Procédures modérées
Etude préclinique pour tester l’effet de 2 molécules sur le phénotype cardiaque des souris Chchd10S59L/+
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
- Troubles nerveux
168 souris vont être utilisées, toutes tuées pour prélever leurs tissus, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Elles portent une mutation liée à la sclérose latérale amyotrophique et reçoivent une injection dans l'abdomen chaque jour pendant seize semaines, avec deux échographies cardiaques sous anesthésie gazeuse de quarante-cinq minutes et deux prélèvements sanguins. Le porteur teste deux molécules déjà utilisées chez l'être humain dans d'autres maladies et renvoie l'effet sur les troubles neurologiques à une étude ultérieure. Un amendement ajoute soixante souris au protocole, "suite à un problème lors de la première tentative de réalisation", dans un projet qui présente par ailleurs son effectif comme réduit au minimum.
Objectifs
La sclérose latérale amyotrophique (SLA) est une maladie affectant le système neuromusculaire et entraine la mort par insuffisance respiratoire dans les 3 à 5 ans suivant l'apparition des symptômes. L'une des causes probable de cette maladie est une mutation génétique modifiant une protéine. Pour comprendre le rôle de cette protéine, une souris portant la même mutation a été générée. Ces souris présentent des déficits similaires à la maladie humaine, notamment au niveau cardiaque. A ce jour, il n’existe aucun traitement efficace contre la SLA. Le but de cette étude est de tester deux molécules déjà utilisée chez l'Homme dans d'autres pathologies. Leur mécanisme d'action pourrait en effet lutter contre les effets de la mutation de cette protéine. Nous réaliserons ainsi un traitement de 8 à 24 semaines d’âge pour tester l'effet des 2 molécules sur les symptômes cardiaques des souris. Pour cela, nous effectuerons des échographies cardiaques et un suivi du poids des animaux durant l'ensemble de la durée du traitement. Des analyses sanguines seront aussi effectuées. L’effet du traitement sur le l'aspect neurologique qui apparait plus tardivement, fera l’objet d’une autre étude.
Bénéfices attendus
Aucun traitement n’étant disponible à ce jour pour agir contre la SLA, il est primordial de mieux comprendre cette pathologie, et notamment les mécanismes responsables de la mort des neurones moteurs, dans l’optique à plus long terme de développer des recherches à visée thérapeutique. La réalisation de cette étude préclinique sur un modèle murin est indispensable pour savoir s'il est possible d'améliorer les maladies des motoneurones en général mais aussi les troubles cardiaques et musculaires développés par ces animaux. Une meilleure connaissance du modèle sera aussi obtenue avec des tests permettant de déterminer la perméabilité de la barrière hémato-encéphalique de ces animaux, permettant une possible modélisation de l'aspect neurologique des pathologies modélisées
Procédures
2 prélèvements sanguins qui durent quelques minutes. Une injections intrapéritonéales par jour pendant maximum 16 semaines. 2 évaluations cardiaques réalisées par imagerie avec une anesthésie gazeuse de 45 minutes environ. un autre lot d'animaux aura uniquement une injection intraveineuse et un prélévement sanguin, sous anesthésie. Ces deux gestes ne durent que quelques minutes.
Impact sur les animaux
Les animaux subiront une anesthésie gazeuse lors des échographies cardiaques induisant un stress léger ainsi que des prélévements sanguins induisant une légère douleur. Les injections journalières par contention induiront un stress modéré.
Devenir
Les animaux seront euthanasiés en fin de procédure afin de collecter les tissus pour des analyses histologiques.
Remplacement
Dans un but de remplacement, des expériences ont été réalisées précédemment sur des cellules de patients porteurs de mutations de ce gène d'intéret. Ces expériences ont montré que les troubles cliniques de SLA chez l’homme n’étaient pas limités au système nerveux central et que d’autres tissus, tels que les muscles, étaient affectés. Il n'est malheureusement pas possible de tester des traitements sur ces cellules musculaires en culture pour mettre en évidence une restauration de la fonction cardiaque. Seul un modèle animal permettra d’appréhender tous ces aspects : effets de la mutation d’intérêt dans différents tissus et à différents âges. Nous ne disposons pas d'une autre possibilité d'étudier la fonction de ce gène dans un organisme vivant. Dans le cadre d'atteintes de la fonction cardiaque, le modèle souris constitue la meilleure approche disponible à ce jour pour cela.
Réduction
Chaque groupe expérimental sera constitué de 15 animaux, cet effectif étant suffisant pour obtenir des résultats statistiquement interprétables dans les protocoles d'analyse prévus (échographie cardiaque et électrocardiogramme). Nous souhaitons donc employer un total de 60 souris pour ce protocole, en comparant des animaux exprimant ou non le gène d'intérêt, dans des conditions physiologiques ou suite à un traitement. Par ailleurs, nous utiliserons également 48 animaux produits dans la fécondation in vitro permettant la création de la cohorte expérimentale. Ces derniers permettront de mieux connaitre la perméabilité de la barrière hémato-encéphalique afin d'envisager ensuite une analyse de l'effet thérapeutique des molécules sur les troubles neurologiques existants à un stade plus tardif. Amendement 1: Un deuxième groupe de 60 souris devra être employé suite à un problème lors de la première tentative de réalisation du protocole.
Raffinement
Nous suivrons l'état général des animaux, le toilettage, la posture, la présence de vocalisation. Tous ces items nous permettront de décider de l'atteinte de points limites le cas échéant pouvant entrainer l’euthanasie de l'animal pour éviter toute souffrance. En cas de rixe entre animaux, nous pourrons être amenés à isoler l'individu dominant pour éviter toute lésion. L’animal isolé sera sorti de la procédure temporairement (si on arrive à le soigner) ou définitivement et il sera alors mis à mort. Les animaux seront maintenus en groupes, dans des conditions d'animalerie optimales. Ils disposeront sans limitation de nourriture, boisson et d'un milieu enrichi. Le cas échéant, des soins locaux seront attribués. Si une douleur est présente, un antalgique pourrait être administré selon les recommandations vétérinaires. Les animaux seront pesés et observés toutes les semaines en plus du suivi quotidien habituel. Lors du prélèvement sanguin, nous effectuerons une compensation du volume injecté avec du sérum physiologique.
Choix des espèces
La souris est l’animal modèle de choix pour cette étude préclinique. Elle permet notamment un accès facile à l’ingénierie génétique. La souris est un animal dont la modification génétique est aisée et nous disposons justement du modèle porteur de la modification génétique sur le gène d'intérêt, ce qui en fait un modèle de choix. Par ailleurs, ce mammifère permet une première approche informative concernant les mécanismes physiologiques, fournissant de nombreuses données qui pourront ensuite servir dans une approche translationnelle afin de mieux comprendre la physiologie humaine. Enfin, dans le cadre d'atteintes de la fonction cardiaque, le modèle souris constitue la meilleure approche disponible à ce jour. Les animaux seront des souris âgées de 8 semaines au début du protocole, afin de travailler sur un modèle adulte où la fonction cardiaque est développée mais avant l’apparition de l’altération du phénotype afin d’agir de façon précoce avec le traitement avec les deux molécules.
Contribution de la dystrophine dans différents domaines musculaires
- Recherche fondamentale
- Système musculosquelettique
Une échelle de douleur à quatre niveaux encadre le protocole, le niveau 3 correspondant à une paralysie des membres, qui déclenche un analgésique plus puissant puis la mise à mort si nécessaire. 454 souris mâles porteuses de la dystrophie de Duchenne vont être utilisées, 316 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent un virus vecteur par voie intramusculaire à six semaines, dans l'abdomen à deux à quatre jours de vie, ou dans le sinus rétro-orbitaire à dix-sept mois, et la mesure de la force contractile se fait sous anesthésie par huit stimulations successives, sans réveil. Le porteur écrit collecter les biopsies musculaires de tous les animaux et ne prévoir ni réutilisation ni adoption.
Objectifs
La dystrophie musculaire de Duchenne (DMD) est une maladie dégénérative grave et progressive causée par des mutations du gène DMD codant pour la protéine dystrophine. Malgré des efforts considérables, la DMD reste incurable et de nombreuses questions fondamentales sur ses mécanismes pathologiques restent en suspens. Une question particulièrement importante est de savoir quelle partie du muscle la dystrophine (perdue dans la DMD) est fonctionnellement importante pour prévenir le développement de la DMD. La dystrophine est une protéine structurelle clé qui aide à maintenir l'intégrité des fibres musculaires pendant la contraction. Il y a trois décennies déjà, il a été reconnu qu’elle est plus fortement exprimée à la jonction neuromusculaire (JNM) et à la jonction myotendineuse (JMT), que dans le reste de la myofibre. Ces sites sont essentiels à la fonction musculaire : la JNM est l'endroit où les impulsions nerveuses déclenchent la contraction musculaire, et la JMT est l'endroit où les fibres musculaires se connectent aux tendons, dissipant ainsi la force de contraction. L'accumulation de preuves commence à suggérer que la dystrophine pourrait être plus importante dans certaines zones musculaires que d'autres. Par exemple, des études récentes sur l'expression génétique ont révélé que le gène responsable de la pathologie est plus fortement exprimé dans la JMT. De plus, une étude de thérapie génique à faible dose a suggéré que la restauration de ce gène dans la JMT pourrait être suffisante. En outre, des perturbations de la JMT et de la JNM ont été signalées chez les souris mutantes pour ce gène avant le début de la nécrose. Compte tenu de ces observations, il devient de plus en plus essentiel de comprendre les contributions fonctionnelles de la dystrophine dans les différents domaines musculaires. Cependant, cette question est difficile à étudier avec les constructions génétiques conventionnels chez la souris car ils n'ont pas de spécificité spatiale. Nous avons donc développé de nouvelles constructions génétiques permettant de manipuler uniquement les noyaux de la JNM ou de la JMT. L'objectif de notre projet est maintenant de répondre à cette question en utilisant notre approche unique. De plus cette nouvelle approche pourrait donner lieu à une thérapie génique plus ciblée et donc potentiellement avec moins d’effets secondaires.
Bénéfices attendus
La réponse à la question de notre projet de recherche devrait avoir un impact significatif sur la façon dont nous comprenons la DMD et sur l'élaboration de meilleures stratégies thérapeutiques. Cependant, les outils précédemment disponibles dans le domaine musculaire ne peuvent pas être utilisés car ils n'ont pas de précision spatiale à l'intérieur des cellules musculaires. En revanche, les outils que nous avons développés permettent de manipuler la dystrophine uniquement dans des zones précises de la cellule musculaire et donc d’aller plus loin dans la compréhension du fonctionnement de la pathologie et de sa prise en charge.
Procédures
1. Injection intramusculaire d’AAV (Virus Adéno Associé) sous anesthésie générale administrée par voie intrapéritonéale chez les jeunes adultes de 6 semaines, injection intrapéritonéale d’AAV chez les nouveau-nés âgés de 2 à 4 jours et injection d’AAV dans le sinus retro-orbitale sous anesthésie générale administrée par voie intrapéritonéale chez les animaux âgés de 17 mois. 2. Prélèvement de sang au sinus retro-orbital sera immédiatement suivi de la mesure de la force contractile sous la même anesthésie générale (sans réveil). Le prélèvement ne durera qu’une minute. 3. Mesure de la force contractile in situ (sans réveil) : Cette procédure est invasive et sera donc réalisée sous anesthésie générale. La durée d’une stimulation est de 0,5 sec, elle est réalisée 8 fois avec un intervalle de 30 secondes entre chaque stimulation et les souris encore sous anesthésie seront mises à mort.
