Procédures modérées

Pour satisfaire aux exigences réglementaires précédant la mise sur le marché d'un produit de santé, 3 700 rats sont utilisés, la moitié dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, tous tués pour autopsie. Chaque animal reçoit des implants placés entre la paroi de son ventre et la membrane qui entoure ses organes, jusqu'à quatre sites, plus six sites sous la peau, avec des réimplantations chirurgicales répétées, jusqu'à trois en prépéritonéal et cinq en sous-cutané sur un an. Le porteur décrit des cris à la manipulation et des morsures dues à la douleur, ainsi que des atteintes possibles à l'œil quand le sang est prélevé dans sa veine. L'étude est commandée par un client, qui garantit lui-même qu'elle ne double pas une étude déjà réalisée.

Objectifs

Le projet vise à respecter les exigences des autorités réglementaires et des normes en vigueur avant l’utilisation d’un produit de santé chez l’Homme. Il évalue la toxicité (i.e. les éventuels effets néfastes sur le corps) et/ou la tolérance locale (i.e. sécurité, toxicité/réaction locale) du produit de santé. L’évaluation de ces produits de santé doit mimer autant que possible l’utilisation clinique et ainsi considérer un mode d'administration similaire dans les modèles animaux (prépéritonéal et/ou sous-cutanée) et l’effet cumulatif (réimplantation(s)) lorsque cela est possible. Prépéritonéal signifie situé entre la membrane qui entoure les organes du ventre et la paroi du ventre. Sous-cutanée signifie situé sous la peau.

Bénéfices attendus

Ce projet permet de s’assurer avant sa mise sur le marché que le produit de santé est sûr pour les patient afin de répondre aux exigences des autorités réglementaires et des normes en vigueur. Il permet d’évaluer les risques éventuels liés à l’utilisation de ce produit et de s'assurer que les éventuels risques sont acceptables par rapport aux bienfaits/bénéfices apportés aux patients. Les résultats des études aideront à décider si le produit peut être mis ou maintenu sur le marché, conformément aux règles en vigueur.

Procédures

Lors de la chirurgie réalisée sous analgésie/anesthésie, un ou des sites prépéritonéaux (situés entre la membrane qui entoure les organes du ventre et la paroi du ventre) (environ 15 minutes) seront réalisés. Un ou des site(s) sous la peau (environ 8 minutes supplémentaires) pourront également être ajoutés sur les même animaux. Il est possible d'ajouter à cela des tatouages des sites pendant la procédure (10 minutes additionnelles). Selon la durée de l'étude, une ou plusieurs autres réimplantations chirurgicales (espacées de 4 semaines minimum) pourront avoir lieu pour réimplantation (implanter de nouveau des dispositifs). La durée de ces interventions est similaire aux durées précédemment mentionnées. Le nombre et la fréquence des réimplantations dépendent de l'utilisation clinique du produit à tester, de sa taille, du nombre maximum de sites possible (4 sites maximum en prépéritonéal et 6 sites au maximum sous la peau), de la durée d'étude, de la nature et de la durée de l'ensemble des procédures cumulées, et de l'avis vétérinaire en fonction de l'état général des animaux. Pour une étude 14 à 28 jours: pas de réimplantation possible (car espacement considéré insuffisant). Pour une étude de 13 semaines: maximum 2 réimplantations prépéritonéales et 2 réimplantations sous-cutanées. Pour une étude de 26 semaines à 1 an, maximum 3 réimplantations prépéritonéales et 5 réimplantations sous-cutanées. Pendant l'étude, selon une fréquence et un volume n'affectant pas l'animal, des prélèvements sanguins (environ 5 minutes) pourront être réalisés. La durée des interventions en fin d'étude est d'environ 10 minutes.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables pouvant être observés sont principalement dus à l’implantation prépéritonéale et/ou sous la peau. Cela peut engendrer un stress et ou une douleur localisé au niveau du site chirurgical (entrainant par exemple des réactions inhabituelles, des cris lors de la manipulation, une agressivité, des morsures dues à la douleur), faible perte de poids, baisse d’appétit. Si le produit est toxique, il peut causer des pertes des poids significatives et une baisse d’activité plus importante, des gonflements/blessures au niveau des sites. En cas de prélèvements sanguins se faisant au niveau de la veine de l'oeil, des effets indésirables sur l'oeil peuvent se produire.

Devenir

Pour les besoins de l'étude, une autopsie est nécessaire. Ceci permet d'évaluer les effets potentiels de toxicité systémique et/ou locale du produit de santé à tester. Ces analyses expliquent l'impossibilité en fin d'étude de maintenir en vie les animaux utilisés. De plus, l’analyse des paramètres sanguins ainsi qu'une évaluation des tissus au microscope (analyse histopathologique) est nécessaire.

