Procédures modérées

407 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Toutes subissent une neurochirurgie de 45 minutes à 1 h 30, avec craniotomie, pour l'implantation d'électrodes, puis des stimulations optogénétiques qui peuvent provoquer des mouvements involontaires, et certaines reçoivent quatre injections intrapéritonéales sous contention. Elles passent des tests fondés sur des récompenses, désignés comme des "jeux de décisions" sans que leur déroulé soit décrit, pour étudier la flexibilité comportementale et le rôle de la protéine Shank3 dans l'autisme. Elles sont tuées pour vérifier l'emplacement des implants, et le porteur affirme que son protocole comportemental "augmente le bien-être des animaux".

Objectifs

Les troubles du spectre autistique (TSA), caractérisés par des déficits de flexibilité comportementale, résultent parfois d'une mutation monogénique de gènes codant pour les protéines d'échafaudage interagissant avec les récepteurs synaptiques, régulant l'équilibre entre stabilité et plasticité de la force des connexions synaptiques (plasticité synaptique). L'équilibre entre plasticité et stabilité synaptique constitue probablement une base neurale de la "flexibilité" :la capacité à apprendre vite quand l’environnement change, mais à ne pas forcément changer de croyances quand l’environnement est stable. La flexibilité comportementale est un processus central au développement social et cognitif typique des individus, et est fortement altérée dans les TSA. Nous testerons le lien entre les protéines d'échafaudage liées aux TSA, la plasticité neuronale dans le cortex préfrontal, et la flexibilité dans un contexte d'apprentissage.

Bénéfices attendus

Précisement, nous déterminerons: - le rôle causal des aires préfrontales dans la flexibilité - le codage au niveau neuronal de la flexibilité dans les différentes aires préfrontales - le rôle de l'échauffadage des synapses glutamatergiques (protéine "Shank3") dans ces processus.

Procédures

Tous les animaux seront soumis à des neurochirurgies. La durée de l'opération est de 45 minutes à 1h30, avec toutes les précautions possibles pour éviter la douleur (anesthésie gazeuse, anesthéisques locaux, morphiniques en péri-opératoire). Les seules manipulations quotidiennes consisteront en un branchement des implants à électrodes (geste non douloureux). Des injections intra-péritonéales seront réalisées pour certains animaux (4 injections par animal sur la totalité de l'expérience). Le reste des procédures implique des tests comportementaux de type "jeux de décisions", basés sur des récompenses, et décrits comme positifs pour le bien-être animal dans la littérature.

Impact sur les animaux

Les animaux qui subiront des neurochirurgies peuvent éventuellement avoir des douleurs associées aux craniotomies effectuées sur l'os mais aussi au niveau des sutures. Certains effets indésirables liés à la stimulation optogénétique peuvent survenir (artefacts moteurs) et troubler l'activité locomotrice (un mouvement incontrolable mais non douloureux comme lever une patte ou tourner un peu la tête). Les animaux d'une des procédures auront des contentions (pour lesquelles ils seront habitués en douceur) en vue d'injections intrapéritonéales sur quatre jours. La lignée de souris ne présente pas de phénotype dommageable.

Devenir

Les animaux sont tous mis à mort après les procédures pour vérifier que les sites stéréotaxiques d'injection et d'implantation sont corrects.

Remplacement

Nous cherchons à évaluer le rôle des neurones pendant le comportement de décision, il est donc impossible de remplacer les méthodes in vivo par des methodes in vitro.

Réduction

Nous avons déjà effectué des expériences similaires (pour étudier d'autres zones cérébrales) ce qui nous permet de réduire le nombre d'animaux au strict nécessaire. De plus nous développons un modèle informatique de réseau de neurones récurrent capable de modéliser la prise de décision. L'activité électrique des neurones y est fonction des connexions synaptiques, qui elle-mêmes évoluent en fonction de l'activité électrique des neurones et des récompenses reçues par l'animal (plasticité synaptique). ce modèle fournira des prédictions précises sur ce qu'il est important d'enregister comme activité électrique, ce qui réduit le nombre d'animaux.

Raffinement

Pour diminuer et abolir les douleurs chirurgicales, nous utilisons une combinaison d'anesthésiques et d'anti-inflammatoires pendant la chirurgie et en péri-opératoire. De la pommade antifongique ainsi que du désinfectant seront appliqués pour prévenir les infections. Nous stopperons les expériences d'optogénétique en cas d'artefact locomoteur. Le protocole sera interrompu si les points limites définis sont atteints, à savoir une perte de poids durable de l’animal, des signes de souffrances évalués par l’échelle Mouse Grimace Scale et une prostration, malgré les mesures prises. Nous tiendrons une feuille de suivi post-opératoire sur les deux jours suivant l'opération pour évaluer rapidement ces points. Le stress de l’animal sera limité par un enrichissement permanent de l’environnement (igloos, tunnels, nesting), ainsi qu’une habituation quotidienne à l’expérimentateur/rice et à la salle expérimentale. Le protocole de comportement consiste en un jeu de décisions et augmente le bien-être des animaux.

Choix des espèces

Le système de décision (circuit mésocorticolimbique) est plus proche anatomiquement et fonctionnellement entre mammifère (rongeurs et Humains) qu'entre mammifères et invertébrés, poissons ou oiseaux. De plus, la génétique de la souris offre des outils de modulations des réseaux neuronaux. Enfin, nos tâches comportementales de type "jeux" ont été spécifiquement développées et adaptées à l'étude des prises de décision de la souris, tout en assurant leur bien-être. Ce projet implique d'utiliser des groupes de souris de même stade de développement (8 semaines) qui est un stade classique dans les études sur les prises de décision (8 semaines étant considéré comme le début de l'âge adulte dans cette espèce).

Une perte de 20 pour cent du poids en une semaine met fin au protocole. 54 souris porteuses d'une mutation du gène de la titine vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, la mutation provoquant chez elles faiblesse musculaire et troubles respiratoires ou cardiaques. Elles passent une vingtaine de minutes sous anesthésie gazeuse pour une mesure de pression artérielle et un test respiratoire, puis une trentaine de minutes sous anesthésie générale pour un test de force, à l'âge d'un an. La cohorte de quarante animaux sera tuée pour prélever organes et tissus, et le porteur précise que les animaux qui les ont engendrés le seront aussi, la lignée n'étant pas maintenue.

Objectifs

Au cours de ce projet, nous allons caractériser un modèle souris qui développe une myopathie avec des problèmes respiratoires graves. Cette myopathie représente 65% des cas mondiaux de myopaythies héréditaires avec insuffisance respiratoire précoce. L’étude de ce modèle souris permettra de mieux comprendre les causes de la maladie et pourra ainsi servir pour des essais de traitement de la maladie.

Bénéfices attendus

L étude de ce nouveau modèle de souris myopathe nous permettra de mieux comprendre cette maladie et en particulier d 'étudier l 'importance de l 'activité respiratoire et cardiaque. Toutes ces nouvelles connaissances nous permettront d 'envisager de nouveaux traitements mieux ciblés qui seront d 'un grand bénéfice pour les patients atteints de cette myopathie.

Procédures

Les animaux seront soumis à une anesthésie gazeuse d' une vingtaine de minutes dans un premier temps et à une mesure de la pression artérielle (phénotypage cardiaque) puis à un test respiratoire (plethysmographe). Ensuite ils subiront une anesthésie générale d 'une trentaine de minutes pour le test de la force musculaire.

Impact sur les animaux

Dans ce modèle animal, les mâles et les femelles sont affectés avec une sévérité modérée (faiblesse musculaire, problèmes respiratoires et /ou cardiaques) ce qui peut générer un inconfort. Tous les animaux expérimentaux seront isolés temporairement ce qui peut générer un stress. L’induction de l’anesthésie nécessite la contention de l’animal peut générer un stress et/ou un inconfort. L’injection d’anesthésique peut induire une douleur ou un inconfort.

Devenir

Après la mesure de la force musculaire , les animaux de la cohorte (40) seront euthanasiés en vue de prélèvements d 'organes et de différents tissus. Les animaux ayant servi à la production de la cohorte seront également euthanasiés ( pas de maintien de la lignée).