Impact sur les animaux
La souris que nous utiliserons dans ce projet est un modèle animal largement utilisé pour l'étude de la dystrophie musculaire de Duchenne. En tant que telles, ces souris sont atteintes de dystrophie, elles présentent un phénotype de faiblesse de sévérité légère musculaire à partir de l’âge de 4 mois, qui n’est pas encore visible d’un point de vue physique ou comportemental, puis une fibrose et des faiblesses évidentes au niveau des muscles du diaphragme et du cœur de sévérité modérée aux alentours de 17 à 22 mois pouvant entraîner des difficultés pour se déplacer et donc se nourrir et s’abreuver. Bien que nous générions de nouvelles lignées en croisant les souris atteintes de DMD avec d’autres lignées, ces autres lignées elles-mêmes n'ont pas de phénotype. Par conséquent, le phénotype des nouvelles lignées est équivalent à celui des souris atteintes de DMD. Nous espérons supprimer ou atténuer les symptômes chez ces souris mutantes injectées avec notre AAV (Virus Adéno-Associé), en restaurant la présence d’une protéine dystrophine courte et donc passer d’une sévérité modérée à une sévérité légère pour les animaux âgés et de légère à pas de phénotype visible pour les jeunes animaux et les adultes de moins de 4 mois. Les jeunes animaux qui seront injectés avec des AAV ayant pour but de muter la dystrophine devraient voir apparaître un phénotype semblable aux souris présentant la DMD et donc passer de «pas de phénotype » à un phénotype de sévérité légère. Nous utiliserons également différentes techniques d'injection à différents âges : l’injection intraveineuse dans le sinus retro-orbital, l’injection intra-musculaires, le prélèvement de sang dans le sinus retro-orbital. L’injection intraveineuse et le prélèvement de sang ne seront réalisés qu’une seule fois par animal sous anesthésie. Il s’agit de techniques fiables qui n’induisent pas d’effets indésirables. L’injection intramusculaire qui sera aussi réalisée sous anesthésie provoque une douleur musculaire passagère due à l’introduction de l’aiguille qui endommage les fibres musculaires. Les animaux seront aussi soumis à la mesure de la force de contraction musculaire sous anesthésie finale.
Devenir
Pour parvenir à des conclusions scientifiques solides avec le nombre minimal d'animaux utilisés, nous collecterons les biopsies musculaires de tous les animaux à la fin de chaque procédure. Par conséquent, nous ne réutiliserons pas, ne remplaçons pas et ne ferons pas adopter les animaux.
Remplacement
Bien qu'il soit possible de différencier les cellules musculaires in vitro, ces cellules ne contiennent pas de domaines musculaires (JNM et JMT) et sont toujours immatures. Par conséquent, de nombreux aspects de la DMD ne peuvent pas être modélisés en culture cellulaire. De plus, notre projet vise à étudier l'impact thérapeutique sur la physiologie animale complète qui implique de multiples types de cellules et de tissus. L'expérimentation animale est donc essentielle à la réalisation de notre projet.
Réduction
Pour minimiser le nombre d'animaux utilisés, nous choisirons un point temporel par condition expérimentale. Grâce à des recherches antérieures approfondies dans le domaine de la DMD, ces points expérimentaux sont déjà bien établis, ce qui permettra de réduire le nombre d'animaux. L’utilisation d’AAV nous permet de produire moins d’animaux pour obtenir nos animaux d’expériences. Nous avons déterminé que 7 animaux par groupe de traitement seront nécessaires afin d'obtenir une robustesse statistique. Nous n'utiliserons que des souris mâles car le gène responsable de la pathologie est localisé sur le chromosome X et les patients atteints sont principalement des hommes. Nous utiliserons également des contrôles internes pour réduire le nombre d'animaux. Pour l'injection intramusculaire, le muscle controlatéral sera injecté avec un virus vide pour servir de contrôle négatif. Pour l'injection intrapéritonéale chez les nouveau-nés, des animaux sans génotype complet mais injectés avec le virus serviront de contrôle négatif. Ces considérations permettent d'éviter de mettre à mort des animaux supplémentaires pour obtenir des échantillons de contrôle.
Raffinement
Au cours de notre projet, tout signe de douleur sera pris en charge par des mesures appropriées en fonction du niveau de douleur observé (0 à 3). Si une douleur est présente, elle sera traitée soit par l’administration d’un analgésique, soit par l’euthanasie prématurée des animaux concernés. Niveau 0 : aucune douleur, aucun inconfort détecté. Niveau 1 : douleur légère (exemple : inconfort léger au niveau d’un membre traité ou non, type légère boiterie), dans ce cas les souris seront contrôlées quotidiennement. Niveau 2 : la douleur est présente (exemple : douleur manifeste d’un membre entrainant un problème de déplacement), dans ce cas un analgésique sera administré à la souris. Niveau 3 : douleur intense (exemple : paralysie des membres traités ou non), dans ce cas un analgésique plus puissant sera administré et les animaux seront euthanasiés prématurément si nécessaire pour éviter une douleur chronique. Après les injections, les souris seront suivies quotidiennement. Le suivi de nos souris comprend une observation du comportement général (perte de poids, apathie, yeux fermés) et de la paralysie des membres postérieurs. Pour les souris qui ont des difficultés à manger de la nourriture solide (croquettes), de la nourriture en gel sera placée dans la litière de la cage. Les prélèvements sanguins et la mesure de la force musculaire in situ seront effectuées sous anesthésie générale afin d'éviter toute gêne ou douleur qui pourrait en résulter et les animaux seront mis à mort avant leur réveil.
Choix des espèces
Les outils génétiques que nous avons construits sont créés chez la souris car les modifications génétiques utilisées sont mieux établies dans ce modèle. De plus, la souris mutante que nous utiliserons est un modèle de DMD déjà existant et bien connu. La souris est donc le meilleur choix pour mener cette étude. En fonction de l'objectif des expériences, nous devrons modifier le temps d'injection. Pour obtenir une promesse de thérapie rapide et simple, l'injection intramusculaire sur un jeune animal (6 semaines) est appropriée. Pour obtenir un effet de « sauvetage » (réexpression de la protéine active) et prévenir la maladie, une injection intrapéritonéale précoce sur un nouveau-né est appropriée. Enfin, pour pouvoir guérir une maladie déjà existante ou tardive, l'injection dans le sinus retro-orbital sur un animal âgé (17 mois) est appropriée. Notre projet couvre ces trois scénarios pathologiques. Nous attendrons l’apparition des phénotypes dommageables qui devraient survenir à partir de l’âge de 4 mois pour réaliser le dosage de la créatine kinase sérique, la mesure de la force contractile et collecter les tissus pour les analyses histologiques. Les animaux seront donc testés et mis à mort à l’âge de 6 mois sauf pour l’injection dans le sinus retro-orbital sur animaux âgés qui seront mis à mort à 22 mois.
Radiothérapie vectorisée pour le traitement du glioblastome : évaluation thérapeutique et dosimétrique de nouveaux radiopharmaceutiques dans des modèles orthotopiques syngéniques murins
- Recherche appliquée
- Cancers
Pour comparer des radiopharmaceutiques émetteurs alpha contre le glioblastome, une tumeur cérébrale est greffée par chirurgie stéréotaxique puis le traitement injecté par la même voie, chaque opération durant quarante-cinq minutes. 459 souris vont être utilisées, 333 en souffrance modérée, 120 en souffrance sévère et 6 opérées sans réveil, toutes tuées pour prélever leurs organes. S'ajoutent une IRM hebdomadaire sous anesthésie pendant cent cinquante jours et cinq prélèvements sanguins, le porteur signalant que le traitement peut exposer certains organes à une dose proche du seuil toxique. Le choix de la souris plutôt que du rat est justifié par son poids dix fois plus faible, qui divise d'autant le coût du vecteur radioactif et l'irradiation des expérimentateurs.
Objectifs
Le glioblastome est le cancer du cerveau le plus agressif chez l’homme. Même avec différents traitements, la majorité des patients ne survivent pas plus de 15 mois, car les cellules du glioblastome résistent souvent à la radiothérapie et à la chimiothérapie, même après une opération. Une nouvelle méthode prometteuse est l’utilisation de la radiothérapie interne avec des particules appelées émetteurs alpha. Ces particules peuvent détruire des cellules tumorales qui, normalement, sont difficiles à éliminer. De plus, on a découvert qu’une grande partie des glioblastomes exprime une protéine spécifique à leur surface. Dans nos recherches, nous avons vu que l'utilisation d'un anticorps ciblant cette protéine, couplé à un émetteur alpha a considérablement amélioré la survie des souris atteintes de glioblastome. Le but de notre projet est d'approfondir et d'améliorer ces résultats. Pour cela, nous souhaitons : Comparer nos résultats avec ceux obtenus en utilisant deux nouveaux traitements. Evaluer ces résultats par rapport à un traitement actuellement testé sur des patients. Étendre nos recherche en utilisant un autre modèle de souris avec un glioblastome. Mieux comprendre comment ces traitements se distribuent dans la tumeur et dans le cerveau pour saisir comment fonctionnent ces émetteurs alpha. En bref, nous cherchons à perfectionner un nouveau type de traitement pour améliorer la survie des patients atteints de glioblastome.
Bénéfices attendus
Le succès de la radiothérapie interne vectorisée dépend de deux choses : Une bonne dose de radioactivité : Il faut injecter juste assez de radioactivité pour attaquer les tumeurs tout en préservant les organes sains. L’utilisation d’émetteurs alpha : Ces particules sont prometteuses car elles ont une portée plus courte et une énergie plus élevée que d'autres types, appelés émetteurs bêta. Cela signifie qu'elles peuvent délivrer plus d'énergie directement à la tumeur tout en épargnant les tissus sains voisins, comme le cerveau. Ce projet vise à mieux comprendre les doses de rayonnement que nos traitements envoient aux tumeurs. Cela nous aidera à choisir le meilleur traitement pour les essais cliniques. En plus de cela, nous allons également étudier comment ces traitements affectent biologiquement et immunitairement le corps. Comprendre ces effets peut renforcer la réponse du système immunitaire des patients, ce qui pourrait les aider à vivre plus longtemps après le traitement. En résumé, nous travaillons à optimiser un nouveau type de traitement pour le cancer qui cible les tumeurs efficacement tout en réduisant les risques pour la santé.
Procédures
Greffe stéréotaxique de la tumeur sur souris analgésiées et anesthésiées (45 minutes) Injection stéréotaxique du traitement sur souris analgésiées et anesthésiées (45 minutes) Suivi IRM hebdomadaire sur souris anesthésiées (15 à 20 minutes) sur 150 jours. Prélèvements sanguins (5) sur souris analgésiées et anesthésiées (1minute)
Impact sur les animaux
La procédure d’étude d’efficacité thérapeutique peut entrainer une exposition proche de la dose toxique pour certains organes. Pour toutes les expériences prévues, c'est l'étape de greffe orthotopique puis l'évolution tumorale qui peuvent induire des nuisances aux souris. A savoir : -1 Les greffes orthotopiques se font par chirurgie ce qui induit de la douleur. Cette douleur est gérée par un traitement analgésique préventif et postopératoire adapté. 2 L'injection en stéréotaxie du radiopharmaceutique se fait par chirurgie ce qui induit de la douleur. Cette douleur est gérée par un traitement analgésique préventif et postopératoire adapté. 3- L'évolution tumorale peut également engendrer de la douleur notamment dans les groupes contrôle.
Devenir
Mise à mort pour prélèvements d'organes.
Remplacement
Les pathologies chroniques comme le cancer sont des phénomènes complexes qui font intervenir de multiples étapes. Ces paramètres ne pouvant être étudiés in vitro de façon globale et intégrée, le recours aux animaux est indispensable. La spécificité des traitements est préalablement testée in vitro sur des cellules tumorales.
Réduction
Pour chaque étude, le nombre d'animaux utilisés est réduit à un minimum acceptable pour l’obtention d’informations robustes et statistiquement pertinentes. L’apport de l’imagerie permet de réduire le nombre de souris utilisées.