Remplacement

L’utilisation d’animaux est requise dans la réglementation. Les méthodes alternatives existantes ne permettent pas d’évaluer les effets toxiques à court, moyen ou long terme des produits de santé en raison de la complexité des mécanismes de régulation d’un organisme vivant. Il n'existe pas de test in vitro validé ni de modèle simulé par ordinateur capable de reproduire la complexité d'une réaction tissulaire et/ou des effets systémiques. L’utilisation d’animaux est alors obligatoire pour y parvenir.

Réduction

A la constitution de l’étude, le nombre minimal d'animaux requis par les textes de références est considéré. Dans la mesure du possible, les animaux témoins sont mutualisés entre les différents essais (un même groupe d’animaux "témoin" pour plusieurs groupes d’animaux "test" recevant des produits à tester différents) et la tolérance locale est couplée à l’évaluation de la toxicité systémique. Pour chaque étude, le client pour lequel l'étude est conduite garantit que cette étude ne duplique pas une étude déjà réalisée. Les études dites "faisabilités/pilotes", sur un nombre restreint d’animaux, peuvent aussi servir à orienter les choix de poursuite de développement d'un produit avant d'entamer les études réglementaires à plus grande échelle et devant répondre aux normes en vigueur. De plus, dans le cadre d'essai de toxicité systémique subaiguë, subchronique et chronique, le nombre d'animaux doit être suffisant pour permettre une analyse statistique pertinente (i.e. nombre minimum d’animaux requis) et cela est défini dans la norme en vigueur Les analyses statistiques (exemple: Test de Mann & Whitney avec un risque de 5%) sont réalisées sur le poids des animaux, le poids des organes (absolus et relatifs) et les paramètres sanguins.

Raffinement

La stratégie de raffinement est établie afin de limiter le stress et la douleur des animaux. Elle repose sur la présence d’enrichissements du milieu en systématique, l’utilisation d’antalgiques, d’analgésiques et d’anesthésiques lorsque nécessaire, un suivi sanitaire et clinique renforcé pendant la/les phase(s) d’administration avec une visite vétérinaire en cas d’anomalie clinique, sanitaire ou comportementale, pour permettre une gestion adéquate de la douleur ou de l’anomalie constatée selon chaque cas. Un suivi des points limites spécifiques au projet sera mis en place.

Choix des espèces

L’espèce animale choisie est définie dans le(s) texte(s) de référence. De plus, il est largement utilisé, rendant disponibles de nombreuses données dans la littérature (données sur différents modèles - raffinement, données basales de pathologie…). Le choix du stade de développement est décrit dans les textes de référence qui recommandent généralement l'utilisation d'animaux adultes, âgés en général de 6 à 12 semaines. Lorsque la procédure le nécessite ou dans le cas des propriétés intrinsèques du produit à tester (ex : quantité et/ou taille du matériel à tester importante), des animaux d’un poids plus important (donc plus « âgés ») peuvent être utilisés.

5 758 souris vont être utilisées, toutes tuées, dont 3 446 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Chacune peut recevoir deux injections par jour ou un gavage une à deux fois par jour pendant un à deux mois, après qu'on lui a injecté des cellules de médulloblastome dans le cervelet ou greffé un fragment de tumeur sous la peau. Des souriceaux subissent la même injection intracérébrale, ce cancer touchant des enfants et le porteur cherchant à en reproduire l'environnement. La tumeur cérébrale provoque perte de poids, tête penchée et troubles de la locomotion, et le porteur conclut qu'après les travaux en culture le passage par un "organisme entier" devient "indispensable".

Objectifs

Le cancer est une maladie qui touche l’ensemble de la population et qui est, encore aujourd’hui, un véritable fléau pour la société. Nous nous intéressons plus particulièrement à un cancer touchant les enfants, le Médulloblastome. Le Médulloblastome est la tumeur cérébrale maligne la plus commune en pédiatrie. Ce cancer touche entre 100 et 200 enfants chaque année en France. Actuellement, le taux de survie à 5 ans est inférieur à 80%. Les traitements existants sont la chirurgie, la radiothérapie et la chimiothérapie mais ils laissent malheureusement d’importantes séquelles. A ce jour, il n’existe aucune thérapie ciblée qui permettrait d’agir sur des marqueurs spécifiques des cellules tumorales de Médulloblastome et ainsi réduire les effets secondaires pouvant être causés par des thérapies conventionnelles avec un champs d’action plus large touchant à la fois les cellules tumorales mais aussi les cellules saines. Ainsi, une meilleure compréhension de la maladie permettrait le développement de nouvelles approches thérapeutiques. Notre travail consiste tout d’abord à comprendre les mécanismes conduisant à l’apparition de ce cancer afin d’établir de nouvelles stratégies thérapeutiques. Dans le but d’étudier ces mécanismes, nous utilisons des modèles mimant ces tumeurs. Ces modèles peuvent s’étendre de la cellule tumorale en culture jusqu’à l’utilisation de modèles animaux. Nos dernières études nous ont permis d’identifier 5 stratégies thérapeutiques prometteuses pour le traitement du Médulloblastome. Tout d’abord, nous avons montré, par des études bioinformatiques, l’importance de différents gènes dans le développement de ces tumeurs cérébrales. De plus, nous avons mis en évidence, dans des systèmes de culture de cellules tumorales in vitro, que ces 5 stratégies thérapeutiques, basées sur l’utilisation de nouvelles molécules, induisent la mort des cellules tumorales. Il nous est maintenant nécessaire de pouvoir étudier l’efficacité de ces approches in vivo en utilisant pour modèle, la souris. Ainsi, dans le cadre de ces projets, nous étudierons, chez la souris, l’effet de différents traitements sur le développement et la croissance tumorale de différents modèles de Médulloblastome. En conclusion, notre travail pourrait apporter une avancée conséquente dans le domaine du cancer du cerveau chez l’enfant.