Remplacement

Pour caractériser cette maladie ( myopaythie héréditaire avec insuffisance respiratoire précoce) et évaluer l’impact de cette mutation, nous souhaitons étudier le modéle souris porteur de cette mutation. Ce modèle étant physiologiquement et structurellement assez proche de l’Homme, il nous permet d’étudier d’une part la physiopathologie et les conséquences de cette mutation. D’autre part, une étude exclusivement réalisée sur des cellules ne pourrait pas se suffire à elle-même car les effets sur l’ensemble de l’organisme et l’évaluation de la force musculaire, respiratoire et cardiaque seraient impossible à évaluer. Une étude sur culture de cellules mutantes ne peut être envisagée car le phénotype pathologique ne se développerait pas et le bénéfice de la force musculaire, la fonction respiratoire et cardiaque ne pourraient pas être mesurées (REMPLACEMENT).

Réduction

Plusieurs tests seront réalisées avec un test maximum par jour. Le nombre de géniteurs sera réduit en créant des cages d’accouplements avec deux femelles pour un mâle et en générant plusieurs portées par femelle. Pour la partie expérimentale, les tests cardiaques et respiratoires, peu invasifs, offrent la possibilité de réaliser un suivi longitudinal en utilisant les mêmes animaux au cours du temps. Ce point est essentiel car il permet de réduire de manière drastique le nombre d’animaux. Nos connaissances sur ces modèles animaux mutants et les études réalisées auparavant montrent que 10 souris par groupe seront nécessaires pour obtenir une étude concluante et statistiquement valable. Nous prévoyons 54 animaux pour cette étude (REDUCTION).

Raffinement

Un certain nombre de procédures seront mises en place afin d’améliorer le bien-être de l’animal. Si des faiblesses musculaires modérées apparaissaient, de la nourriture en gel sera placée dans la cage afin de soulager l’animal dans ses déplacements. Les souris seront hébergées par groupe de 2 à 4 par cage (interaction sociale). Les cages d’accouplements seront constituées de deux femelles par cage pour faciliter l’élevage des petits. Le bien-être des animaux sera contrôlé quotidiennement afin de détecter au plus tôt les premiers signes de souffrance comme l’apathie, la prostration ou problèmes de déplacements. Les nouveau-nés seront hébergés avec leurs parents jusqu’au sevrage. A partir du sevrage, les animaux seront hébergés en groupe. Les animaux seront observés et pesés une fois par semaine; une perte de poids de 20% en une semaine conduira à l’arrêt du protocole. Afin de diminuer le stress lié à aux diférents tests, une session de familiarisation sera effectuée. Pour les tests nécessitant une anesthésie générale de l’animal, la respiration sera contrôlée visuellement, la température de l’animal sera régulée et maintenue à sa valeur basale à l’aide d’une lampe chauffante et un gel ophtalmique sera appliquée sur les yeux de l’animal afin de limiter l´assèchement des cornées. La phase de réveil s’effectuera sous une lampe chauffante dans une cage où l’animal sera seul, puis l’animal sera replacé dans sa cage avec ses congénères.(RAFFINEMENT).

Choix des espèces

La souris est une des seules espèces assez proche de l’Homme dans laquelle nous pouvons réaliser les manipulations génétiques pour obtenir un modèle de HMERF, une pathologie humaine. D'autre part, les souris ont des caractéristiques biologiques très utiles pour la recherche comme leur petite taille, une durée de vie plutôt courte et une durée de gestation courte. De plus, les souris sont couramment utilisées dans un grand nombre de recherches dans ce domaine, ainsi que dans notre équipe, ce qui nous permettra de comparer nos résultats avec d'autres études et de mieux comprendre le pathomécanisme de cette maladie. Ces analyses ne peuvent pas être réalisées in vitro car nous souhaitons étudier la fonction cardiaque, la fonction respiratoire et la fonction musculaire. Pour caractériser le phénotype de ces souris, les animaux seront étudiés à l âge d 'un an, ce qui correspond environ à la moité de la vie d 'une souris, sachant que chez l homme la pathologie se déclare vers 35/40 ans (envion demi- vie également)

Le bord de la paupière est incisé puis suturé sur un œil de ratons qui n'ont pas encore ouvert les yeux, intervention de dix minutes sous anesthésie gazeuse et analgésie oculaire locale. Douze rats vont ainsi être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, tous tués ensuite pour prélever le tissu cérébral. L'œil reste fermé quatre, sept ou dix jours pour reproduire l'amblyopie humaine, la mère tentant régulièrement d'arracher les points sur ses petits, ce qui conduit le porteur à prévoir 25 pour cent d'échec. Le stade choisi correspond aux jours 13 à 24 après la naissance, période où le fonctionnement du système visuel dépend le plus de l'expérience visuelle.

Objectifs

Notre projet est de comprendre la capacité de transformation (plasticité) des neurones lors de l’adaptation à une différence de vision entre les deux yeux dans l’enfance afin de mieux traiter l’amblyopie, une perte de vision d’un œil, l’une des principales causes de malvoyance qui touche 2 à 5 % de la population mondiale. Ce n’est pas une maladie de l’œil, l’œil étant fonctionnel. Elle est due à une perte de la capacité des neurones à répondre aux signaux visuels en provenance de l’œil le plus faible ou déviant. L’acuité visuelle à la naissance est faible à cause de l’immaturité du système nerveux. Pendant une période précoce, chez le petit enfant où la capacité du système nerveux à se modifier en fonction de l’expérience du monde environnant est la plus grande, des différences de réfraction, d’alignement entre les deux yeux ou une opacité d’un œil amènent à un défaut de fonctionnement des neurones excités par les signaux provenant de l’œil faible. Le traitement, seulement possible avant 6-7 ans, se fait d'abord en corrigeant le défaut visuel, puis en rééduquant l’œil amblyope par pénalisation de l’œil dominant. Ce projet propose de déterminer les mécanismes moléculaires et cellulaires des transformations neuronales induites par des signaux visuels discordants entre les deux yeux au cours du développement neuronal en mimant l’amblyopie sur le jeune raton, par suture d’une paupière avant l’ouverture des yeux.

Bénéfices attendus

L’amblyopie est un déficit visuel fonctionnel chez l’humain qui, s’il n’est pas traité dans une période de temps limité, avant 6-7 ans, est irréversible. C’est la principale cause de malvoyance qui touche 2 à 5 % de la population mondiale. Le but de ce travail est d’identifier les mécanismes neuronaux à l’origine de la perte de réponse du cerveau aux stimuli visuels dans l’objectif d’allonger la fenêtre thérapeutique au-delà de l’enfance.

Procédures

Le bord des paupières d’un œil de l’animal seront suturés avant l’ouverture des yeux. Le raton sera disposé sur un matelas chauffant sous anesthésie gazeuse profonde associée à une analgésie locale oculaire. Avant de procéder aux points de suture, une incision devra être faite sur le bord de la paupière pour permettre aux deux paupières de se coller l’une à l’autre durant le processus de cicatrisation. Après le réveil le raton sera remis à la mère. Durée totale de l’intervention : 10 minutes.

Impact sur les animaux

Suite à la procédure de privation visuelle monoculaire par suture des paupières, l’apparition d’effets indésirables sera contrôlée quotidiennement, en particulier : - risque d’infection au niveau des points de suture - risque d’arrachement des points de suture. Dans ces deux cas, l’animal sera écarté pour ne pas fausser les résultats expérimentaux et sera immédiatement euthanasié pour éviter toute souffrance.

Devenir

Euthanasie préalable au prélèvement du tissu cérébral sur lequel seront réalisées les expérimentations.

Remplacement

L’utilisation d’animaux à des fins scientifiques est indispensable dans le cadre de ce projet dans la mesure où il est nécessaire de priver le système nerveux d’entrées sensorielles au cours du développement. L’utilisation de culture de neurones est donc naturellement exclue.

