Procédures modérées

Tous tués en fin de protocole pour analyse des tissus, 30 cochons miniatures vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une première chirurgie d'une heure leur coupe la continuité digestive et leur pose un anus artificiel, une seconde intervention rétablit le passage par voie endoscopique deux semaines plus tard, et une à trois anesthésies supplémentaires suivent pour retirer la prothèse et examiner le rectum. Chaque intervention est précédée d'une mise à jeun, le porteur reconnaissant que la faim et l'angoisse précèdent les deux opérations. La première phase chirurgicale sert aussi à former des internes en chirurgie, ce que le porteur inscrit à sa rubrique réduction puisqu'aucun animal supplémentaire n'y est consacré.

Objectifs

Environ 4000 patients sont opérés annuellement en France d’une intervention de Hartmann, dont 80% par chirurgie ouverte (laparotomie), souvent dans le cadre de l’urgence, pour diverses pathologies entraînant une lésion du côlon . Cette intervention consiste à reséquer la partie du côlon gauche lésée. Le rectum est ensuite refermé (et reste en place dans l’abdomen), et le côlon en partie haute est extériorisée en extracorporel via une stomie permettant l’évacuation des selles. Cette intervention est généralement réalisée dans le cas où les risques de complications sont trop importants pour réaliser dès la première chirurgie la connexion entre le côlon et le rectum (anastomose). La stomie ainsi réalisée est théoriquement temporaire et le rétablissement de la continuité digestive se fait dans un second temps qui va néanmoins nécessiter une nouvelle opération en chirurgie ouverte le plus souvent. Cependant, compte tenu de la fragilité des patients, et des risques propres à une deuxième chirurgie pour le rétablissement de continuité, moins d’un patient sur deux sera à terme candidat à cette nouvelle chirurgie, avec des risques supplémentaires. L'objectif de notre étude est de développer une méthode non invasive de rétablissement de la continuité colorectale à l'aide d'une procédure endoscopique innovante.

Bénéfices attendus

Il s’agit d’une étude pilote in vivo sur modèle expérimental animal portant sur la faisabilité́ d’une nouvelle technique mini-invasive. Les perspectives sont l’établissement d’un protocole standardisé de la réalisation endoscopique d'anastomose colorectale, et l’évaluation du devenir des anastomoses colorectales confectionnées endoscopiquement après retrait de la prothèse d’apposition luminale. Les impacts attendus et les perspectives sont multiples : il s’agit en priorité de pouvoir proposer, après réalisation d’une expérimentation prospective chez l’homme en cas de succès, à des patients contre-indiqués au rétablissement de continuité chirurgicale, une prise en charge moins invasive, et de limiter le risque de réintervention pour sténose ou fistule anastomotique. Une évaluation du devenir des anastomoses après retrait des prothèses d’apposition luminale paraît indispensable, l’objectif à terme étant de proposer un rétablissement mini-invasif à des patients opérés d’une intervention de Hartmann, y compris en dehors de toute situation carcinologique ou palliative. La participation d’internes dans la première phase, permettra également d’améliorer leur formation et leur préparation aux situations réelles.

Procédures

Les animaux auront tous 2 anesthésies générales avec mise à jeun des aliments solides dans les heures qui précédent : une première procédure chirurgicale destinée à interrompre la continuité digestive et à créer la stomie ("anus artificiel") (durée environ 1 heure). La seconde intervention, deux semaines après la première, est le traitement par voie endoscopique, d’une durée de 40 minutes environ. Les animaux auront ensuite de une à 3 interventions supplémentaires non invasives, sous courte anesthésie générale, d’une durée inférieure à 30 minutes, pour l’ablation de la prothèse et la rectoscopie (examen endoscopique du rectum). La mise à mort sera réalisée en fin de projet, sous anesthésie générale préalable.

Impact sur les animaux

Du stress et de l’angoisse peuvent être présents en amont des deux interventions chirurgicales (J0 et J14), faites sous anesthésie générale : ces deux interventions sont considérées comme des procédures à degré de sévérité modérée car de la douleur peut être ressentie par les animaux à l’issue des procédures. Les procédures de contrôle endoscopique sont considérées comme des procédures à degré de sévérité légère. Une mise à jeun des solides au matin de la procédure est nécessaire pour les deux interventions de J0 et J14. De la faim peut donc être ressentie avant les interventions chirurgicales (J0 et J14) mais la boisson est autorisée ad libidum. La reprise de l’alimentation est autorisée le jour-même en l’absence d’élément évocateur de complication. Aucune mise à jeun n’est nécessaire pour les contrôles endoscopiques sous sédation simple.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort en fin de procédure à des fins d'analyses des tissus traités pour rétablir la continuité digestive.

Remplacement

Il s’agit d’une nouvelle procédure au stade de recherche pré-clinique, n’ayant pas été réalisée chez l’Homme et ne pouvant être envisagée en l’absence d’étude de faisabilité sur modèle animal. Les simulateurs virtuels et mécaniques (Phantômes) ont démontré leur efficacité pour réduire l’utilisation du modèle animal dans l’apprentissage de l’écho-endoscopie diagnostique et de la ponction sous écho-endoscopie. Les modèles ex-vivo ont démontré leur utilité pour l’apprentissage du drainage des collections pancréatiques en suturant sur les faces postérieure et antérieure de l’estomac des morceaux d’intestin de porc remplies de gel d’échographie. Des modèles de simulation (virtuel, mécanique ou sur organe isolé) existent pour apprendre la technique de pose des prothèses utilisées dans ce projet. Néanmois, à l’heure actuelle, aucun modèle existant permet de remplacer le modèle animal vivant anesthésié. Effectivement, aucun modèle ex-vivo ne permet de reproduire le péristaltisme digestif, ni les conditions post opératoires après intervention de Hartmann. S’agissant d’une étude de faisabilité d’anastomoses, du tissu vivant est indispensable pour permettre une cicatrisation et évaluer la survenue de sténoses anastomotiques. L’objectif étant l’étude de la faisabilité de cette procédure, cela nécessite un suivi dans le temps, et ainsi l’utilisation d’un modèle animal est indispensable.