Bénéfices attendus

Ce projet contribuera à améliorer notre connaissance des mécanismes impliqués dans le développement tumoral des différents sous-groupes de Médulloblastome. Et il permettra également de valider l’efficacité de nos approches thérapeutiques in vivo, avec pour finalité une éventuelle transposition à l’Homme si les résultats s’avèrent satisfaisants

Procédures

- Un premier lot de souris sera injecté avec des cellules tumorales sous la peau (durée de l’anesthésie 2min). Dans un 2ème lot, des cellules seront injectées dans le cervelet de souris adultes anesthésiées (15min). Un troisième lot de souris sera constitué de souris génétiquement modifiées. Toutes ces souris seront ensuite traitées soit par 1) injection 3 fois/semaine (1min), 2) injection 2 fois/jour (30sec), 3) gavage (30sec) 1 à 2 fois/jour, 4) injection 3 fois/semaine + gavage 1 fois/jour, 5) injection 2 fois/jour + gavage 1 fois/jour, pendant 1 à 2 mois selon la croissance tumorale. - Dans un 4ème lot, des cellules tumorales génétiquement modifiées ou non seront injectées dans le cervelet de souris adultes sous anesthésie gazeuse (15min) puis le développement tumoral sera suivi au cours du temps. - Dans un 5ème lot, des cellules tumorales seront injectées dans le cervelet de souriceaux sous anesthésie (10min). Puis, ces dernières seront traitées à raison de soit 2 injections par jour (30sec) soit 3 injections par semaine, pendant 1 à 2 mois selon la croissance tumorale. - Dans un 6ème lot, des souris anesthésiées seront greffées avec des fragments de tumeurs sous la peau (durée de l’anesthésie : 15min) - Dans un 7ème lot, des cellules tumorales seront injectées dans le cervelet de souris adultes sous anesthésie (15min). Puis, ces souris recevront un régime alimentaire modifié en acide gras ou non et un traitement par injection 1 fois/semaine, pendant 1 à 2 mois selon la croissance tumorale. Un prélèvement de sang sous anesthésie (< 1min) sera réalisé au moment de la mise à mort. Une partie des animaux des lots 2, 3, 4, 5 et 7 seront opérés sous anesthésie générale profonde juste avant leur mise à mort pour remplacer le sang par une solution de fixation (durée de l’anesthésie : 15 min). Les animaux ne reprendront pas conscience après cette anesthésie.

Impact sur les animaux

Les animaux pourront ressentir un stress modéré de courte durée lors de la contention et de l’initiation de l’anesthésie. Les procédures d’injection de traitements sont susceptibles d’entraîner également un stress et une douleur légère de courte durée chez l’animal. Il est possible que certains traitements entraînent à certaines doses une éventuelle toxicité pouvant causer une perte de poids de l’animal. L’acte chirurgical permettant la greffe tumorale pourra entraîner un stress et une douleur modérée dû à l’incision du plan cutané. De plus, l’injection de cellules tumorales chez l’animal est susceptible d’entraîner un léger stress et une légère douleur de courte durée due à la piqure. Ces animaux transplantés ou greffés développeront par la suite des tumeurs, qui à partir d’un certain volume, pourront entraîner une certaine gêne, tension au niveau de la peau, démangeaisons et irritations. La greffe des cellules tumorales dans le cervelet des souris pourra entraîner un stress ainsi que des douleurs post-opératoire chez l’animal durant les 3-4 premiers jours. Suite à cette greffe, le développement de la tumeur dans le cervelet des souris entraînera lui aussi des effets indésirables, tels que la perte de poids, une tête penchée et des problèmes de locomotion.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort et des prélèvements seront réalisés pour des analyses.