Raffinement
Les animaux seront hébergés selon la réglementation en vigueur avec un enrichissement du milieu. Les souris sont hébergées avec des frisottis pour pouvoir faire un nid , avec un libre accès à l'eau et la nourriture adaptée. Chaque cage contient un tunnel de préhension, pour pouvoir manipuler l'animal sans stress. Pour chaque procédure, les souris bénéficient d'une période d'acclimatation d'une semaine. L’état général et clinique des animaux sera surveillé de façon quotidienne ce qui permet de déterminer le palier de douleur. L’évaluation journalière permettra la mise en place et l’ajustement de traitements analgésiques lorsque ce sera nécessaire, en accord avec le palier de douleur observé. L’apport de l’imagerie permet d’une part de raffiner les modèles animaux existants et d’autre part de développer et proposer des modèles in vivo toujours plus proches des situations cliniques. Par ailleurs, l’imagerie permet de visualiser et quantifier le volume des tumeurs et donc de pouvoir, en parallèle de l’observation comportementale, d’adapter l’analgésie à mettre en place et de déterminer le jour auquel il faut procéder à la mise à mort. Pendant l’acquisition d’imagerie, les souris sont anesthésiées durant les 15 à 20 minutes de l’examen. Elles sont placées dans une cellule d’imagerie chauffante et une goutte de gel est déposée sur leurs yeux pour prévenir le dessèchement oculaire. Elles sont replacées dans leur cage dès le réveil avec libre accès à la nourriture et à l’eau.
Choix des espèces
Leur petite taille, leur grande fécondité et leur coût de production et d’entretien relativement peu élevé en font des animaux de choix. De plus, de nombreux modèles de tumeurs syngéniques ont été développés chez la souris. Il existe plus de modèles de souris que de rats. Les quantités de vecteur sont proportionnelles au poids de l'animal. Un rat pèse environ 200 grammes et une souris entre 20 et 30 grammes. Il faudrait donc injecter 10 fois plus de vecteur radiomarqué à un rat qu'à une souris pour un coût 10 fois plus élevé et une irradiation multipliée par 10 pour les expérimentateurs. A partir de 7 semaines car les souris sont adultes et les glioblastome touchent principalement les adultes. Les greffes sont faites entre 7 et 12 semaines, le suivi se fait jusqu'à 150 jours après la greffe
Impact du microbiote implanté à la naissance par une supplémentation anténatale en Human Milk Oligosaccharides (HMO) sur la prévention de l’allergie alimentaire
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
Des femelles gestantes reçoivent un complément alimentaire jusqu'au dix-neuvième jour de gestation, puis sont tuées pour une césarienne. Les nouveau-nés sont confiés à des femelles adoptantes dont la portée est tuée aussitôt le remplacement fait, et les adoptantes le sont à leur tour après le sevrage. La descendance reçoit deux injections d'allergène à vingt-huit et trente-huit jours, puis un gavage à quarante-cinq jours qui déclenche la réaction allergique, chute de température, irritation de la bouche et des oreilles, isolement, avant d'être tuée à son tour. 193 souris vont être utilisées au total, 174 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, et aucun des trois groupes ne sort vivant du protocole.
Objectifs
La vie prénatale constitue la première période au cours de laquelle l'environnement maternel, comme l’alimentation, peut influencer le système immunitaire du fœtus , via des transferts mère-enfant de facteurs immunitaires et nutritionnels, ou de facteurs bactériens. Le concept de l'origine développementale de la santé et des maladies (DOHaD) suggère que l’environnement maternel pendant la grossesse conditionne le développement du fœtus et influence le développement de futures maladies chez la descendance. Dans ce contexte, notre équipe a démontré chez la souris qu’une supplémentation durant la grossesse avec un oligosaccharide majeur du lait maternel (HMO : Human Milk Oligosaccharide) pendant la gestation protégeait de la survenue de l’allergie alimentaire chez la descendance. De plus, les femelles gestantes ainsi que leurs descendances possédaient un microbiote modifié par rapport aux souris sous-alimentation standard. Les HMOs sont connus pour leurs effets bénéfiques sur le microbiote intestinal bénéfique pour la santé. Lors d’un accouchement naturel, il existe un transfert du microbiote maternel vers le nouveau-né. Au cours de ce projet, nous souhaitons savoir si lors d’une supplémentation gestationnelle en HMO, les transferts lors de la grossesse sont suffisants à protéger la descendance de la survenue de l’allergie alimentaire ou si le microbiote implanté lors de l'accouchement est nécessaire. L’objectif de ce projet est de supprimer le transfert du microbiote maternel aux souriceaux lors de l'accouchement en réalisant des césariennes et d’évaluer si l’effet préventif de la supplémentation en HMO sur l’allergie alimentaire chez la descendance est toujours présent.
Bénéfices attendus
Nous avons déjà démontré chez la souris qu’une supplémentation durant la grossesse en HMOs protégeait de la survenue de l’allergie alimentaire chez la descendance. Nous avons également caractérisé les transferts immuns entre la mère et son fœtus in utero ainsi qu'un microbiote spécifique transmis de la mère au souriceau. Cependant nous ne savons pas quelle est la part du microbiote et celle du système immunitaire dans la prévention de l’allergie alimentaire. Le bénéfice attendu de ce projet est d’identifier chez la souris le rôle du microbiote implanté lors de l'accouchement sur la prévention de l’allergie alimentaire chez la descendance.
Procédures
L’observation d’un bouchon vaginal (quelques secondes) sera réalisée lors des sorties de reproduction, pouvant induire une légère gêne chez la souris. Une partie desfemelles reproductrices sera exposée à un aliment enrichi en un oligosaccharide du lait maternel, une semaine après leur arrivée à l’animalerie et ceci jusqu’à leur mise à mort au 19ème jour de gestation. Des fèces seront récoltées chez les descendants au jour 21 et 45 de vie. L’animal sera placé dans une cage propre sous un poste de sécurité microbiologique pendant quelques minutes, le temps de récupérer 4 à 5 fèces. Une injection intrapéritonéale sera effectuée sur les descendantes femelles 28 et 38 jours de vie afin de les sensibilisées à l’allergène. Lors de l’injection, la souris sera prise en contention pendant quelques secondes afin de réaliser une injection sûre avec une douleur minime. A 45 jour de vie, un challenge oral par gavage de l’allergène sera réalisé sur la descendance. Lors du gavage, la souris sera prise en contention pendant quelques secondes afin de réaliser un gavage oral sûr sans douleur.
Impact sur les animaux
Les femelles gestantes seront pesées tous les deux jours afin de confirmer la gestation par la prise de poids. La pesée peut occasionner un stress chez la souris par la répétition de la pesée. Ce stress est limité par une pesée rapide effectuée par une personne exercée et avec un tube pour éviter la contention. Un stress sera induit aux femelles adoptantes lors de l’échange de portée. Afin de limiter ce stress, les nouveau-nés seront imprégnés de l’odeur de la femelle adoptante par l’urine de la femelle avant de placer les nouveau-nés dans la cage de la femelle adoptante. Lors de l’injection intrapéritonéale de l’allergène, une petite lésion au niveau de l’introduction de l’aiguille peut avoir lieu. Lors du gavage oral (challenge avec l’allergène pour déclencher les symptômes de l’allergie alimentaire), les symptômes de l’allergie sont provoqués chez les souris (baisse de température, irritation bouche/oreille, isolement/diminution de l’activité). Lors de la prise de température rectale pour mesurer la chute de température induite par la réaction allergique, une irritation du colon peut avoir lieu.
Devenir
Les femelles reproductrices seront mises à mort à 19 jours de gestation afin de réaliser les hystérectomies. Les femelles adoptantes seront mises à mort après le sexage et la fin du sevrage. La descendance seront mises à mort après le challenge à 45 jours de vie.
Remplacement
Il est impossible de reproduire efficacement les systèmes biologiques très complexes que sont le microbiote et le système immunitaire intestinaux in vitro ou in silico et ce notamment dans le cadre d’interactions complexes comme ici avec des HMO et leur influence au cours de la période prénatale.
Réduction
Ce projet a été conçu pour permettre de réduire un maximum le nombre d’animaux du fait de la connaissance et de la précision des paramètres observés. Des outils statistiques ont été utilisés afin de réduire au maximum le nombre de souris par groupe pour être statistiquement relevant sur le paramètre principal de l’étude : la présence ou non de symptômes de l’allergie. Afin de limiter le nombre d’animaux, un test en amont sera réalisé afin de sélectionner la souche de souris adoptante (Balb/cJRj ou SWISS) la plus adéquate. Ce test permet de former certains utilisateurs certifiés à l’hystérectomie et à valider le choix de la femelle adoptante afin de garantir la qualité de l’adoption et la survie des nouveau-nés. Les souris surnuméraires ou non utilisées seront mises à mort ou utilisées pour des protocoles in vitro.
Raffinement
Seul le personnel expérimenté et qualifié effectuera les expérimentations animales. Ces exigences visent à s’assurer que les procédures nécessaires à l’élevage et à l'expérimentation soient exécutées efficacement, avec les soins appropriés afin de minimiser la souffrance des animaux. Un test sera réalisé en amont du protocole afin de choisir la souche des souris adoptantes et donc de valider celle permettant la meilleure qualité d’adoption, mais aussi à former le personnel aux hystérectomies et à valider l’organisation du protocole. Le suivi quotidien des animaux et des signes généraux permet de minimiser l'inconfort et la douleur. Dans le cadre du projet, une gestation compliquée peut être observée impliquant une euthanasie en fonction du tableau des points limite. Il est aussi possible d’observer une adoption problématique (ex : cannibalisme). Dans ce cas, les petits seront séparés de la femelle adoptante pour être placés dans une autre portée, ou euthanasiés si des signes de souffrances ou des blessures sont observés. Les souris seront hébergées dans des cages dans un portoir ventilé avec un cycle jour/nuit de 12h (température, humidité) à 2 (femelles reproductrices), 1 (mâle reproducteur) et 4 (descendants) par cage selon les groupes dans un environnement avec au moins 2 enrichissements (dôme, tube, coton) pour limiter l’angoisse et s’adapter à nos expériences pour des raisons pratiques de logistique. Dans notre animalerie, nous avons observé lors des différents protocoles de reproduction que les mâles, une fois entrés en reproduction, deviennent plus agressifs envers leurs congénères du même sexe. Afin d’assurer le bien-être de nos animaux, les mâles reproducteurs seront hébergés à 5 par cage avant la première reproduction puis 1 par cage par la suite. Une demande de dérogation pour l’hébergement des mâles a été ajouté à ce projet.
Choix des espèces
Nous avons démontré chez la souris Balb/cJRj que les prébiotiques et les HMO administrés lors de la grossesse protégeaient la descendance de la survenue de l’allergie alimentaire. Afin de rester cohérent dans nos études nous devons rester sur la même espèce de souris. Les souris mâles et femelles reproducteurs seront âgées de 6 semaines à leur arrivée. Les souris seront mises en reproduction à 8 semaines de vie, l’âge où elles sont mâtures sexuellement. Les souris gestantes seront mises à mort au 19ème jour de gestation afin de réaliser les césariennes. Si la reproduction n’a pas été efficace, les souris non enceinte seront de nouveau accouplées avec d’autres mâles la semaine suivante et ceci, jusqu’à ce que le nombre de descendants nécessaire soit atteint. Les souris certifiées gestantes arriveront à l'animalerie au 15ème de jour de grossesse. Ces femelles accoucheront 1 ou 2 jour avant les césarienne. Le jour des césarienne, les nouveau-né seront adoptés par ces souris adoptantes. La portée des femelles adoptantes seront mis à mort, une fois le remplacement réalisé. Après le sexage réalisé à 21 jours de vie, les descendants mâles et femelles seront séparés, afin de poursuivre le protococole.
Evaluation chez la vache laitière de l’effet de traitements dirigés contre les mammites
- Recherche appliquée
- Maladies animales
- Tests réglementaires
- Autres tests de tolérance et d’efficacité
Gardées vivantes et réintégrées au troupeau après un mois de repos minimum, 140 vaches laitières sont réutilisables d'une étude à l'autre. Elles vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, une mammite leur étant provoquée par inoculation de bactéries ou d'un immunostimulant dans le canal du trayon. Suivent trois à six administrations de traitement par le trayon, dix à douze prélèvements sanguins en vingt-quatre à quarante-huit heures, des palpations de la mamelle à chaque traite et des prises de température rectale plusieurs fois par jour, le gonflement et la douleur de la mamelle pouvant durer une semaine. Le porteur range parmi les bénéfices attendus la guérison de l'animal, mais aussi "le rendement de l'éleveur" et le développement de médicaments par l'industrie vétérinaire.