Réduction

Le nombre d’animaux maximum étudié a été fixé à 30 pour notre étude, s’agissant du nombre d’animaux nécessaire pour explorer les différents délais avant retrait des prothèses d’apposition luminale, tout en évitant les biais liés à la variabilité individuelle. Cet effectif est suffisant pour apporter des conclusions et permettre de détecter d’éventuelles complications associées à la réalisation des procédures et au suivi à long terme des effets de la procédure. Ces 30 animaux sont répartis en plusieurs lots de 4 à 5 animaux stables, permettant un étalement des procédures et une adaptation progressive en cas de difficultés techniques ou de complications. Il n’existe à ce jour pas d’étude dans la littérature s’intéressant à notre sujet de recherche, ce qui ne permet pas de réaliser un calcul d’effectif ou de nombre de sujets nécessaires. La participation d’internes de chirurgie en fin de cursus sous la surveillance d’un chirurgien sénior, pendant la première phase chirurgicale, permettra la formation chirurgicale aux techniques précédemment évoquées sur un modèle vivant utilisé en formation, et ce, sans utilisation d’animaux supplémentaires. Le projet d’étude présenté prévoit également l’utilisation de dispositifs innovants visant à améliorer l’efficacité de l’intervention par le rapprochement du colon et du rectum. Apporter la preuve de l’efficacité de ces dispositifs lors de cette étude dispenserait également de la réalisation d’une nouvelle étude animale.

Raffinement

Les animaux seront hébergés dans le respect du bien-être animal. Les animaux seront gardés pendant une période d’acclimatation de 5 jours minimum entre leur entrée dans l’animalerie et leur première entrée en procédure. Ils seront suivis quotidiennement et leur état de santé sera évalué tout au long du protocole expérimental. Leur environnement sera enrichi (ballon, jouets divers) pour leur permettre d’exprimer un spectre plus large de comportements normaux. Dans la mesure du possible, les animaux seront hébergés par groupes stables afin de favoriser les interactions. Les protocoles chirurgicaux se feront sous anesthésie générale et analgésie. L’analgésie pourra accompagner l’animal en post-opératoire pour éviter toute souffrance inutile.

Choix des espèces

L’anatomie du tube digestif du porc est connue pour être particulièrement proche de celle de l’anatomie humaine et constitue le modèle de référence pour la formation et la recherche en endoscopie digestive depuis de nombreuses années. La taille de l’animal permet d’utiliser les mêmes dispositifs (endoscopes, prothèses) que ceux disponibles en pratique clinique humaine. Nous projetons d’utiliser des mini-pigs pour limiter l’impact de la croissance post-opératoire, et faciliter le suivi au long cours ainsi que les diverses manipulations (retrait de la prothèse, scanner, contrôle endoscopique) Les animaux doivent être sevrés et peser plus de 15 kg permettant l’utilisation du même matériel que chez l’humain adulte (qui est utilisé chez l’enfant de plus de 15 kg).

Provoquer un accident vasculaire cérébral pour étudier deux récepteurs des plaquettes sanguines mobilise 696 souris, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal subit une chirurgie pouvant durer deux heures sous anesthésie générale, une IRM de trente minutes à une heure vingt-quatre puis soixante-douze heures après l'AVC, enfin une laparotomie et une perfusion intracardiaque. Le porteur décrit des saignements, un œdème après ouverture du crâne, une activité réduite voire une prostration, des paupières fermées et des mouvements de rotation pendant les trois jours suivant l'opération. Toutes sont mises à mort, le développement d'un AVC n'étant selon lui "pas compatible avec un maintien en vie de la souris".

Objectifs

Les plaquettes sanguines jouent un rôle central dans l’arrêt du saignement en s’accumulant au niveau d’une lésion du vaisseau. Un processus similaire intervient dans la thrombose artérielle dans un vaisseau malade présentant une plaque d’athérosclérose. Suite à la rupture de la plaque, les plaquettes s’accumulent et forment un caillot qui bloque la circulation du sang pouvant entraîner des accidents vasculaires cérébraux (AVC). A l’heure actuelle, il n’y a qu’un seul traitement de l’AVC qui permet de détruire le caillot, combiné ou non à une approche de retrait mécanique du caillot. Ces deux approches doivent être utilisées rapidement après l’apparition des 1er symptômes chez le patient (4h30 pour le traitement et 6h pour le retrait mécanique), ce qui limite fortement le nombre de patients traités. Les antiplaquettaires ne sont pas utilisés dans le traitement de l’AVC car ils augmentent fortement le risque de saignement. Ce projet comprend trois axes d’étude - Axe 1 : caractériser deux modèles d’AVC et confirmer que les plaquettes sont bien impliquées dans le mécanisme de l’AVC. L’ajout de 2 nouvelles lignées de souris, modifiant ainsi le nombre d’animaux, nécessite une modification du projet initial. - Axe 2 : étudier le rôle d’un 1er récepteur plaquettaire dans la restauration du flux sanguin après un AVC. Nous utiliserons des souris génétiquement modifiées qui ne présentent pas ce récepteur pour voir l’impact sur la restauration du flux sanguin. Nous utiliserons également des souris qui présentent ce récepteur dans sa forme humaine pour étudier l’effet d’un traitement ciblant ce récepteur sur la restauration du flux sanguin. Nous utiliserons des souris déficientes pour deux protéines se fixant au récepteur : la fibrine et le fibrinogène ; et nous allons générer des souris avec ce récepteur humain et déficientes pour la fibrine ou le fibrinogène afin d’évaluer s’il y a un impact de l’interaction protéine – récepteur sur la restauration du flux sanguin. - Axe 3 : étudier le rôle d’un 2e récepteur plaquettaire dans la restauration du flux sanguin dans l’AVC. Nous utiliserons 2 agents ciblant la forme humaine de ce récepteur. Pour cela, nous utiliserons des souris présentant la forme humaine du récepteur car nous disposons d’anticorps anti-humaine. Le projet se déroule sur 2 établissements utilisateurs différents (EU1 et EU2).

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus de ce projet portent sur l’accident vasculaire cérébral (AVC). On pourrait mettre en évidence une réduction des séquelles lors de l’absence du récepteur ou lors d’un traitement ciblant l’un des 2 récepteurs étudiés, sans trop augmenter le saignement. Ce qui ouvrira des perspectives pour de nouvelles indications et de nouveaux essais cliniques. L’obtention de tels résultats pourrait déboucher à long terme sur une amélioration de la prise en charge des patients présentant un AVC et, de ce fait, à une réduction des séquelles à long terme de cette pathologie.