Réduction

• Les structures cérébrales étudiées ne présentant pas de différences entre mâles et femelles, nous utiliserons les animaux des deux sexes ce qui limitera le nombre d'animaux à euthanasier. • Le temps de suture de 10 jours est le plus délicat à obtenir sans ouverture de l’œil, car il est connu que les sutures se relâchent au bout de quelques jours et que la mère des ratons tente d’enlever les points sur les petits non sevrés. Le travail étroit avec un vétérinaire qui interviendra et formera le personnel permettra de réduire le nombre d’essais et donc de réduire le nombre d’animaux. Notamment l'incision du bord de la paupière qui sera entrepris permettra une fermeture pérenne de la paupière supérieure avec la paupière inferieure et donc une diminution du taux d’échec et du nombre d’animaux. • L'analyse de l'expression des gènes nécessitera peu de tissu animal. A partir d’un cerveau de rat congelé, une quarantaine de coupes fines seront obtenues. Nous aurons besoin pour atteindre une significativité statistique pour chaque temps de privation monoculaire de lumière de 3 rats suturés pour chacune des 3 durées de suture. Nous prévoyons d’après notre expérience passée 25 % d’échec du maintien de la fermeture de l’œil. Nombre de rat = 3 rats suturés pour chacune des 3 durées (4, 7, et 10 jours) = (3 x 3) + 25 % = 12 rats

Raffinement

Pendant la suture de la paupière, les ratons seront maintenus sur un matelas chauffant sous anesthésie gazeuse profonde associée à une analgésie locale oculaire. Les ratons seront remis sous la mère immédiatement après le réveil post-anesthésie, et surveillé quotidiennement par un personnel expérimenté. Vérification sera faite que la mère les reprendra bien en charge lors du change des cages. Ils seront observés quotidiennement pour vérifier qu’ils sont bien nourris, que les sutures sont en place et bien tolérées. Nous utiliserons des morceaux de papier ciselé comme matériaux de nidification, des bûchettes en peuplier pour répondre aux besoins naturels des rongeurs ainsi que des tunnels en cartons pour réduire l‘ennui et diminuer le stress en stimulant l‘activité et en procurant un sentiment de sécurité aux animaux. Les animaux auront libre accès à la nourriture et à l’eau, seront maintenus à une température et une hygrométrie ambiante contrôlées avec un cycle lumière/obscurité artificielle de 12 h. En cas de problème lié à la suture (par exemple une infection) l’animal sera écarté du lot pour ne pas fausser les résultats expérimentaux et sera immédiatement euthanasié pour éviter toute souffrance.

Choix des espèces

Le rat est le modèle animal le plus utilisé comme décrit actuellement dans la littérature pour l’étude des mécanismes neuronaux de la plasticité du système visuel. Entre les jours 13 et 24 postnataux, pendant la période critique de développement au cours de laquelle le fonctionnement du système visuel est particulièrement dépendant de la qualité de l’expérience visuelle dont bénéficie le sujet.

1 708 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une partie développe un diabète de type 2 sous régime riche en glucides et en lipides, avant de subir une chirurgie de trente minutes qui retire un volume de muscle et y implante un biomatériau, la plaie étant refermée par des sutures. Après cicatrisation viennent un test de course sur tapis de vingt minutes et une mesure de force musculaire sous anesthésie, le porteur signalant que la perte de mobilité postopératoire rend l'accès à la nourriture et à l'eau difficile. Les biomatériaux ont déjà passé des preuves de concept in vitro et ex vivo, ce que le porteur reconnaît avant de conclure qu'un "modèle physiologique complexe" reste nécessaire.

Objectifs

La perte musculaire volumétrique (VML) peut résulter de traumatismes ou de chirurgies (tumeurs, infections), affectant aussi bien les civils que les militaires. Elle entraîne des déficits fonctionnels et esthétiques permanents. Lorsque la fibre musculaire est endommagée ou lorsque la VML dépasse 20% de la masse musculaire, le tissu perd sa capacité à se régénérer, et une fibrose se développe, réduisant la fonctionnalité musculaire. La régénération musculaire repose sur l’action des cellules souches musculaires activées par l’inflammation pour reconstruire les fibres musculaires endommagées. Cependant, chez les diabétiques, la cicatrisation musculaire est ralentie par des mécanismes comme l’hyperglycémie, qui altère la microcirculation et diminue l’apport en oxygène. Il n’existe actuellement aucune solution clinique permettant de restaurer la fonctionnalité des tissus lésés. Pour traiter ces lésions, l’ingénierie tissulaire utilise des biomatériaux qui imitent la matrice extracellulaire naturelle pour soutenir les cellules et favoriser la formation de nouveaux tissus, tout en limitant la fibrose. Ce projet se concentre sur la régénération structurelle et fonctionnelle du muscle squelettique en utilisant des biomatériaux innovants.

Bénéfices attendus

Actuellement les lésions musculaires dues à des traumatismes, infections ou tumeurs sont mal tolérées par le muscle et entrainent des douleurs et une perte de fonctionnalité. Cette étude nous permettra d’identifier des biomatériaux à utiliser à des fins biomédicales afin de réparer ces lésions musculaires chez le patinent non diabétique et diabétique.

Procédures

Les souris subiront au maximum un prélèvement de sang à la queue pour une glycémie, une chirurgie musculaire sous anesthésie générale de 30 minutes, un test de performance de course sur tapis après cicatrisation de 20 minutes maximum, un test de mesure de force musculaire sous anesthésie générale + analgésie de 30 minutes.

Impact sur les animaux

Ci-dessous sont listés les étapes induisant des nuisances sur les souris lors des procédures. Douleur : chirurgie musculaire et implantation du biomatériau. Faim/soif : Mise à jeun de 4h, perte de mobilité après la chirurgie, difficulté à atteindre la nourriture et le biberon. Stress physique : Anesthésies médicamenteuse et gazeuse, plaies (présence de points de sutures sur la peau), réalisation des tests de fonctionnalité musculaire (test de performance de course sur tapis), diabète.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés car le prélèvement des muscles opérés (pour l'histologie) ne permet pas de garder les souris en vie.

Remplacement

Aucune autre méthode alternative ne peut se substituer à l’utilisation d’animaux pour la réalisation de ce projet car la régénération du muscle repose sur des interactions complexes entres les tissus lésés et les systèmes immunitaires et vasculaires ainsi que sur la coordination efficace de multiples types cellulaires. Les preuves de concept in-vitro et ex-vivo de la biocompatibilité des hydrogels pour les cellules musculaires ont déjà été effectuées avec succès. A présent, un modèle physiologique complexe est nécessaire pour permettre de caractériser la cicatrisation histologique et la récupération de la fonctionnalité musculaire.

Réduction

Dans un premier temps la réalisation du geste chirurgical sera validée sur un groupe restreint de souris. Ensuite le projet a été conçu de manière à ne pas répéter les groupes témoins. Les effectifs ont été déterminés à l’aide d’outils statistiques. En nous appuyant à chaque fois sur les résultats précédents, nous pourrons identifier les conditions optimales de manipulation, ce qui permettra de limiter le nombre de groupes et de variations expérimentales. Cela contribuera à réduire le nombre de souris utilisées tout en garantissant la pertinence des résultats.

Raffinement

Afin de gérer la douleur des souris, elles recevront une dose d’analgésique avant la chirurgie musculaire et l’implantation du biomatériau, puis une deuxième injection après l’acte chirurgical et une fois par jour pendant 2 jours. La chirurgie musculaire sera réalisée sous anesthésie générale et une anesthésie locale sera appliquée sur la plaie. Les souris seront suivies et pesées tous les jours après la chirurgie avec ajout de nourriture humide et d’hydrogel dans la cage.

Choix des espèces

Au cours de ce protocole, nous utiliserons des souris mâles et femelles adultes à proportion égale âgées d’au moins 8 semaines, connues pour développer un diabète de type 2 à la suite d’un régime riche en glucides et en lipides. La cicatrisation musculaire chez la souris présente des similitudes notables avec celle chez l'humain ce qui fait de cette espèce un modèle pertinent pour ce projet.

Injectées de cellules cancéreuses humaines sous la peau, dans le cœur, dans une veine ou directement dans le tibia, 832 souris immunodéficientes entrent dans un protocole pouvant durer trois mois, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent ensuite des anticorps deux fois par semaine par voie intrapéritonéale, et passent une à deux fois par semaine sous anesthésie pour que leurs tumeurs soient photographiées. Le porteur décrit prostration, perte de poids, pelage dégradé, morsures entre animaux et, en cas de métastases osseuses, une lyse de l'os suivie aux rayons X. Toutes sont tuées à la fin de chaque protocole, mise à mort que le porteur présente comme un moyen "de mettre fin à la souffrance des animaux".

Objectifs

Un vaste ensemble de preuves suggèrent que l'expression de la protéine TRPV6 est un événement commun dans le développement du cancer de la prostate. En effet, cette protéine qui constitue un canal calcique est totalement absente dans la prostate saine mais devient de plus en plus exprimé au cours du développement du cancer jusqu'à être présente chez 100% des patients ayant des stades tardifs du cancer. Pourtant, le rôle de cette protéine dans le développement des métastases et notamment les métastases osseuses (apparaissant majoritairement chez les patients atteint du cancer de la prostate) reste entièrement méconnu. Pour cela, notre projet vise à étudier la possibilité de cibler et supprimer des tumeurs et des métastases exprimant TRPV6 en utilisant un modèle de xénogreffe de cellules cancéreuses humaines dans des souris immunodéficientes afin de déterminer la faisabilité du traitement par notre anticorps TRPV6 ainsi que les mécanismes moléculaires impliqués. Afin de préciser le rôle du canal TRPV6 dans la formation de métastases in vivo, dont les métastases osseuses, il est nécessaire d’utiliser plusieurs modèles d’injection qui reflètent divers mécanismes/étapes de cancérogénèse.