Remplacement

Dans un premier temps, des méthodes alternatives telles que des analyses de données de patients nous ont permises d’établir des hypothèses de travail pertinentes en identifiant plusieurs cibles impliquées dans la tumorigenèse des Médulloblastomes. Nous avons préalablement validé ces hypothèses par des études in vitro afin de remplacer en partie l’expérimentation in vivo autant que possible, mais à ce stade du projet, l’utilisation de modèles animaux appropriés devient indispensable pour examiner l’aspect translationnel de nos travaux. La souris représente un modèle biologique « intégré », permettant d’évaluer une cible dans un système physiologique dans son ensemble et non pas dans un contexte restreint (in vitro). Seule l’utilisation de ce modèle permet donc d’étudier l’efficacité d’une thérapie de manière compréhensive au niveau d’un organisme entier et est donc nécessaire pour les présents projets. De plus, des coupes de cerveau obtenues à partir d’animaux sains seront mises en culture afin d’étudier ex vivo certaines questions scientifiques et ainsi limiter le nombre d’animaux utilisés en procédure.

Réduction

Afin de réduire le nombre d’animaux utilisés, dès que cela est possible, des expériences préliminaires réalisées sur un nombre restreint de souris permettront de déterminer la fréquence et les concentrations appropriées à utiliser pour les expérimentations de plus grande envergure. De plus, des coupes de cerveau obtenues à partir d’animaux sains seront mises en culture afin d’étudier ex vivo certaines questions scientifiques et ainsi limiter le nombre d’animaux utilisés. Le nombre de souris a été choisi de façon à limiter le nombre d’animaux utilisés tout en permettant une analyse statistique adéquate et ainsi une robustesse des résultats obtenus

Raffinement

Les procédures ont été réfléchies de façon à réduire au maximum le stress et les souffrances des animaux soumis aux expérimentations. En effet, lors d’interventions chirurgicales, les souris seront anesthésiées et des analgésiants locaux et généraux leur seront administrées pré- et post-opératoire. Durant l’opération, afin d’éviter une hypothermie des animaux, ces derniers seront placés sur un tapis chauffant. De plus, un gel ophtalmique sera appliqué sur les yeux des souris afin d’éviter un assèchement de leur cornée qui peut être causée par l’anesthésie gazeuse. A la fin de la procédure, les souris seront transférées dans une cage propre sous une lampe chauffante jusqu’à leur réveil, puis un gel hydratant et nutritif leur sera fourni afin de faciliter leur récupération post-opératoire. La croissance des tumeurs induites par injection sous-cutanée sera suivie par mesure régulière du volume à l’aide d’un pied à coulisse. Concernant les tumeurs intracrâniennes, la souffrance des animaux pourra, selon les modèles injectés, être anticipée par l’utilisation hebdomadaire de techniques, non invasives, d’imagerie du petit animal, qui permettront d’évaluer leur croissance au cours du temps et ainsi permettre une mise à mort précoce des animaux si cela est nécessaire. Les souris seront surveillées quotidiennement si besoin pour détecter le plus précocement possible la douleur chez ces dernières et y remédier. En cas d’apparition de signes de souffrance (perte de poids importante, prostration…), les animaux seront mis à mort. Une grille de score a notamment été définie afin de détecter la souffrance des souris et mettre en place des soins support destinés à la minimiser, ou d’arrêter l’expérience. En cas d’inconfort visible de l’animal, un gel hydratant et nutritif sera déposé dans la cage et une prise en charge analgésique sera effectuée.

Choix des espèces

La souris est un modèle particulièrement adapté pour les expériences menées en oncologie pour valider des cibles thérapeutiques. De plus, à ce jour, uniquement les modèles transgéniques de souris ont pu récapituler les caractéristiques du Médulloblastome. Leur physiologie est proche de l’Homme et la pharmacologie pertinente pour des applications cliniques. L’utilisation de ces modèles permet également de reconstituer un environnement tumoral complexe qui peut jouer un rôle déterminant dans l’efficacité d’une thérapie. D’autre part, l’utilisation de souris immunodéficientes permet de conserver la signature de la tumeur humaine d’origine tout en l’amplifiant et de minimiser les risques de rejet. Nous utiliserons des souris adultes et des souriceaux selon l’objectif scientifique étudié. Le Médulloblastome étant un cancer pédiatrique, les souriceaux permettront de mimer le plus fidèlement possible l’environnement de ce cancer. Cependant, de par leur petite taille, les voies possibles d’administration des médicaments sont plus limitées chez les souriceaux que chez une souris adulte, empêchant ainsi l’utilisation de certaines molécules nécessaires à ce projet. De plus, l’utilisation de souriceaux implique d’utiliser des souris immunocompétentes car les souriceaux immunodéficients, étant par conséquent plus fragiles, ces derniers ne survivent pas suite à une chirurgie. Ce dernier point nous empêche alors d’étudier des tumeurs humaines qui présentent un risque élevé de rejet dans ces souris. Ainsi, certaines études seront conduites sur des souris adultes dont le système immunitaire est déficient afin de permettre une conservation de la signature de la tumeur humaine d’origine et de minimiser les risques de rejets. Nous utiliserons aussi des souris adultes immunocompétentes lors d’études réalisées sur des souris transgéniques.