Objectifs
L’objectif du projet est d’évaluer chez la vache laitière, l’efficacité de nouveaux traitements dirigés contre les mammites. Au cours de ce projet, l’efficacité de traitements sera évaluée sur des animaux présentant des mammites expérimentales infectieuses ou non infectieuses. Les modèles d’infection et d’inflammation sont des modèles mis en place d’après des modèles décrits dans la littérature et adaptés pour induire des signes légers à modérés de mammite sur une courte durée. Les traitements sont testés chez l’espèce de destination et de ce fait une sélection préalable de formulations ne présentant pas de risque pour l’animal sera réalisée (composants du médicament, volume à administrer). Les traitements seront administrés par voie intramammaire ou par injection (intraveineuse, intramusculaire ou sous-cutanée) selon les bonnes pratiques vétérinaires d’administration. Plusieurs études pourront être conduites afin d’améliorer le type de formulation, la combinaison de différents traitements, la voie, la dose ou la fréquence d’administration des traitements testés.
Bénéfices attendus
Une mammite se traduit par une diminution de la production de lait et une modification de sa composition avec des variations importantes selon la bactérie responsable de la mammite et selon sa gravité, une modification possible de la mamelle et de l’état général de l’animal. Certains cas de mammites sévères peuvent entrainer des dommages permanents à la glande mammaire avec un arrêt de la production de lait, et dans le pire des cas, la mort de l’animal. L’efficacité d’un traitement dirigé contre les mammites peut se démontrer par la guérison de l’infection (élimination de la bactérie infectante) mais aussi par une amélioration clinique (disparition des signes inflammatoires induits par l’infection). Dans le cadre de la recherche et du développement de médicaments vétérinaires, les produits destinés à prévenir ou guérir les infections permettent de limiter les conséquences d’une maladie, d’améliorer de façon notable le bien-être de l’animal et le rendement de l’éleveur. La preuve de concept d’efficacité de nouveaux traitements doit être évaluée sur l’animal présentant les caractéristiques de la maladie ciblée. Au-delà du bénéfice pour l’animal avec la guérison de la maladie, ce projet bénéficiera aux producteurs laitiers, vétérinaires d’exploitation et à la santé publique.
Procédures
Tous les gestes techniques seront réalisés sur animaux vigiles. Tous les animaux entrant dans une procédure auront tous les gestes techniques associés à l’exception de la voie d’administration des traitements qui pourra varier selon les groupes dans une même procédure (exemple comparaison d’une voie d’administration intramammaire par rapport à une administration intraveineuse) et des prélèvements sanguins qui ne seront pas obligatoirement réalisés lors des procédures impliquant des traitements par voie intramammaire. Voici l'ensemble des gestes pouvant être effectué sur un animal : - Inoculation de la solution induisant la mammite (1 à 10 mL) via le canal du trayon, 1x par procédure - Administration du (des) traitements : Par voie intramammaire via le canal du trayon, 1 ou 2 applicateurs / quartier, généralement 3 à 6 administrations à 12h/24h d’intervalle (après chaque traite). Par voie générale, une administration unique - Prélèvements Lait : lors de la traite biquotidienne sur tout ou partie de l’étude. - Prélèvements Sang : 10 à 12 prélèvements pendant les 24 à 48 heures suivant l’administration du traitement - Mesures de température rectale : 1 à plusieurs fois par jour sur tout ou partie de l’étude. - Palpation de la mamelle : lors de la traite biquotidienne sur tout ou partie de l’étude.
Impact sur les animaux
Dans le cadre de l’évaluation de l’efficacité d’un traitement, les vaches devront d’abord présenter les signes de mammite. A cette fin, des mammites expérimentales seront induites chez l’animal. Les nuisances ou effets indésirables attendus seront plus ou moins importants selon le type de mammite induite et seront principalement : - une modification de l’apparence du lait (présence de quelques grumeaux dans le lait), - un gonflement de la mamelle, - une douleur de la mamelle à la palpation ou lors de la traite, - une diminution de la production laitière, - une augmentation transitoire de la température rectale de l’animal, - une légère modification de l’état général de l’animal, - un stress modéré dû aux manipulations multiples et inhabituelles dans les conditions d’hébergement hors procédure. Selon l’agent utilisé pour induire la mammite, ces nuisances et effets indésirables pouvant impacter le bien-être de l’animal pourront persister jusqu’à 1 semaine. Des nuisances légères liées à certaines interventions sur l'animal sont attendues (Par exemple, lors de la réalisation d'injections ou de prises de sang).
Devenir
Tous les animaux utilisés dans le projet seront réintroduits dans le stock des animaux hébergés dans les locaux de l’EU. L’effet cumulatif est évalué par le vétérinaire de l’EU en collaboration avec le(s) directeurs(s) d’étude(s) selon le type de produits administrés. Les animaux peuvent être réutilisés après une période de repos suffisante entre 2 études pour s’assurer de l’élimination totale de l’organisme du dernier traitement administré ; cette durée ne peut être inférieure à 10 fois la demi-vie du produit si celle-ci est connue ou 1 mois si celle-ci n’est pas connue. Tout autre délai devra être justifié et validé par le vétérinaire de l’EU. De plus, tout animal réutilisé fait l’objet d’une visite du vétérinaire de l’EU qui certifie que l’animal a pleinement recouvré son état de santé et de bien-être général et peut être ré-inclus dans une nouvelle étude sans dommage pour lui.
Remplacement
Il n’existe pas de méthode alternative pour reproduire une infection ou une inflammation de la glande mammaire et évaluer l’efficacité d’un traitement. Une mammite est une maladie multifactorielle impliquant : • L’animal : statut physiologique, état de santé… • L’agent déclencheur : virulence, capacité à pénétrer les cellules de l’hôte, à former des biofilms pour les bactéries, / dose ou puissance des immunostimulants… • L’environnement : conditions d’élevage, qualité de l’alimentation, hygiène de traite…
Réduction
Dans la mesure du possible, des approches in vitro sont réalisées afin de sélectionner les meilleurs candidats pour un passage in vivo et limiter le nombre d’animaux inclus dans les procédures. La mamelle de la vache est constituée de 4 quartiers anatomiquement et physiologiquement indépendants. Afin de réduire le nombre d’animaux en limitant l’impact sur le bien-être de l’animal, les infections expérimentales seront induites autant que possible sur deux quartiers. Le calcul du nombre d’animaux minimum nécessaire a de plus été estimé grâce à des études préliminaires. Si plusieurs études sont nécessaires, elles seront réalisées successivement, et les animaux pourront être réutilisés dans les études suivantes après totale guérison et une période de repos de 30 jours minimum. Il sera possible de réduire le nombre d’animaux par groupe, au cas par cas, selon la finalité de l’étude. Cette décision sera dûment justifiée dans le plan d’étude spécifique à la procédure suivie dans le cadre de ce projet.
Raffinement
Les animaux seront hébergés dans les conditions standards d’élevage d’un troupeau laitier à savoir hébergement en groupe, en stabulation ou en extérieur selon la saison. Les vaches incluses dans une procédure expérimentale sont généralement hébergées en intérieur sur tapis de sol dans les zones prévues pour le repos et avec des tapis antidérapages sur les zones de circulation. Un système de ventilation et d’aspersion est prévu en période de forte chaleur. La stabulation est nettoyée quotidiennement (robot racleur) et des brosses automatiques sont à disposition des animaux en permanence. Tous les actes sur les animaux seront réalisés par du personnel expérimenté ou par le vétérinaire. L’utilisation d’un modèle de mammite non infectieuse permettra d’induire des signes transitoires de mammite en s’affranchissant de la stimulation par les bactéries présentes lors d’un infection bactérienne. Les administrations intramammaires (bactéries ou immunostimulants pour l’induction des mammites et traitements) seront effectuées en salle de traite et aucune contention particulière des animaux ne sera nécessaire. Dans le cas d’un traitement par voie générale (intraveineuse, intramusculaire, sous-cutanée), les animaux seront maintenus au cornadis durant la période du traitement (généralement moins de 5 min) en accord avec les pratiques vétérinaires habituelles. Dans le cas de prélèvements de lait réalisés lors des procédures (1 et 2), les animaux seront en salle de traite et aucune contention particulière des animaux ne sera nécessaire pendant les prélèvements. Dans le cas des prélèvements sanguins ou des prises de températures rectales réalisés si besoin lors des procédures, les vaches seront maintenues au cornadis durant la période nécessaire à l’activité (généralement moins d’1 heure). Le maintien des vaches au cornadis sera fait en accord avec les pratiques vétérinaires habituelles et facilitera la collecte des échantillons et/ou des données, permettra de diminuer le stress de l’animal, et réduira les risques pour le personnel.
Choix des espèces
L’espèce de destination des traitements contre les mammites étant la vache laitière et l’absence d’alternative à l’utilisation d’animaux justifie l’utilisation des vaches dans ce projet. L’objectif du projet est l’évaluation de nouveaux produits destinés au traitement des mammites chez des vaches laitières en lactation. Ceci correspond à des animaux adultes de plus de 2 ans dans les pratiques classiques d’élevage laitier. Les mammites pouvant apparaitre à tout stade de la lactation, les études pourront inclure des animaux à partir de 15 après vêlage jusqu’au tarissement.
Etude des évènements vasculaires précoces dans la physiopathologie de l’AVC ischémique : développement d’une nouvelle approche en imagerie chez l’animal vigile
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
- Système nerveux
Un AVC est provoqué chirurgicalement chez des souris éveillées, après pose d'un cathéter veineux et, pour 1 280 d'entre elles, d'une prothèse crânienne, l'opération durant de quarante-cinq minutes à une heure et demie. 1 760 souris vont être utilisées, 1 440 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, toutes tuées à l'issue. Le porteur écarte tout maintien en vie au motif qu'il n'est pas concevable de réhabiliter ou de réutiliser des souris ayant subi une ischémie, et affirme que les procédures ont un caractère de "stricte nécessité". Deux tests comportementaux sont annoncés pour évaluer la récupération sensorielle et motrice avant l'AVC puis vingt-quatre heures après, sans que le texte précise lesquels.
Objectifs
L’Accident Vasculaire Cérébral (AVC) est la 1ère cause de handicap acquis chez l’adulte, posant un problème majeur à la fois pour la santé publique et pour les patients eux-mêmes. Chaque année environ 17 millions de personnes dans le monde connaitront un épisode d'AVC pouvant entrainer des séquelles plus ou moins sévères voir la mort de l’individu. Actuellement, le traitement des AVC repose sur l’injection intraveineuse d'un médicament aidant à dissoudre le caillot sanguin (tPA ou activateur tissulaire du plasminogène) associée ou non intervention pour retirer le caillot (thrombectomie). Toutefois, seule une faible proportion des patients (moins de 10%) y sont éligibles. L’AVC est donc un problème de santé publique et nécessite le développement de nouvelles approches thérapeutiques afin d’élargir la prise en charge des patients. Pour cela, un travail doit être réalisé afin de se placer dans les conditions les plus proches de la clinique humaine et permettre ainsi de mieux appliquer les résultats obtenus en laboratoire aux phases cliniques. Dans cette volonté d’adopter une démarche translationnelle dans les projets de recherche, un modèle davantage en adéquation avec la clinique doit être mis en place. C’est ce qui a été fait précédemment au laboratoire via la mise en place d’un modèle murin d’AVC ischémique chez l’animal éveillé permettant d’exclure tout impact de l’anesthésie qui pourrait perturber les résultats. Les anesthésiques peuvent modifier le fonctionnement cérébral et notamment la circulation sanguine ce qui peut interférer avec l'évolution de l’AVC mais aussi biaiser les résultats obtenus quant à l’efficacité de certaines traitements. Le but de ce projet est de caractériser les évènements vasculaires survenant au plus proche de l'AVC ainsi que les modifications et altérations des vaisseaux sanguins post-AVC afin de déterminer de nouvelles stratégies thérapeutiques et diagnostiques. Les différents modèles utilisés dans cette étude permettront de recréer les différents profils d’AVC ischémiques observés en clinique. Cette étude pourra à terme permettre d'améliorer la prise en charge de patients suspectés d'AVC et minimiser ainsi ses conséquences à long terme. Enfin, une nouvelle méthode d’imagerie par ultrasons sera utilisée pour évaluer si elle peut être utilisée en tant que technique de diagnostic rapide, directement au lit des patients, pour confirmer la présence d’un AVC.
