Procédures modérées
Thérapie génique du syndrome de Prader Willi chez le nouveau-né de souris – Étape 2 : Évaluation du traitement sur les effets post-nataux
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
Le lendemain de leur naissance, des souriceaux vigiles reçoivent une injection dans le cerveau, une crème anesthésiante ayant été posée trente minutes plus tôt sur le crâne. Une semaine après, l'extrémité de leur queue est prélevée pour savoir s'ils portent la mutation, puis viennent sept pesées, sept mesures de taille, cinq mesures de tête et des tests de redressement répétés. 150 souris au maximum vont être utilisées, dont 120 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, le porteur relevant chez les souriceaux modèles de la maladie de Prader-Willi une mortalité accrue de 10 à 15 % dans la première semaine de vie. Les souriceaux porteurs de la maladie sont tués au sevrage, tandis que 57 animaux, dont 18 femelles reproductrices, seront réutilisés dans d'autres projets et trois mâles gardés en vie pour maintenir la lignée.
Objectifs
La maladie de Prader-Willi est due à la perte de certains gènes et se manifeste dès la naissance. Pour compenser ce manque, un traitement administré au plus tôt chez le nouveau né malade pourrait contrecarrer le développement de la maladie. Ainsi, dans ce projet, nous voulons mettre en lumière les effets positifs sur le développement de jeunes souriceaux, d’un nouveau médicament validé précédemment sur des cellules en culture et qui sera administré un jour après la naissance. Nous testerons trois doses différentes afin de déterminer la plus efficace, qui pourra alors être utilisée comme valeur de référence dans les thérapies contre la maladie de Prader Willi chez l’Homme.
Bénéfices attendus
Cette phase du projet va tester la capacité d'un médicament à corriger certains symptômes de la maladie de Prader-Willi chez des souris nouveau-nées. Nous veillerons à déterminer la dose la plus efficace pour traiter les enfants atteints par cette maladie qui touche environ 250 nouveau-nés par an en France. Nous espérons observer chez les animaux malades traités une diminution de la faiblesse de leurs mouvements, un poids et une taille générale semblables ou se rapprochant de ceux des animaux témoins, ainsi qu’une vitesse de développement des mouvements équivalente. En outre, nous espérons observer chez les animaux traités un intérêt envers l’environnement identique à celui de nos animaux témoins. De même nous évaluerons la réduction des comportements répétitifs chez ces groupes traités.
Procédures
L’ensemble des souriceaux subira une injection unique du médicament dans le cerveau le lendemain de leur naissance (environ 10 secondes), puis, au terme d’une semaine d’existence, un prélèvement de l’extrémité de la queue afin de savoir si l’animal est porteur de la maladie ou normal (environ 5 secondes). Les juvéniles subiront un ensemble de mesures du développement incluant suivi pondéral (7 pesées de 10 secondes espacées de 3 jours), 7 mesures de taille de 10 secondes (espacées de 3 jours), 5 mesures de la longueur de la tête de 10 secondes (espacées de 3 jours), ainsi que 2 tests d’évaluation du neurodéveloppement de durées inférieures ou égales à 120 secondes, réalisés 4 fois aux âges précoces et séparés de 1 journée chaque.
Impact sur les animaux
Les animaux modèles de la maladie de Prader-Willi sont généralement plus petits que les animaux témoins et ont des comportements modérément affectés. Ils ne montrent pas de signes de douleur ou de difficultés à survivre, mais une mortalité accrue de 10-15% la première semaine après la naissance est néanmoins relevée. Le retrait transitoire (de 20s à 2min30s environ) des souriceaux nouveau-nés de la portée pour les expérimentations comportementales, les pesées et les mesures de taille peuvent entrainer un stress léger de courte durée et sans douleur. L'injection unique du médicament dans le cerveau chez souriceaux vigiles peut entrainer un inconfort transitoire lié à la contention des souris, tandis que l'injection peut entrainer un stress léger et une douleur modérée de courte durée. L'inconfort lié à la position du corps au début du test de redressement est limitée temporellement par le comportement de l'animal qui va naturellement chercher à redresser sa position ; si un animal échoue en cela, le test sera arrêté au bout de 2 minutes ce qui bornera ses effets à un stress léger et de durée limitée. Le prélèvement de l’extrémité de la queue pour savoir si l’animal est porteur de la maladie ou normal peut entraîner un stress léger sans douleur.
Devenir
La mise à mort des 30 à 150 juvéniles d’intérêt sera réalisée au sevrage. Les animaux des trois groupes constitués d’individus sains injectés par le traitement test aux doses D1 à D3 pourront être réutilisés pour d'autres projets de recherche une fois leur sevrage atteint. Les trois mâles reproducteurs seront gardés en vie pour le maintien de cette lignée dans notre structure. Les 18 femelles reproductrices seront réutilisées pour d'autres projets de recherche.
Remplacement
Ce projet vise à évaluer l'effet d'un traitement de thérapie génique chez de jeunes souris modèles de la maladie de Prader-Willi. Ce traitement a déjà été étudié et validé par des expérimentations préliminaires menées sur des lignées cellulaires humaines, sans utilisation d’animaux. L'efficacité du traitement selon 3 doses testées sera maintenant étudiée sur un modèle animal et ce, via plusieurs critères biologiques qui ne peuvent être évalués sans l’utilisation d’animaux tels que la croissance des individus, leur métabolisme et leur comportement.
Réduction
Ce projet utilisera 30 souriceaux (au minimum), effectif qui pourra s’étendre à 150 au maximum. Les effectifs les plus faibles permettant d’obtenir un effet statistique significatif ont été calculés et retenus pour les expériences ; pour ce faire, nous avons utilisé un logiciel informatique afin de déterminer le nombre d'animaux nécessaire en utilisant les données issues de précédentes recherches.
Raffinement
Les souris porteuses de la maladie de Prader-Willi présentent 0 à 15% de mortalitéle jour de leur naissance. A partir du second jour de vie, il n’est pas reporté d’excès de mortalité chez ces souris en condition classique d’élevage et d'hébergement : les animaux sont en mesure de se déplacer et de se nourrir correctement, les petits ne sont pas rejetés par les mères et, hormis une petite taile, ils ne montrent pas d’incapacité fonctionnelle justifiant de mesures de raffinement spécifiques. Les mâles porteurs de la maladie de Prader-Willi seront d'abord acclimatés avec des éléments d’enrichissement simples. Après deux semaines, ils seront mis en accouplement à raison de deux femelles par mâle. Ensuite, les femelles gestantes seront hébergées seules jusqu’à la mise bas. Pour les souriceaux nouveau-nés injectés, de la crème anesthésiante sera appliquée sur le crâne 30 minutes avant l’injection. Après l'injection, les petits seront roulés dans la litière de leur cage d’origine et un suivi de l'absence de rejet par la mère sera opéré lors de son replacement dans sa portée d’origine. Si un petit était rejeté par sa mère, une démarche de ré-adoption par une autre femelle sera alors mis en place. Tous les animaux de ce projet seront surveillés quotidiennement ainsi que lors des tests réalisés afin de surveiller si les points limites établis sont atteints.
Choix des espèces
La souris est le seul animal pour lequel un modèle de la maladie de Prader Willi existe. Le développement de la maladie chez la souris est proche de celui observé chez l’humain. Dans notre projet, le traitement dès le lendemain de la naissance est choisi afin de mimer le traitement en bas-âge des patients Prader Willi.
Caractérisation et étude d’un nouvel agent de contraste à potentialité multimodale
- Recherche appliquée
- Cancers
- Diagnostic des maladies
- Recherche fondamentale
- Oncologie
Un cathéter posé dans la veine de la queue, une heure d'IRM sous anesthésie, puis deux nouvelles séances d'imagerie à quatre et vingt-quatre heures : 62 souris suivent ce protocole, dont une partie après avoir reçu sous la peau une injection de cellules tumorales. Les procédures sont classées en niveau de souffrance léger pour 42 souris et modéré pour 20. L'objet du projet est de tester si trois enrobages polymères rendent des nanoparticules assez discrètes vis-à-vis du foie et du système immunitaire pour circuler plusieurs heures dans le sang et atteindre une tumeur. Toutes les souris sont tuées pour le prélèvement des organes et de la tumeur, celles dont la tumeur dépasse 10 % du poids corporel ou qui perdent plus de 20 % de leur poids étant sorties de l'étude et mises à mort avant terme.
Objectifs
Après une étude préalable réalisée in vitro sur des cellules en culture, l’objectif de ce projet est l’évaluation in vivo de nouveaux composés issues des nanotechnologies comme agents de contraste pour l’imagerie médicale. Ces composés sont prometteurs pour l'amélioration du diagnostic et la thérapie du cancer. Ils permettent notamment une augmentation de contraste des images obtenues par résonance magnétique nucléaire (IRM). La difficulté majeure rencontrée pour l'utilisation de ces composés est qu'ils sont très rapidement captés en quelques minutes par les systèmes de défense de l'organisme comme le foie et les cellules du système immunitaire. Si les composés ne restent pas suffisamment longtemps dans la circulation sanguine, ils n'ont pas le temps de passer dans le tissu tumoral. Des modifications de la surface de ces composés par greffage de polymères particuliers permet de les rendre relativement invisibles du système de défense. Ainsi, leur temps de présence dans le sang s'allonge, augmentant la probabilité de passage du composé dans le tissu tumoral. Pour ce projet nous allons tout d'abord évaluer avec pour critère principal de sélection, l’invisibilité biologique pour 3 types de polymères à 3 concentrations différentes. Le temps de présence dans la circulation attendu est de plusieurs heures avec nos composés Puis sur un modèle de souris porteuse d'une tumeur, nous testerons les 2 meilleurs agents à 2 concentrations différentes. L’imagerie sera réalisée avec un IRM dédié au petit animal sous anesthésie pour éviter les mouvements durant les acquisitions.
Bénéfices attendus
Ces nouveaux agents de contraste sont développés dans le but de limiter les doses à injecter chez les patients, et pour pallier le fait qu’une seule technique d’imagerie se révèle souvent insuffisante pour poser un diagnostic précis. La mise au point d’agents de contraste bimodaux (combinant deux types d’imagerie complémentaires) et vectorisés (aptes à cibler sélectivement la zone d’intérêt), devient une nécessité en matière de santé. Leur utilisation permettrait d’accéder rapidement à un diagnostic plus précis et de définir le traitement le plus approprié, limitant ainsi les effets secondaires, améliorant la prise en charge des patients, et réduisant les coûts de santé. Des études menées auprès de professionnels du secteur montrent qu’un intérêt particulier se dégage pour une sonde associant la précision spatiale de l’IRM à la grande sensibilité de l’imagerie nucléaire, du fait de leur complémentarité et du développement d’appareils combinant IRM et imagerie nucléaire. Pour autant, et même si de nombreuses publications rapportent la synthèse de sondes associant IRM et imagerie nucléaire, aucune sonde duale adaptée n’est actuellement disponible sur le marché. Les nanomatériaux sont de bons candidats pour le développement de tels outils bimodaux, notamment par les possibilités de vectorisation/modification qu’ils apportent.