La procédure s'arrête si le seuil de douleur mécanique d'une souris descend sous 0,3 gramme, mesuré au filament de von Frey. 246 souris sont utilisées, dont 156 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, toutes tuées pour prélèvement d'organes. Un emphysème pulmonaire leur est installé sur quatorze jours, elles subissent une biopsie de la queue à six jours de vie, puis des aérosolisations pendant lesquelles elles sont suspendues par les incisives à un panneau incliné à 45 degrés. Le bénéfice avancé, une thérapie inhalée qui remplacerait les perfusions hebdomadaires des personnes déficientes en alpha-1-antitrypsine, reste au stade de la preuve de concept.

Objectifs

Le projet se déroule dans 2 établissements utilisateurs : EU1 et EU2. Le déficit en alpha-1-antitrypsine (AAT) est une maladie génétique rare causée par une mutation du gène SERPINA1, responsable de la production de la protéine AAT. L'AAT est principalement synthétisée dans le foie et sécrétée dans la circulation, où son rôle principal est de protéger le tissu pulmonaire contre l'action de différentes enzymes. Ce déficit en AAT est un facteur de risque au développement d'un emphysème pulmonaire, caractérisé par une dégradation progressive et irréversible du tissu alvéolaire, entraînant une diminution de la fonction respiratoire et un risque accru de mortalité. Chez les patients souffrant de cette maladie, l'administration intraveineuse d'AAT réduit la perte annuelle du tissu pulmonaire et ralentit le déclin de la fonction respiratoire. Cela étant, ce traitement n'a aucun effet sur des épisodes d'aggravations des symptôles et donc l'état de santé. Ce projet vise à évaluer un nouveau traitement reposant sur l'aérosolisation de l'AAT, vectorisée dans des nanoparticules lipidiques. Ces nanoparticules ont des propriétés protectrices (anti-inflammatoire, anti-oxydante et anti-infectieuse). Ces effets protecteurs, combinés avec ceux de l'AAT, constituent une thérapie prometteuse pour laquelle l'inhalation permettra une action directe sur les poumons. Ainsi, ce projet qui se déroulera dans deux établissements utilisateurs, a le potentiel de fournir une preuve de concept pour le développement d'une thérapie innovante pour les patients déficients en AAT.

Bénéfices attendus

Recherche médicale : il existe un besoin d'améliorer les normes de soins pour les maladies pulmonaires liées à la déficience en alpha-1-antitrypsine (AATD). L'injection intraveineuse d'AAT a montré une efficacité limitée et les injections hebdomadaires constituent une contrainte sur la qualité de vie des patients. La voie inhalée est une stratégie thérapeutique prometteuse qui améliorera l'observance et l'autonomie des patients. Des études précliniques et cliniques de ces dernières années ont démontré la capacité des nanoparticules lipidiques inhalées à délivrer localement divers médicaments dans les poumons, pour le traitement de maladies pulmonaires telles que les cancers pulmonaires, les maladies pulmonaires obstructives et les infections respiratoires. Les nanoparticules lipidiques ont permis d’atteindre cet objectif tout en améliorant la stabilité des médicaments, en réduisant la toxicité systémique et en permettant une concentration locale plus élevée du médicament dans les poumons. Ici, nos particules ont aussi un intérêt thérapeutique, en potentialisant les effets bénéfiques des nanoparticules à celle de l’AAT. Coûts des soins de santé : des traitements efficaces contre l'emphysème pulmonaire lié à l'AATD et la bronchopneumopathie chronique obstructive (BPCO ; 3ème cause de décès dans le monde) pourraient réduire les coûts des soins de santé associés aux hospitalisations et à la gestion à long terme de ces maladies chroniques. Les perspectives du projet sont de mener un essai clinique multicentrique avec des médecins du réseau RespiFIL (Filière Maladies Respiratoires Rares) pour évaluer si l'aérosolisation des nanoparticules enrichits en AAT peut améliorer la santé des patients.

Procédures

Dans l'EU1/2 : Les animaux auront une biopsie de queue à 6 jours et seront soumis à des aérosolisations à l'âge adulte. Parmi les animaux exposés, certains recevront des nanoparticules et ou du LPS et certains auront des mesures de leur fonction respiratoire. Les procédures d’aérosolisations et d’injections intraveineuses dure environ 1 minute et la procédure de mesure de fonction respiratoire dure environ 10 minutes. Ces procédures sont réalisées sous anesthésie générale. Dans l'EU2/2 : Les animaux seront soumis à des aérosolisations de nanoparticules radiomarquées. La procédure d’aérosolisation dure environ 1 minute puis la mesure de la scintigraphie se déroule à 6h, 24h et 48h. Des prélèvements sanguins (caudales) sont aussi réalisés à ces temps. Ces procédures sont réalisées sous anesthésie générale.