Procédures

Les animaux seront soumis à des injections en bolus ou en perfusion de 30 min (animal anesthésié) (EU1). Les modèles nécessitent des procédures chirurgicales (EU1), celles-ci seront de maximum 120 min et réalisées sous anesthésie générale. Des IRM (EU2) de 30 min à 1h seront réalisés 24 et 72h après avoir induit l’AVC. Une seule chirurgie et une seule IRM seront effectuées sur les animaux. Une laparotomie et une perfusion intra-cardiaque (animal anesthésié) seront réalisées pour permettre une analyse histologie de l’AVC. Ces gestes seront réalisés sur une durée de 20 min (EU1).

Impact sur les animaux

Pour toutes les procédures, une des complications attendues est un impact de l’anesthésie sur le rythme respiratoire (irrégulier ou apnée) ainsi que le risque de saignement au site d’incision ou au site chirurgical. Des saignements ainsi qu’un œdème pourraient être observé suite à la craniotomie. De manière plus spécifique, les souris peuvent avoir des signes cliniques neurologiques pendant les 72h qui suivent l’intervention chirurgicale : modification du comportement (activité réduite, voire prostration), de l’apparence physique (apparence des poils, paupières fermées), de la prise alimentaire et de la motricité (rotation), même si les premiers tests sur ces modèles semblent indiquer que les signes cliniques sont modérés. Des signes de douleur peuvent également apparaitre après l’intervention chirurgicale. Les traitements antiplaquettaires pourraient conduire à des saignements au niveau des plaies chirurgicales. Durant l’imagerie IRM, l’anesthésie pourrait avoir un impact sur le rythme respiratoire (irrégulier ou apnée).

Devenir

A la fin des procédures, tous les animaux sont mis à mort car le développement d’un AVC n’est pas compatible avec un maintien en vie de la souris. Des tissus seront prélevés pour des analyses ultérieures.

Remplacement

L’AVC impliquant un processus particulièrement complexe faisant intervenir plusieurs types cellulaires ainsi que les conditions de circulation du sang (vaisseau, pression artérielle, flux sanguin), il est impossible de substituer la souris par des modèles in vitro. Cependant, tous les traitements utilisés dans cette étude sont soit déjà utilisé en clinique, en essai clinique ou ont été préalablement testés dans des modèles in vitro afin de valider leur effet antithrombotique.

Réduction

Le projet se fera par étapes, comme indiqué dans le déroulé du projet. Le nombre d’animaux utilisés lors de cette étude est réduit au minimum, ce nombre étant fixé à 12 souris/groupe pour l’obtention de résultats statistiquement significatifs.

Raffinement

Une période d’acclimatation de 2 semaines entre l’arrivée des souris à l’animalerie et leur utilisation sera respectée. Aucun geste n’est réalisé sur animal vigile, nous n’avons donc pas prévu d’habituation. Le stress et la douleur de tous les animaux utilisés dans ce projet seront diminués au minimum: • Par l’hébergement dans des cages en fonction des groupes expérimentaux au moins 7 jours avant l’expérimentation. Ces cages seront munies de particules de bois et enrichies avec des carrés de cellulose, bâtonnets de coton, frisure de papier, ce qui leur permet d’organiser leur environnement selon leurs besoins. • Par une habituation au gel nutritif avant l’opération • Par une anesthésie de l’animal avant et pendant la durée de l’opération • Par l’installation de l’animal sur une plaque chauffante afin de lutter contre l’hypothermie pendant la chirurgie. • Par l’injection d’analgésique avant chaque procédure • Par application de gel protecteur sur les yeux lors de l’anesthésie et par injection de sérum physiologique avant la procédure chirurgicale pour assurer l’hydratation de l’animal. • Pendant toutes les expérimentations, les animaux sont surveillés par du personnel entrainé pour vérifier l’absence de signe de douleur grâce à des points limites spécifiques établis pour chaque procédure. Ces points limites permettront de soustraire l’animal aux procédures expérimentales et ainsi limiter sa souffrance et son inconfort. • L’animal est acheminé par nos soins dans une boîte de transport équipée de litière et d’aliment hydraté dans le laboratoire où se trouve l’IRM afin d’y effectuer un examen IRM. Du coton et de la frisure seront rajoutés dans la cage de transport.

Choix des espèces

Chez la souris, les modèles in vivo sont largement répandus et maitrisés, notamment les modèles d’accident vasculaire cérébral (AVC). De plus, les techniques de modifications génétiques ont permis d’obtenir des souris déficientes pour un récepteur plaquettaire, sans fibrinogène ou incapable de former de la fibrine, tout comme des souris exprimant 2 récepteurs humains distincts. Ces souris nous permettent donc d’évaluer le rôle de ces récepteurs/protéines dans la restauration du flux sanguin dans l’AVC afin de mieux comprendre les mécanismes, mais aussi de tester de nouveaux traitements ciblant ces récepteurs humains. Les souris seront utilisées au stade adulte entre 2 et 6 mois. Cet âge correspond à la période utilisant des souris pubères et ne présentant pas encore de vieillissement. Il n’y aura pas d’effet lié à l’âge.

Anesthésiés puis incisés trois fois dans le dos, 8 rats mâles reçoivent deux membranes de biomatériau de cinq millimètres de côté, la troisième incision étant refermée sans implant pour servir de témoin. Ils passent les vingt-quatre heures suivantes isolés, puis un mois sous observation, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le porteur juge le risque de réaction inflammatoire douloureuse "très limité" du fait des essais in vitro préalables, alors que l'étude a précisément pour objet de mesurer l'inflammation produite par ces implants. Il conclut que les étapes de validation chez l'animal ne peuvent pas être "totalement remplacées" avant le passage à l'humain, et tous les rats sont tués au bout du mois pour prélever les implants et les tissus alentour.