Procédures
Les animaux seront soumis à 3 types d’interventions dans ce projet : (1) une imagerie par IRM sous anesthésie in vivo non invasive et non traumatique, 3 sessions : la première dure 1 h, la seconde dure 10 min et est réalisée après 4h suivant l’injection de l’agent de contraste, enfin la dernière est réalisée 24h après la première. (2) pose d’un cathéter réalisé en moins de 10 minutes pour injection par voie intraveineuse à la première session d’imagerie, le cathéter est enlevé à la fin de la première session d’imagerie, l’animal étant toujours sous l’effet de l’anesthésie gazeuse. (3) pour certains animaux, une injection sous-cutanée de cellules tumorales, durée incluant la préparation 10 min.
Impact sur les animaux
- La pose d’un cathéter : le cathéter est posé dans la veine caudale , il peut induire un hématome et une altération temporelle de la veine. -Induction tumorale : la génération d'une tumeur peut entrainer une perte de poids de l’animal, des souffrances et éventuellement des troubles fonctionnels.
Devenir
A l’issue de la procédure 1, tous les animaux sont mis à mort car les organes sont prélevés pour analyse. A l'issue de la procédure 2 sur les animaux porteurs d’une tumeur solide, tous les animaux sont mis à mort car les organes et la tumeur sont prélevés pour analyse.
Remplacement
Certaines phases d'optimisation des nano-particules (vérification de la stabilité, toxicité cellulaire) seront intégralement menées in vitro. Cependant, la validation des propriétés de distribution aux organes, d’élimination par voie urinaire et/ou hépatobiliaire tout comme les propriétés de ciblage tumoral ne peuvent se faire qu’en utilisant le petit animal. Les propriétés pharmacocinétiques des nanoparticules de distribution et élimination seront caractérisées chez l’animal sain avant de passer sur un modèle tumoral pour caractériser et mesurer leur capacité à intégrer la tumeur.
Réduction
L'imagerie, par opposition aux bio-distributions in vivo classiques, permet de réduire le nombre global d'animaux mis en œuvre pour une procédure donnée car la même cohorte pourra être suivie au cours du temps ce qui permet de réduire la variabilité inter animal (chaque souris étant son propre contrôle). Les mêmes animaux pourront également subir plusieurs sessions d’imagerie (une session après 4h et après 24h suivant l’injection de l’agent de contraste). Les variables quantitatives issues de l'analyse des images obtenues en IRM seront analysées en utilisant des méthodes de statistique paramétrique ou non paramétrique selon la distribution des données. Pour la première phase de caractérisation de nos nano-sondes, des animaux non inclus dans un protocole dont la mise à mort était programmée pourront être utilisés.
Raffinement
La première phase de caractérisation in vivo des nano-sondes sera menées sur des souris saines pour réduire autant que possible l’inclusion d’animaux porteur de tumeur sous-cutanée. Tous les animaux sont hébergés selon les conditions de la réglementation en vigueur (directive européenne 2010/63, décret n°2013-118 du 1er février 2013). Tout animal présentant des signes de souffrance, de léthargie, une perte de poids supérieure à 20% ou une tumeur dépassant 10% du poids corporel sera exclu de l’étude et sacrifié. Nous veillerons à ce que chaque cage bénéficie d’un enrichissement adapté (igloo, tunnel ou paper wool). Pour les animaux devant subir une injection sous-cutanée de cellule tumorales, l'anesthésie sera réalisée classiquement par induction à l'isoflurane. Les animaux sont maintenus dans la salle de chirurgie sous une source de chaleur et leur respiration est observée jusqu’à leur réveil. En cas d’apparition de signes de douleur (isolement, yeux fermés, dos voûté, poils hérissés, immobilité, perte de poids, déshydratation, yeux et abdomen creux, automutilation etc.), une dose d’analgésique sera administrée, si l’état général de l’animal ne s’améliore pas dans les 48h et qu’aucune solution ne peut être apportée, ce dernier sera mis à mort.
Choix des espèces
Le modèle de la souris est reconnu comme pertinent pour l'évaluation préclinique des caractéristiques des agents de contraste en imagerie. La souris possède comme l’homme une vésicule biliaire ce qui permet de visualiser la voie d’élimination hépatique. Le modèle de tumeur sous-cutanée chez la souris est bien maitrisé. Les animaux pour la phase d’évaluation de la furtivité seront utilisés au stade de jeunes adultes à adulte (de 7 à 16 semaines environ) après atteinte de la maturité sexuelle, hormonale et immunitaire. Des animaux jeunes de 4 à 6 semaines seront utilisés pour la génération d’une tumeur sous-cutanée. Ce stade est optimal pour l'induction tumorale par transplantation de cellules cancéreuses. Ces animaux seront explorés par IRM (entre 7 et 10 semaines).
Etude des facteurs protecteurs contre l’inflammation du cerveau à l’aide d’un modèle animal de sclérose en plaques
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
Les souris dont l'état se dégrade nettement sont tuées immédiatement, puis analysées. 405 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dont 360 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré et 45 pour l'élevage, mises à mort à un an. Chacune subit un prélèvement de 2 mm au bout de la queue, quatre injections abdominales consécutives, puis deux injections sous la peau et dans l'abdomen d'un mélange qui déclenche une inflammation du système nerveux reproduisant la sclérose en plaques. Le porteur affirme avoir choisi des conditions d'induction produisant des symptômes "modérés", sans douleur ni perte de poids significative, et annonce que les retombées "devraient sans nul doute" ouvrir des pistes thérapeutiques chez l'humain.
Objectifs
La sclérose en plaques (SEP) est une maladie chronique du cerveau et de la moelle épinière qui conduit à une destruction progressive de la gaine de protéines qui entoure les neurones. Elle est dévastatrice et conduit à la paralysie du patient. Une partie des cellules immunitaires, les macrophages du cerveau appelés microglies (MG), protègent normalement le système nerveux central du développement de la SEP. Il a été récemment découvert que les MG contiennent une substance nommée la protéine P, qui contrôle la fonction des MG et leur capacité de protection contre les maladies du cerveau. L'objectif de ce projet est d'étudier in vivo le rôle de la protéine P dans la progression de la SEP chez des souris transgéniques, en induisant la maladie par un traitement chimique. Nous étudierons également comment la protéine P modifie l'activité des MG. Nous espérons que notre projet permettra d'identifier de nouveaux outils diagnostics et thérapeutiques dans le contexte de la SEP.
Bénéfices attendus
Le rôle de la protéine P dans un modèle murin de SEP n'a jamais été testé et permettra de confirmer des résultats préliminaires in vitro sur son rôle dans la progression de la SEP. Les données que nous obtiendrons permettront d'identifier de nouveaux outils pronostics, et peut-être thérapeutiques, en découvrant les gènes contrôlés par la protéine P dans les MG, qui seront des cibles thérapeutiques potentielles. Les retombées de ce travail seront utiles pour la compréhension des mécanismes pathologiques de la SEP et devraient sans nul doute faire découvrir de nouveaux outils de prévention et des implications thérapeutiques à terme chez l'homme.
Procédures
Les souris auront une biopsie de la queue, qui consiste à prélever 2 mm de l'extrémité de la queue. Elles recevront pendant quatre jours consécutifs une injection dans le ventre d'un produit permettant de supprimer la protéine P chez les souris ayant une modification génétique spécifique. Cette injection dure moins de deux minutes. Quatorze jours plus tard, les souris recevront deux injections sous la peau et dans le ventre d'une combinaison de substances produisant le modèle de sclérose plaques chez l'animal. Ce traitement consiste à injecter deux produits qui induisent une inflammation du système nerveux. Cette intervention dure moins de 15 minutes sur des souris anesthésiées pour éviter tout stress chez l'animal. Toutes les souris seront observées quotidiennement pour évaluer l'évolution de la pathologie. Celles présentant une dégradation importante de leur état seront immédiatement euthanasiées et analysées.
Impact sur les animaux
La biopsie de l’extrémité de la queue peut causer une brève douleur et un léger saignement qui seront arrêtés par une légère pression exercée localement.Si une rougeur au niveau de la queue est observée nous appliquerons un antiseptique (Clorhexidine). Des injections répétées pendant quatre jours consécutifs peuvent être une source de stress pour les animaux.
Devenir
Les 45 souris utilisées pour l’élevage seront euthanasiées à l’âge d’un an. Les 360 souris étudiées (souris d’intérêt et souris contrôle) seront euthanasiées à la fin de l’étude (10 à 15 semaines pour les souris euthanasiées au pic de la maladie et 12 à 17 semaines pour les souris euthanasiées 30 jours après induction de la maladie). Des études post-mortem seront réalisées sur les cellules immunitaires prélevées dans le cerveau de ces souris.
Remplacement
Toutes les données in vitro montrent clairement, et pour la première fois, que la protéine P est exprimée par les macrophages (MG) du cerveau et contrôle leur fonction. La lignée de souris qui n’exprime plus P dans les MG nous permettra de mimer au mieux la sclérose en plaques, une maladie très sévère qui conduit à la paralysie des patients et à leur mort. Les connaissances issues de cette étude sur l’animal ne peuvent pas être obtenues par d’autres méthodes, étant donné la complexité physiologique du développement de la sclérose en plaques. Nous sommes donc obligés de travailler à l'échelle de l'organisme. L'inactivation de la protéine P ne peut être réalisée que sur l'animal et la complexité du cerveau ainsi que les interactions entre les nombreux types cellulaires impliqués dans la maladie ne peuvent pas être reproduites in vitro par des cultures cellulaires.
Réduction
Nous utilisons l'effectif minimal qui permet d'avoir des résultats robustes qui pourront ensuite être transposés chez l’homme. L’induction de la maladie sera réalisée en trois séries d'expériences : 1). - pour suivre l’état clinique des animaux pendant un mois ; 2) - pour isoler les macrophages du cerveau (MG) au pic de la maladie et les analyser ; 3)- pour isoler les macrophages du cerveau des souris avec ou sans la protéine P, en absence de la maladie. Cette dernière étape nous indiquera des marqueurs qui pourront être utilisés pour prédire la progression de la maladie. Le nombre total de souris est de 360. 45 souris seront utilisées comme géniteurs dans l'élevage. Pour réduire le nombre total de croisements et donc de souris, nous utiliserons aussi bien des femelles que des mâles, parce que la maladie SEP ne montre pas de différence due au genre.
