et de déterminer les avantages d'une telle combinaison par rapport aux traitements de référence.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus de ce projet sont la conservation de l'efficacité des traitements de référence lorsque combinés avec notre traitement tout en diminuant leurs effets indésirables. Comme décrit précédemment, les traitements de référence existant actuellement sur le marché s’accompagnent généralement d’un risque accru de saignement. Notre traitement n’augmente pas le risque de saignement. Le bénéfice attendu de ce projet est une diminution du saignement après administration des traitements combinés par rapport à l'administration des traitements de référence seuls. Ce traitement pourrait donc entraîner un réel bénéfice clinique pour des millions de patients traités pour des pathologies cardiovasculaires. La réalisation de ce projet permettra de valider les résultats obtenus précédemment.

Procédures

Pour toutes les souris : Anesthésie (2 fois, temps maximal total : 1h) ; Injections (3 à 4 fois, temps maximal par injection : 30 secondes sur une durée totale de 3 à 4h) ; Procédure chirurgicale (1 fois, temps maximal : 10 minutes).

Impact sur les animaux

Les effets indésirables peuvent être un stress physique ou thermique de courte durée et une douleur de courte durée à l’endroit des injections. Les injections peuvent en particulier générer des blessures au niveau de l’œil ou des saignements internes. La chirurgie peut aussi comporter un risque de saignement non contrôlé voire de mort de l’animal. La section de la queue peut entraîner une douleur et un risque de saignement non contrôlé.

Devenir

Les actes chirurgicaux induits par la procédure sur les animaux ne permettent pas le réveil des animaux. À la fin de l’expérimentation, l’ensemble des animaux sera mis à mort. Les animaux seront toujours sous anesthésie afin de garantir une mort sans douleur.

Remplacement

Ce projet s’inscrit dans la continuité d’une étude réalisée précédemment. Ce modèle permettra de renforcer les preuves d’efficacité déjà obtenues. Il s’agit de plus d’un modèle bien caractérisé au sein du laboratoire, son utilisation est ainsi pertinente afin d’évaluer la combinaison avec des traitements de référence. De plus, les pathologies cardiovasculaires sont des phénomènes complexes et multifactoriels qui nécessitent l'utilisation de modèles animaux ne pouvant pas être modélisés ou reproduits.

Réduction

Le nombre d’animaux nécessaires a été calculé de manière à réduire au maximum la quantité d’animaux tout en permettant une interprétation fiable des résultats basée sur des analyses statistiques adaptées. Notons de plus que certaines expériences ne seront pas conduites si les expériences précédentes ne permettent pas d’obtenir des résultats concluants. Le bénéfice éventuel lié au traitement ou aux combinaisons de traitements sera évalué par la mise en évidence du maintien de l'efficacité des traitements d’une part et d'une diminution significative des effets indésirables, d’autre part, chez les animaux traités en combinaison par rapport aux animaux traités avec les traitements de référence. L'effet des traitements sur ces deux critères sera analysé avec des tests statistiques adaptés.

Raffinement

Une observation quotidienne des souris sera réalisée afin de garantir leur bien-être et détecter d’éventuels signes de douleur ou de stress. L’utilisation d’anesthésiques et d'antidouleurs (kétamine/xylazine) permettra de prévenir et/ou traiter toute douleur éventuelle. Un gel protecteur sera de plus utilisé lors des injections. Une attention particulière sera portée à l’observation des critères limites fixés tout au long du projet afin d’éviter toute souffrance non soulagée par les soins apportés, auquel cas l’animal sera euthanasié. Un soin sera apporté aux conditions d’hébergement permettant de limiter le stress (enrichissement du milieu de vie, respect de leur vie en groupe, surveillance quotidienne). Au cours de l’anesthésie, les signes vitaux seront surveillés avec une attention particulière portée à la respiration et au rythme cardiaque avec un maintien de la température corporelle grâce à une lampe chauffante et une plaque thermorégulée. Afin de limiter toute souffrance, dans le cas de dommages irréversibles dus à l’anesthésie, l’animal sera immédiatement euthanasié (l’animal sera, par conséquent, éliminé des études statistiques d’analyse du protocole). L’ensemble des animaux sera euthanasié à la fin du protocole.