Objectifs

A la suite de traumatismes ou d’opérations au niveau du cerveau, la dure-mère (partie localisée entre le crâne et le cerveau) peut être endommagée. Lorsque cela arrive, des substituts artificiels de remplacement, créés en laboratoire, peuvent être implantés pour remplacer les zones où la dure-mère est lésée. Ces derniers sont cependant responsables de nombreux effets secondaires (infection, douleurs, fuite de liquide en provenance du cerveau …), qui affectent la récupération des patients. Notre équipe travaille donc au développement de nouveaux substituts, dont la composition est très proche de celle de la dure-mère naturelle, dans le but de limiter ces effets indésirables. Les études menées en laboratoire à partir de cultures cellulaires montrent que deux des substituts que nous avons créés pourraient être compatibles avec un usage chez le patient. Le travail que nous proposons aujourd’hui vise à faire une première évaluation de la compatibilité de ces matériaux dans un organisme entier. Pour cela, les deux substituts seront implantés sous la peau de 8 rats et nous analyserons l’inflammation et le devenir de ces substituts 1 mois après leur implantation. Si les résultats sont concluants, de nouvelles études plus sensibles seront envisagées, avec implantation des substituts au niveau crânien, après un retrait de la dure-mère.

Bénéfices attendus

Ces implantations permettront de confirmer une réponse biologique positive après implantations peu invasives (sous la peau) des substituts candidats et d’envisager ainsi la suite des étapes pré-cliniques avec un risque de complication réduit au minimum, ou bien de mettre à jour des effets indésirables non anticipés suite aux campagnes d’évaluation et de caractérisation in vitro, permettant alors une amélioration des substituts ou l’arrêt du projet sans recourir à plus d'animaux. A long terme, ce projet doit permettre d’améliorer le parcours de santé des patients ayant subi un intervention sur la dure-mère (baisse du risque de complication, donc baisse des coûts et hausse du bien-être des patients).

Procédures

Suite à une période d’acclimatation, chaque individu recevra sous analgésie et anesthésie générale les deux biomatériaux candidats en implantation sous-cutanée sur le dos. Les biomatériaux se présentent sous la forme de membranes carrés de 5 mm de côté et de moins d’1 mm d’épaisseur. Une troisième incision sera réalisée puis suturée sans insertion de biomatériau comme auto-contrôle. Les animaux seront maintenus en observation quotidienne pendant 1 mois puis euthanasiés après analgésie et anesthésie pour réaliser l’analyse des tissus et le devenir des biomatériaux.

Impact sur les animaux

La réalisation de l’incision suivie d’une suture entraine un faible risque d’infection indépendant du biomatériau implanté. L’anesthésie et la manipulation liées à la chirurgie peuvent entrainer du stress, tout comme l’isolement temporaire post-chirurgie (24 heures). La chirurgie elle-même entraine une douleur locale à chaque site d’implantation, qui sera prise en charge pendant et après la procédure par des analgésiques cutanés. La littérature indique pour les sutures cutanées une disparition de la douleur dans les 24h. L’implantation du biomatériau peut engendrer une réaction inflammatoire à l’origine de douleurs locales, mais ce risque est jugé très limité du fait de la caractérisation in vitro de la cytocompatibilité effectuée en amont et de la littérature sur les matériaux utilisés.

Devenir

Les animaux devront être mis à mort à la fin de la procédure pour prélever les implants et les tissus environnants, les analyser et pouvoir ainsi remplir les objectifs scientifiques de l'étude.

Remplacement

Nous cherchons à développer des biomatériaux pour soigner la dure-mère chez l'homme, des étapes de validation chez l’animal ne peuvent pas être totalement remplacées pour évaluer précisément leur comportement après implantation et leurs conséquences sur l'organisme entier, avant de passer aux études cliniques. Une importante phase d’évaluation in vitro a cependant précédé l’étude présentée ici afin de réduire à 2 les biomatériaux candidats à tester chez le rat et anticiper des résultats positifs avec confiance.

Réduction

Seuls deux substituts candidats seront évalués. Dans un souci de réduction du nombre d’animaux, les deux biomatériaux seront implantés sur le même animal, séparés de quelques centimètres. Une incision supplémentaire sans implantation de biomatériaux (incision contrôle) sera réalisée afin que chaque animal soit son propre contrôle. Cette approche permettra de limiter à 8 le nombre d’animaux nécessaires à cette étude. Seul des mâles seront utilisés, des différences selon le sexe n’étant pas attendues pour les phénomènes étudiés (évolution des biomatériaux et inflammation).

Raffinement

La composition et la compatibilité des substituts candidats ont été vérifiés in vitro avant implantation chez l’animal afin de limiter le risque d’effets indésirables. De plus, une amélioration des conditions d'hébergement sera mise en place par des jouets présents dans les cages et des interactions avec les soigneurs encouragées lors des inspections quotidiennes. Analgésie et anesthésie seront utilisées pendant et après la procédure, et des points limites adaptés ont été établis. Pour minimiser les biais liés au rythme jour/nuit et éviter les erreurs engendrées par de nombreuses répétitions du même geste à la chaine, les animaux seront implantés 2 par 2 chaque matin, le groupe total de 8 étant ainsi étalé sur 4 jours.

Choix des espèces

Le rat constitue une espèce peu sensible et bien référencée pour ce type d’étude, facile à manipuler (réduisant ainsi le stress) et d’une taille suffisante pour permettre l’implantation de deux matériaux ainsi qu’une incision contrôle sur chaque individu. Les animaux seront adultes (10 semaines) : les éléments évalués au cours de l’étude n’impliquent aucune notion de développement qui amènerait à utiliser des rats immatures ou âgés, le substitut développé est à visée d’utilisation chez l’humain adulte, et la taille des rats adultes permettra l’implantation de plusieurs substituts candidats sur le même individu.

51 souris immunodéficientes vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune reçoit sous anesthésie une injection de cellules de cancer du foie humain sous la peau, puis porte une tumeur dont le porteur indique qu'elle peut provoquer douleurs, perte de poids, déshydratation et gêne à la marche par encombrement. Leur système immunitaire défaillant les empêche de rejeter les cellules humaines, ce qui garantit la prise tumorale. Le projet doit confirmer chez l'animal ce qui a déjà été observé en culture cellulaire, et le bénéfice thérapeutique reste énoncé au conditionnel, comme une piste vers une nouvelle cible.