Raffinement
Les méthodes et les mesures choisies visent à diminuer au maximum les contraintes imposées aux animaux. Les souris sont placées par groupe de cinq dans des cages ventilées. La température, l'humidité, la nourriture et l'eau sont contrôlées tous les jours. En plus de la litière, les cages sont enrichies avec un bâtonnet en bois, des cotons et du kraft, pour permettre aux souris de jouer et avoir une activité diversifiée. Avant les injections sous-cutanées, les souris seront anesthésiées pour éviter l’induction de stress. Des points limites suffisamment précoces et prédictifs ont été définis pour éviter toute douleur, souffrance et angoisse infligée aux animaux. D’ailleurs, nous avons choisi des conditions d’induction de la maladie qui permettent un développement modéré des symptômes de la maladie sans induction de douleur et sans perte significative de poids des aliments spécifiques qui permettront aux souris de s’hydrater et s’alimenter sans difficulté. Le suivi des souris malades deux fois par jour permettra de réagir immédiatement en cas de souffrance. Enfin, nous nous attendons à ce que le blocage de la protéine Pax6 induise la maladie plus tôt et avec un phénotype plus marqué. Si notre hypothèse est correcte, nous allons raccourcir la durée de l’expérience.
Choix des espèces
Nous travaillons sur la souris, car c'est le meilleur modèle pour créer des animaux transgéniques et comparer le développment des maladies chez ces animaux avec les pathologies humaines. Les souris transgéniques sont largement utilisées dans l'étude des mécanismes physiopathologiques des maladies humaines. Toutes nos données in vitro montrent clairement, et pour la première fois, que la protéine P est exprimée par les macrophages du cerveau et régule l'état inflammatoire de ces cellules. La lignée de souris qui permet d'inactiver la protéine P chez l’animal adulte, exclusivement dans les microglies (les macrophages du cerveau), est un modèle idéal pour étudier le rôle de la protéine P dans le développement de la sclérose en plaques (SEP). Ce modèle de SEP chez la souris est de loin le meilleur moyen de mimer la SEP humaine, l'une des maladies les plus sévères et dévastatrices, liée à une activation aberrante des microglies, qui sont les macrophages du cerveau, et qui jouent un rôle protecteur contre l'inflammation du cerveau. Toutes les souris devront être adultes, âgées de 6 à 8 semaines, parce que la maladie SEP se développe chez l'être humain adulte.
Immunogénicité et innocuité de candidats vaccins chez le macaque
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
- Troubles immunitaires
400 macaques à longue queue vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger pour 350 d'entre eux et modéré pour 50. Pendant leurs trois ans de présence sur le site, chaque animal peut recevoir jusqu'à dix vaccinations et subir de 30 à 40 prélèvements de sang ou de muqueuses, soit environ un par mois, avec rougeurs, gonflements et poussées de température au point d'injection. Le porteur affirme qu'aucune méthode in vitro ne reproduit la complexité des réponses immunitaires et conclut que le recours à l'animal de laboratoire est "indispensable", le primate permettant en outre de tester des doses humaines. Aucune mise à mort n'est programmée à l'issue du projet : 300 macaques seront réutilisés dans d'autres études et 100 envoyés vers d'autres centres, internes ou externes au groupe, dès l'âge de cinq ans, pour éviter les bagarres liées à la maturité sexuelle et renouveler la colonie.
Objectifs
Ce projet a pour objectif d’évaluer, chez le macaque, l’immunogénicité et l’innocuité de candidats vaccins développés en traitements préventifs ou thérapeutiques de maladies infectieuses. Ces candidats incluent des protéines recombinantes, des bactéries ou virus vivants atténués ou inactivés, des acides nucléiques (ARN ou ADN), des vaccins sous-unitaires de type polysaccharides, etc…. Les études d'immunogénicité permettent d'évaluer le bénéfice de nos candidats vaccins préventifs ou thérapeutiques, d'identifier les composants nécessaires à leur formulation, d'évaluer les nouvelles voies d'administration ou les nouvelles formes pharmaceutiques qui permettent d'améliorer leur performance et leur innocuité. Ces études permettent également de comprendre le mécanisme d'action des candidats vaccins. L’objectif est d’analyser dans un contexte prophylactique la réponse immune primaire, de rappel ou mémoire, ainsi que certains paramètres d’innocuité (réactogénicité locale et systémique, suivi du poids et éventuellement de la température corporelle, …). Des études de dosage de l’antigène d’intérêt peuvent être aussi nécessaires (contexte thérapeutique ou biodistribution).
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus pour ce projet sont multiples : i) sélection des antigènes ou des adjuvants constituant le candidat vaccin ii) définition de la dose humaine iii) évaluation du mécanisme d’action du candidat vaccin iv) évaluation de la performance du candidat vaccin au niveau préclinique avant les essais cliniques chez l’homme. Ainsi la découverte de nouveaux vaccins permettra de lutter contre des maladies pour lesquelles il n'existe pas de thérapies ou de prophylaxies suffisamment efficaces.
Procédures
Les études d’immunogénicité et d’innocuité chez le macaque consistent à administrer des antigènes vaccinaux, anticorps, sérums, dont la dose peut être unique ou multiple sous différentes voies d’immunisation en vue de générer des réponses immunitaires spécifiques contre un pathogène défini. Cette réponse immunitaire sera suivie grâce aux différents prélèvements réalisés sur les animaux comme des prises de sang ou des prélèvements mucosaux. Les animaux sont soumis, durant leur 3 ans de présence sur notre site à un maximum de 10 vaccinations et à un maximum de 30 à 40 prélèvements (sang ou autres), soit en moyenne un prélèvement par mois. Les injections durent moins d’une minute et les prélèvements sont inférieurs à 5 minutes (contention – prise de sang – hémostase).
Impact sur les animaux
Le degré de gravité des procédures utilisées est évalué en modéré et léger. L’administration des candidats vaccins ou thérapeutiques génère des signes cliniques légers à modéré. Seul des signes de réactogénicité locale au point d’injection avec principalement de l’érythème, voire parfois un gonflement et une induration des tissus, ou une réactogénicité systémique comme une élévation de la température corporelle pourraient être observés. Ces signes sont transitoires et disparaissent quelques jours après l’immunisation.
Devenir
Les macaques font partis de la colonie du site. Ceux-ci sont gardés et utilisés dans plusieurs études. Afin d’éviter les conflits (bagarre, morsures, …) dus à la maturité sexuelle et aussi pour permettre de renouveler la colonie, ils peuvent être envoyés dans d’autres centres internes ou externes au groupe, généralement à partir de l’âge de 5 ans. En dernier recours, en fonction de l’état de santé des animaux et en accord avec le vétérinaire désigné, l’euthanasie pourra être prévue pour les animaux le nécessitant.
Remplacement
Dans le cadre du développement de candidats vaccins, thérapeutiques ou d’anticorps la réponse immunitaire ainsi que la protection induite par de nouveaux antigènes et des candidats vaccins doivent être évaluées sur un organisme entier. A ce jour, il n'existe pas de méthodes alternatives in vitro pour reproduire la complexité des réponses immunes et évaluer les capacités d’un vaccin prophylactique ou thérapeutique à induire une réponse immunitaire. De plus, le primate est un modèle animal qui permet d'évaluer le potentiel des formulations vaccinales ou thérapeutiques à des doses humaines.Le recours à l'animal de laboratoire s'avère donc indispensable.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisé est revu par nos équipes de biostatisticiens et correspond au nombre minimal d’animaux permettant d’avoir des résultats scientifiquement fiables et reproductibles. Lorsque le design du test le rend possible, un prélèvement sanguin des animaux avant la première immunisation est réalisé pour éviter l’ajout d'un groupe contrôle non immunisé.
Raffinement
Les animaux sont hébergés en groupes sociaux dans des volières contenant des dispositifs d'enrichissement structurels (tunnels, balançoires, lianes, tiges verticales, barrières visuelles), environnementaux (musique, jouets) et alimentaires (graines, fruits secs, vers de farine) conformes aux standards réglementaires. La présence de litière au sol leur permet d’avoir un comportement exploratoire. Un renforcement positif aux actes techniques courants (passage d’une volière à l’autre, passage dans une cage de transport ou dans une cage de pesée) dès leur arrivée dans nos locaux permet de diminuer le stress des manipulations. Les animaux sont suivis quotidiennement par un personnel spécifiquement formé. L'anesthésie chimique est utilisée seulement si le type de manipulation le nécessite (examen clinique à réception, actes de chirurgie, prélèvements sanguins de plus de 15 ml...)
Choix des espèces
L’immunogénicité induite par un candidat vaccin à visée prophylactique ou thérapeutique nécessite un enchainement d’étapes et implique de multiples organes et tissus. Cette succession d’évènements est difficile à reproduire in vitro, pour cette raison, le recours à l’animal est requis dans la plupart des cas. Des essais sur cellules animales ou humaines reproduisant in vitro certains compartiments du système immunitaire humain, peuvent apporter des données complémentaires mais ne peuvent totalement se substituer aux essais in vivo à ce jour.
Rôles du facteur de transcription hypothalamique Mafa dans la régulation physiologique du sommeil chez la souris
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Trois heures de chirurgie pour poser des électrodes crâniennes, puis six semaines d'isolement dont trois passées seule dans un baril de plexiglas : 80 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue pour prélever leur cerveau. L'objet du projet est d'établir si le dysfonctionnement d'un groupe de neurones de l'hypothalamus explique les troubles du sommeil qui accompagnent le diabète. Le porteur reconnaît que cet isolement peut induire un stress, qu'il qualifie de léger et rapidement estompé, et met en avant les contacts visuels et olfactifs conservés entre quatre barils voisins. Il écarte la mouche et le poisson zèbre, dépourvus de sommeil paradoxal, et juge que les organoïdes, les cultures sur puces et l'intelligence artificielle "ne constituent pas encore d'alternatives crédibles".
Objectifs
Le diabète est fréquemment associé à des troubles du sommeil (fragmentation, cauchemars, apnées, fatigue diurne) et de la température corporelle (sueur, hypothermie). Notre équipe a récemment observé chez la souris qu’un gène contrôlant la fabrication de l’insuline par le pancréas jouerait également un rôle dans une région du cerveau impliquée dans des fonctions vitales comme le sommeil et la thermorégulation. Conduit chez la souris, ce projet expérimental vise donc à (1) caractériser anatomiquement et fonctionnellement les neurones de cette région du cerveau ; (2) étudier leur lien avec le glucose ; et (3) établir dans quelle mesure leur disfonctionnement pourrait être responsable des troubles du sommeil liés au diabète. Seul le troisième axe de ce projet plus large fait l’objet de cette présente DAP.
Bénéfices attendus
Ce projet vise à renforcer nos connaissances sur le sommeil physiologique mais aussi pathologique accompagnant le diabète et des troubles de la température corporelle. Nos travaux et ceux de nos collaborateurs apporteront un éclairage nouveau sur le lien entre le diabète et certaines de ses comorbidités dans le système nerveux central. Ces connaissances fondamentales sont susceptibles d'ouvrir sur le long terme des pistes thérapeutiques pour le traitement des troubles du sommeil chez les patients diabétiques.