Bénéfices attendus

Retombées scientifiques et économiques attendues : Comme partie fondamentale du projet, nous allons d’abord démontrer le rôle du canal TRPV6 dans l’acquisition du phénotype agressif/métastatique tels que la migration, l’invasion et, et ainsi évaluer son implication dans le guidage et l’installation des cellules cancéreuses dans l’os. Ces données nous permettront de corréler la présence/expression de ce canal à sa fonction pathophysiologique particulière et le proposer comme outil de diagnostique en clinique. Ce dernier point est crucial pour le diagnostic du cancer de la prostate pour éviter un sur-traitement inutile et possiblement nocif pour le patient. L’application la plus importante de ce projet sera la preuve de concept de la stratégie thérapeutique en utilisant l’anticorps mabTRPV6 afin de cibler spécifiquement et de stopper les tumeurs exprimant TRPV6. Finalement, nos outils pour cibler TRPV6 in vivo comme mabTRPV6 seront validés pour être humanisés et utilisés chez l’humain. Les perspectives quant à la possibilité d’empêcher l’apparition de métastases et/ou leur expansion, notamment, les métastases osseuses, seront également considérées afin de les mettre sur l’échelle des essais cliniques.

Procédures

Tous les animaux seront soumis une fois à l'injection de cellules cancéreuses sous anesthesie par isoflurane : soit par la voie souscutanée: 260 animaux, soit par la voie intracardiaque: 221 animaux, soit par la voie intraveineuse: 130 animaux, soit par la voie intratibiale : 221 animaux. Les injections des cellules cancéreuses réalisées sont faites sur un temps relativement court (30 secondes maximum par souris). Les animaux seront ensuite traités quotidiennement par injection intrapéritoneale avec des anticorps monoclonaux anti-TRPV6 (2 fois par semaine) pour suivre le développement des tumeurs (acte rapide nécessitant seulement quelques secondes par souris pour le traitement et environ 30 secondes pour mesurer la taille tumorale à l'aide du pied à coulisse). La durée de l'expérience peut s'étaler jusq'à 3 mois (temps maximal nécessaire pour avoir un développement tumoral complet). Les tumeurs seront photographiées une à deux fois par semaine sous anesthésie par isoflurane pour suivre le développement des métastases et cela nécessitera de les garder sous anesthésie environ 5min sous isoflurane le temps de l'endormissement et de l'acquisition (2 minutes). Chaque acte réalisé est effectué sur un temps le plus court possible afin de limiter le stress des animaux tout en effectuant des gestes sûrs et précis. Au maximum, cela représentera 832 animaux.

Impact sur les animaux

L’injection de cellules cancéreuses entraînera l’apparition de tumeur qui constituera la nuisance principale attendue. Des signes de stress peuvent apparaître à la suite du développement de la tumeur : prostration, perte de poids, pelage dégradé ou encore des comportements agressifs avec morsures qui seront suivis quotidiennement. Dans le cas où des métastases osseuses apparaissent, il peut également y avoir une lyse osseuse (qui sera suivie par rayons X). L’anesthésie par isoflurane ne constitue qu’une nuisance légère, les souris se réveillant extrêmement rapidement (quelques secondes).

Devenir

Afin de mettre fin à la souffrance des animaux, à la fin de chaque protocole, les animaux seront euthanasiés.

Remplacement

Les caractéristiques morphologiques, physiologiques et immunologiques de la souris ne sont pas reproductibles in vitro. L’utilisation d’animaux d‘expérimentation est particulièrement pertinente dans le cadre de recherche en cancérologie reflétant ce qui se produit en pathologie humaine. De plus, le trafficking/guidage et l’installation dans l’os au niveau d’un organisme entier n’est pas reproductible in vitro.

Réduction

Réduction : Des analyses statistiques ont été utilisées afin de déterminer la taille des groupes nécessaires à la génération de données fiables. Afin d’observer une différence statistiquement significative entre deux groupes, 10 souris par groupe expérimental (nombre de groupes: 13) seront nécessaires pour réaliser un test de Wilcoxon requis pour ce type d’étude. Nous ferons donc 3 protocoles de 130 souris chacun. Des expériences préalables ont été effectuées dans le but de déterminer la dose optimale de mAbs, ne permettant pas de réduire le nombre d’animaux. Pour les procédures concernant les injections intracardiaques et intratibiales, 17 souris par groupe expérimental (13 groupes) seront nécessaires. Pour réduire au maximum le nombre de souris utilisées, nous nous entraînerons avant chaque début d'expérience sur des souris ayant été préalablement euthanasiées issues de récupération d'autres expériences au sein de l'animalerie pour optimiser notre taux de réussite (qualité d'injection) et de prise de la xénogreffe et ainsi réduire au maximum le nombre de souris nécessaires dans nos groupes.

Raffinement

Raffinement : Les souris cohabiteront par groupe de 5 dans un environnement enrichi (tunnel en papier, batôn à ronger, coton) pour réduire le stress des animaux et aucun nouvel animal ne sera introduit dans des groupes déjà formés. L'environnement des animaux, l'équipement, système d’abreuvoir, la qualité de l’eau, la nourriture et la litière seront révisés régulièrement. L’état de bien être des souris sera évalué quotidiennement par l’observation des signes physiologiques (perte de poids, aspects du pelage, morsures, etc). Les expérimentations se feront dans un environnement confiné. Lors de chaque anesthésie, la température des animaux sera maintenue grâce à l’utilisation de coussins chauffants. En cas de plaies causées par les souris (lutte entre animaux), des soins seront immédiatement prodigués afin de réduire la douleur. En cas de signes graves de stress associé à un des points limites, les animaux correspondant seront mis à mort afin de mettre fin à leur souffrance.

Choix des espèces

Les souris swiss nude sont couramment utilisées en oncologie. Elles sont immuno-déficientes, ce qui permet l’injection de cellules tumorales humaines et reproduire les tumeurs humaines in vivo. Elles ne possèdent pas de lymphocytes T, mais les autres cellules du système immunitaire (lymphocytes B, macrophages, cellules dendritiques, cellules NK) sont présentes et ne sont pas affectées dans leurs fonctions. Les protocoles seront réalisés avec des souris âgées de 5 semaines. L’incidence, et le développement des tumeurs humaines est très faible chez les animaux plus âgés.

Une injection de cellules cancéreuses dans le flanc droit, sous anesthésie gazeuse, ouvre le protocole pour 1 840 souris, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. La masse tumorale peut gêner leurs déplacements, et le porteur décrit une altération possible de l'état général, perte de poids, posture douloureuse, léthargie, arrêt du toilettage. L'objectif est de mesurer l'effet d'une cytokine inflammatoire sur l'efficacité de chimio-immunothérapies déjà utilisées en clinique contre le cancer du poumon. Les effectifs annoncés geste par geste, 920 souris pour la chimiothérapie, 2 080 pour un traitement répété trois fois par semaine et 640 pour un autre, dépassent le total de 1 840 déclaré.

Objectifs

Le cancer du poumon fait partie des cancers les plus fréquents et les plus meurtriers. Son traitement repose sur l’utilisation de chimiothérapies et/ou d’immunothérapies, qui malheureusement ne conduisent pas systématiquement à une rémission totale du patient, en particulier dans les cas de cancers avancés. Il apparait donc important d’étudier les mécanismes responsables de la résistance aux traitements. L’IL-1β est une cytokine inflammatoire ayant un rôle ambigu dans le cancer et dans la réponse aux traitements. Le but de ce projet est d’évaluer les effets de l’IL-1β sur l’efficacité antitumorale des chimio-immunothérapies utilisées en clinique, dans différents modèles de cancers du poumon chez la souris. Nous étudierons également les cellules immunitaires dans les tumeurs. Cette étude nous permettra également de comprendre les mécanismes de résistance aux traitements actuellement utilisés en clinique.