Objectifs

Le cancer du foie est la deuxième cause de décès liés au cancer. C’est un cancer particulièrement agressif; son taux de survie à 5 ans est estimé à 13 %. Les carcinomes hépatocellulaires (CHC) sont à l‘origine de 80 à 90% de tous les cancers primitifs du foie. Son incidence continue à augmenter dépassant 9 000 nouveaux cas par an en France et près d’un million de nouveaux cas par an dans le monde. Bien que les programmes de dépistage permettent de diagnostiquer environ 40 % des CHC à un stade où des traitements curateurs peuvent être proposés, au moins la moitié de patients relèvera d’un traitement systémique à un stade plus avancé de la maladie. À ce stade avancé, le pronostic reste encore défavorable. Le traitement clinique du CHC reste difficile en raison du haut taux de la récidive des patients atteints et de l’aspect asymptomatique des premiers stades de la maladie. Il est donc important de caractériser les anomalies moléculaires responsables de la prolifération anormale des cellules hépatiques cancéreuses et de permettre à terme d’identifier des biomarqueurs prédictifs de la réponse aux traitements ou de nouvelles cibles thérapeutiques. Cette étude cherche à comprendre le rôle de deux protéines dans la croissance du cancer du foie (CHC). Pour cela, nous allons tester la prolifération des cellules cancéreuses humaines dans un modèle animal. Nous injecterons à des souris différents types de cellules : des cellules cancéreuses hépatiques non modifiées ou des cellules cancéreuses hépatiques modifiées au niveau de l’une des protéines. Nous observerons ensuite comment ces cellules se développent pour mieux comprendre le rôle de ces protéines dans la prolifération tumorale. L'objectif final sera de trouver de nouvelles cibles thérapeutiques pour stopper la croissance du cancer du foie et développer des traitements plus efficaces.

Bénéfices attendus

Ce projet vise à confirmer in vivo chez la souris les résultats obtenus in vitro sur cellules en culture concernant l’implication de la kinase IKKepsilon et de sa cible RelA dans le processus de la croissance tumorale. Ce projet pourrait aboutir à l’identification d’une nouvelle cible thérapeutique et à la mise au point de nouvelles approches thérapeutiques afin de provoquer l’arrêt de prolifération des CHC.

Procédures

Tous les animaux recevront une unique injection sous-cutannée de cellules tumorales sous anesthésie générale. L’anesthésie durera environ 10 minutes. Les animaux seront observés quotidiennement et pesés 3 fois par semaine.

Impact sur les animaux

L'implantation de cellules tumorales peut engendrer chez les souris douleurs, faibles pertes de poids, déshydratation. Chez les animaux développant une tumeur, une faible gêne lors de la locomotion est possible en raison de de l'encombrement que la tumeur peut engendrer.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort en fin de procédure ou ayant atteint les points limites.

Remplacement

Il est indispensable de développer des modèles expérimentaux in vivo les plus proches possible de la maladie humaine, chose qui n’est pas possible in vitro compte tenu du nombre et de la complexité des systèmes biologiques mis en jeu.

Réduction

Dans ce projet, nous utiliserons 51 souris immunodéficientes qui seront réparties en trois groupes de 17 afin d’obtenir des résultats statistiquement exploitables.

Raffinement

Les animaux seront observés tous les jours et l'étude sera stoppée à partir de points limites précoces qui prendront en compte la taille de la tumeur et l'état général de la souris. Les animaux seront hébergés en groupes sociaux stables dans un environnement enrichi favorisant les comportements exploratoires et réduisant le stress.

Choix des espèces

Nous utiliserons des souris jeunes adultes (6-8 semaines) immunodéficientes qui sont dépourvues de réponse immunitaire. Elles seront donc incapables de rejeter les cellules humaines qui seront implantées pour le développement de la tumeur à cause de leur système immunitaire défaillant et par conséquent développeront une tumeur.

Une ou deux chirurgies du crâne sous anesthésie attendent chacune des 483 souris de ce projet, et 125 d'entre elles portent ensuite une prothèse fixée sur la tête. Ces 125 souris vivent seules pendant cinq semaines, ce que le porteur reconnaît comme un stress puisqu'elles ne peuvent pas exprimer leur comportement social. Toutes sont soumises à une tâche de mémoire associative, 45 reçoivent en plus quatorze injections en sept jours, et toutes sont tuées pour prélèvement de leurs tissus, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le RNT qualifie cette tâche de "légèrement aversive" sans dire en quoi consiste l'aversion infligée.

Objectifs

L’objectif de ce projet est d’étudier les mécanismes cellulaires et neuronaux impliqués dans le stockage de la mémoire à court et à long terme au sein du cerveau des rongeurs. Cette recherche s’appuie sur des travaux antérieurs, qui ont révélé que certaines propriétés des neurones se modifient suite à une expérience ou une tâche comportementale. Nous cherchons à approfondir ces observations en explorant les facteurs moléculaires et les processus cellulaires responsables des changements observés. Pour les raisons techniques, le projet se déroule dans deux Etablissements Utilisateur: EU1 et EU2

Bénéfices attendus

Notre projet aborde des défis importants pour comprendre les bases neurobiologiques de la formation de la mémoire. Grâce à la combinaison d'approches utilisées, le projet permettra : i) une meilleure compréhension du rôle du cerveau dans le stockage de la mémoire, ii) l'identification des mécanismes cellulaires et moléculaires à l'origine de l'oubli.

Procédures

Tous animaux subissent à une ou deux intervention(s) chirurgicale(s) (chacun d'une durée < 60 min) réalisées sous anesthésie, pour lesquelles ils reçoivent un traitement analgésique et des soins appropriés. Certains animaux (125) subiront une intervention sous sédation (sans acte invasif) d'une durée d'environ 60 minutes pour la pose d'une prothèse sur la tête. Pour des raisons techniques liées à la présence d'une prothèse, il est nécessaire d'adapter les conditions d'hébergement de ces animaux. 125 animaux seront hébergés individuellement pendant une période de 5 semaines, avec des périodes d'échange entre congénères. Ces mêmes animaux seront progressivement habitués à accepter la pose d'un appareil d'imagerie sur leur tête au cours de séances d'entraînement, dont la durée augmentera progressivement de 2 à 15 minutes. Tous les animaux sont soumis à une tâche comportementale classe de sévérité modère. La tâche comportementalel se compose de deux séances, l'apprentissage de la mémoire associative et le rappel (chaque séance dure 6 à 7 minutes). Certains animaux (45) reçoivent également des injections bi-quotidiennes pendant 7 jours (14 injections en totale). Toutes ces interventions sont réalisées au sein de l' EU1. Certains animaux (150) seront transportés (trajet à pied de 5 minutes) vers une zone annexe de l'EU 2, où ils seront profondément anesthésiés, puis euthanasiés. Leurs tissus seront ensuite utilisés pour des expériences physiologiques aiguës.