Procédures
Les animaux seront soumis à une intervention chirurgicale (3h) sous anesthésie et analgésie générales requises pour la pose des électrodes permettant d’enregistrer le sommeil. A l’issue de la chirurgie, les souris seront placées à l’isolement partiel pendant 6 semaines dont 3 en cage double avec séparateur pendant la récupération post-opératoire et 3 en baril individuel pendant les enregistrements. Ce baril sera placé dans une enceinte contenant 3 autres barils. Quelques interactions sociales sont ainsi maintenues sans contact tout au long de la procédure.
Impact sur les animaux
La procédure est classée de sévérité modérée. Les lignées de souris transgéniques mises en œuvre dans ce projet sont normales et viables. L’anesthésie chirurgicale entraîne une légère baisse de la température corporelle rapidement compensée par l’utilisation d’une couverture chauffante. Chirurgie : possible douleur au réveil, contrôlée par des médicaments appropriés. Récupération post-opératoire en quelques heures en cage double avec grillage facilitant des interactions sociales sans contact. Lors de l’enregistrement du sommeil, chaque souris sera hébergée dans un baril individuel placé dans un caisson contenant 3 autres barils, facilitant ainsi quelques interactions sociales. Cet isolement peut induit un léger stress qui s’estompe rapidement au cours de la période d’habituation à ce nouvel environnement. Les expérimentations induisent une perturbation réversible transitoire du rythme veille-sommeil (3h) qui fait l’objet de la présente étude.
Devenir
Toutes les souris pour ce projet de recherche seront mises à mort à la fin de la procédure pour le prélèvement des cerveaux.
Remplacement
Il est impossible d’étudier une fonction vitale comme le sommeil hors d’un organisme vivant. Aussi, les modèles animaux demeurent essentiels pour reproduire, comprendre et modéliser des mécanismes neurobiologiques complexes. La souris est particulièrement bien adaptée aux études neurophysiologiques (faible prise de poids et de volume corporel avec l’âge, lignées génétiquement modifiées). Par ailleurs, ses mécanismes nerveux du cycle veille-sommeil sont communs à tous les mammifères, incluant l’homme. Des animaux moins évolués comme la mouche ou le poisson zèbre sont parfois utilisés (activité/inactivité) mais ils ne possèdent pas de sommeil paradoxal et leur cerveau ne présente pas la même complexité anatomique et fonctionnelle. D’autres méthodes prometteuses se développent comme la modélisation et l’intelligence artificielle, les cultures cellulaires sur puces ou les organoïdes mais elles ne constituent pas encore d’alternatives crédibles et pertinentes aborder des processus aussi complexes que le sommeil et comprendre des pathologies qui l’affectent comme le diabète, les apnées du sommeil ou la narcolepsie.
Réduction
Notre estimation porte sur un besoin de 80 souris réparties en 8 lots expérimentaux. Les expériences proposées ont été conçues pour minimiser le nombre d'animaux tout en maximisant les effets statistiques. La taille de chaque lot expérimental a été calculée et optimisée sur la base de nos études chez la souris publiées récemment. Ces calculs prennent en compte les « erreurs et échecs » aux différentes étapes de la procédure expérimentale, la variabilité́ interindividuelle des paramètres physiologiques considérés, la dégradation des conditions d’enregistrement du sommeil au cours du temps pouvant rendre les interprétations fonctionnelles aléatoires, mais aussi la nécessité́ de ne pas compromettre la reproductibilité́ et la significativité́ des données obtenues (utilisation systématique de tests statistiques adaptés aux petits échantillons).
Raffinement
Les animaux seront suivis quotidiennement dès la phase post-opératoire pour optimiser leur récupération (médicaments adaptés si nécessaire, suivis du poids, de la mobilité et du comportement). Notre préoccupation est de détecter rapidement si certains paramètres physiologiques et comportementaux se dégradent pendant la procédure, constituant des points limites avec mise à mort pour prévenir une quelconque souffrance. Pour la durée de la procédure, chaque animal est hébergé dans un baril individuel en plexiglas transparent. Quatre barils sont placés dans le caisson d’enregistrement pour que les animaux gardent des contacts visuels, auditifs, olfactifs, limitant les effets possiblement angoissants liés à l’isolement social. Des enrichissements conventionnels (roue, coton, bâtonnet de bois, lanière de carton) sont fournis pour la fabrication du nid et réduire l’anxiété générée par cet isolement social. Les souris sont habituées à ingérer volontairement, sans intervention de l’expérimentateur, le principe actif à la dose de travail pour éviter le stress intense provoqué par leur manipulation lors d’une injection par piqure, avec des effets physiologiques confondants évidents sur le sommeil.
Choix des espèces
Les souris génétiquement modifiées ouvrent d’immenses possibilités de recherche scientifique sur des mécanismes nerveux complexes. Il est ainsi possible de corréler l’action d’un gène avec à une fonction vitale comme le sommeil. La compréhension de ces mécanismes à l’échelle cellulaire et moléculaire passe par des techniques encore impossibles chez l’homme mais applicables chez la souris. Des animaux plus simples que la souris sont parfois utilisés (mouches, poissons rouges etc) mais ils ne sont pas pertinents pour comprendre le sommeil et ses fonctions chez l’homme. Des souris jeunes adultes (3-5 mois) seront utilisées car leur sommeil est mature et consolidé à cet âge-là.
Rôle des hormones dans la régulation du métabolisme chez la souris.
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
1 600 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, chacune pouvant recevoir jusqu'à quinze injections, subir vingt-huit jours consécutifs de contention et d'administration hormonale par pousse-seringue, puis passer sept jours seule en cage métabolique. S'y ajoutent, selon les groupes, une injection bilatérale dans le crâne de vingt-cinq minutes, la pose de canules ou de pompes osmotiques sous la peau, trois mois de régime obésogène et un jeûne de six heures. Toutes sont tuées à l'issue, la moitié pour prélever cerveau, foie et tissus adipeux, l'autre moitié lors d'une chirurgie menée sous anesthésie sans réveil. Le bénéfice annoncé, de nouvelles stratégies contre l'obésité, l'anorexie et le déclin métabolique lié à l'âge, tient en une phrase au conditionnel, et l'effectif n'est justifié que par la mention d'un "nombre minimum d'animaux le plus réduit possible".
Objectifs
Comme chez les humains, les souris possèdent des récepteurs et des hormones similaires que l'on peut étudier pour mieux comprendre les mécanismes de régulation du métabolisme. L'objectif de cette étude est de comprendre comment les hormones régulent le métabolisme en agissant sur le cerveau chez les souris : - Nous nous intéresserons dans une première partie à ces mécanismes de régulation du métabolisme dans le cadre d'un régime alimentaire conduisant à l'obésité. - La seconde partie s'intéressera aux effets du vieillissement sur ces mécanismes de régulation. Il est bien établi que le vieillissement est associé au déclin du métabolisme mais aussi des taux sanguins des hormones : notre objectif est de savoir si un lien existe entre ces deux déclins dans la dérégulation du métabolisme chez le sujet âgé.
Bénéfices attendus
Ce projet pourrait permettre de conduire au développement de nouvelles stratégies thérapeutiques contre l'obésité et/ou l'anorexie mais aussi pour ralentir et limiter le déclin du métabolisme associé au vieillissement.
Procédures
- Injections intrapéritonéales (5 max par souris ; durée
Impact sur les animaux
Les différentes injections sous cutanées ou intrapéritonéales peuvent induire un stress et une douleur légère de courtes durées. Lors de l’intervention chirurgicale (10 ou 25 minutes par souris), l’anesthésie conduit à des modifications physiologiques transitoires de l’animal. La perforation et l’ouverture du plan cutané entrainera une nuisance directe de cet acte le temps de la cicatrisation des tissus osseux et cutanés d’une durée de plusieurs jours. Suite à la chirurgie, les plaies chirurgicales peuvent présenter des signes d'infections ou d'inflammation. La pose de pompes osmotiques et de canules d'administrations locales peut entrainer une gêne légère et nécessitera un temps d'adaptation pour les souris. Pour les administrations locales, la contention de l'animal peut générer également un stress transitoire. Lors de l’étude du comportement alimentaire et pour la mesure des paramètres métaboliques, les animaux sont isolés dans leur cage métabolique (nouvel environnement pendant 7 jours) pour recueillir les données individuelles. Cet isolement est incontournable et peut générer un stress léger transitoire. Le jeûne de 6h sera réalisé pendant la période d’activité des animaux (période nocturne) et peut générer des troubles relationnels (agressivité modérée). Suite au jeûne, l’incision du bout de la queue pour les prélèvements de sang pour les tests de la glycémie peut éventuellement générer un stress très furtif.
Devenir
Les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure. Une moitié d’entre eux sera utilisée pour la collecte de structures cérébrales et d’organes périphériques (foie, tissus adipeux...) pour des études de biologie moléculaire. La seconde moitié fera l’objet d'une chirurgie sans réveil sous anesthésie (études histologiques).
Remplacement
Une veille bibliographique a été réalisée pour ce contexte scientifique. A ce jour, il n’existe pas dans la littérature de modèle de remplacement pour étudier le comportement alimentaire animal. Pour réaliser les tests de comportement alimentaire et mesurer le métabolisme énergétique, nous devons utiliser des animaux vivants.
Réduction
L’étude sera arrêtée si les expérimentations initiales invalident l’hypothèse de travail. Les expériences sont réalisées avec le nombre minimum d'animaux le plus réduit possible. Des prélèvements auront lieu pour des analyses histologiques, de biologie cellulaire et moléculaire afin d’extraire le maximum de données de chaque expérimentation.
Raffinement
Les chirurgies seront réalisées sous anesthésie générale profonde pour éviter toute douleur et des antalgiques sont prévus en pré et post-opératoire. Pour assurer le bien-être des souris, elles seront regroupées et placées en cages dans un milieu enrichi pour réaliser une nidification à façonner (matière fibres végétales). Les souris seront sous surveillance journalière et des points limites ont été établis, entrainant la mise à mort anticipée de l’animal si nécessaire.
Choix des espèces
Les gènes des récepteurs hormonaux sont exprimés aussi bien dans le cerveau de l'homme que dans celui de la souris. La souris présente l’avantage de faciliter en termes d’élevage et de reproduction. De plus, de nombreux outils d’analyses ont été développés et bien caractérisés dans cette espèce animale. Des souris jeunes adultes (3-7 mois) ou âgées (16-19 mois) seront utilisées. Ces deux niveaux d’âges nous permettent ainsi d’évaluer l’effet du vieillissement sur les processus de régulation du comportement alimentaire et du métabolisme énergétique.