Bénéfices attendus
Le bénéfice attendu de ce projet est de mieux comprendre les évènements vasculaires précoces survenant très tôt après le début d'un AVC afin de déterminer leur rôle dans le développement de l'ischémie et des séquelles à long terme. Les différents modèles utilisés dans cette étude permettront d’être au plus proche des situations rencontrées en clinique humaine. Dans ce but, nous proposons de caractériser les différents évènements vasculaires survenant au cours d’un AVC ischémique chez l’animal éveillé à l'aide de deux approches permettant d'induire un AVC avec des caillots sanguins de compositions différentes comme cela est le cas en clinique mais également chez l'animal anesthésié présentant une diversité des zones cérébrales atteintes de part une localisation aléatoire des caillots sanguins formés. Le bénéfice de ce projet serait donc de pouvoir caractériser et étudier les différents évènements vasculaires survenant lors d’un AVC ischémique et cela au plus près de la survenue de ce dernier. Ceci nous permettrait également de comprendre les mécanismes physiopathologiques survenant au plus près de l’AVC et amènerait ainsi l’opportunité de déboucher sur des études cliniques et la possibilité d’augmenter le succès de transpositions de résultats précliniques à la clinique humaine. De plus, ce projet offre la possibilité d'évaluer le potentiel diagnostique d'une nouvelle méthode d'imagerie à ultrasons offrant l'avantage de pouvoir être réalisée au lit du patient. In fine, ce projet offrirait la possibilité d’adapter les pratiques cliniques en modifiant les protocoles de prises en charge et/ou thérapeutiques des patients sujets à un AVC et adopter une approche d'imagerie plus accessible en clinique.
Procédures
Les animaux seront soumis a: 1 - Pose d’un cathéter intraveineux (n=1760, durée de la procédure :15 minutes); 2 - Chirurgie pour induire un AVC (n=1760 souris, durée de la procédure entre 45 minutes et 1.5 heures); 3 - Pose de prothèse crânienne (n=1280, durée de la procédure: 30minutes); 4 - 5 procédures d'imagerie : (n=1780, durée de la procédure : 30 minutes); 5- 3 protocoles comportementaux : 5.1 Habituation à la contention et aux examens d'imagerie : une habituation par jour pendant 5jours consécutifs, avec des sessions augmentant progressivement de 15minutes jusqu'à 1h30 au total (n=1280). 5.2 2 tests comportementaux pour évaluer la récupération des fonctions sensorielles et motrices (avant induction de l'AVC et 24heures après; durée de la procédure: 5min, n=1760).
Impact sur les animaux
Les nuisances et effets indésirables étant susceptibles d'apparaitre chez les animaux lors de la procédure seraient : - un stress lors des premières sessions d'habituation à la contention, - des douleurs postopératoires après la pose de prothèse, - une perte de masse corporelle après les anesthésies et l'induction de l'AVC, - des douleurs post-opératoires après la chirurgie d'accès à l'ACM, - un stress dû à la survenue de l'AVC chez la souris éveillée, - des douleurs post-opératoires après l'induction de l'AVC sous anesthésie, - des déficits fonctionnels à la suite de l'AVC. Ces effets sont connus dans l’expérimentation au laboratoire. Une surveillance accrue sera réalisée à chacune de ces étapes. L’animal sera gardé en vie uniquement dans le cas où une personne compétente atteste de l’état de bien-être de l’animal suite à chaque étape de la procédure.
Devenir
L'ensemble des animaux utilisés dans ce projet (1760) feront l'objet d'une mise à mort à la fin de chaque procédure. Il a été décidé de ne garder aucun animal en vie car il n'est pas concevable pour leur bien-être de réhabiliter ou réutiliser des souris ayant subi une procédure sévère telle qu'une ischémie. De plus, les tissus générés permettront des observations histologiques étudiant ainsi l'intégrité anatomique et vasculaire ainsi que les altérations induites suite à la survenue d'un AVC.
Remplacement
Nous ne pouvons souscrire au principe de remplacement dans ce protocole. En effet, il est nécessaire d'utiliser des animaux dans le cadre de notre protocole. Les procédures expérimentales pour réaliser ce projet ont un caractère de stricte nécessité et ne peuvent pas être remplacées par d'autres méthodes expérimentales n'impliquant pas l'utilisation d'animaux vivants car des techniques de remplacement ne sont pas susceptibles d'apporter le même niveau d'information. En effet, il s’agit d’étudier un modèle vivnat avec tous les mécanismes vasculaires survenant lors d'un l'AVC. Les effets de molécules pharmacologiques sur le développement des lésions cérébrales ainsi que la récupération fonctionnelle ne peuvent être investigués autrement que via un modèle in vivo. Ce projet concerne les modèles animaux les plus utilisés dans le cadre d’étude sur l’AVC et les connaissances acquises notamment dans la réalisation de procédure chez l’animal éveillé rendent l’emploi de la souris particulièrement intéressantes pour les études portant sur l’AVC. Les conditions d'élevage, d'hébergement, de soin et les méthodes utilisées sont les plus appropriées pour respecter le bien-être de l’animal. Le projet est justifié d’un point de vue scientifique car il permettra des recherches fondamentales, translationnelles et/ou appliquées pour le diagnostic et le traitement de différentes pathologies humaines). L’ensemble des acquis et des connaissances dont nous disposons rend cette espèce (souris) particulièrement intéressantes dans le cadre des études portant sur l'AVC.
Réduction
Conformément à la règle des 3R, avant de procéder à une telle étude, nous nous sommes assurés d’utiliser le nombre minimal d’animaux adéquat pour obtenir des résultats significatifs en réduisant le plus possible les effectifs afin de souscrire au principe de réduction . Le nombre d’animaux utilisé est déterminé en fonction de la spécificité/sensibilité des méthodes utilisées, à partir de nos expériences précédentes, de nos données sur chaque modèle et des données disponibles dans la littérature. A partir de ces données, nous avons utilisé des outils statistiques afin de déterminer le nombre minimal d'animaux nécessaire pour obtenir des résultats significatifs. Ainsi, les procédures décrites dans ce projet ont un caractère de stricte nécessité. L’utilisation d’outils d’imagerie non invasif (IRM, échographie) permet de réduire significativement le nombre d’animaux utilisés et de réaliser un suivi longitudinal contribuant à la réduction des groupes expérimentaux tout en disposant de données obtenues à partir des différents paramètres étudiés. L'utilisation d'un animal pour un enchainement de procédures légères et modérées réduit également le nombre total d'animaux.
Raffinement
Afin de souscrire au principe de raffinement, les animaux seront anesthésiés et analgésiés durant chaque procédure. Les animaux seront hébergés dans des cages standards. Pour éviter de stresser les animaux, les cages seront isolées de tout bruit extérieur et l’accès à l’eau et à la nourriture sera ad libitum. Les cages seront enrichies (coton et papier kraft en quantité pour la fabrication d'un nid, ainsi que des paillettes et un morceau de bois). Le bien-être des animaux sera suivi quotidiennement par du personnel qualifié 7j/7, cela pendant toute la durée du projet. Une attention particulière est accordée à l'état général, à l'évolution de la masse corporelle, au comportement de chaque animal et à leur bien-être. Les expériences seront réalisées en respectant les règles de bonnes pratiques de laboratoire pour le respect des animaux, tout en veillant à ne pas dépasser les points limites fixés au préalable. Tout sera mis en oeuvre pour réduire l’angoisse, la souffrance et la douleur de chaque animal, pouvant être occasionnées pendant le projet. Les principes éthiques et les standards de raffinement seront utilisés jusqu’à la mise à mort de l’animal.
Choix des espèces
La souris est l’espèce animale la plus étudiée dans les neurosciences, et notamment dans le développement de thérapies et d'outils diagnostiques. C’est également l’espèce de référence pour étudier l’inflammation et l’ischémie cérébrale dans la littérature. Les connaissances et acquis dont nous disposons au laboratoire et dans la littérature rendent cette espèce particulièrement intéressante pour étudier l’AVC ischémique. L’anatomie et la physiologie de la circulation cérébrale sanguine de la souris sont bien connues et semblables par leurs grands traits à celles de l’homme. De plus, un travail préliminaire de développement du modèle d’AVC ischémique chez l’animal éveillé a été mené au laboratoire chez la souris et permet d’avoir une expertise pour l’application du protocole. Deux types de souris, présentant des réseaux vasculaires et des réponses à l'ischémie différentes comme observées chez l'homme, seront utilisés. Ces souris sont régulièrement utilisées en recherche, d'où l'intérêt de valider ce modèle sur ces dernières. Les souris utilisées seront de jeunes adultes, entre 5 et 9 semaines (5 semaines lors du début du protocole, et 9 semaines arrivées à la fin du protocole). Nous réaliserons nos modèles sur des jeunes adultes soit des animaux de même stade de développement que ceux utilisés en majorité dans les modèles d’AVC nous permettant ainsi de pouvoir comparer les données de cette étude avec la majorité des données obtenues au laboratoire sur les modèles d’AVC. Les animaux seront commandés à l'âge de 5 semaines afin de leur laisser un temps d'acclimatation à leur nouvel environnement.
Etude des effets thérapeutique et immunitaire de la combinaison chimio-immunothérapie et thérapie ciblées dans les modèles murins de cancers du côlon, du poumon et du pancréas.
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
6 900 souris vont être utilisées, chacune portant une tumeur greffée sous la peau du flanc et recevant jusqu'à neuf injections d'immunothérapie en trois semaines, plus neuf gavages quotidiens de thérapie ciblée. Toutes sont tuées, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. La masse tumorale peut gêner les déplacements et dégrader l'état général, la mise à mort intervenant quand la croissance de la tumeur atteint le seuil fixé. Le but déclaré est d'optimiser des combinaisons de chimiothérapie et d'immunothérapie déjà utilisées en clinique, la perspective d'essais thérapeutiques dans les cancers du poumon et du pancréas restant au conditionnel.
Objectifs
Le but du projet est d’évaluer l’efficacité antitumorale d’une association de traitement anticancéreux (immunothérapie et chimiothérapies) utilisées en clinique dans plusieurs modèles de cancers du côlon, du poumon ou du pancréas chez la souris.
Bénéfices attendus
Le but de ce projet est d’évaluer des combinaisons de traitement utilisable chez l’homme et ayant des propriétés anti-tumorales. L’intérêt de ce travail est donc de mieux comprendre l’impact de ces nouvelles associations sur la croissance du cancer et d’évaluer l’effet qu’ils peuvent avoir sur la réponse immunitaire. Nous nous intéresserons en particulier à la capacité de certaines chimiothérapies et de thérapies dites « ciblées » (spécifique de la cellule cancéreuse) d’augmenter l’effet des médicaments d’immunothérapies. In fine, notre projet devrait nous permettre d’optimiser l’utilisation de ces traitements et de proposer la mise en place d’essais thérapeutiques dans le cancer du poumon et du pancréas.