Impact sur les animaux

Les animaux subissent une ou deux procédures chirurgicales sous anesthésie. Les effets indésirables potentiels de ces interventions incluent un inconfort modéré, une perte de poids potentielle et un risque d'infection. Ce projet comprends également un test comportemental légèrement aversif. Ce test comportemental peut être stressant pour les souris. Les injections répétées peuvent également être une source d'inconfort. Certains animaux seront hébergés individuellement pendant 5 semaines. Cela représente un stress, car ils ne peuvent pas exprimer leur comportement social naturel.

Devenir

Les animaux seront euthanasiés et leurs tissus récupérés pour les analyses post-hoc.

Remplacement

Le projet se concentre sur l'étude des mécanismes sous-jacents à la formation et au stockage de la mémoire dans le cerveau. Il comprend les tests comportementaux. Pour mener à bien cette étude, nous avons besoin d'un modèle qui soit : i) complexe et intact, ii) modifiable génétiquement, iii) doté de la structure cérébrale ciblée, et iv) adapté aux approches comportementales complexes et les tests invasifs.

Réduction

Afin de limiter au maximum le nombre d'animaux utilisés, nous avons estimé le nombre nécessaire pour obtenir une signification statistique en nous basant sur des études antérieures et des recherches bibliographiques. Nous nous engageons à utiliser le nombre minimal d'animaux requis pour atteindre les objectifs de l'étude. Pour ce faire, nous avons prévu une stratégie expérimentale permettant une analyse précoce des données (c'est-à-dire, analyse effectuée en petits lots avec une expérience par jour). Cette approche nous permettra d'ajuster la taille de l'échantillon en fonction des résultats préliminaires et de détecter rapidement tout problème potentiel avec la procédure, afin de modifier notre approche pour les lots suivants si nécessaire. En ce qui concerne l'approche statistique, nous appliquerons les tests appropriés en fonction des caractéristiques de nos données.

Raffinement

i) Surveillance quotidienne : Les animaux seront surveillés chaque jour pour assurer leur bien-être général. ii) Vérification de l'état de l'animal : Avant chaque manipulation, l'état de l'animal sera vérifié selon les critères généraux ainsi que les signes cliniques spécifiques à la manipulation. iii) Critères d’évaluation de la souffrance : L’apparence générale et le comportement de l’animal seront observés pour détecter tout signe de souffrance, douleur ou détresse (par exemple : état prostré, pelage non toiletté, griffures, etc.). Tout signe de souffrance déclenchera une réponse immédiate et appropriée, comme des mesures conservatoires (isolement temporaire, administration de glucose, réchauffement en couveuse, soins des blessures, etc.). Si aucune amélioration n'est constatée après ces interventions, l'expérimentateur décidera de l'euthanasie de l'animal, en consultation avec le vétérinaire et l'équipe des zootechniciens si nécessaire. iv) Les actes chirurgicaux seront réalisés sous anesthésie et analgésie. v) Manipulation quotidienne : Les animaux seront manipulés quotidiennement avant les expériences pour réduire leur niveau de détresse. vi) Intégration des techniques de raffinement : Nous intégrerons régulièrement de nouvelles techniques de raffinement en formant les expérimentateurs et en consultant des ressources éducatives visant à renforcer le respect des principes de raffinement. vii) Conditions d’hébergement : Les animaux seront maintenus dans des cages collectives avec un enrichissement comprenant des tubes en carton et du matériel pour la nidification.

Choix des espèces

Nous utiliserons la souris pour les raisons techniques liées à la réalisation du projet. Actuellement, la souris est la seule espèce mammalienne pour laquelle il est possible, de manière routinière, de modifier le génome, et pour laquelle les modèles créés ont été caractérisés tant au niveau comportemental que moléculaire. Les protocoles comportementaux décrits dans ce projet sont déjà validéspour ce modèle. Nous utiliserons des souris adultes âgées de 6 à 12 semaines. Nous ne pouvons pas utiliser de souris plus âgées en raison de l'effet du vieillissement sur la formation de la mémoire. De plus, les souris de moins de 6 semaines (avec un cerveau en développement) peuvent avoir des mécanismes différents sous-jacents à la formation de la mémoire et sont également sujettes à un oubli plus rapide.

Le rat des sables, rongeur diurne dont la rétine compte 40 % de cônes contre 3 % chez la souris, est retenu pour reproduire une maladie de l'œil humaine. 208 individus vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, avec une injection sous la rétine pratiquée sur des nouveau-nés de dix à vingt jours, puis trois électrorétinogrammes, trois tomographies et trois fonds d'œil sous anesthésie. Le porteur indique que l'injection n'engendre "en général" aucune lésion, sans écarter une infection, une inflammation ou une douleur transitoire, et signale un stress aigu lié aux transports entre les deux établissements. Tous sont mis à mort pour analyse moléculaire et cellulaire de leur rétine.

Objectifs

La maladie de Stargardt est une maladie qui affecte l’œil, et constitue la forme de dégénérescence maculaire héréditaire la plus fréquente chez l’Homme. Elle touche souvent des personnes jeunes et provoque un handicap visuel lourd dû à la perte de la partie centrale de la rétine, nommément la macula qui est riche en cônes. Les mécanismes pathogènes ont été largement analysés dans une souche de souris modifiée qui n‘exprime pas le gène responsable. Néanmoins, ces souris ne présentent pas les déficits observés chez les patients. Contrairement aux rongeurs nocturnes (rat et souris), le rongeur diurne appelé Rat des Sables (Psammomys obesus) présente des caractéristiques uniques pour modéliser cette maladie, car nous avons montré que sa rétine riche en cônes ressemble fortement à celle de l’homme. L’objectif du projet qui est un projet multisite se déroulant dans deux établissements utilisateurs est de développer un nouveau modèle animal dans lequel le gène responsable sera invalidé spécifiquement dans la rétine. Les conséquences de la mutation induite seront étudiées par des méthodes non-invasives permettant de suivre la dégénérescence lente de la rétine grâce à l’évaluation longitudinale de la fonction de la rétine et à l'obtention d'images de l’œil. Des analyses cellulaires et moléculaires viendront compléter l’étude. Ainsi, ce modèle permettra d’éclaircir les mécanismes impliqués dans l’apparition de la maladie de Stargardt. Si le modèle récapitule les caractéristiques principales de la maladie il sera utilisé dans une deuxième phase pour tester une thérapie génique, potentiellement capable de contrecarrer la dégénérescence et maintenir la fonction des photorécepteurs. Une modification a été déposé afin d'inclure une cararctérisation électrorétinographique plus fine, sans ajout d'animaux.