Effets combinés de contaminants environnementaux sur la truite arc en ciel
- Recherche appliquée
- Toxicologie (hors obligations réglementaires)
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
1 770 truites arc-en-ciel vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dont 1 500 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Alevins et juvéniles de 1 à 40 grammes, elles seront exposées pendant plusieurs mois à un herbicide, à des cyanotoxines et au virus de la nécrose hématopoïétique infectieuse, dont le porteur indique qu'il provoque léthargie, hémorragies et une mortalité élevée. Une seule phrase décrit les procédures dans tout le résumé, et les effets indésirables annoncés vont "du simple stress" jusqu'à la mort, que l'équipe espère anticiper au moyen d'une grille de score. Le choix de l'espèce est justifié par son "grand intérêt économique" et par un cycle de développement plus long que celui du poisson zèbre, qui autorise des expositions chroniques dès le stade embryonnaire.
Objectifs
Le projet s’intéresse à un trio de contaminants majeurs, chimiques et microbiologiques, présents dans les rivères et à leur impact sur la truite arc-en-ciel, espèce modèle en écotoxicologie et à fort intérêt économique. Les pesticides couramment utilisés en agro-viticulture et présentent des effets perturbateurs endocriniens avérés chez le poisson. Les microcystines, cyanotoxines les plus courantes dans les eaux douces et connues pour induire une toxicité sur divers tissus et organes (principalement foie et appareil reproducteur) chez les animaux, présentent un risque avéré pour l’homme et la faune aquatique. Enfin, le virus de la Nécrose hématopoïétique infectieuse, agent non-zoonotique réglementé, induit de multiples signes cliniques (léthargie, hémorragies, …) chez les salmonidés, associés à une mortalité élevée. Les objectifs sont de mesurer 1) l'accumulation et l'élimination des microcystines chez la truite, préalablement exposées ou non à un pesticide pendant les premiers stades de vie et 2) les perturbations potentielles induites sur les défenses immunitaires ainsi que sur la réponse antioxydante dans un contexte d’exposition simple et complexe.
Bénéfices attendus
Si l’impact du couple contaminant chimique/virus a été testé chez la truite sur des composés de différentes natures, le couple microcystines/virus a pour l’instant fait l’objet d’une seule étude, sur une autre espèce piscicole, et le couple pesticide/microcystines ainsi que le trio pesticide/microcystines/virus n’ont encore jamais été testés. Les données de la littérature semblent indiquer que l’exposition aux contaminants augmenterait la susceptibilité aux pathogènes. Outre le caractère novateur du choix des composantes, nous produirons au travers de ce projet des données originales concernant les capacités d’accumulation et d’élimination des microcystines chez différentes populations de truite i.e. saines, exposées au pesticide et/ou infectées par le virus. La prise en compte de ces phénomènes de multi-exposition est une approche importante permettant de prendre la pleine mesure de l’impact de co contaminants sur un écosystème, et s’inscrit donc dans le concept “One Health” avec une démarche intégrée d’évaluation des risques. L’environnement aquatique se caractérisant par la présence concomitante de différents types de contaminants, l’évaluation de l’effet de multi-expositions est particulièrement pertinente pour mesurer les impacts écotoxicologiques et sanitaires dans cet écosystème. L’approche expérimentale choisie permettra de déterminer si la co-exposition a un effet aggravant sur l’état de santé de la truite, en intégrant une notion du risque sanitaire pour l’homme lié à l’accumulation des microcystines dans le poisson.
Procédures
Les animaux seront exposés à un trio de contaminants majeurs, chimiques et microbiologiques, présents dans les rivières.
Impact sur les animaux
Les effets indésirables vont du simple stress, aux signes cliniques de l’infection au virus (troubles nerveux) jusqu’à possiblement la mort, où nous essayerons d’intervenir en amont à l'aide de grille de score.
Devenir
tous les animaux seront mis à mort
Remplacement
L’étude de la cinétique de bioaccumulation et d'élimination des microcystines nécessite la mise en place de systèmes biologiques représentatifs de la complexité du fonctionnement d’un organisme. Ceci est encore plus vrai dans le cas de l’étude d’interactions possibles entre différents systèmes biologiques, ici la cinétique de bioaccumulation et le système immunitaire. Elle ne peut pas être substituée, notamment pour l’étude des effets sur différents systèmes et des interactions entre ceux-ci, par des méthodes alternatives (tests in vitro ou embryo larvaires).
Réduction
Ces procédures expérimentales seront menées en réduisant au maximum le nombre d’animaux utilisés tout en conservant une pertinence scientifique et statistique.
Raffinement
Les mesures de raffinement viseront à: - Assurer des conditions optimales d’hébergement des animaux afin de s’assurer de leur bien-être ; - Evaluer quotidiennement l’état de santé général des poissons et leur comportement natatoire et alimentaire, en suivant une grille de points limites adaptée.
Choix des espèces
La truite arc-en-ciel (Oncorhynchus mykiss) est une espèce idéale : (1) elle est d'un grand intérêt économique et représente un modèle environnemental pertinent proche des espèces endémiques (c.à.d, Salmo trutta fario) des eaux européennes, (2) c'est une espèce facile à élever en laboratoire, avec un cycle de développement plus long que le poisson-zèbre, ce qui permet des expositions chroniques aux stades embryonnaires, larvaires et juvéniles. Les animaux testés sont des alevins et juvéniles de poids moyen pouvant aller de 1 à 40g, leur petite taille permet de les étudier dans de bonnes conditions expérimentales sur plusieurs mois.
Réseaux neuronaux activés par des changements de règles spatio-temporelles
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
- Système nerveux
Opérés du cerveau sous anesthésie générale pendant une heure à une heure trente, 350 rats enchaînent ensuite jusqu'à douze semaines d'entraînement, cinq jours sur sept, sous restriction alimentaire maintenue à 90 ou 95 % de leur poids de forme pour garantir leur motivation à obtenir une récompense. Tous sont tués à l'issue pour analyse des cerveaux, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le porteur annonce que cette étude servira surtout de pilote afin de cibler les régions cérébrales visées lors de "procédures plus lourdes et invasives" prévues ensuite. La tâche imposée aux rats n'est jamais décrite, désignée seulement comme un changement de règle spatiotemporelle et une tâche comportementale que le porteur juge non stressante en soi.
Objectifs
L’objectif général du projet est de déterminer les réseaux neuronaux mis en jeu lors d’une adaptation comportementale suite à des changements de règles spatiotemporelles. L’objectif premier est d’évaluer, par imagerie moléculaire, l’implication d’un réseau entre deux zones du cortex. Cette étude nous apportera des informations importantes et nouvelles sur le rôle de ces régions cérébrales dans la flexibilité comportementale, mais elle servira également de pilote pour pouvoir cibler précisément les régions cérébrales impliquées lors de procédures plus lourdes et invasives qui auront lieu dans une prochaine étude.
Bénéfices attendus
Ce projet apportera une information précieuse sur les réseaux neuronaux impliqués dans la flexibilité comportementale. Outre son intérêt en recherche fondamentale, ce projet devrait fournir des indications précieuses en recherche translationnelle dans la mesure où des dysfonctionnements préfrontaux et de flexibilité cognitive ont été décrits dans plusieurs maladies du cerveau (ex : Schizophrénie, addictions).
Procédures
Dans ce projet, tous les rats subiront une intervention chirurgicale sous anesthésie générale (durée ~1h-1h30) pour une injection dans le cerveau et un entraînement comportemental, qui nécessite un apport de nourriture contrôlé pour une durée maximale de 12 semaines, à raison d'une séance d'au maximum 1h, à un rythme d'au minimum 5 jours sur 7.
Impact sur les animaux
La tâche comportementale n’est pas stressante en soi, mais nécessite que l’animal ait une certaine motivation pour explorer l’environnement et chercher le renforcement positif (récompense). Pour être au plus près du comportement naturel et favoriser la motivation, nous procéderons à une alimentation contrôlée, en donnant la nourriture immédiatement après la séance comportementale en quantité suffisante (90-95% de la ration normale), de façon à ce qu’il n’y ait pas de reste de nourriture le lendemain, mais que l’animal ait une légère sensation de faim garantissant la motivation des animaux à obtenir une récompense alimentaire. Le poids de l’animal est vérifié régulièrement et ne doit pas descendre en-dessous de 90-95% de son poids de forme théorique pour plus de deux jours consécutifs. Cette restriction temporaire est en partie compensée par la nourriture obtenue au cours de la tâche comportementale et impacte très peu leur bien-être. Un autre point de vigilance concerne la chirurgie. La chirurgie d’injection cérébrale de composés est faite sous antalgique et anesthésie générale, mais présente un risque de diminution du bien-être animal dans les moments/jours qui suivent la chirurgie (inconfort, fatigue et parfois douleur).
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure (pour analyse des cerveaux).
Remplacement
Ce projet de recherche fondamentale s’inscrit dans le champ des Neurosciences comportementales. En effet, l’évaluation comportementale et neurobiologique en réponse à un changement de règle spatiotemporelle nécessite l’utilisation d’organismes entiers et vivants. L'utilisation d'animaux dans ce projet est nécessaire car nous ne pouvons pas mener ces expériences sur des sujets humains. De plus, les espèces d'invertébrés n'ont pas la capacité pour les comportements décisionnels étudiés dans ce projet et, à l'heure actuelle, ces comportements n'ont été démontrés que chez les mammifères et les corvidés. De même, l’approche neurocomputationelle faisant appel à la modélisation est utile, mais complémentaire des approches invasives in vivo permettant de vérifier la véracité des modèles prédictifs. Dans ce contexte il demeure nécessaire d’avoir recours à l’expérimentation animale.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés sera minimisé autant que possible grâce à l’étude de plusieurs paramètres chez le même animal. Nous avons calculé le nombre de rats minimal par groupe pour obtenir des résultats significatifs et exploitables, en tenant compte de la perte de certains animaux (comportement temporel instable, perte à la chirurgie, mauvaise incorporation du traceur). Pour l’ensemble des données, une analyse statistique classique dans le domaine sera utilisée.
Raffinement
Après quelques jours d’acclimatation à leur arrivée dans l’animalerie, les rats sont manipulés et pesés au moins 2-3 jours avant la chirurgie, afin de les habituer à l’expérimentateur. Pour la procédure chirurgicale initiale, des protocoles appropriés d’analgésie et d’anesthésie seront appliqués. Le suivi postopératoire sera effectué quotidiennement par l’expérimentateur ou les zootechniciens pour s’assurer de la récupération complète des rats. Des points limites associés à des actions sont identifiés pour le cas où les mesures de prises en charge de la douleur et de l’inconfort pouvant résulter de l’étape chirurgicale ne seraient pas suffisantes, selon une grille de score et de suivi post-opératoire. Concernant la perfusion intracardiaque, nous utilisons une overdose d’euthanasiant et vérifions que les réflexes sont abolis avant de procéder à l’incision de la cage thoracique. En pilote, nous tentons une technique de raffinement (ajout d’un anesthésiant à l’euthanasiant, qui peut être douloureux au point d’injection) et vérifierons qu’elle ne compromet pas les résultats immunohistochimiques. Cette méthode pourra ensuite être généralisée. En pilote également, dans l'optique d'une future DAP avec des procédures plus invasives, nous évaluerons l'utilisation d'un équipement comportemental plus adapté pour des animaux porteurs d'implants cérébraux. Nous réduirons au maximum les techniques douloureuses ou stressantes. Chaque animal sera suivi tout au long de l’expérience afin de détecter tout indicateur de souffrance et déterminer si besoin l’arrêt de l’expérimentation en accord avec le SBEA et les conseils vétérinaires.