Procédures
- Injection sc des cellules cancéreuses murines : - Geste réalisé sous anesthésie générale gazeuse - Une seule injection par animal - Durée : 5 minutes - Traitements par chimiothérapie (ip) : - Geste réalisé sur animal vigil - Une seule injection par animal - Durée : 30 secondes - Traitements par immunothérapie (ip) : - Geste réalisé sur animal vigil - Une injection trois fois par semaine pendant 3 semaines maximum par animal - Durée : 1 minute - Traitements par thérapie ciblée par voie orale : - Geste réalisé sur animal vigil - Une administration par jour pendant 9 jours par animal - Durée 1 minute - Traitements par anticorps (ip): - Geste réalisé sur animal vigil - Une injection trois fois par semaine pendant 3 semaines maximum par animal - Durée : 1 minute
Impact sur les animaux
L’injection de cellules tumorales en sous-cutané génère une masse tumorale au niveau du flanc droit pouvant gêner la liberté de mouvement de l’animal. Une altération de l’état général est possible, du fait de la pathologie cancéreuse induite. D’éventuels effets secondaires des traitements anti-cancéreux sont possibles : les chimiothérapies, immunothérapies et thérapies spécifiques utilisées ont déjà fait l’objet de recherches sur l’animal, il n’est pas attendu d’effet secondaire important. Gêne et douleur associées à l’administration des traitements par gavages et par injections en i.p.
Devenir
Dans ce projet deux axes de travail sont prévus : Nous avons prévu de faire des analyses de croissance tumorale et de survie. Lorsque les points limites seront atteints (en lien avec la croissance de la tumeur), les souris seront euthanasiées comme décrit précédemment. Si des souris présentent une guérison à long terme une récupération d’organes (rate, ganglion) et de sang sera faite de manière à évaluer la mémoire immunologique dirigée contre la tumeur. Enfin, nous avons prévu d’étudier la réponse immunitaire dans les tumeurs à différents temps d’analyse.
Remplacement
Le cancer est une maladie complexe impliquant des mécanismes de contrôle et des interactions possibles seulement dans un organisme vivant. En effet, la recherche a permis de comprendre l’importance de l’environnement dans lequel le cancer se développe et les multiples interactions avec le système immunitaire, le stroma tumoral, le système vasculaire et le métabolisme. Par ailleurs, les thérapies que nous cherchons à évaluer impliquent la présence d’un système immunitaire compétent. En conséquence, pour être prédictifs, l’évaluation de l’efficacité ou de l’échec de nouvelles combinaisons thérapeutiques en oncologie doit être réalisée sur les organismes vivants. Nous réalisons à ces fins des études translationnelles sur des modèles d‘animaux greffés avec des cellules tumorales.
Réduction
Les expériences ne seront réalisées que deux fois ce qui permet donc de réduire le nombre d’animaux de l’étude tout en en conservant la puissance statistique nécessaire. Le test statistique utilisé sera celui de Kruskal-Wallis en raison de la présence de nombreux groupes. Les différents modèles utilisés dans ce projet sont nécessaires. En effet, selon les mutations intrinsèques des cellules cancéreuses utilisées, le microenvironnement tumoral sera différent et affectera par conséquent la réponse aux traitements. Les expériences de croissances tumorales seront réalisées en premier. Si aucune différence entre les différents groupes n’est observée pour tous les modèles, les expériences d’immunomonitoring ainsi que les expériences sur le rôle des lymphocytes T CD8, T CD4, NK et de la voie CXCR/IFNAR1 (partie II) ne seront pas réalisées.
Raffinement
Les animaux seront hébergés dans des conditions qui répondent à leurs besoins (groupes, environnement enrichi) et seront habitués aux techniques de préhension. Les animaux sont suivis au minimum 3 fois par semaine par des techniciens responsables d’études. Une anesthésie générale gazeuse sera réalisée avant chaque greffe. Certains points limites peuvent survenir, ce qui conduira dans un premier temps à un arrêt des traitements, puis si persistance à la mise à mort de l’animal.
Choix des espèces
Les souris présentent des caractéristiques physiologiques qui permettent une variété de techniques d’administration et de prélèvement présentant des analogies avec ce qui est réalisé en recherche clinique sur l’homme. Diverses souches de souris immunocompétentes sont disponibles pour l’établissement de modèles tumoraux syngéniques, indispensables à la recherche préclinique en immuno-oncologie. Les animaux seront utilisés à l’âge adulte (entre 8 et 12 semaines d’âge) pour la mise en œuvre de modèles expérimentaux stables et reproductibles avec des animaux possédant un système immunitaire mature et un poids corporel > 20g.
Etude du dialogue cellules épithéliales-fibroblastes dans le cancer colorectal
- Recherche appliquée
- Cancers
- Troubles gastrointestinaux
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système gastrointestinal
Une colite est provoquée par un produit ajouté à l'eau de boisson pendant six à sept jours, répétée sur plusieurs cycles, avec diarrhées et perte de poids de 5 à 10 %, et des injections dans l'abdomen déclenchent ensuite un cancer du côlon. 5 004 souris vont être utilisées, toutes tuées pour prélever leurs organes, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le projet porte sur le dialogue entre cellules épithéliales et fibroblastes du côlon, avec des cibles thérapeutiques annoncées à long terme. Le porteur écrit que la colite provoque une douleur qu'il ne peut traiter ni par analgésique ni par anti-inflammatoire, ceux-ci fausseraient les résultats, et détaille par ailleurs les cabanes en carton, la pâtée et le fond musical installés dans l'animalerie.
Objectifs
Le cancer colorectal est le 3° cancer le plus répandu et le 2° cancer qui tue le plus de patients au monde. Les patients atteints de maladies inflammatoires chroniques de l’intestin, telles que la colite ulcéreuse et la maladie de Crohn, présentent un risque accru de développer un cancer du côlon. Les patients atteints d’un cancer du côlon suite à une inflammation présentent un pronostic plus sombre que ceux atteints d’un autre type de cancer du côlon, car l’inflammation chronique augmente leur agressivité. De plus, souvent indolore, il est fréquemment diagnostiqué aux derniers stades de la croissance tumorale, ce qui diminue l’efficacité des traitements proposés aux patients et augmente la résistance des tumeurs à ces mêmes traitements. Malgré l’ampleur de cette pathologie dans la population, les cellules et les molécules responsables du déclanchement et de la progression de cette maladie restent encore mal comprises. En conséquence, un grand nombre de cas ne sont pas efficacement diagnostiqués puis soignés. Notre projet est centré sur l’étude du dialogue entre les deux types de cellules les plus importantes du côlon. Ces deux types de cellules interagissent entre elles pour maintenir la structure du côlon, le réparer et coordonner la réponse immunitaire mise en place en cas d’agressions. Leur nombre est très fortement augmenté en pathologie et notamment lors d’une inflammation ou pendant la progression du cancer. Découvrir le rôle précis de ces deux types de cellules et les molécules qu’elles libèrent, pourrait ouvrir la voie vers de nouveaux traitements. Les modèles animaux de pathologies intestinales (inflammation aigue et chronique ou cancer du côlon) constituent des outils importants pour étudier le déclanchement et le développement de ces maladies. Par exemple, ils permettent de suivre les changements des tumeurs depuis une tumeur bégnine à une tumeur plus agressive comme cela a été observé chez l’homme. Enfin, les modèles animaux permettent aussi de tester de nouveaux traitements et étudier la réponse des tumeurs à ces traitements.
Bénéfices attendus
Notre projet, centré sur l’étude du dialogue entre les deux types cellulaires majoritaires du côlon, permettra de mettre en lumière de nouveaux mécanismes favorisant ou inhibant le développement du cancer colorectal. A court terme, l’utilisation des modèles animaux des colites aigues, chroniques et du cancer colorectal permettront de délimiter les similitudes entre ces pathologies induites chez l’animal et les caractéristiques des maladies humaines correspondantes. A long terme, la description de nouvelles cibles thérapeutiques impliquées dans le dialogue entre les fibroblastes et les cellules épithéliales pourront être proposées dans le traitement des patients atteints de cancer colorectal liés à une maladie inflammatoire chronique de l’intestin.
Procédures
Les seules interventions sur animal vigile prévues dans cette étude sont des injections intrapéritonéales. Ces injections sont soit unique, comme celle d’un agent inducteur de mutation pour induire un cancer ; soit double, à deux jours d’intervalle, pour induire la perte du gène d’intérêt. Étant donné notre expérience, chaque injection ne dure pas plus 2-3 secondes avant que l’animal ne revienne dans sa cage. Tous les prélèvements d’organes seront réalisés après anesthésie et euthanasie de l’animal.
Impact sur les animaux
Les injections en intrapéritonéal représentent le premier effet indésirable attendu chez les animaux. Notre pratique régulière de ces injections nous permet de réduire au maximum le temps de contention et d’injection. Les cages restent sous surveillance rapprochée au moins 20minutes après toute injection pour détecter le plus rapidement possible les signes de souffrance chez les animaux (prostration). Les effets indésirables attendus chez les animaux résultent essentiellement de la prise, dans l’eau de boisson, du traitement qui induit une inflammation localisée au niveau du colon. La prise du traitement pendant 6 ou 7 jours induit une altération de la paroi du colon qui provoque une perte de poids entre 5 à10% chez les souris. Cette perte est due à une mauvaise absorbation des aliments et une perte d’eau suite à des diarrhées. Ces effets apparaissent au jour 6 après le début du traitement pour une perte maximale à jour 8 ou 9, puis les souris reprennent très vite du poids pour revenir à leur poids initial en 3-4 jours. Nous n’avons jamais observé une prise d’eau augmentée par les souris au cours de cette procédure, qui pourrait révéler une déshydratation des animaux. D’après la littérature et notre expérience de cette procédure, la perte de poids survient majoritairement lors du 1er cycle de traitement car il est courant que les souris perdent moins de poids lors des deux cycles suivants. Enfin, nos observations des projets précédents montrent que les souris sont susceptibles de développer de multiples tumeurs du côlon avec ce modèle, sans que leur mobilité, leur appétit et leurs relations sociales soient altérées. Comme chez l’homme, la présence de polypes intestinaux est souvent asymptomatique.
Devenir
Tous les animaux utilisés dans chaque procédure de ce projet seront euthanasiés pour le prélèvement d'organes.
Remplacement
Nous pouvons envisager de faire des expériences in vitro sur des cellules épithéliales intestinales et des fibroblastes isolés du colon pour étudier le caractère autonome des modifications génétiques dans ces deux types cellules. Par contre, Il n’existe pas d’alternative autre que l’utilisation d’animaux génétiquement modifiés pour évaluer avec précision et pertinence, le rôle des nouveaux gènes de notre étude dans le dialogue qui peut se mettre en place entre les cellules épithéliales tumorales et les cellules de l’environnement comme les fibroblastes. Nous utiliserons le modèle souris, permettant l’inactivation des gènes d’intérêt.
Réduction
La demande de projet actuelle reprend des procédures déjà réalisée sur d’autres lignées de souris (dans une demande précédente). Ceci nous permet de définir avec précision le nombre de souris suffisant par groupe, pour chaque procédure, afin de générer des données statistiquement robustes tout en prenant en compte une éventuelle variation inter-individuelle ou expérimentale. Ce nombre a été validé par le service de statistique de notre institut pour atteindre un chiffre permettant de valider statistiquement les résultats observés.
Raffinement
Les colites entrainent une douleur pour laquelle il n’est pas possible d’administrer de traitement analgésique ni anti-inflammatoire, qui interféreraient avec le processus de régénération/cancérisation et donc modifieraient les résultats de l’expérimentation. La surveillance des animaux se fera de manière accrue lors de visites quotidiennes. Certaines souris pouvant être gênées plus que d’autres par la colite, de la nourriture pourra également être placée à même le sol de la cage pour s’assurer que toutes les souris puissent se nourrir correctement. De plus, elles auront à leur disposition dans la cage de la pâtée alimentaire en complément de leurs croquettes habituelles pour favoriser leur réhydratation. L’administration des produits permettant l’élimination des gènes d’intérêts ou l’induction du cancer se fera par voie intrapéritonéale, en changeant d’aiguille à chaque souris pour éviter que celle-ci ne s’émousse et provoque de la douleur chez les animaux. Un enrichissement des conditions d'hébergement est prévu grâce à l'ajout dans les cages de cabanes en carton et de cotons à décortiquer. Un fond musical est assuré pour éviter les variantions sonores trop importantes entre les périodes d’expérimentation et les périodes de repos ce qui pourraient générer un stress supplémentaire chez les animaux.