Bénéfices attendus

Le but de ce projet est d’évaluer les effets de l’IL-1β, sur l’efficacité anti-tumorale des chimio-immunothérapies, utilisées en clinique dans 2 modèles de cancers murins. Ce projet permettra également de déterminer son mécanisme d’action. Dans ce projet, nous évaluerons l’efficacité des traitements sur la croissance tumorale. Etant donné que certaines cellules du système immunitaire peuvent contribuer à l’élimination des cancers, nous étudierons leur présence et leur état d’activation au niveau des tumeurs, chez les souris traitées ou non par chimio-immunothérapie. L’intérêt de ce travail est donc de mieux comprendre les mécanismes immunologiques associés aux tumeurs et de rechercher des moyens de potentialiser les effets de la chimio-immunothérapie, jusqu’alors peu efficaces dans le traitement du cancer. L’identification d’un rôle de l’IL-1 dans la sensibilisation aux traitements aura des avantages à court terme, comme la validation (ou non) de nos résultats précédents in vitro et à long terme en confirmant l’intérêt de trouver et tester des molécules induisant cette voie chez la souris (futur projet) puis chez l’Homme.

Procédures

- Injection des cellules cancéreuses murines : - Geste réalisé sous anesthésie générale gazeuse - Une seule injection par animal - Durée : 5 minutes - Nombre de souris : 1840. - Traitements par chimiothérapie : - Geste réalisé sur animal vigil - Une seule injection par animal - Durée : 1 minute - Nombre de souris : 920 - Traitements : - Geste réalisé sur animal vigil - Une injection trois fois par semaine pendant 3 semaines par animal - Durée : 1 minute - Nombre de souris : 2080 - Traitements: - Geste réalisé sous anesthésie générale gazeuse - Une injection par animal - Durée : 1 minute - Nombre de souris : 640

Impact sur les animaux

L’injection de cellules tumorales en sous-cutané génère une masse tumorale au niveau du flanc droit pouvant gêner la liberté de mouvement de l’animal. Une altération de l’état général est possible, du fait de la pathologie cancéreuse induite (perte de poids, posture douloureuse, léthargie, absence de toilettage).

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure. afin de prélever la tumeur et l’analyser.

Remplacement

Le cancer du poumon est une maladie complexe impliquant des mécanismes de contrôle et des interactions possibles seulement dans un organisme vivant. En effet, la recherche a permis de comprendre l’importance de l’environnement dans lequel le cancer se développe et les multiples interactions avec le système immunitaire, le stroma tumoral, le système vasculaire et le métabolisme. En conséquence, pour être prédictifs, l’évaluation de l’efficacité ou de l’échec de nouvelles combinaisons thérapeutiques en oncologie doit être réalisée sur les organismes vivants. Nous réalisons à ces fins des études translationnelles sur des modèles d‘animaux greffés avec des cellules tumorales.

Réduction

Les groupes seront constitués de 10 animaux (suivis de croissance) ou de 5 animaux (immunomonitoring) afin de considérer les variabilités inter-individuelles. Les expériences ne seront réalisées que deux fois ce qui permet donc de réduire le nombre d’animaux de l’étude tout en en conservant la puissance statistique nécessaire. Les expériences de croissances tumorales seront réalisées en premier. Ce projet est divisé en 3 sous-parties. Si aucun effet thérapeutique n’est observé dans la première partie, le projet sera stoppé. Si aucun effet n’est observé en partie II, le projet sera stoppé à ce stade.

Raffinement

Les animaux seront hébergés dans des conditions qui répondent à leurs besoins (en groupes, dans un environnement enrichi avec mise à disposition des matériaux pour leur permettre de faire leurs nids). Les animaux seront habitués aux techniques de préhension de contention et de pesées. Une anesthésie générale gazeuse sera réalisée avant chaque greffe et pour les traitements intra-tumoraux. Durant toute l’expérience, suivi du poids au minimum trois fois par semaine. L’apparition d’éventuels points limites sera recherchée. Le volume tumoral sera déterminé trois fois par semaine, afin d’appréhender au plus tôt d’éventuels signes de souffrance.

Choix des espèces

Les souris présentent des caractéristiques physiologiques qui permettent une variété de techniques d’administration et de prélèvement présentant des analogies avec ce qui est réalisé en recherche clinique sur l’homme. Diverses souches de souris sont disponibles pour l’établissement de modèles tumoraux, indispensables à la recherche préclinique en immuno-oncologie. Les animaux seront utilisés à l’âge adulte (entre 8 et 12 semaines d’âge) pour la mise en œuvre de modèles expérimentaux stables et reproductibles avec des animaux possédant un système immunitaire mature et un poids corporel > 20g.

Les souris utilisées ont un système immunitaire déficient, condition posée pour qu'elles acceptent la greffe de cellules leucémiques humaines. 8 100 d'entre elles vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Après une injection intrapéritonéale puis une injection intraveineuse quarante-huit heures plus tard, elles reçoivent des injections quotidiennes sur animal vigile pendant une à trois semaines, certaines subissant en plus des séances d'imagerie ou des ponctions de moelle osseuse sous anesthésie. Toutes seront tuées, le porteur indiquant que la souche immunodéprimée et la greffe humaine interdisent de les garder en vie.

Objectifs

Les Leucémies Aigües Myéloïdes (LAM) sont un cancer du sang et de la moelle osseuse pour lequel la majorité des patients rechutent à cause de la présence de cellules leucémiques qui ont résisté à la thérapie. L’objectif de l’équipe est d’explorer les pistes pouvant être impliquées dans ce processus de résistance et de trouver des stratégies thérapeutiques ciblées. En effet, nous avons découvert que le métabolisme des cellules joue un rôle important dans la résistance, tout comme les mutations génétiques. L’hôte est également un environnement intéressant puisque les cellules leucémiques interagissent directement avec les autres cellules du microenvironnement pour survivre aux différentes thérapies. Notre objectif est d'utiliser nos modèles précliniques pour mimer les différents paramètres cliniques observés à la suite d'une prise en charge thérapeutique : quantification de la charge tumorale post-traitement, mesure de la survie globale des patients selon leur prise en charge, mesure du risque de récidive (apparition des rechutes). A l'issue de nos études, le but est de comparer les différents schémas de traitement et d'étudier les mécanismes de résistance associés pour trouver des combinaisons thérapeutiques efficaces.

Bénéfices attendus

Ce projet vise à la découverte de nouvelles combinaisons thérapeutiques avec des thérapies existantes, ou bien de nouvelles molécules en ciblant de manière différente les cellules chimiorésistantes (types inhibiteurs). Nous pourrions également établir différents groupes de patients selon les caractéristiques moléculaires de la maladie, et ainsi prédire la réponse à la chimiothérapie puis orienter les types de patients vers un autre type de thérapie ciblée.

Procédures

Au début de chaque protocole, tous les animaux seront soumis à une injection intrapéritonéale puis intraveineuse 48h après. Ils recevront ensuite des injections vigiles d’une minute pour permettre l’administration du traitement pendant une durée de 1 à 3 semaines. Certains animaux recevront en plus une injection de moins d’une minute pour imagerie (acquisitions de 30 secondes après une anesthésie de 15 minutes). D’autres seront anesthésiés pendant 10 à 15 minutes pour supporter un prélèvement de sang ou de moelle osseuse.

Impact sur les animaux

Les animaux pourraient être confrontés à des effets indésirables tels que du stress, des symptômes liés à l'apparition de la maladie, une gêne physique en cas d'administration thérapeutique prolongée. La fréquence d'administration, la dose et les volumes de traitement seront choisis optimiser le confort des animaux et tous les traitements utilisés auront pour but de réduire la charge tumorale. En revanche, tout signe de douleur observé mettra fin à l'expérimentation pour l'animal concerné.

Devenir

Tous les animaux utilisés dans ce projet seront euthanasiés pour étudier les échantillons biologiques issus des animaux. Dans chaque cas, la souche étant immunodéprimée et les animaux ayant reçu une greffe de cellules humaines, ils ne peuvent être gardés en vie.

Remplacement

Les modèles in vitro existants de Leucémie Aiguë Myéloïde seront utilisés en première intention pour connaître la sensibilité des cellules leucémiques seules aux différentes traitements. En revanche l'utilisation des modèles in vivo reste nécessaire pour pouvoir étudier le développement tumoral au sein du microenvironnement, et le comportement/mécanisme de résistance des cellules leucémiques dans l’organisme vivant auquel elles s’adaptent.