Choix des espèces
D’une façon générale, les rongeurs sont un bon modèle d’étude des circuits neuronaux des processus cognitifs. Les principes fonctionnels à l’œuvre dans ces circuits sont en effet largement conservés le long du phylum. De plus, de nombreuses épreuves comportementales spécifiques permettent de modéliser chez le rongeur des aptitudes cognitives complexes. Les rats ont été sélectionnés pour ce projet car ils sont grégaires, intelligents et présentent de nombreuses capacités comportementales similaires aux sujets humains. De plus, la littérature sur l’apprentissage temporel, dont nos propres publications, est majoritairement basée sur des études chez le rat, fournissant une base de connaissances solide. Les analyses anatomiques et fonctionnelles dans ces expériences s'appuient sur une richesse de connaissances sur la structure anatomique et la neurochimie du rat. Par ailleurs, le rat est généralement considéré comme ayant des capacités cognitives plus évoluées que la souris et la taille supérieure du rat nous permet de réaliser des interventions plus spécifiques au niveau central. Ce modèle animal est donc le plus approprié à la fois pour les études comportementales et neurobiologiques. Nous utilisons pour ce projet de jeunes adultes âgés de trois mois environ au début des expériences, âge auquel les structures cérébrales sont matures.
Délivrance ciblée d’une nanomolécule immuno-modulatrice par une approche d’ultrasons dans un modèle murin de maladie de Parkinson
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
Quatre injections de toxine en une journée, deux heures d'intervalle entre chacune : 408 souris reçoivent ainsi le produit qui reproduit la maladie de Parkinson, et environ 10 % d'entre elles en meurent dans les vingt-quatre heures. Au total 1 416 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré pour 600 d'entre elles et sévère pour 816. Chacune est anesthésiée jusqu'à huit fois pour recevoir un candidat médicament, puis exposée autant de fois à des ultrasons destinés à ouvrir la barrière qui protège le cerveau, 816 subissant en plus jusqu'à quatre prélèvements sanguins. Le porteur qualifie pourtant l'injection de la toxine de procédure "rapide et indolore", tout en attribuant la mortalité observée à une chute de la température corporelle et à un effet cardiovasculaire direct.
Objectifs
L’objectif principal de ce projet est d’évaluer l’utilisation d’un dispositif d’ouverture transitoire de la barrière hémato-encéphalique, ou BHE pour adresser efficacement un candidat médicament pour le traitement de la maladie de Parkinson. La BHE a pour rôle principal de protéger le cerveau en l’isolant de la circulation sanguine. De fait, le franchissement de cette barrière est un frein pour le traitement des maladies neurologiques dont la maladie de Parkinson, ainsi que pour le développement clinique de nouveaux candidats médicaments.
Bénéfices attendus
Nous avons montré précédemment que le candidat médicament a une faible capacité à passer la BHE. Pourtant, pour qu’il ait un effet thérapeutique, il est nécessaire qu’une quantité suffisante de ce candidat médicament atteigne le cerveau. Le dispositif que nous envisageons d’utiliser permettra au candidat médicament d’atteindre le cerveau en passant par le sang, afin qu’il puisse avoir un effet anti-inflammatoire local dans un modèle de la maladie de Parkinson chez la souris. À terme, nous espérons que ce système de passage à travers la BHE nous permettra de prouver l’efficacité de ce candidat-médicament contre la maladie de Parkinson, qui reste aujourd’hui incurable.
Procédures
1- Injection de produits : 1 416 souris seront anesthésiée pour administrer des produits spécifiques y compris le candidat médicament. Selon les groupes, cette intervention sera faite entre 1 et 8 fois. Durée estimée : moins de 2 minutes. 2- Application d’ondes spéciales, des ultrasons, pour permettre le passage du candidat médicament au cerveau : Ces 1 416 souris seront également exposées aux ultrasons pour permettre au candidat médicament d’atteindre le cerveau. La fréquence de cette procédure sera aussi de 1 à 8 fois selon les groupes. Durée estimée : moins de 10 minutes. 3- Injections de la toxine permettant de modéliser la maladie de Parkinson : un sous-groupe de 408 souris recevra des injections de la toxine. Quatre injections seront faites sur une journée, avec deux heures entre chaque injection. Cette procédure est rapide et indolore. Durée estimée : 5 secondes. Un autre sous-groupe de 408 souris recevra des injections de solution saline. 4- Prélèvements sanguins : les 816 souris, citées ci-dessus, subiront des prélèvements sanguins de faible volume sous anesthésie légère. Entre 1 et 4 prélèvements seront réalisés en fonction des groupes de souris. Durée estimée : moins de 2 minutes. 5- Procédure d’euthanasie : Toutes les souris (1416) seront euthanasiées par surdosage avec un mélange d'anesthésiants.
Impact sur les animaux
L’administration du médicament par la technique utilisée peut causer une augmentation locale de la température de 1.5°C au site d’application des ultrasons mais sans que cela n’engendre des brûlures. En ce qui concerne l'administration de la toxine pour modéliser la maladie de Parkinson chez la souris, elle présente un effet indésirable : une mortalité aiguë relativement élevée (environ 10 %). Cette mortalité ne semble pas être liée directement aux effets de la toxine sur le cerveau, mais plutôt à une baisse de la température corporelle et à un impact direct sur le système cardiovasculaire. Ces effets sont visibles pendant 24h post-administration.
Devenir
A l'issu de chaque procédure, les animaux seront euthanasiés et des analyses anatomiques, cellulaires et moléculaires sur les cerveaux et le sang des animaux utilisés dans ce projet seront réalisés.
Remplacement
Les animaux sont utilisés après des analyses réalisées in vitro afin de confirmer des résultats démontrés et des hypothèses formulées à partir des travaux réalisés sur cellules. A ce stade de l’expérimentation, l’utilisation de l’animal est inévitable. Actuellement aucun modèle in vitro ne permet de mimer le phénomène étudié dans son ensemble et dans sa complexité. Les études sont systématiquement optimisées d’après la littérature ou les observations réalisées au laboratoire. De plus, les traitements sont administrés de la façon la moins invasive possible.
Réduction
L’utilisation de l’animal est réduite au maximum et les effectifs des cohortes sont limités par l’outil statistique. Dans cette optique, nous utiliserons des groupes de 10 souris par groupe expérimental et nous répéterons les expériences 3 fois afin de rendre nos résultats exploitables. Pour chaque expérience, le maximum d’échantillons autorisés réglementairement seront prélevés sur l’animal afin d’éviter d’avoir à reproduire l’expérience par manque de tissus. Chaque fois que cela sera possible, nous analyserons un maximum de paramètres cellulaires et moléculaires sur les mêmes individus afin de limiter le nombre d’expériences in vivo.
Raffinement
Le bien-être des animaux sera suivi tout au long de nos expériences et fera l’objet de procédures strictes. Les souris seront toujours hébergées en groupes dans des cages avec une surface réglementaire, avec un libre accès à l’eau et la nourriture. Un suivi des animaux a été mis en place en accord avec le comité de suivi du bien–être animal de notre établissement pour limiter la douleur, la souffrance ou l’angoisse de l’animal. Les animaux sont hébergés dans des conditions définies par la directive européenne 2010/63/UE et auront à disposition des igloos, des bâtons à ronger et cotons pour la nidification. Les animaux sont suivis quotidiennement, leur masse, leur posture, leur mobilité seront observés, permettant la détection précoce d’anomalies éventuelles. Si l’animal présente des altérations physiques signes de douleur tels que des tremblements continus (4h), le dos constamment courbé et des problèmes d’équilibre, une anomalie respiratoire sévère, une diminution forte de la mobilité ou une perte de poids de plus de 20%, alors l’expérimentation sera immédiatement arrêtée et les souris concernées seront euthanasiées. Des périodes d’acclimatations à l’hébergement comme à la manipulation permettront de limiter l’angoisse des animaux. La douleur liée à l’expérimentation sera limitée par l’utilisation systématique d’analgésiques. En outre, les responsables du projet ont été formés à l’utilisation des animaux à des fins scientifiques et garantissent de la formation et l’encadrement des autres expérimentateurs impliqués dans les procédures expérimentales.
Choix des espèces
L’utilisation d’animaux vivants est essentielle dans la création de nouveaux médicaments, surtout pour démontrer l’efficacité potentielle de la molécule en développement. Ce projet a pour objectif de prouver que le candidat médicament peut agir efficacement dans un modèle de maladie de Parkinson (MP) grâce à une technique qui permet d’ouvrir de façon transitoire la barrière qui protège le cerveau. Les rongeurs, et en particulier les souris, sont souvent utilisés pour étudier des maladies du cerveau comme la maladie de Parkinson. Dans ce modèle, on induit la maladie en administrant une toxine, qui provoque chez les souris des symptômes similaires à ceux de la maladie de Parkinson, tels que la perte des neurones spécifiques impliquées dans le contrôle des mouvements. Ce modèle permet ainsi de mieux comprendre la maladie et de tester les effets des traitements potentiels. Le choix d’utiliser des souris se justifie aussi par la disponibilité d’outils d’analyse spécifiques qui sont bien développés pour cette espèce par rapport à d’autres. Ces outils facilitent l’étude des effets du traitement sur les tissus cérébraux des souris. Le principal facteur de risque dans des maladies comme la maladie de Parkinson est l’âge. Il est donc nécessaire d’utiliser des animaux adultes pour modéliser au mieux la progression de la maladie. Les effets de la toxine, qui reproduit certains symptômes de la maladie, ainsi que ses effets secondaires, varient beaucoup selon les différentes souches de souris. Cette sensibilité peut aussi être influencée par des facteurs comme le sexe, le poids et l’âge des animaux. Pour ce projet, nous utiliserons des souris adultes âgées de 12 semaines, car elles présentent une sensibilité bien documentée à cette toxine, ce qui en fait un modèle fiable pour cette étude.