Bénéfices attendus

L’utilisation du modèle rongeur Psammomys obesus, dont la rétine est riche en cônes comme chez l’homme, va permettre d’étudier les mécanismes de la maladie de Stargardt et de tester une potentielle thérapie génique. Il est évident que si des effets bénéfiques suite à l’administration de la thérapie géniques ont constatés, cela ouvre des perspectives importantes pour les patients atteints de la maladie de Stargardt, qui est actuellement sans traitement.

Procédures

Les procédures décrites dans ce projet comprennent une injection sous-rétinienne (EU1/2) réalisée sur animal anesthésié ainsi que des analyses structurales et fonctionnelles de la vision réalisées avec des méthodes non invasives, également sur animal anesthésié. Il s'agit de l'électrorétinogramme (EU1/2), de la tomographie par cohérence optique (EU2/2) et du fond d'oeil (EU2/2). Ces 3 analyses seront réalisées chacune à 3 reprises.

Impact sur les animaux

L’injection sous-rétinienne chez les nouveaux nés de Psammomys obesus, n’engendre, en général, aucune lésion ni altération de la fonction visuelle. Toutefois nous ne pouvons exclure l’apparition d’une infection, d’une inflammation ou de dommages à l’œil injecté lors de son développement ou d’une douleur transitoire. L’ERG et l’imagerie sont des méthodes non invasives, ne provoquant pas de souffrance particulière mais une inflammation de l’œil n’est pas à exclure suite à l’ERG, même si son occurrence est minimisée à travers l’utilisation de gel ophtalmique. Le transport entre les deux EU pourra induire un stress aigu transitoire chez les animaux.

Devenir

Tous les animaux sont mis à mort pour analyses ultérieures moléculaires et cellulaires de la rétine.

Remplacement

A ce jour aucun modèle in vitro ne permet de recréer la complexité du système visuel dans son intégralité, c’est-à-dire depuis la détection de la lumière jusqu’aux réponses fonctionnelles (ce qui nous concerne ici). Toutefois, la technique de modification du gène responsable de la maladie de Stargardt a été validée par analyse génomique et par nos observations expérimentales précédentes.

Réduction

Pour la majorité des expériences chaque animal est son propre contrôle. A savoir un œil est injecté avec une construction contrôle et l’autre avec une construction qui permet d'obtenir l’inactivation du gène impliqué dans la maladie de Stargardt. Le nombre d'animaux a été évalué au maximum en prenant en compte le risque potentiellement engendré par l’injection, ainsi que la variabilité interindividuelle pour aboutir à des résultats significatifs lors de la comparaison entre l’œil contrôle et l’œil traité. Il s'agit également d'une étude où le même animal est suivi à plusieurs temps après injection (étude longitudinale) ce qui contribue à réduire le nombre d'animaux utilisés. Dans cet avenant le nombre total d’animaux de la procédure 1 a été réduit car les données obtenues ont permis de déterminer que la dégénérescence débute précocement et que les temps de mise à mort tardifs initialement prévus ne sont pas nécessaires.

Raffinement

Afin de respecter / stimuler les interactions sociales, les animaux sont hébergés avec leur mère et leur fratrie jusqu’au sevrage, puis ensuite par groupes sociaux comprenant 2 à 3 individus de même sexe. L’environnement est enrichi (matériel de nidification, bâton à ronger, tunnel) afin de stimuler leur activité motrice. . Les animaux reçoivent de l'eau et de la nourriture ad libitum, qui est adaptée selon l’état physiologique des animaux (mère allaitante, animaux sevrés, adultes). Lors de l’injection sous-rétinienne les animaux au stade de développement P10-20 sont placés sur tapis chauffant et sous anesthésie générale, à laquelle est rajoutée une anesthésie locale de l’œil. Après l’intervention, l’application d’un gel ophtalmique permet d’éviter un desséchement de la cornée. Lors de l’ERG, de l'OCT et du fond d'œil, les animaux sont placés sous anesthésie, complétée d’une analgésie locale pour l’ERG. L’application de gel ophtalmique permet ici aussi d’éviter tout desséchement de l’oeil. Un suivi quotidien est assuré par du personnel spécialisé afin de mettre en évidence d'éventuels signes précoces de mal être : deux fois par jour le jour d’une intervention (injection, FO + OCT, ERG), puis une fois par jour jusqu’à la fin de la procédure. Pendant ces surveillances, l’aspect des yeux sera minutieusement inspecté. En cas d’infection ou de douleur manifeste, les animaux seront mis à mort immédiatement selon une méthode adaptée à l’âge de l’animal. Les deux sites expérimentaux sont distants de moins de 10 km. Les animaux sont transportés entre sites expérimentaux, en présence de la personne habituée à les manipuler, dans des boites de transport pour animaux de laboratoire contenant litière et enrichissements type bâton et frisure, nourriture et eau gélifiée. Lors du précédent projet, les animaux n'ont montré aucun signe de stress à leur arrivée dans chacun des sites.

Choix des espèces

Pour cette étude nous utiliserons un modèle rongeur diurne Psammomys obesus. Par comparaison avec la souris, la rétine de Psammomys obesus est de plus grande taille et est enrichie en cellules nerveuses photosensibles (ou photorécepteurs) de type cônes (40% versus souris 3%). Ce modèle est donc parfaitement adapté pour l’injection sous rétinienne et l’étude des cônes, qui sont impliqués dans la maladie de Stargardt. Nous utiliserons des animaux aux stades postnataux P10-20 (jours après la mise bas), car ce stade correspond à la période où la maladie de Stargardt se déclare chez l’homme (entre 7 et 12 ans), et la protéine ciblée n’est encore que peu exprimée dans les photorécepteurs.