Réduction

Les effectifs des cohortes seront calculés et limités par un logiciel de simulation et l’outil statistique. Les études antérieurement effectuées permettront d’optimiser le nombre d’animaux et le nombre d’échantillons issu de l’animal.

Raffinement

L’expérimentation fait l’objet d’une procédure de suivi du bien-être des animaux adaptée au modèle et aux potentiels effets indésirables des procédures : les animaux seront observés quotidiennement et le milieu sera enrichi avec du papier et des frisottis pour améliorer le bien-être. Les protocoles seront étudiés afin de limiter au maximum le stress ainsi que la douleur subie par l’animal, en optimisant la voie et le volume d'injection, et la durée de traitement. Les animaux seront anesthésiés et une analgésie sera effectuée s'il y a un risque plus important de gêne ou de douleur liée à la procédure.

Choix des espèces

Le modèle murin est caractérisé dans la compréhension des pathologies cancéreuses et la recherche biomédicale. Il est très utilisé dans le criblage de nouvelles molécules du fait de sa similitude de nombreux gènes avec ceux de l’humain, ce qui permet d’étudier la résistance des cellules aux traitements. Il présente aussi des avantages pratiques tels qu’une reproduction et une croissance rapide, et une facilité de manipulation et d’adaptation aux conditions expérimentales ainsi qu’un coût moindre. Nous utilisons des souris avec un système immunitaire déficient qui permet d'étudier la leucémie aiguë myéloïde humaine in vivo. Nous pourrons aussi utiliser d'autres souches immunodéprimées développées par des laboratoires de production afin d'optimiser nos modèles. La procédure utilise des animaux âgés de 6 minimum à 10 semaines car les transplantations de cellules cancéreuses sont plus efficaces chez les jeunes adultes et permettent ainsi une meilleure prise de greffe leucémique. Nous n'utiliserons pas d'animaux âgés de moins de 6 semaines car leur développement est encore en cours et le microenvironnement de la moelle osseuse pas totalement formé.

1 980 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune reçoit une injection de cellules tumorales puis une à trois injections de traitement, la tumeur qui pousse sous la peau étant mesurée au pied à coulisse jusqu'à gêner les déplacements de l'animal. Ulcérations, baisse de température, perte de poids et difficultés respiratoires figurent aussi parmi les effets possibles de la croissance tumorale. L'objectif est de documenter une protéine immunomodulatrice déjà repérée par criblage in vitro, le porteur indiquant que ces études chez l'animal sont "requises" pour que le candidat médicament soit autorisé à passer en clinique.

Objectifs

Au cours de la dernière décennie, les approches immunothérapeutiques ont révolutionné le traitement des cancers et constituent un domaine de recherche en plein essor. Les immunothérapies visent à rendre le système immunitaire plus à même de détruire les cellules tumorales. Cependant, la proportion de patients répondant à ce type de médicaments est pour l’instant trop faible. De plus, ces traitements s’avèrent inefficaces pour certains types de cancers (pancréas, glioblastome, etc.). Pour pallier ces limites, nous tentons de créer de nouveaux médicaments immunothérapeutiques. Nous avons développé une technologie permettant de produire une grande variété de protéines immunomodulatrices, c’est-à-dire capables de moduler l’activité du système immunitaire. Sur la base de tests (cribles) d’activité immunologique réalisés in vitro, nous avons identifié et sélectionné une protéine immunomodulatrice capable de limiter, chez un modèle souris, la croissance tumorale de deux cancers différents. Ce composé pourrait représenter un médicament pertinent pour lutter contre les cancers. Ces premiers résultats prometteurs doivent maintenant être complétés par des études approfondies d’efficacité thérapeutique, de mode d’action et d’innocuité, réalisées chez l’animal. En effet, il est requis de fournir ces études pour que le candidat médicament soit ensuite autorisé par les autorités règlementaires à être évalué en clinique, chez des patients atteints d’un cancer. L’objectif de notre projet est de réaliser ces études précliniques approfondies. Nous évaluerons le candidat médicament pour sa capacité à induire les défenses immunitaires et le contrôle d’un large panel de cancers afin de déterminer ceux pour lesquels il pourrait constituer un traitement pertinent. Nous l’évaluerons aussi en association avec d’autres immunothérapies actuellement utilisées chez le patient afin de déterminer le bénéfice de traitements combinés.

Bénéfices attendus

La proportion de patients répondant aux immunothérapies anticancéreuses actuelles est pour l’instant trop faible et l’efficacité de ces traitements varie en fonction du cancer dont le patient est atteint. La caractérisation approfondie de l’efficacité thérapeutique et du mode d’action de notre candidat médicament permettra de progresser dans : i) l’identification des types de cancers pour lesquels il peut s’avérer efficace, ii) l’évaluation du bénéfice procuré par son association avec d’autres immunothérapies déjà commercialisées, iii) la définition d’un dosage optimal pour une efficacité maximale et une toxicité minimale. Les études précliniques réalisées dans ce projet ouvriront la voie à l’évaluation clinique de l’innocuité et de l’efficacité du candidat médicament chez le patient.

Procédures

Les animaux subiront une injection de cellules tumorales, puis une à trois injection(s) des traitements sera(ont) réalisée(s). Deux prélèvements de sang seront réalisés avec un intervalle de six jours. Les injections et prélèvements de sang seront réalisés en quelques minutes. La croissance de la tumeur sous-cutanée sera suivie par mesure au pied à coulisse. Pour éviter tout stress, les animaux seront anesthésiés avant chaque intervention. Les 1980 animaux mentionnés dans la saisine seront soumis à l’injection des cellules tumorales et aux traitements.

Impact sur les animaux

Les animaux peuvent subir une douleur locale liée aux injections et aux prélèvements. La croissance tumorale peut engendrer différents effets chez l’animal. L’effet le plus fréquent consiste en une gêne dans la mobilité liée à l’encombrement de la tumeur. D’autres effets, plus rares, peuvent être rencontrés. Ainsi, les animaux peuvent présenter une température diminuée, iune ulcération des tissus. De plus, de façon encore moins fréquente, les rongeurs peuvent subir une perte de poids, des difficultés respiratoires.

Devenir

Les animaux seront euthanasiés à la fin des procédures afin de prélever différents tissus ou organes. Ces organes serviront à des analyses précise des tissus et des cellules permettant d’étudier l’état des défenses immunitaire. Ces données permettront de déterminer ainsi l’effet du traitement sur le système immunitaire en lien avec son impact sur la croissance tumorale.

Remplacement

Notre objectif est de développer de nouveaux médicaments immunothérapeutiques pour lutter contre les cancers. Pour cela, nous avons développé une technologie permettant de produire une très grande variété de protéines immunomodulatrices. Nous avons également mis en place des cribles d’activité immunologique réalisés in vitro permettant de se passer d’animaux dans les premières étapes de sélection de protéines présentant les activités immunomodulatrices les plus adéquates. Ces cribles ont notamment permis de sélectionner le candidat médicament qui fait l’objet de ce projet et qui s’est montré capable de contrôler la croissance tumorale chez la souris lors de travaux préliminaires. Ces résultats prometteurs doivent maintenant être complétés par des études approfondies d’efficacité thérapeutique, de mode d’action et d’innocuité, réalisées chez l’animal. En effet, il est requis de fournir ces études pour que le candidat médicament soit ensuite autorisé par les autorités règlementaires à être évalué en clinique, chez le patient atteint d’un cancer. L’évaluation approfondie de l’efficacité immunothérapeutique de ce candidat médicament doit être faite chez l’animal car aucune technique in vitro ne permet de reproduire le lien complexe entre la croissance d’une tumeur et son contrôle par les défenses immunitaires, ces dernières s’établissant dans un premier temps à distance, au sein d’organes immunitaires, pour migrer ensuite vers le site à protéger.

Réduction

Le nombre d’animaux à utiliser pour le bon déroulement du projet a été réduit au minimum de deux manières. Premièrement, par la réduction du nombre d’animaux dans chacun des groupes d’étude. Pour cela, une étude statistique préalable a permis de déterminer le nombre minimal d’animaux à utiliser pour la mesure d’un effet thérapeutique significatif. Deuxièmement, par la réduction du nombre de groupes dans les études d’efficacité du candidat médicament en association avec d’autres traitements actuellement utilisés chez le patient. Pour réduire ce nombre, uniquement deux traitements, chacun représentatif d’un type d’immunothérapie, seront évalués.