Travaux pratiques sur rongeurs dans le cadre des formations continues pour les personnes amenées à réaliser les procédures expérimentales sur l’animal
- Enseignement supérieur
Rats : 330
Écartés des projets de recherche pour leur génotype ou leur sexe, 330 souris et 330 rats issus de l'élevage de l'établissement vont être utilisés dans des travaux pratiques de formation continue. Tous seront tués, 220 sous anesthésie sans réveil, les autres dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger ou modéré. Chaque participant dispose d'un animal sur lequel il pratique des injections sous-cutanée, intrapéritonéale, intramusculaire et intraveineuse, un gavage, une anesthésie gazeuse puis pharmacologique et trois types de prélèvements sanguins, avant d'apprendre le prélèvement d'organes et l'autopsie sur le cadavre. Le porteur affirme que la maîtrise de ces gestes passe par un apprentissage sur l'animal et ne peut être remplacée, la formation répondant à une obligation réglementaire de vingt-et-une heures sur six ans.
Objectifs
L’objectif du projet est la mise en place de travaux pratiques sur rongeurs dans le cadre des formations continues pour les personnes amenées à réaliser les procédures expérimentales sur l’animal afin de les aider à acquérir, entretenir, améliorer et/ou développer des compétences et connaissances professionnelles en accord avec le bien-être des animaux.
Bénéfices attendus
La formation des agents qui manipulent les animaux est très importante et incontournable car permet la réduction du stress et de la souffrance chez les animaux. Des agents bien formés seront plus attentif aussi aux signes de détresse des animaux. Cette formation est en conformation aux exigences réglementaires de formation continue des personnels impliqués dans le domaine de l’utilisation des animaux à des fins scientifiques (21h sur 6 ans).
Procédures
Les animaux seront soumis à : une anesthésie gazeuse (1 fois, 5 min) ; une anesthésie pharmacologique (injection intra-péritonéale ou sous-cutanée, 1 fois, 5 min) ; à une injection sous-cutanée, intra-péritonéale, Intra-musculaire, Intra-véneuse et gavage (1 fois, 3 min par injection/gavage) sur animal vigile; à 3 types de prélèvements sanguins sous anesthésie pharmacologique (1 fois, 15 min). L’euthanasie sera effectuée par une méthode réglementaire.
Impact sur les animaux
Les nuisances découleront des épisodes de contention des animaux vigiles et d’anesthésie, des administrations (sous-cutanée, intra-péritonéale, Intra-musculaire, Intra-véneuse, gavage) et des prélèvements sanguins. Ces différentes manipulations peuvent entrainer un stress chez l’animal. Les sites d’injections peuvent s’infecter. Les risques liés à l’anesthésie peuvent être : l’hypothermie, difficultés de réveil et respiratoires.
Devenir
Les animaux utilisés sont des animaux de réforme et seront tous euthanasiées à l’issue de période de maintien afin de permettre également aux participants des travaux pratiques d’apprendre les modalités de prélèvement d’organes et d’autopsie pouvant être nécessaire dans le cadre de leur activité professionnel.
Remplacement
Savoir mettre en œuvre les gestes techniques de façon appropriée pour la manipulation des rongeurs, dans le respect de leur bien-être, est fondamental pour le personnel manipulant les animaux. L’acquisition et la maitrise des bonnes pratiques nécessitent un apprentissage sur l’animal, encadré par un formateur pédagogue et expérimenté. L’utilisation d’animaux ne peut pas être remplacée dans ce contexte.
Réduction
Les séances des travaux pratiques seront organisées avec la participation de 10 personnes en présence de 2 formateurs. Chaque participant aura à disposition 1 animal (1 rat lors de la séance rat et 1 souris lors de la séance souris). Les formateurs utiliseront 1 animal (1 souris ou 1 rat selon la séance). Étant donné qu’il s’agit de travaux pratiques dispensés dans le cadre d’une formation continue, il est essentiel que chaque participant puisse mettre en œuvre de manière individuelle les gestes enseignés et de limiter le nombre d’interventions sur chaque animal. Les séances seront dédiées seulement aux souris ou aux rats. Il y aura 2 séances par semestre (4 séances par an) avec l’utilisation en totale de 660 animaux (330 souris et 330 rats) sur 5 ans. Pour ces travaux pratiques, seulement des animaux de réforme de la structure (qui héberge la formation) seront utilisés. Ces animaux, n’ayant subi aucune expérimentation au préalable, sont destinés à l’euthanasie car ne disposant pas des critères d’inclusion pour les projets de recherche (génotype, sexe, etc).
Raffinement
La stabulation des animaux sera conventionnelle (litière normale, cages ventilées individuellement, température et hygrométrie adaptées, éclairage alterné jour/nuit 12h/12h de 7h du matin à 7 h du soir) et ils recevront un régime alimentaire normal ad libitum ainsi que l'eau par abreuvement automatique. L’enrichissement consiste à placer des nids végétaux et des tunnels en carton dans les cages. Le comportement général des animaux sera suivi. Les animaux seront manipulés par les agents de la structure lors du change des cages afin de les habituer à la manipulation avant les travaux pratiques. Les animaux seront transférés dans la salle des Travaux pratiques le jour de la séance (3h avant le début de la séance). Par semestre, il y aura une séance dédiée aux souris et une dédiée aux rats (afin d’éviter les odeurs et ajouter du stress par la présence de plusieurs espèces pendant la même séance). Pour chaque séance pratique, il y aura un maximum de 10 participants et 2 formateurs expérimentés (1 pour 5 participants) qui veilleront à la bonne réalisation par les étudiants des gestes enseignés. Un animal sera utilisé par stagiaire et par formateur, ce qui évite de multiplier les interventions sur un même animal et permet à chaque participant d’être actif et réaliser les gestes enseignés, objectif de la formation. Pendant certaines travaux pratiques, les animaux seront soumis à l’anesthésie gazeuse et/ou chimique. Pendant l’anesthésie, les animaux seront placés sous tapis chauffants, leur température sera suivie à l'aide d'une sonde rectale ainsi que leur réveil.
Choix des espèces
Les formations proposées concernent la manipulation des rongeurs car les souris et rats constituent près de 75 pour cent des animaux utilisés à des fins scientifiques. Nous utiliserons des rongeurs adultes (à partir de 6 semaines) pour faciliter la manipulation des animaux par les participants à la formation.
Effet d’un nouvel anti-inflammatoire sur la circulation sanguine et le pronostic neurologique dans un modèle d’arrêt cardiaque chez le cochon EU2/2
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
Un calmant est injecté, puis une anesthésie générale posée, avant qu'une stimulation dans le ventricule droit ne déclenche une fibrillation et un arrêt cardiaque. Suivent quinze minutes de réanimation par massage cardiaque mécanique, quatre heures d'anesthésie, un réveil, vingt-quatre heures de surveillance, puis une nouvelle anesthésie et la mise à mort pour prélever les organes. 26 cochons vont être utilisés ainsi, répartis entre deux établissements, pour tester un anti-inflammatoire sur les lésions cérébrales qui suivent un arrêt cardiaque. Le porteur écrit que le massage mécanique peut causer des lésions internes douloureuses pendant les vingt-quatre heures suivant le réveil, et classe l'ensemble en souffrance modérée.
Objectifs
L'arrêt cardiaque correspond à l'arrêt brutal de la circulation sanguine et de la respiration. En Europe, seulement 11,7 % des personnes victimes d'un arrêt cardiaque en dehors de l'hôpital survivent. Cependant, à peine 7 % d'entre elles retrouvent un bon état neurologique, c'est-à-dire sans séquelles importantes. Au fil des années, les progrès scientifiques et technologiques ont permis d'améliorer les chances de survie. Par exemple, le massage cardiaque effectué rapidement par un témoin et l'utilisation précoce de défibrillateurs semi-automatiques ont considérablement augmenté les chances de survie. De nombreux facteurs influencent le pronostic, (temps écoulé avant le début des massages, problème de ventilation, ...) et ne permettent pas toujours de prédire avec précision l'évolution pour chaque patient. C'est pourquoi une étude comparative est essentielle pour mieux comprendre et améliorer les traitements actuels , en particulier pour étudier un nouvel anti-inflammatoire utile en urgence. Le projet se déroule dans 2 établissements utilisateurs différent (noté EU1 et EU2).
Bénéfices attendus
Ce projet étudie les effets d'un nouveau médicament sur l'inflammation et les dommages au cerveau causés par un manque temporaire de circulation sanguine. Ces connaissances aideront à mieux comprendre pourquoi la circulation sanguine devient instable et comment des lésions cérébrales peuvent se produire après un arrêt cardiaque.
Procédures
Les animaux auront tout d'abord une injection d'un calmant afin de réduire le stress dû à la manipulation (durée 2 minutes) dans l'EU1 puis une perfusion intraveineuse sera posée afin de permettre une anesthésie générale (2minutes). A partir de ce moment, les animaux seront sous anesthésie profonde et subiront un arrêt cardiaque puis une réanimation qui durera 15 minutes (opérations dans l'EU2). Ils resteront anesthésiés pendant 4h après l'arrêt cardiaque avant d'être réveillés et surveillés pendant 24h (retour dans l'EU1). Après 24h, Ils recevront une nouvelle injection de calmant et une nouvelle anesthésie avant mise à mort pour réaliser les prélèvements terminaux.
Impact sur les animaux
Nuisances : douleur due à l'injection de la prémédication en intra-musculaire (20 secondes) ; Risques inhérents à la procédure : Induction d'une fibrillation ventriculaire par stimulation dans le ventricule droit provoquant un arrêt cardiaque, une hypoxie globale et un stress métabolique chez l’animal (24h). La procédure implique un massage cardiaque mécanique qui peut engendrer des lésions physiques internes, douloureuses au réveil de l'animal (24h).
Devenir
Tous les animaux sont euthanasiés à la fin de la procédure pour prélèvements d'organes en vue de l'étude des tissus.
Remplacement
L'arrêt cardiaque et la réanimation cardio-pulmonaire touchent plusieurs systèmes du corps en même temps : le cœur, le cerveau, les vaisseaux sanguins et le système immunitaire. Ces interactions complexes ne peuvent pas être entièrement reproduites en laboratoire ou avec des modèles informatiques. Les expériences sur des cellules isolées aident à comprendre certains mécanismes mais elles ne reflètent pas le fonctionnement global d’un corps vivant, où circulent le sang, les hormones et les réponses immunitaires. Les simulations informatiques, basées sur des données existantes, ne peuvent pas prédire avec précision les réactions complexes d’un organisme entier à des traitements comme ce nouvel anti-inflammatoire.
Réduction
Le modèle est déjà en place dans notre structure permettant de réduire le nombre d’animaux à étudier, personnel formé à l’étude et à la manipulation du modèle porcin. Le nombre d'animaux a été déterminé grâce à un test de puissance statistique.