Choix des espèces

L'espèce animale choisie est la souris (Mus musculus). Il s'agit du modèle de référence pour l'étude de processus cardiovasculaires. Par ailleurs, l'animalerie est agréée pour l’espèce souris. Dans le but de se placer dans des conditions expérimentales les plus représentatives de la réalité physiologique, les souris seront utilisées à l’âge de 8 semaines, ce qui correspond à un stade adulte (jusqu’à environ 1 an chez la souris).

Les souris utilisées appartiennent à une lignée qui développe spontanément une maladie auto-immune détruisant les glandes salivaires et lacrymales, et sont réparties par âge, à 4, 12 et 20 semaines, pour couvrir les stades de la maladie. 960 d'entre elles vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour analyse. Chacune subit une biopsie du bout de la queue, un tatouage d'identification, un prélèvement de sang à la veine faciale que le porteur décrit lui-même comme modérément douloureux, et jusqu'à six injections. La contrepartie annoncée tient en une phrase, de nouveaux outils thérapeutiques pour une maladie sans remède, et le dimensionnement des groupes en une autre, une "étude statistique adaptée" dont rien n'est précisé.

Objectifs

Nous étudions une maladie auto-immune chronique caractérisée par la destruction des glandes exocrines. Environ 0,5% de la population totale est atteinte et souffre de sécheresse buccale et oculaire et jusqu'à présent, il n'y a pas de remède pour celle maladie. Cela amène à la nécessité d'explorer d'autres domaines dans la compréhension de la maladie. Le rôle des molécules antimicrobiennes émerge dans le domaine de l'auto-immunité. Ces molécules constituent un groupe de petites molécules largement exprimés pour la défense contre les micro-organismes. Des études récentes révèlent que ces molécules régulent également les réponses immunitaires. Les molécules anti-microbiennes sont très exprimées dans les glandes salivaires. Notre objectif général est de déterminer le rôle de molécules anti-microbiennes dans les glandes exocrines lors du développement de l'auto-immunité dans un modèle murin.

Bénéfices attendus

Notre projet fournira de nouveaux outils thérapeutiques pour prévenir ou guérir un syndrome auto-immun.

Procédures

* Biopsie extrême pointe de la queue : 1 fois par animal, 2-3 secondes. * Prélèvement de sang : une fois par animal,, 2-3 secondes. * Injection : entre 1 et 6 injections, 2-3 secondes.

Impact sur les animaux

- Biopsie pointe de la queue (douleur légère de quelques secondes), -Tatouage d'identification (douleur légère de quelques secondes), -Injections (douleur légère de quelques secondes), Prélèvement sang à la veine faciale (douleur modérée de quelques secondes).

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort pour analyse.

Remplacement

Pour étudier la physiopathologie des maladies auto-immunes, seuls les modèles in vivo sont capables de refléter la complexité de ces maladies et notamment les interactions entre le microbiote intestinal, le système immunitaire et le tissu cible. Mise en place d’une veille bibliographique pour éviter toute répétition d’expérimentation bien menée sur les plans scientifiques et méthodologiques.

Réduction

Les groupes ont été dimensionnés par une étude statistique adaptée.

Raffinement

-nombre d’individus par cage : un nombre suffisant sera défini pour préserver leurs interactions sociales et limiter les phénomènes de stress engendrés par une surpopulation; Stratégies d’enrichissement pour assouvir leur besoin ludique (blocs de cotons); Surveillance de leur bien-être quotidien par le personnel de l’animalerie; Selon le plan d’action défini, par les expérimentateurs : Détermination de points limites précoces pour réduire la sévérité des procédures au maximum tout en préservant l’analyse scientifique.Tout animal qui aura une valeur totale comprise entre 1 et 3 dans les différents points limites recevra un analgésique (Ketoprofen, dose 5mg/kg, volume 0,012ml/g; SC).

Choix des espèces

Nous avons choisi la souris en raison de ces similarités génétiques et physiologiques proches de l'homme, ainsi que la facilité avec laquelle son génome peut être manipulé et analysé. De plus il existe des modèles bien établis de maladies auto-immunes. Les souris NOR seront de 3 âges différents (4, 12, 20 semaines) correspondant aux différents stades de développement de la maladie. Les souris C57BL/6 Tcfcp2L1-Cre-ERT X Slpi-flox seront utilisées à l'âge adulte >8 semaines.