Raffinement

Les protocoles que nous utiliserons sont classiquement employés chez l’animal. Pour préserver le bien-être des animaux, ceux-ci seront hébergés au calme en respectant des cycles diurne/nocturne. De plus, ils seront hébergés en groupe dans un environnement enrichi. Pour limiter le stress des animaux, permettre une manipulation aisée et douce, ceux-ci seront anesthésiés avant l’injection des cellules tumorales, des traitements et des prélèvements. Leur état de santé et l’apparition de signes de souffrance liés au développement d’une tumeur seront surveillés tout au long de l’expérience de façon à intervenir de manière appropriée, notamment via l’utilisation d’analgésiques ou d’antiseptiques. Une grille de score qui permet d’évaluer précisément le bien-être de l’animal, des points limites et critères d’arrêt seront utilisés pour décider de l’euthanasie des animaux.

Choix des espèces

Pour évaluer l’efficacité anti-tumorale du traitement ainsi que son mode d’action, nous travaillerons chez la souris. Pour ce type d’étude, elle représente en effet une référence utilisée par la plupart des chercheurs académiques ou de l’industrie pharmaceutique pour étudier l’efficacité de traitements contre le cancer. Les rongeurs auront entre 8 et 12 semaines car ils présentent un système immunitaire et une physiologie pleinement mature qui s’avère cruciale pour évaluer l’effet de l’immunothérapie sur le système immunitaire ainsi que sur la croissance tumorale.

Des injections dans l'œil détruisent les cellules à mélanopsine de la rétine, une chirurgie cérébrale de trente à quarante-cinq minutes vient ensuite moduler une structure du cerveau. 546 Arvicanthis ansorgei, un rongeur diurne, vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, tous tués pour prélever rétine et cerveau. Dès l'âge de vingt jours et jusqu'à la fin des procédures, chaque animal est isolé dans une cage individuelle pour mesurer son activité locomotrice, puis placé quinze à vingt jours en obscurité constante, afin d'évaluer les effets d'une exposition à la lumière bleue nocturne pendant l'adolescence. Le porteur annonce sept tests comportementaux "validés" sans préciser lesquels, et qualifie l'obscurité constante de procédure standard n'induisant "aucune nuisance".

Objectifs

Le cycle lumière/obscurité de 24 h synchronise l'horloge biologique du cerveau. La lumière a des effets positifs et négatifs selon ses caractéristiques (moment, durée, intensité, spectre, etc.). La littérature montre qu'une exposition aberrante à la lumière, notamment bleue la nuit, altère les rythmes, la cognition et induit des états dépressifs chez l'animal et l'Homme. Les cellules à mélanopsine de la rétine jouent un rôle clé dans la médiation de ces effets. La lumière pénètre dans l'organisme par la rétine, captée par par des cellules particulières, sensibles à la lumière bleue, convertissant le signal lumineux en un signal biochimique transmis aux structures cérébrales régulant les rythmes biologiques, l'humeur et la cognition. Les adolescents, plus sensibles à la lumière, présentent un risque particulier d'exposition nocturne à la lumière bleue, car les troubles mentaux surviennent souvent avant 25 ans. Nous émettons l’hypothèse que l'exposition à la lumière bleue nocturne pendant l'adolescence contribue au développement de troubles circadiens (par exemple un décalage du cycle veille sommeil ou un retard chronique à l'endormissement), affectifs et cognitifs à l’âge adulte. Cette étude sera réalisée sur le modèle diurne Arvicanthis ansorgei, plus pertinent que les rongeurs nocturnes comme les rats ou souris. Les objectifs sont : 1) Étudier l'impact de la lumière bleue nocturne sur le système circadien, l'humeur et la cognition via des tests comportementaux validés. 2) Analyser les conséquences sur la rétine, son fonctionnement et ses projections cérébrales. 3) Caractériser les effets dans les régions cérébrales cibles des cellules à mélanopsine régulant ces systèmes. Cette analyse, de la cellule au comportement, aura des résultats déterminants pour la recherche fondamentale et clinique. Avenant : Nos résultats montrent que les animaux exposés à la lumière nocturne ont un retard de rythme biologique, indiquant une perturbation de leur horloge interne. Une procédure étudiera le rôle de la sérotonine dans cette perturbation. Une autre teste si cet impact affecte leur capacité à se réajuster après un changement d'heure. Enfin, une troisième examine si la lumière bleue nocturne les rend plus sensibles au stress.

Bénéfices attendus

Le projet permettra de décortiquer l’impact de l'exposition à la lumière bleue nocturne pendant l’adolescence sur le développement des troubles circadiens, affectifs et cognitifs à l’âge adulte. Les données obtenues permettront d’élaborer de nouvelles stratégies pour limiter les effets délétères d’une exposition aberrante à la lumière bleue chez les adolescents.

Procédures

Pour définir l'impact d'une exposition nocturne à la lumière bleue, notre projet comporte 4 interventions. La première, l'électrorétinographie (ERG), évalue la fonction visuelle. Le test est similaire à celui chez l'homme, mais l'animal est endormi pendant l'enregistrement. Chaque test dure 45-60 min, avec deux passages : un avant et un après l'exposition à la lumière pour évaluer son impact. Ensuite, les animaux passeront 7 tests comportementaux validés pour étudier l'impact de la lumière sur leur système circadien, l'humeur et la cognition. La durée d'un test varie, mais chaque animal est testé environ 5 min. Pour étudier le rôle des cellules à mélanopsine rétiniennes, les animaux recevront des injections oculaires : une avec un "traceur" pour marquer les projections rétiniennes vers le cerveau, et une seconde avec des molécules pour cibler spécifiquement les cellules à mélanopsine et les détruire. Ces injections se font sous anesthésie et analgésie. Enfin, pour vérifier l'implication d'une structure cérébrale régulant l'humeur et la cognition, une chirurgie sera réalisée sous anesthésie. Des molécules pharmacologiques seront injectées pour moduler l'activité de cette structure. La procédure dure entre 30 et 45 min. Après récupération, un activateur de ces molécules sera injecté dans la cavité abdominale pour inhiber certains neurones. Avenant : suite aux premiers résultats, les animaux recevront une injection (moins d'une minute par animal) sur animal vigile pour bloquer un messager chimique spécifique. Ils subiront ensuite des changements de cycle lumineux. D’autres animaux seront soumis à des cycles lumineux simulant des décalages horaires ou à du stress par immobilisation (quotidiennement, pendant 2h maximum, et sur 3 semaines).

Impact sur les animaux

Les animaux peuvent être soumis à différentes interventions, susceptibles de causer des nuisances: 1) Impact généré par l'exposition à la lumière : nous nous attendons à une altération du système circadien, visuel, de l’humeur et de la cognition (objet même de la question). 2) A partir de 20 jours d'âge et jusqu’à la fin des procédures, les animaux seront placés individuellement dans des cages afin de mesurer le rythme de leur activité locomotrice en continu. L’isolement de l'animal sur une longue période est susceptible d’induire du stress chez les rongeurs. 3) Afin d’évaluer les paramètres de leur horloge biologique, les animaux seront placés pendant 15-20 jours à l’obscurité constante. Le placement de l’animal en obscurité constante est la procédure standard utilisée afin d’évaluer le fonctionnement endogène du système circadien, ce qui n‘induira aucune nuisance. 4) Pour étudier l’impact de la lumière sur l’humeur et la cognition, les animaux seront soumis à différents tests comportementaux susceptibles d’induire du stress. 5) Les animaux seront soumis à différents types d'injections, toutes réalisées sous anesthésie. 6) Les animaux seront également soumis à une technique d'électrorétinographie (ERG - permettant d'évaluer la fonction visuelle) susceptible d’induire des anomalies oculaires dans certains cas (inflammation, infection, rougeur, opacité…). 7) Les animaux seront soumis à une exposition à des cycles lumineux perturbants, et à une immonilisation pouvant provoquer du stress, des perturbations physiologiques, un incofort temporaire et une altération du comportement. avenant : l’administration de molécule dans l'abdomen peut causer une légère douleur et un inconfort temporaire à l’endroit de l’injection. Le décalage horaire simulé (jet lag) peut créer du stress, perturber leur activité et nuire à leur sommeil. Ces effets peuvent durer entre 10 et 15 jours, selon la rapidité avec laquelle l’animal se réajuste. Enfin, l’immobilisation peut provoquer une douleur, du stress, des comportements inhabituels, comme des bruits ou de l’agitation, une réduction de l’activité, une perte de poids ou un manque d'appétit. Ces effets varient en fonction de l'animal et de la durée et de l'intensité de l'immobilisation.