Raffinement
Les animaux sont hébergés en petits groupes pour réduire leur stress et leur angoisse. Leur environnement est aménagé avec des jouets (balles, cordes) pour les stimuler et favoriser leur bien-être. Avant le début de l'expérience, ils ont une période d'acclimatation d'au moins sept jours pour s'habituer à leur nouveau cadre de vie et réduire le stress. Avant l'intervention, on leur donne des médicaments pour les détendre et pour soulager la douleur afin de les manipuler sans qu'ils aient peur ou soient soumis à des traitements douloureux. Durant l'expérience, les animaux sont sous anesthésie et analgésie profonde, et leurs paramètres vitaux (fréquence cardiaque, respiratoire, pression artérielle) sont surveillés en continu. Si un signe de douleur ou de réveil apparaît, les médicaments sont ajustés immédiatement pour garantir leur confort. Après l'intervention, les animaux sont placés en salle de réveil où ils sont surveillés de manière continue. Leur état et leur paramètres vitaux sont suivis de près pour détecter rapidement toute anomalie ou signe de détresse. Des points limites à chaque étape du protocole ont été établis.
Choix des espèces
Le choix du porc comme modèle animal et le stade préclinique de cette étude sont justifiés par la nécessité de simuler avec précision les conditions humaines d’un arrêt cardiaque et d’une réanimation afin d’évaluer l’impact d’un traitement. Cette démarche est essentielle pour faire progresser la recherche médicale, améliorer les traitements et garantir la sécurité des thérapies avant leur application clinique. Un animal adulte de 50kg a été choisi afin de pouvoir réaliser une réanimation cardio-pulmonaire permettant de reproduire la prise en charge d'un patient adulte à l'hôpital.
Etude des mécanismes de sensibilité et évaluation de l’efficacité d’un traitement combinant le Dasatinib et l’Arsenic Tri-Oxide avec la chimiothérapie conventionnelle dans des modèles précliniques de leucémies humaines
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
Des cellules leucémiques prélevées chez des patients sont injectées à des souris immunodéficientes, qui développent une leucémie humaine, perdent du poids, voient leur rate grossir et finissent prostrées. 920 souris vont être utilisées, 710 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré et 150 un niveau sévère, avec des ponctions de moelle osseuse douloureuses au point de piqûre. Toutes sont tuées, le porteur jugeant la mise à mort "indispensable" pour isoler et caractériser les cellules leucémiques après traitement. La chimiothérapie administrée provoque une perte de poids et une anémie, et se trouve décrite dans le même paragraphe comme apportant "une meilleure condition physique" aux souris.
Objectifs
Ce projet de recherche vise à améliorer la prise en charge des leucémies aiguës lymphoblastiques (LAL), cancers du sang agressifs affectant aussi bien les enfants que les adultes. Lorsque ces leucémies résistent à la chimiothérapie classique, les chances de guérison diminuent fortement. Pour mieux comprendre ces résistances et trouver de nouvelles solutions, des modèles de recherche ont été développés à partir de cellules leucémiques prélevées chez des patients. Une particularité de ces cellules est la présence d’anomalies génétiques qui influencent leur comportement face aux traitements. Un premier médicament déjà testé, le Dasatinib, permet de réduire la maladie, mais des cellules cancéreuses survivent et provoquent des rechutes. Pour améliorer l’efficacité du traitement, une autre molécule, l’Arsenic Trioxyde, déjà utilisée pour d’autres types de leucémies, pourrait être une solution prometteuse. Des premiers tests ont montré que la combinaison de ces deux traitements semblait fonctionner. L’objectif est maintenant de mieux comprendre leur action et d’évaluer leur efficacité lorsqu’ils sont associés à la chimiothérapie classique, afin d’ouvrir la voie à de nouvelles stratégies thérapeutiques. . Trois objectifs spécifiques sont définis : Objectif 1 : Comprendre la sensibilité aux traitements. Nous testerons l’efficacité de Dasatinib + Arsenic Trioxide dans trois types de LAL et étudierons la cause de leur sensibilité aux traitements. Objectif 2 : Suivre la migration des cellules leucémiques Nous étudierons la capacité des cellules leucémiques humaines porteuses des fusions d’intérêt à migrer dans la moelle osseuse des souris, un aspect crucial pour évaluer la progression de la maladie. Objectif 3 : Evaluer l’efficacité de la combinaison de plusieurs traitements. Nous testerons l'efficacité de la combinaison Dasatinib + Arsenic Trioxide avec la chimiothérapie conventionnelle sur des souris greffées avec les cellules leucémiques d’intérêt.
Bénéfices attendus
Ce projet de recherche revêt une importance scientifique et de santé publique considérable. Les avancées récentes de la recherche en génétique ouvrent de nouvelles perspectives thérapeutiques avec la mise en lumière de nouveaux gènes mutés impliqués dans les LAL. L'identification d'une nouvelle fusion oncogénique dans la LAL éclaire des aspects inexplorés des mécanismes sous-jacents de cette maladie. Cette découverte nécessite des recherches pour comprendre comment certaines fusions géniques influent sur l'évolution de la maladie et sur la réaction aux traitements, ce qui permettrait de développer des stratégies thérapeutiques plus ciblées et efficaces. Nos travaux pourraient améliorer la prise en charge des patients en fournissant des informations cruciales sur les mécanismes de sensibilité et en proposant des traitements adaptés à chaque profil de patient. Cela inclut la possibilité de développer des thérapies personnalisées qui prennent en compte les caractéristiques moléculaires spécifiques de chaque tumeur, améliorant ainsi les résultats cliniques et la qualité de vie des patients atteints de LAL.
Procédures
Les animaux seront soumis à plusieurs interventions limitées dans le temps : 1. Une injection unique des cellules leucémiques sera effectuée sous anesthésie. Cette procédure est rapide et ne dure que quelques secondes. 2. Selon les protocoles, certaines souris recevront entre 1 à 4 traitements administrés en moins d’une minute, soit sous anesthésie, soit lorsqu’elles sont éveillées. 3. Trois prélèvements seront réalisés sous anesthésie générale et après analgésie. Cette procédure durera moins de cinq minutes.
Impact sur les animaux
Notre expérience dans la réalisation de protocoles similaires nous permet de prévoir des nuisances pour les animaux utilisés dans ce projet. Plusieurs points sont à retenir : • L'injection des cellules leucémiques et/ou de certaines drogues utilisées en chimiothérapie est effectuée sous anesthésie, ce qui minimise le stress opératoire pour l'animal. Le stress principal est lié à la contention avant anesthésie.. Cependant, une douleur peut être provoquée par la piqûre au site d'injection, similaire à ce que ressentent les patients traités par certaines chimiothérapies. • L'expansion des cellules leucémiques humaines dans le modèle murin entraîne à long terme une perte de poids de l'animal et une augmentation de la taille de la rate. À un stade avancé, nous observons parfois une prostration ou un manque de mobilité de l'animal. • La chimiothérapie utilisée provoque également une perte de poids et peut entrainer une anémie, due aux effets adverses des agents utilisés. Cette chimiothérapie qui réduit le nombre de cellules leucémiques apporte une meilleure condition physique aux souris chez lesquelles les leucémies se sont amplifiées. • Le prélèvement de moelle osseuse et de sang en tant que procédures invasives dans nos protocoles, peut provoquer une douleur au niveau du site de ponction.
Devenir
Tous les animaux utilisés dans nos procédures seront euthanasiés. L'euthanasie est indispensable pour isoler, caractériser et étudier les cellules leucémiques présentes après les différents traitements ou à différents temps après injection et donc mesurer l’efficacité des thérapeutiques appliquées.
Remplacement
Dans ce projet de recherche, nous avons besoin d'utiliser des modèles animaux, en particulier des souris, pour étudier la leucémie. Ces modèles sont essentiels car ils reproduisent de manière précise comment cette maladie se développe. Bien que nous ayons des méthodes de culture pour certaines expériences, elles ne peuvent pas recréer toutes les étapes complexes de la leucémie qui se produisent dans la moelle osseuse et d'autres organes du corps. Ces modèles animaux ne peuvent pas être remplacés par des systèmes de culture cellulaire en laboratoire pour étudier comment la leucémie se développe. Ils sont complémentaires et indispensables pour notre recherche. En parallèle, les expériences réalisées en laboratoire ne peuvent pas reproduire de manière exacte les réponses variées que l'on observe dans le corps humain, ce qui est crucial pour évaluer les effets de potentiels traitements, chez les patients atteints de leucémie aiguë lymphoblastique. En résumé, bien que les cultures cellulaires soient utiles pour certaines expériences, elles ne peuvent pas remplacer les modèles animaux nécessaires pour comprendre et traiter la leucémie de manière efficace. Ces souris sont essentielles pour ce projet car elles nous offrent une méthode précise et fidèle pour tester de nouveaux traitements dans un environnement qui ressemble à celui des humains.
Réduction
Chaque patient réagit différemment à la chimiothérapie. Nous avons observé cette variabilité de réponse à travers nos modèles de xénogreffes. Il est donc judicieux d'utiliser 3 à 4 échantillons de cellules leucémiques de patients par type de leucémie aiguë lymphoblastique. Par ailleurs, les concentrations des médicaments à utiliser sont déjà établies dans la littérature et dans le laboratoire : leur efficacité est confirmée par des résultats précédents du laboratoire. Il n'est donc pas nécessaire de faire des ajustements qui exigeraient plus d'animaux dans cette étude. Le nombre minimum d'animaux requis pour atteindre chaque objectif avec une puissance statistique adéquate a été déterminé à l'aide d’un logiciel spécifique.
Raffinement
Les animaux impliqués dans la réalisation des différents objectifs du projet seront surveillés régulièrement par l'expérimentateur et les animaliers afin de détecter toutes modifications comportementales et éviter les souffrances, douleurs et angoisses inutiles, avec des points limites définis à cet effet. Afin d'éviter toute douleur, souffrance et angoisse liées aux manipulations expérimentales, les souris affaiblies seront supplémentées avec de l’hydrogel et de la nourriture humidifiée déposée directement sur la litière en plus de leurs nids en coton et des tubes en cartons. Un analgésique sera donné lors du prélèvement de la moelle osseuse afin de prévenir les douleurs pouvant survenir après l'intervention. Les injections de cellules et les prélèvements sanguins et médullaires seront réalisés sous anesthésie générale.
Choix des espèces
Nous utilisons en laboratoire des souris adultes immunodéficientes depuis de nombreuses années, car elles ne rejettent pas les greffes de cellules humaines. Ce modèle est particulièrement pertinent pour étudier les cancers du sang, car il reproduit fidèlement l'expansion des cellules leucémiques observée chez les patients. Les cellules cancéreuses provenant de patients interagissent avec tous les éléments cellulaires et moléculaires de la souris, de la même façon qu’elles interagissent dans l'organisme humain. Ce modèle nous permet également d'explorer une question cruciale liée à la diversité inter-individus face à une même maladie. En effet, le terme "leucémie" regroupe plusieurs sous-types, chacun présentant des variations qui influencent la réponse au traitement. Contrairement à des modèles murins où seule une leucémie murine se développe, notre approche de transplantation de cellules humaines chez des souris immunodéficientes permet d'aborder cette diversité inter-patients. Ainsi, ce modèle devient une référence préclinique pour étudier la maladie humaine dans un contexte murin bien établi et documenté dans la littérature spécialisée.