Choix des espèces
La disponibilité de souris génétiquement modifiées pour les molécules que nous étudions justifie l'utilisation de ce modèle pour nos expériences. Le protocole d'induction du cancer colorectal que nous utilisons est bien standardisé chez la souris et largement admis comme le modèle de référence mimant au plus près les étapes du développement du cancer suite à une inflammation chronique. Notre étude porte sur le dialogue entre les cellules épithéliales et les fibroblastes du colon. Pour cela, nous éliminerons des lignées de souris dans lesquelles les gènes d’intérêt seront supprimés soit dans les cellules épithéliales soit dans les fibroblastes. Les gènes que nous étudions ont été démontrés comme : - Impliqués dans d'autres types de cancer que le cancer colorectal. - sur-exprimés ou sous-exprimés chez les patients atteints de cancer colorectal sans que leur fonction soit encore parfaitement déterminée. Les animaux seront utilisés à partir de 2 ou 3 mois d'âge selon le protocole établi dans la littérature ou lorsqu’ils auront atteint un poids minimum de 20g. Cet âge tient compte de la maturité sexuelle nettement dépassée pour les animaux, compatible avec la description des âges des patients atteints de cancer colorectal ou de colites chroniques.
Évaluation de thérapies permettant l’inhibition des canaux mécanosensibles sur la progression des malformations caverneuses cérébrales chez la souris.
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Des souris reçoivent un traitement qui provoque des malformations vasculaires et des saignements dans le cerveau, puis une injection quotidienne pendant quatre mois, soit jusqu'à 81 injections par animal éveillé, auxquelles s'ajoutent douze séances d'imagerie d'une heure sous anesthésie. 450 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le porteur qualifie ces administrations de source d'une "légère douleur" et l'imagerie hebdomadaire d'un "léger stress", tout en indiquant que les lésions cérébrales entraînent des complications à cinq mois, raison pour laquelle les souris sont utilisées avant quatre mois afin d'éviter la mortalité. Toutes sont tuées en fin de traitement pour prélever les tissus.
Objectifs
L’angiome caverneux est une malformation vasculaire localisée essentiellement dans le cerveau. Cette maladie affecte 1 individu sur 200. La forme héréditaire des angiomes caverneux est souvent liée à des mutations génétiques. Cette malformation se caractérise par des amas de vaisseaux sanguins dans le cerveau qui peuvent provoquer des saignements et des problèmes neurologiques. À ce jour, il n’existe aucun traitement médicamenteux pour les patients. L’unique option est la suppression de la lésion par neurochirurgie, qui peut se révéler impossible selon la localisation de la lésion, en raison d’un risque vital pour le patient. Il est donc urgent de trouver des traitements empêchant le grossissement des lésions existantes, voire même de les faire disparaître et ainsi diminuer le risque de saignement. L’objectif est de tester 3 médicaments qui ont été identifiés dans des études préliminaires afin évaluer leurs effets sur des lésions vasculaires qui sont sur le point de se former ou qui sont déjà établies dans nos modèles animaux qui présentent les caractéristiques de la pathologie humaine des angiomes caverneux.
Bénéfices attendus
Ce projet vise à tester des molécules candidates pour le traitement des angiomes caverneux. L'utilisation de modèles animaux porteurs de la maladie permettra d'évaluer l'efficacité de ces molécules dans un contexte proche de la pathologie humaine. Ces recherches pourraient ainsi représenter une avancée majeure dans la prise en charge des angiomes caverneux chez les patients.
Procédures
L’étude implique une injection quotidienne du traitement aux animaux éveillés, pendant maximum 4 mois. Les animaux vigiles (au maximum 372) recevront 81 injections (une injection par jour, moins de 10 secondes de manipulation) pour l’expérience la plus longue c’est-à-dire 4 mois. L’étude implique également une session hebdomadaire (maximum 12 sessions) d’imagerie non invasive d’une durée maximum d’une heure, réalisée sous anesthésie et analgésie adaptées. Pour vérification du génotypage, une biopsie à l’oreille sera effectuée sur 20 animaux répartis tout le long du projet.
Impact sur les animaux
Les animaux recevront un traitement afin d’induire les angiomes caverneux impliquant des saignements dans le cerveau. En parallèle, les animaux recevront un traitement expérimental administré quotidiennement, afin de tester l’efficacité de molécules candidates sur la progression de la maladie. Ces administrations peuvent induire une légère douleur. L'évolution des lésions et la réponse au traitement seront suivies par des imageries hebdomadaires qui peuvent engendrer un léger stress. La formation des lésions vasculaires dans le cerveau s’effectue de façon progressive sur 5 mois et peut induire une perte de poids.
Devenir
En fin de traitements, les animaux seront mis à mort afin d’effectuer les analyses sur des tissus récupérés.
Remplacement
Notre projet se fera dans la continuité d'études réalisées sur des cellules. Le projet portant sur l’étude de la réponse d’organe entier (cerveau), il nous est impossible de remplacer l’animal vivant par un modèle cellulaire ou de simulation informatique. En effet, un organe isolé, ne permettra pas d’évaluer l’efficacité des médicaments candidats pour le traitement des angiomes caverneux. Le passage au modèle animal est donc une étape indispensable afin d’observer les effets des composés administrés dans l'organisme. De plus, la souris possède toute la complexité du réseau vasculaire cérébral trouvé chez l’Homme.
Réduction
Le nombre d’animaux minimum pour mettre en évidence des différences statistiquement significatives a été calculé en se basant sur les études précédentes menées au laboratoire. Pour évaluer les effets des traitements, le nombre d’animaux tient compte des risques d’exclusion d’un animal lors de la réalisation des expériences. De plus, le nombre d’animaux pourra être réduit en fonction des résultats d’imagerie. Le nombre d’animaux nécessaires à nos travaux a été réduit au minimum sans compromettre l’interprétation statistique de nos résultats.
Raffinement
Pour réduire les nuisances attendues, l’ensemble des expérimentations d’imagerie seront réalisées sous anesthésie et analgésique adaptées, les animaux seront maintenus en température et un suivi de la fréquence cardiaque et respiratoire sera effectué. Une échelle de cotation de douleur sera utilisée afin d’évaluer l’état général de chaque animal et de définir des points limites adaptés permettant ainsi de prendre le plus rapidement possible des mesures nécessaires pour préserver le bien-être animal. Ce n’est qu’à 5 mois que les lésions cérébrales entraînent des complications inhérentes à la pathologie. Nous utilisons les animaux avant 4 mois afin d’éviter cette mortalité et la souffrance des animaux.
Choix des espèces
Les animaux utilisés représentent le modèle le plus pertinent pour nos études, car il reproduit de manière fidèle les caractéristiques clés de la pathologie humaine des angiomes caverneux. Nous utilisons les souris dès leur naissance pour induire la maladie et, ainsi, pouvoir évaluer l’effet préventif ou curatif de différentes molécules sur les lésions qui sont sur le point de se former ou qui sont déjà établies.
Etude de la connectivité des différentes populations de neurones granulaires dans le gyrus denté de l’hippocampe
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Soixante embryons reçoivent une injection dans le cerveau via vingt-cinq femelles gestantes, et soixante-quinze souris adultes en subissent deux, espacées de onze semaines. 360 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour prélever leur cerveau, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Il s'agit de savoir si les neurones nés pendant la vie embryonnaire et ceux nés à l'âge adulte se branchent sur les mêmes réseaux du gyrus denté, les retombées sur la mémoire étant renvoyées au long terme. La seule nuisance annoncée tient en une ligne, la douleur liée à la chirurgie. Le porteur justifie le choix de la souris par le fait que ce projet fait suite à un autre projet mené chez la souris.
Objectifs
L'objectif de ce projet est de comprendre si les nouveaux neurones produits dans le cerveau, soit pendant le développement, soit à l'âge adulte, s'intègrent aux mêmes réseaux de communication. Nous nous concentrons sur une région du cerveau impliquée dans la mémoire, appelée le gyrus denté. Pour cela, nous allons étudier comment ces neurones se connectent : reçoivent-ils des messages des mêmes types de neurones ? Envoient-ils eux-mêmes des messages à des groupes de neurones similaires ou différents ?
Bénéfices attendus
Ce projet nous permettra de mieux comprendre le fonctionnement du gyrus denté et le rôle des différents neurones qui se forment à différentes étapes de la vie. À long terme, cela nous aidera à mieux cerner leur impact sur la mémoire, les émotions et d'autres fonctions essentielles du cerveau.
Procédures
Les animaux seront soumis à une injection cérébrale pendant la vie embryonnaire (25 min, 60 embryons provenant de 25 gestantes), à la naissance (5 min, 60 souriceaux provenant de 20 gestantes), à 3 semaines (30 min, 60 animaux) ou à 12 semaines de vie (30 min, 60 animaux). Les injections lors de la vie embryonnaire seront réalisées en utilisant des souris gestantes. D'autres animaux recevront deux injections cérébrales, la première à l'âge adulte et la seconde 11 semaines plus tard (75 animaux).
Impact sur les animaux
La nuisance majeure que pourrait subir les souris est la douleur associée à la chirugie.
Devenir
Tous les animaux injectés seront mis à mort car leurs cerveaux sont récupérés pour les analyses.
Remplacement
N'existant pas de modèle in vitro et in silico permettant de reproduire l'environnement complexe caractéristique du gyrus denté (multiples types cellulaires, architecture complexe, afférences variées..) et ce à différents moments de la vie, cette étude ne peut être réalisée que chez l'animal ex vivo ou in vivo.
Réduction
Nous prévoyons d’utiliser le nombre minimal de souris nécessaire pour obtenir des analyses statistiques fiables et cohérentes. Mâles et femelles seront utilisés.
Raffinement
Pour réduire toute souffrance liée à la chirurgie, les règles suivantes seront appliquées pour le bien-être des animaux: 1- Avant les chirurgies, un analgésique sera administré en sous-cutané, à titre préventif afin d’éviter la souffrance post-opératoire. 2- Les chirurgies se feront sous anesthésie générale. Un suivi post-opératoire sera assuré afin d'évaluer le bien-être de l'animal par la mesure du poids, l’évaluation de l’apparence et du comportement . Des points limites stricts et précis sont définis pour détecter précocément d'éventuelles souffrances des animaux. Si l'animal est en souffrance, un analgésique sera injecté. Un soin particulier sera également accordé à leurs conditions d’hébergement.
Choix des espèces
Le modèle utilisé dans ce projet est la souris car il fait suite à un autre projet réalisé chez la souris. Dans la structure cérébrale étudiée, les neurones sont générés de la vie embryonnaire à l'âge adulte. Nous ciblerons les cellules à l'origine de ces neurones et ce à différents moments de la vie de l'animal: 1) pendant la vie embryonnaire, 2) à la naissance (P0), 3) en période juvénile (P21) et à 4) l'âge adulte (P84). Ces temps précis d'analyse ont été choisi en fonction de la littérature et de nos études précédentes.
Etude du rôle bénéfique du régime cétogène et/ou du composé X dans la cicatrisation chez la souris diabétique
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Organes sensoriels
- Système endocrinien
- Système immunitaire
Deux plaies sont taillées dans la peau du dos de souris rasées, puis maintenues ouvertes par des disques de silicone cousus, opération d'une vingtaine de minutes par animal. 740 souris vont être utilisées, 560 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré et 180 un niveau léger, toutes tuées à la fin pour prélever des organes. Les pansements sont changés chaque jour sous anesthésie, et des injections intrapéritonéales quotidiennes alternent d'un côté puis de l'autre, l'objectif déclaré étant de tester si un composé produit lors d'un régime cétogène accélère la cicatrisation chez la souris diabétique. Le porteur écrit que ce composé, produit naturellement par l'organisme, "ne présente donc pas d'effet nuisible", et ne dit rien des deux plaies chirurgicales.