Devenir

Suite à l'ensemble des procédures les animaux seront mis à mort, les organes tels que la rétine et le cerveau seront prélevés afin de réaliser des analyses post-mortem.

Remplacement

Le but de ce projet est d’évaluer l’impact d’une exposition aberrante à la lumière durant l’adolescence sur le système circadien, visuel, la cognition et l’humeur. A ce jour, il n’est pas possible de modéliser informatiquement les différentes structures du cerveau sur lesquelles reposent ces fonctions, ni de reconstruire l’ensemble des structures impliquées, de la rétine aux régions cérébrales cibles, ce qui nécessite donc d’avoir recours au modèle animal. Le projet nécessite la réalisation d’expériences dans un environnement intégral, à l’échelle de l’animal.

Réduction

Le nombre d’animaux a été déterminé par méthode mathématique à l'aide de logiciels conçus à cet effet et sur la base notre connaissance du modèle de rongeur utilisé, des techniques mentionnées et de nos expériences à ce sujet, ainsi que sur la littérature scientifique actuelle. De plus afin de réduire le nombre total d'animaux: - Nous utilisons certaines approches non invasives (tests comportementaux) et longitudinales (ERG) ne conduisant pas à la mise à mort de l'animal. - Plusieurs prélèvements de tissus ainsi que certaines mises au point techniques seront réalisés chez le même animal. L'effet délétère de la lumière bleue sera évalué entre les groupes par des tests statistiques adaptés.

Raffinement

Des mesures seront mises en œuvre pour optimiser le bien-être des animaux tout au long des procédures. - Durant toute la durée des procédures les animaux seront placés individuellement dans des cages dans une pièce avec d'autres animaux isolés. Les animaux peuvent se voir et ont accès aux odeurs et bruits générés par leurs congénères. Ils restent ainsi en contact visuel et olfactif avec leurs congénères hébergés dans la même pièce. De plus, pour pallier à l'isolement des animaux, un enrichissement est apporté dans chaque cage (matériel de nidification et baton à ronger). Les procédures considérées comme invasives seront réalisées sous anesthésie et analgésie. Durant ces procédures la température de l’animal sera maintenue à l’aide d’un tapis chauffant. Les animaux sont ensuite suivis tous les 2 jours à l’aide d’une grille de score permettant d’objectiver différents paramètres (apparence, poids, examen clinique, comportement) et d’établir des points limites permettant d’interrompre les procédures et donc de soustraire l’animal à la souffrance.

Choix des espèces

Le choix de notre modèle animal s'est porté sur l'espèce de rongeur Arvicanthis ansorgei. En effet, notre étude multi-échelle (allant du comportement à la cellule) vise à identifier les effets délétères d'une exposition aberrante à la lumière bleue chez les adolescents (P20), afin in-fine, d'élaborer de nouvelles stratégies pour limiter son impact. Il semble donc plus pertinent d'utiliser un modèle diurne (période d'activité le jour, période de repos la nuit), comparable à la physiologie de l'homme. L’objectif du projet est d’exposer les animaux à de la lumière bleue nocturne à l’adolescence (P20) et d’évaluer ensuite les conséquences de cette exposition sur le système circadien, l’humeur et la cognition au stade adulte (P40).

Six chevaux subissent jusqu'à vingt-cinq prises de sang par phase expérimentale, répétées sur huit phases, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque phase comporte une administration d'antibiotique, l'objectif étant de recalculer doses et intervalles pour des molécules anciennes déjà utilisées chez le cheval, afin de préserver les antibiotiques récents pour la médecine humaine. Le porteur indique que le stress des prélèvements répétés sera limité par du renforcement positif, récompenses alimentaires à l'appui. Les six animaux viennent d'un centre équestre où ils travaillent quotidiennement, et ils y retourneront à la fin du projet, choix que le porteur justifie aussi par le souci de ne pas mobiliser des chevaux pour cette seule étude.

Objectifs

Pour préserver l’efficacité des antibiotiques « récents » en médecine humaine, il est recommandé d'utiliser des antibiotiques « anciens » en médecine vétérinaire. Ces antibiotiques « anciens » sont déjà utilisés chez le cheval mais du fait de l'ancienneté des autorisations de mise sur le marché de ces antibiotiques, une révision et une optimisation des modalités de traitement (doses, voies d'administration, intervalles de traitement) sont nécessaires pour garantir l'efficacité des molécules pour traiter les infections chez le cheval. Les objectifs de ce projet seront donc de (1) déterminer le devenir de certains antibiotiques « anciens » dans l’organisme de chevaux selon plusieurs modalités d'administration, (2) prédire par des modèles mathématiques l'efficacité ou non des différents traitements antibiotiques contre des bactéries rencontrées fréquemment chez les chevaux, et (3), dans l'éventualité d'une inadéquation des protocoles de traitements actuels, proposer par des modèles mathématiques des doses et intervalles d'administration permettant une lutte efficace contre les bactéries les plus fréquemment responsables d’infection chez le cheval.

Bénéfices attendus

Les applications attendues sont (1) l'utilisation plus efficace des antibiotiques « anciens » pour améliorer le traitement des chevaux malades tout en limitant les durées de traitement et les utilisations inutiles (2) la réduction de l’utilisation des antibiotiques « récents » en médecine vétérinaire ce qui permettra de les préserver pour la médecine humaine.

Procédures

Il y aura 8 phases expérimentales comportant chacune 25 prises de sang au maximum et une administration d'antibiotique. L'administration durera de 2 min à 10 min environ. La durée des prises de sang sera de 30 secondes au maximum (contention comprise).

Impact sur les animaux

Les prélèvements sanguins nécessaires à l’obtention de plasma seront réalisés de manière répétée et peuvent entrainer un stress qui sera diminué au maximum notamment en utilisant le renforcement positif. En ce qui concerne les effets indésirables attendus, aux doses utilisées dans notre étude, leur survenue sera peu probable. Néanmoins, les chevaux auront des examens cliniques quotidiens, la consistance des crottins sera monitorée, et une observation détaillée sera réalisée dans l’heure suivant l’administration.

Devenir

Les chevaux utilisés travaillent quotidiennement en centre équestre. Les actes prévus sur ces animaux (administration d'antibiotiques selon les modalités prévues pour cette espèce et prises de sang) sont compatibles avec un retour à leur activité normale à la fin du projet.

Remplacement

Il n'est pas possible de se passer d'animaux pour ce projet car le devenir d'un médicament dans un organisme (pharmacocinétique) n'est pas prévisible par des études in vitro compte-tenu de la complexité des mécanismes (absorption, métabolisme hépatique, diffusion tissulaire, élimination rénale...).

Réduction

Seulement 6 chevaux seront utilisés lors de cette étude. Ce nombre est suffisant pour déterminer les paramètres pharmacocinétiques d'une substance tout en étant nécessaire pour détecter une éventuelle variabilité interindividuelle. L'avantage de l'utilisation de chevaux permet également de réaliser plusieurs cinétiques sur le même animal tout en ayant un impact limité sur le bien-être des animaux. Enfin, afin de ne pas utiliser des animaux exclusivement pour ce projet, les animaux utilisés seront des chevaux provenant d'un centre équestre.

Raffinement

Les chevaux utilisés pour ce projet travaillent régulièrement en centre équestre ce qui permet d'avoir des chevaux habitués au contact humain, manipulés quotidiennement, avec un suivi régulier de leur état général par un vétérinaire. Ils vivent au pré en groupes constitués selon leurs affinités et ne seront placés en boxs que ponctuellement pour les administrations et les prises de sang. Au cours de l'étude, les chevaux auront des examens cliniques quotidiens, la consistance des crottins sera monitorée, et une observation détaillée sera réalisée dans l’heure suivant l’administration. Si le suivi clinique d'un animal révèle une intolérance ou un effet secondaire majeur, l'expérimentation sera arrétée sur l'animal en question et des soins appropriés seront effectués. Le stress des prélèvements sanguins sera diminué au maximum notamment en utilisant le renforcement positif (récompenses alimentaires lors de la réalisation des prises de sang).

Choix des espèces

Ce projet concerne la détermination des paramètres pharmacocinétiques d'antibiotiques chez l'espèce cible, le cheval. Nous utiliserons des chevaux adultes, entre 2 et 20 ans, pour pouvoir étudier la pharmacocinétique de chevaux adultes. On évitera les chevaux trop âgés qui pourraient présenter des paramètres pharmacocinétiques différents et non représentatifs des chevaux de sport et de loisir.