L'objet réel de ce projet est une lignée de souris créée par l'équipe elle-même : 120 souris mâles privées d'un récepteur du goût du gras au niveau de la langue vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Privées d'eau six heures, elles subissent une chirurgie de vingt minutes sous anesthésie profonde, un enregistrement de vingt minutes de l'activité de leurs nerfs autonomes, puis une ponction intracardiaque juste avant la mise à mort. Le porteur signale la peur liée à la contention et les douleurs causées par la chirurgie. Le bénéfice annoncé à court terme se limite à mieux connaître cette lignée pour qu'elle serve ensuite de modèle à l'étude de la préférence pour le gras, et le porteur juge ce modèle "indispensable" puisqu'il n'existe que chez la souris.

Objectifs

Le goût du gras représente une sixième saveur de base aux côtés du sucré, du salé, de l'amer, de l'acide et de l'umami. Les récepteurs gustatifs, sur les cellules des papilles gustatives, permettent la détection des saveurs. Pour les lipides, ce sont les récepteurs lipidiques qui sont responsables de la perception du goût du gras et du renforcement de la préférence pour le gras. Le signal gustatif est transmis de la langue au cerveau par les nerfs gustatifs puis le cerveau communique avec le système digestif pour préparer le système digestif à l'arrivée des aliments. On parle alors de l’axe langue (papilles gustatives) – cerveau – intestin. Pour étudier spécifiquement le rôle d’un des récepteurs lipidiques dans la perception du gras, nous avons développé un modèle de souris n’exprimant pas ce récepteur au niveau de la langue. Nous avons observé que ces souris perdent la préférence pour le gras. De plus, elles développent des troubles métaboliques tels que des augmentations de la glycémie, de l’insulinémie et de la glucagonémie. L’insuline et le glucagon, sont des hormones sécrétées par le pancréas, qui permettent de réguler la glycémie. Elles sont sous le contrôle du système nerveux autonome, qui assure la communication entre le cerveau et l’intestin. Ces observations nous suggèrent que l’absence de d’un récepteur lipidique dans les papilles gustatives perturbe la communication entre la langue, le cerveau et l’intestin. Afin d’explorer le rôle du système nerveux autonome dans les perturbations métaboliques observées chez ces souris, nous prévoyons de mesurer l’activation de ces nerfs en réponse au dépôt de lipides sur la langue. Ces mesures seront effectuées chez des souris normales ou n’exprimant pas un récepteur lipidique au niveau des papilles gustatives.

Bénéfices attendus

A court terme, ce projet permettra de mieux comprendre une nouvelle souche de souris génétiquement modifiée, n’exprimant pas un des récepteurs lipidiques au niveau de la langue. Ces souris pourront donc servir de modèle animal pour étudier la préférence pour le gras.

Procédures

Toutes les souris (120 souris) sont concernées par les points suivants : - Privation d’eau uniquement pendant 6 heures avant le début de la procédure. - une seule intervention chirurgicale suivie d’un seul enregistrement d’activité nerveuse par souris (souris profondément anesthésiées) ; durée de la chirurgie 20 minutes au maximum et durée de l’enregistrement nerveux 20 min. - un seul prélèvement sanguin en intracardiaque par souris durée de 2 minutes maximum. Prélèvement sanguin sur souris profondément anesthésiées juste avant mise à mort.

Impact sur les animaux

Le projet requiert de mettre à jeun hydrique les souris pendant 6 heures (phase diurne) avant la procédure chirurgicale ce qui peut engendrer un stress pour les animaux. Les animaux peuvent subir une peur des suites de la contention nécessaires lors des manipulations. Les souris peuvent subir des douleurs causées par la chirurgie.

Devenir

A l’issue de la procédure, toutes les souris seront mises à mort, pour étudier leurs organes et tissus.

Remplacement

L’activité nerveuse autonome ne peut s’étudier que sur des animaux vivants, ceci expliquant la nécessité de l’expérimentation in vivo. Aucun modèle cellulaire ne peut être utilisé pour substituer l’utilisation de modèles animaux.

Réduction

L’utilisation de lignées cellulaires in vitro nous a permis de réduire le nombre d’animaux dont nous aurions initialement eu besoin pour les études mécanistiques. Le nombre d’animaux nécessaire à cette étude correspondra au nombre minimum permettant une étude statistique, valable avec un test adapté aux petits échantillons. Ainsi, après estimation confirmée, la taille des groupes minimale est de 15 animaux.

Raffinement

Les animaux seront hébergés en groupes dans les conditions habituelles de l’animalerie, le calme sera maintenu tant que possible dans la salle d’hébergement et une visite quotidienne sera réalisée. Pour le bien-être des souris, du matériel d’enrichissement permettant la construction de nid sera fourni en permanence avec un accès libre à la nourriture et la boisson. De plus, habituer les souris à la contention permettra de diminuer le stress induit par le geste. Pour maximiser l’asepsie, plusieurs précautions seront prises, notamment la tenue du manipulateur (le manipulateur portera une blouse propre jetable et des gants nettoyés avec l’alcool 70%), désinfection des surfaces, utilisation d'un champ stérile, stérilisation des outils de dissections, tonte de la zone d’incision et désinfection de la peau. La délimitation des points limites permet d’éviter au maximum les douleurs sévères ou souffrance chez la souris afin de favoriser un état stable dans le bien-être animal. La douleur de la souris est en amont, prise en charge via l’utilisation d’analgésiques,15 minutes avant l’anesthésie. Ceci permettra entre autres de calmer l’animal et de maximiser l’effet de l’anesthésie. Des aiguilles fines biseautées seront utilisées lors des injections et des prélèvements, pour minimiser la douleur.

Choix des espèces

Du point de vue scientifique, la souris reste le modèle de choix qui est assez documenté sur la régulation nerveuse du système gastrointestinal et du comportement alimentaire. Cette technique est plus difficile à réaliser chez la souris que chez le rat, mais notre modèle animal génétiquement modifié est réalisé seulement chez la souris, c’est pourquoi ce modèle est indispensable. D’un point de vue technique, la disponibilité des outils d’analyse biologique contribue au choix de modèle de souris. De plus, l’élevage et la modification de gènes s’exprimant au niveau de la langue étant plus facile sur les souris, cette espèce est un modèle de choix quant à notre étude. Les souris mâles utilisées auront minimum 2 mois car avant 8 semaines, les souris sont trop petites pour effectuer une chirurgie.