Objectifs
Le composé X est produit naturellement par l’organisme lors de la prise d’une alimentation riche en graisses et pauvre en sucre (régime cétogène). Il a sur les cellules immunitaires des propriétés bénéfiques démontrées in vitro mais également in vivo lors de leurs infiltrations sur des zones lésées durant la réparation tissulaire. Ainsi le changement de régime alimentaire, l’injection ou l’application topique de ce composé lors d’une pathologie nécessitant une réparation tissulaire importante (brûlures, plaies…) pourrait être bénéfique à un patient et ce d’autant plus si sa cicatrisation est altérée comme lors d’un diabète.
Bénéfices attendus
Au-delà des informations fondamentales les observations ouvrent des perspectives thérapeutiques pour le traitement de pathologies/situations nécessitant une réparation tissulaire. La cicatrisation de personnes atteintes de diabète est altérée, non seulement elle est plus lente mais les surinfections sont également plus fréquentes. Le composé X est produit naturallement par l’organisme lors de la prise d’une alimentation riche en graisses et pauvre en sucre (régime cétogène). Il a sur les cellules immunitaires des propriétés bénéfiques démontrées in vitro mais également in vivo lors de leurs infiltrations sur des zones lésées durant la réparation tissulaire. Ainsi le changement de régime alimentaire, l’injection ou l’application topique de ce composé lors d’une pathologie nécessitant une réparation tissulaire importante (brûlures, plaies…) pourrait être bénéfique à un patient et ce d’autant plus si sa cicatrisation est diminuée comme lors d’un diabète.
Procédures
Les animaux seront soumis à un régime spécifique ou seront traités par des injections intrapéritonéales du composé X ou seront traités directement en topique avec le composé X. Les 3 traitements seront réalisés sur des souris ayant subi une chirurgie afin d’induire deux lésions cutanées sur le dos de l’animal (modèle de cicatrisation). Les injections intrapéritonéales sont rapides et n’excèdent pas quelques secondes de manipulation. Elles seront réalisées alternativement à droite et à gauche d’un jour à l’autre afin de réduire la douleur. La chirurgie sera réalisée sous anesthésie et antidouleur local. Le temps de raser les animaux, de réaliser la plaie, d’appliquer et de fixer les disques de silicones avec des points de suture, une vingtaine de minutes sont nécessaires par souris. Les pansements des plaies des animaux seront changés chaque jour sous anesthésie. Le temps de changer les pansements, de faire l’acquisition d’images afin de suivre l’évolution de la cicatrisation et d’appliquer le composé X sur les plaies environ 5 minutes sont nécessaires par souris.
Impact sur les animaux
Le composé X utilisé dans ce projet est produit naturellement par l’organisme lors de la prise d’une alimentation riche en graisses et ne présente donc pas d’effet nuisible sur les animaux.
Devenir
La totalité des animaux (740) sera mis à mort à la fin des 2 procédures pour prélèvement d’organes post mortem.
Remplacement
L’utilisation des animaux est indispensable avant de proposer un traitement facile à mettre en oeuvre et dénué de toxicité pour améliorer le processus de cicatrisation et de réparation tissulaire. En effet, seul un modèle in vivo nous assure de l’implication de notre traitement dans des conditions physiopathologiques proches de la réalité clinique.
Réduction
Les procédures seront réalisées sur un nombre nécessaire et suffisant d’animaux (740 souris avec 180 souris dans une procédure et 560 dans l’autre. Ce nombre a été défini afin d’exploiter des résultats statistiquement fiables. Chaque lot dans chacune des procédures expérimentales a été prévu en fonction des résultats attendus afin de réduire le nombre d’animaux utilisés tout en garantissant l’obtention de résultats statistiquement exploitables. Ainsi, l’analyse statistique du modèle cicatrisation des plaies et le recrutement des cellules immunitaires dans les modèles d’inflammation sera faite en utilisant le test statistique le plus approprié.
Raffinement
Le bien-être des animaux sera pris en compte de leur naissance à leur mort afin d’éliminer ou réduire au minimum toute douleur, souffrance, ou angoisse et tout dommage durable susceptible d’être infligé à ceux-ci. Ainsi, les souris seront hébergées en cages collectives (3 animaux par cage), dans des locaux aux paramètres environnementaux contrôlés où leur entretien sera pris en charge par un personnel formé et compétent qui évaluera quotidiennement leur état général Des points limites précoces et adaptés ont également été envisagés avec des procédures d’antalgie (= permettant de gérer la douleur) utilisant le paracétamol et la buprénorphine. Les cages seront enrichies par des tunnels, abris et os en nylon autoclavés, permettant aux animaux d’explorer, de se cacher ou de ronger pour rétablir le répertoire comportemental des souris Ce projet s’inscrit ainsi dans une gestion éthique d’expérimentation animale et est donc en accord avec les réglementations européennes et françaises de bonnes pratiques de laboratoire.
Choix des espèces
Les souris sont les espèces les plus couramment utilisées dans la recherche préclinique. Ceci est dû à la relative facilitée d'hébergement et de soins, à la grande taille des portées et au temps de génération court. Les souris seront utilisées à partir de 6 semaines et jusqu'à 12 semaines car l’insulinémie augmente brusquement à partir du sevrage pour atteindre son maximum à l’âge de 2-3 mois puis elle chute.
Interactions comportementales à fine échelle des poissons des récifs rocheux : des processus individuels à la communauté
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
Capturés à l'hameçon ou au filet, anesthésiés six à sept minutes, puis ouverts pour recevoir une marque acoustique implantée en moins de quatre minutes, 310 poissons de récifs rocheux subissent des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Cinquante castagnoles et cinquante girelles sont suivies de près, dix individus de chacune des vingt et une autres espèces complétant l'échantillon. Le porteur reconnaît des blessures possibles liées à l'engin de pêche et à la manipulation, et décrit un protocole tenu sous dix minutes de l'endormissement au réveil. Tous sont remis à l'eau vivants sur leur lieu de capture, leurs déplacements étant suivis deux à trois mois par télémétrie.
Objectifs
Les animaux dépendent de leur comportement pour vivre, se reproduire et s’adapter à leur environnement. Ils interagissent avec leurs congénères, d’autres espèces et leur milieu pour survivre. Bien que certaines études aient observé comment des espèces marines utilisent l’espace ou interagissent entre elles, peu se sont intéressées aux interactions entre différentes espèces. Pourtant, comprendre ces relations permet de mieux connaître comment un écosystème fonctionne. Le projet vise à surveiller une zone côtière afin d’analyser comment les animaux interagissent entre eux et avec leur environnement. Grâce à des outils innovants, comme la télémétrie (suivi du déplacement des animaux) de haute résolution, le projet vise à observer : • Comment les poissons se déplacent et utilisent l’espace; • Les interactions intra- et interspécifiques (coopération, compétition, prédation); • Les variations de l’environnement, comme la température de l’eau, les vagues de chaleur, le bruit sous-marin ou l’impact des activités humaines. L’objectif est de voir comment ces animaux réagissent face aux perturbations extérieures et s’ils sont capables de s’adapter (leur résilience). Certaines espèces ou individus sont-ils plus vulnérables que d’autres ? Pour répondre à ces questions, 210 poissons de 21 espèces différentes seront équipés de petits émetteurs acoustiques qui permettront de suivre leurs déplacements pendant deux ou trois mois. Cinquante individus de deux autres espèces très courantes, la castagnole (Chromis chromis) et la girelle (Coris julis), seront étudiées de manière plus approfondie. Ce projet unique apportera des réponses précieuses pour mieux comprendre et protéger les écosystèmes marins face aux changements environnementaux.
Bénéfices attendus
Cette approche expérimentale unique en milieu naturel marin permettra d’identifier comment un écosystème réagit à des perturbations extérieures et d’en évaluer sa capacité à s’adapter. Il s’agira notamment de collecter de nombreuses informations comportementales et environnementales très fines et d’étudier le comportement des poissons à différentes échelles (individuelle, intra- et interspécifique), ainsi que les différences de réponses et de degré d’adaptation aux perturbations. En fonction des résultats, des mesures de gestion seront à l’étude et pourront être testées par le gestionnaire de la zone (eg limitation du kayac pendant certains horaire…).
Procédures
L'ensemble des individus seront soumis à une phase de captures par un hameçon ou filet en fonction de l’espèce ciblée qui durera quelques minutes, puis anesthésié pendant 6-7 mn avant une phase d'implantation d'une marque acoustique par voie chirurgicale qui dure moins de 3-4 mn.
Impact sur les animaux
Les nuisances attendues lors de la capture sont essentiellement le stress lié à la capture, des blessures éventuelles liées à l’engin de pêche ou à la manipulation entre l’engin et les bacs de confinements. Des mesures de raffinement sont prises pour limiter le stress et le risque de blessure.
Devenir
Tous les animaux seront relachés vivant dans le milieu naturel sur leur lieu de capture.
Remplacement
L'intérêt du projet étant d’étudier le comportement spatial de ces espèces dans leur milieu naturel, il n’est pas possible de les remplacer.
Réduction
Il est toujours difficile en écologie spatiale de déterminer le nombre d’individus nécessaires pour évaluer la variabilité de l’utilisation de l’espace pour une population. Ce nombre est variable en fonction des objectifs, des caractéristiques écologiques de l’espèce concernées et des modèles utilisés. Le projet s’intéressant aux processus comportementaux et leur hétérogénéite à l’échelle intra- et interspécifique il est nécessaire d’avoir un échantillon assez représentatif afin capter cette hétérogénéite dans l’utilisation spatiale et les intéractions entre individus. Afin de minimiser le nombre d’individus dans cette étude, nous avons choisi de sélectionner deux espèces modèles afin de répondre aux questions relatives aux interactions intra-spécifiques : la casagnole (Chromis chromis) et la girelle (Coris julis) qui sont deux espèces sociales qui fonctionnent en harem et abondante sur le site d’étude. Ainsi il est envisagé de marquer 50 individus de chaque espèce, un échantillon permettant de générer des réseaux d’interactions biologiquement représentatif tout en captant aussi la variabilité individuelle affectant la population. Pour appréhender les processus d’interaction interspécifiques, il n’est pas nécessaire de marquer autant d’individus que pour les espèces modèles. Il s’agira de marquer 10 individus de plusieurs espèces (N=21) afin de pouvoir comparer les patrons d’utilisation spatiale et les interactions entre espèces. Le nombre d’individus de ces espèces de petite taille est minimal compte tenu de leur nombre et densité en milieu naturel et la nécessité de capturer la majorité de la variabilité du comportement de cette espèces. Un total de 310 individus de 23 espèces sera marqué.
Raffinement
L’ensemble des étapes du projet est mis en œuvre de sorte à limiter les nuisances : la capture est réalisée à l’aide de filet non maillant (formant des poches) en apnée ou avec des hameçons de forme ou de taille à limiter les blessures et éviter l’ingestion par le poisson, le transfert entre bac est réalisé à l’aide d’épuisettes en silicon limitant l’abrasion du poisson à sa sortie de l’eau associée à une manipulation minimal des individus; le marquage est réalisé sous anesthésie générale, un bullage dans le bac de réveil permet une bonne récupération du poisson avant d’être relâché en douceur sans exondation. L'ensemble du protocole de l'endormissement au réveil dure moins de 10 mn.
Choix des espèces
L’étude vise à comprendre les processus comportementaux affectant les individus de plusieurs espèces d’une communauté de poissons rocheux côtiers et leur résilience face aux perturbations environnementales et anthropiques. L’idée est de pouvoir suivre et décrire une communauté à très fine échelle en sélectionnant une arène expérimentale en milieu naturel et de suivre des individus de différentes espèces communes de ces écosystèmes rocheux marins côtiers. Vingt trois espèces communes et en grandes densités ont été sélectionnées. Elles sont représentatives de la diversité fonctionnelle et trophique de ces milieux (ex : espèces herbivores et espèces prédatrices). Les espèces considérées étant de petite taille (7-20 cm environ), les animaux capturés seront des individus matures afin de suivre les règles des 2% du poids de l’animal en ce qui concerne la marque utilisée.