Impact sur les animaux

- Nuisance modérée pour la biopsie de queue (douleur légère de courte durée). - Nuisance modérée pour l'instillation intratrachéale. Les souris anesthésiées sont retirées de la chambre d’induction et suspendus par leurs incisives sur un panneau en plexiglas en position couchée, avec une inclinaison d’environ 45 degrés. La durée totale de la procédure d’aérosolisation est d'environ 1 minute. - Nuisance sévère pour la mise en place de l'emphysème pulmonaire. Nous évaluerons le seuil à la douleur dans l’étude pilote en utilisant le test de Von Frey (stimuli mécaniques). Ce test mesure la réponse de retrait à des filaments appliquant une pression mécanique. Chez des souris avec emphysème, on pourrait s'attendre à une hypersensibilité mécanique (réduction du seuil). Une évaluation comportementale sera faite en complément. Si le seuil de douleur est très faible (allodynie mécanique

Devenir

Mise à mort pour prélèvements d’organes

Remplacement

La complexité des processus physiologiques se déroulant lors de l’emphysème pulmonaire ne sont pas modélisables par des techniques in vitro. Les processus de dégradation et de fibrose du tissu pulmonaire impliquent plusieurs types cellulaires : neutrophiles, macrophages, cellules endothéliales, fibroblastes, pneumocyte de type 1 et 2 entres autres. De plus, plusieurs processus physiologiques se mettent en place lors de l’emphysème tel que l’inflammation et le stress oxydatif. A l'heure actuelle, nous ne pouvons réaliser des procédures in vitro permettant d'intégrer l'ensemble de ces acteurs cellulaires et de signalisation.

Réduction

Le nombre d’animaux de cette étude se base sur des publications scientifiques ayant décrit des résultats significatifs avec des approches similaires. Chaque expérimentation sera scindée en trois expériences indépendantes. Cela permettra de ne pas utiliser l'ensemble des animaux si nous observons que les résultats obtenus sont significatifs avec les deux premières expériences (n=8 au lieu de 12 dans l’objectif 2.2 par exemple ; analyses statistiques : two-tailed unpaired t test ou two-way ANOVA). En effet, les résultats, s’ils sont homogènes, peuvent être significatifs avec 8 souris. De plus, si jamais une souffrance ou une mortalité inattendue venait à apparaitre, cela éviterait de relancer une expérimentation avec le groupe d'animaux suivant.

Raffinement

Pour garantir un environnement optimal, les animaux seront logés dans des cages offrant un espace suffisant, avec un maximum de 5 animaux par cage. Cet aménagement limitera au maximum les contraintes subies et permettra un comportement normal. De plus, l’environnement sera enrichi avec des matériaux pour se nicher et jouer, contribuant ainsi à leur bien-être. Les animaux seront observés de façon continue pendant les 30 premières minutes après l’aérosolisation, puis 3 à 6 fois par jour afin de nous assurer de leur bien-être et de ne pas laisser un animal en souffrance. Tout signe de souffrance ou de comportement anormal sera rapporté immédiatement au vétérinaire référent afin de prendre les mesures adéquates. Les procédures invasives seront réalisées sous anesthésie générale par une personne qualifiée, conformément aux protocoles en vigueur pour minimiser la douleur et le stress des animaux. Nous observerons et analyserons divers points limites spécifiques pour évaluer leur bien-être, tels que : 1. Altération du comportement : signes d'apathie, d'agressivité, d'isolement, ou réduction drastique de l'activité normale. 2. Nutrition anormale : incapacité à se nourrir ou à boire normalement. 3. Perte de poids : surveillance régulière du poids pour détecter toute perte significative. 4. Aspect physique : poil ébouriffé, yeux fermés, respiration laborieuse, posture courbée. Si l'un de ces paramètres ou points limites est atteint, cela sera signalé immédiatement au vétérinaire référent. Celui-ci évaluera la situation et pourra décider de l'arrêt de l'expérimentation et de l'euthanasie de l'animal pour limiter ses souffrances, conformément aux règles éthiques en vigueur. Pour compléter le raffinement des procédures, une injection d’analgésique sera réalisée avant chaque intervention et chaque fois que la souris démontrera des signes de douleurs. La mise en place d’une étude pilote permettra aussi d’améliorer les manipulations de l’expérimentateur. Concernant le transport des souris de l’EU1/2 vers l’EU2/2, le transporteur agréé s'engage à réunir toutes les conditions pour assurer la sécurité des animaux et leur bien-être (véhicule climatisée avec des cages de transports agrées sous condition d'autorisation pour le statut sanitaire, ajout de croquettes humidifiées et paille). Le choix d'un transport dédié uniquement à nos souris permet aussi d'assurer un trajet rapide d'environ 1 heure (80km).

Choix des espèces

La structure et la fonction du système respiratoire des souris présentent des similitudes avec celles des humains, bien que les différences existent en termes de taille et de complexité. Les souris possèdent des bronchioles, des alvéoles, et des cellules immunitaires pulmonaires similaires à celles des humains, ce qui permet d'étudier les effets des traitements inhalés. Les souris montrent des réponses inflammatoires et immunitaires comparables à celles des humains lorsqu'elles sont exposées à des agents pathogènes ou à des stimuli nocifs, permettant ainsi d'évaluer les réponses thérapeutiques des nanoparticules. Les modèles murins d'emphysème sont bien établis et peuvent être induits par diverses méthodes telles que l'exposition à la fumée de cigarette, l'administration d'élastase ou d'autres agents chimiques. Ici, les souris AAT KO reproduisent les caractéristiques clés de l'emphysème humain, telles que la destruction des alvéoles et la perte d'élasticité pulmonaire. Animaux adultes entre 8 et 10 semaines. À l'âge de 8 à 10 semaines, les souris ont atteint une maturité physiologique qui leur permet de mieux refléter les caractéristiques pulmonaires des adultes humains. Les structures alvéolaires et les voies respiratoires sont pleinement développées, ce qui est crucial pour étudier les changements pathologiques induits par l'emphysème. Les souris de cet âge possèdent un système immunitaire mature mais encore flexible, permettant une réponse inflammatoire et immunitaire comparable à celle observée chez les adultes humains. Cela est important pour étudier les mécanismes inflammatoires et immunopathologiques de l'emphysème. Enfin, à cet âge, les souris ont un niveau d'activité physique, de métabolisme et de croissance relativement stable, ce qui minimise les facteurs confondants qui pourraient influencer les résultats expérimentaux.

Les souris arrivent déjà opérées, la déstabilisation du ménisque qui provoque leur arthrose étant réalisée par le fournisseur avant leur réception et une semaine d'acclimatation. 80 souris sont utilisées, dont 60 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, la douleur articulaire apparaissant vers la douzième semaine et durant jusqu'à la vingt-quatrième. Trois séances d'imagerie sur 24 semaines suivent l'injection d'un traceur radioactif dans la veine de la queue sur animal éveillé, puis jusqu'à quarante minutes sous anesthésie. Toutes sont tuées à la fin de chaque procédure, leurs articulations devant être prélevées pour analyse.

Objectifs

L’arthrose a un impact majeur sur la qualité de vie des patients et se caractérise par une dégradation progressive des articulations, se traduisant par des douleurs et une limitation fonctionnelle, atteignant l’ensemble des structures de l’articulation, dont le cartilage. Les progrès menés dans la compréhension de l’arthrose ont permis d’identifier des cibles thérapeutiques prometteuses, avec l’émergence de nouvelles molécules visant à prévenir ou à ralentir la progression de la maladie. Malgré d’extensives recherches, aucune approche pharmacologique n’a à ce jour démontré d’efficacité. Les agences règlementaires ont approuvé comme seul critère d’évaluation de l’efficacité des nouvelles molécules le temps écoulé avant le remplacement total de l’articulation en chirurgie. Les auteurs dans ce domaine considèrent que le développement de molécules est limité par le manque d’outils d’imagerie sensibles et spécifiques permettant la quantification réelle de la progression de l’arthrose et l’évaluation de la réponse thérapeutique. Dans ce contexte, ce projet propose une nouvelle approche de ciblage du cartilage par imagerie moléculaire, qui permettra d’aboutir à une méthode innovante, non invasive, d’imagerie fonctionnelle des articulations se basant sur l’utilisation d’un traceur radioactif ciblant le cartilage pour l’exploration en médecine nucléaire. Sur la base de nombreuses études précliniques, notre traceur est un sérieux candidat pour une imagerie sensible et fonctionnelle du cartilage : sa sensibilité et sa spécificité permettront de quantifier des critères fonctionnels au niveau du cartilage, permettant ainsi à la fois une évaluation des signes précoces de la pathologie et de l’efficacité des nouvelles approches thérapeutiques. Afin de démontrer cette hypothèse, notre projet a été soumis avec succès à l’Agence Nationale pour la Recherche (ANR). Ces expériences seront réalisées dans le respect de la règle des 3R (Remplacer, Réduire et Raffiner), utilisant des conditions de stabulation, de bien-être animal et un nombre de souris optimisés. Une observation journalière des animaux est assurée par la personne chargée de l’expérimentation. Cette observation consiste à vérifier l’état et le comportement général des souris. Lors des procédures expérimentales, les souris seront placées sous anesthésie générale afin d'éliminer toute douleur potentielle et de réduire l'angoisse générée par la manipulation. Ce projet se déroulera dans 2 établissements utilisateurs.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de juger de la pertinence de stratégies thérapeutiques ciblant le cartilage dans la prise en charge de l’arthrose.

Procédures

Les animaux inclus dans ce projet multisites seront soumis à différents types d’intervention sur 2 sites différents : - Site 1/2 : chirurgie DMM et traitements par injection intra-articulaire sous anesthésie générale. Ces interventions ont fait l’objet d’une autorisation de projet. Dans ce modèle d’arthrose, la douleur due à la dégradation de l’articulation n’apparait qu’après 12 semaines après l’opération (baisse significative de la distribution du poids sur les pattes arrière chez les souris opérées, par rapport à des souris non opérées. Pour cette raison, la procédure 1, qui va au-delà des 12 semaines, est de classe sévère (douleur modérée, mais qui perdure). - Transport du site 1/2 vers le site 2/2. - Site 2/2 : les souris subiront des procédures d’imagerie, ce qui implique une injection intraveineuse (veine de la queue) sur animal vigil, puis une anesthésie générale maintenue pendant l’acquisition des images (jusqu’à 40 minutes). L’imagerie aura lieu 3 fois au total sur 24 semaines pour la procédure 1.

Impact sur les animaux

Dans notre modèle d’arthrose, la douleur due à la dégradation de l’articulation n’apparaît qu’à partir de 12 semaines après l’opération (baisse significative de la distribution du poids sur les pattes arrière chez les souris opérées, par rapport à des souris non opérées. Cette douleur est modérée mais de longue durée.

Devenir

Les animaux seront systématiquement mis à mort à la fin de chaque procédure, les articulations devant être prélevées pour analyses biochimiques et histologiques.

Remplacement

L’arthrose est une pathologie complexe multifactorielle et qui touche tous les tissus de l’articulation, principalement le cartilage, l’os sous-chondral et la membrane synoviale. Notre projet se concentre sur les interactions entre le cartilage et l’os sous-chondrale et en particulier sur le remodelage de la jonction ostéochondrale. Certains aspects de ces interactions peuvent être mimés par des cocultures entre les chondrocytes, les ostéoblastes et les cellules endothéliales ou bien par transfert de milieux de culture d’un type cellulaire sur un autre type cellulaire. Dans une vision plus intégrée de la maladie et dans un souci de comprendre son développement et sa progression, aucun modèle cellulaire ou moléculaire actuel ne peut remplacer l’approche in vivo.

Réduction

Le nombre d’animaux dans chaque groupe a été défini de façon à utiliser le minimum d’animaux tout en garantissant des résultats exploitables sur le plan statistique. De plus, l’utilisation de l’imagerie permet de suivre un même groupe d’animaux au fil du temps, chaque groupe étant ainsi son propre contrôle. L’approche par imagerie que nous souhaitons évaluer permet de considérablement réduire le nombre total d’animaux nécessaire.

Raffinement

Des méthodes de raffinements sont utilisées afin d'augmenter au maximum le bien-être des animaux inclus dans ce projet, pour cela les conditions d'hébergement seront optimales (portoirs ventilés, température, hygrométrie, luminosité, densité animale, enrichissement de milieu, surveillance quotidienne). De plus, des injections d’antalgiques pourront être appliquées si besoin. Lors des procédures (EU 1/2: chirurgie, traitements ; EU 2/2 : imagerie), les animaux seront placés sous anesthésie générale. Concernant le transport des animaux entre l’EU 1/2 et l’EU 2/2, un examen clinique sera effectué afin de s’assurer de leur bon état de santé. Les souris seront transportées dans des cages autoclavables bien ventilées, équipées d’une trappe de contrôle visuel, et des gels hydro seront ajoutés pour garantir leur hydratation pendant le trajet. Le nombre d’animaux par cage est limité pour minimiser le stress, avec la mise en place de séparateurs si nécessaire.

Choix des espèces

L’utilisation de modèles murins permet d’intégrer les paramètres d’un organisme entier, ce que qui ne peut être abordé in vitro par des cultures cellulaires. Le modèle d’arthrose induite DMM est développé chez la souris C57Bl/6j WT. Le développement de l’arthrose spontanée a également été observé chez ces souris. Description du modèle d’arthrose par déstabilisation du ménisque médian (DMM) : Le modèle DMM consiste à déstabiliser le ménisque médian par la transsection du ligament méniscotibial médian. Cette déstabilisation engendre une arthrose post-traumatique qui est visible dès 4 semaines post-chirurgie. Les souris développent des lésions cartilagineuses et osseuses sans inflammation de la membrane synoviale. Les études in vivo se feront avec des souris mâles adultes. Le modèle DMM est réalisé par notre fournisseur chez des souris C57BL/6j WT âgée de 12 semaines, matures sur le plan squelettique. Les animaux seront ensuite réceptionnés par notre animalerie et utilisés seulement après une période d’acclimatation d’une semaine. Les animaux seront utilisés à l’âge adulte, entre 7 et 24 semaines post-chirurgie.