Procédures modérées

Jusqu'à dix-neuf injections sous la peau, trois injections dans la veine de la queue et un prélèvement de sang : 80 souris dépourvues de système immunitaire subissent des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour analyser leur sang et leur tumeur. Chaque animal porte une tumeur humaine greffée sous la peau, mesurée au pied à coulisse trois fois par semaine pendant huit semaines au maximum. Le projet vise à vérifier chez la souris l'effet de cellules immunitaires modifiées qui ont déjà éliminé des cellules cancéreuses en culture, pour des cancers de l'ovaire et du sein. L'effectif de 80 animaux repose sur un "outil statistique" que le porteur ne nomme pas.

Objectifs

L’immunothérapie dans le domaine du cancer est une approche thérapeutique qui vise à stimuler le système immunitaire du patient pour qu’il puisse éliminer les cellules cancéreuses. Parmi les approches disponibles, il est possible de récupérer certaines cellules immunitaires du patient, de les modifier afin qu’elles reconnaissent spécifiquement les cellules cancéreuses avant de les réinjecter au patient. Cette approche, appelée thérapie cellulaire, a démontré son efficacité dans de nombreux essais cliniques pour le traitement de différents cancers. Nous avons réussi à générer des cellules immunitaires modifiées capables de reconnaître différents types de cancers, tels que le cancer de l’ovaire et un sous-type de cancer du sein très agressif. De plus, nous avons démontré que ces cellules immunitaires modifiées sont capables d’éliminer des cellules cancéreuses in vitro. Cependant, il est nécessaire de vérifier leur potentiel thérapeutique in vivo. Dans ce projet, l’objectif est d’évaluer la capacité de cellules immunitaires reconnaissant notre cible à éliminer les cellules cancéreuses des 2 types de cancer dans ce modèle de souris.

Bénéfices attendus

En cas de résultats positifs, cette étude permettra de valider une nouvelle approche thérapeutique innovante pour les patients atteints de cancer, notamment de cancers de l’ovaire et du sein qui ne répondent pas aux traitements standards. Ceci accélèrera la validation préclinique de cet outil thérapeutique afin d’entamer le transfert vers la clinique.

Procédures

Pour réaliser l’unique injection sous-cutanée de cellules cancéreuses humaines, la souris est maintenue environ 15 secondes. A la suite de cette injection, la souris développera une tumeur sous-cutanée. La croissance tumorale est suivie par des mesures au pied à coulisse 3 fois par semaine, l’animal est maintenu immobile environ 25 secondes. Les injections intraveineuses (1 injection par semaine pendant 3 semaines, soit 3 IV/souris) se feront au niveau de la veine de la queue (1 min d’immobilisation). Pour la procédure 1, les injections sous-cutanées de la molécule de soutien des cellules lymphocytes ou sérum physiologique seront réalisées trois fois par semaine pendant 8 semaines maximum soit 19 injections sous cutanée au total. La souris est maintenue 15 secondes pour ce geste. Ces injections seront réalisées dans la procédure 2 que si elles démontrent un effet bénéfique sur l’efficacité du traitement. Un prélèvement sanguin sera également réalisé sur animaux vigiles, l’animal est maintenu immobile environ 50 secondes (15 secondes pour l’application de l’anesthésique puis 45 secondes pour le prélèvement). Les souris seront également pesées deux fois par semaine, la souris est maintenue environ 15 secondes.

Impact sur les animaux

L’injection des cellules tumorales en sous-cutanée dans le flanc droit de la souris devrait entrainer une douleur temporaire et légère. A la suite de cette injection les animaux développeront des tumeurs localisées sous la peau de l’animal. Le suivi de la croissance tumorale sera effectué par mesure au pied à coulisse et n’entraînera aucune douleur, à l’exception peut-être d’un léger stress temporaire. L’injection sous-cutanée de molécule de soutien des cellules lymphocytes pourrait entrainer un désagrément voire une douleur temporaire légère. L’injection intraveineuse de cellules immunitaires modifiées pourrait engendrer une douleur légère passagère intraveineuse. Le prélèvement sanguin peut entraîner une douleur modérée, qui est atténuée par l’utilisation d’une anesthésie locale.

Devenir

A la fin de la procédure, les animaux seront mis à mort afin de pouvoir analyser la composition du système immunitaire dans le sang et au sein de la tumeur.

Remplacement

Ce modèle permettra d’évaluer l’efficacité d’une thérapie utilisant des cellules immunitaires modifiées. Les animaux sévèrement immunodéprimés correspondent au modèle majoritaire pour l’évaluation de l’efficacité de ce type de traitement, puisqu’elles permettent la greffe de cellules tumorales humaines et l’injection de cellules immunitaires humaines en l’absence de cellules immunitaires murines. Ce modèle est le seul modèle vivo disponible dans le cadre de notre projet, aucune alternative non-animale n’est aujourd’hui disponible pour s’assurer de la fonctionnalité des cellules immunitaires génétiquement modifiées in vivo, ce qui est un des objectifs de cette étude.

Réduction

La première procédure devrait nous permettre de sélectionner la condition expérimentale permettant d’observer le meilleur effet de notre traitement. Cette condition sera utilisée à la fois dans la procédure 2 et, par la suite, pour évaluer d’autres candidats de thérapie cellulaire. Nous avons utilisé un outil statistique pour déterminer le nombre minimal d’animaux nécessaires et suffisants pour garantir la validité scientifique de l’étude. Par ailleurs, un nombre optimal d’échantillons et de données seront collectés pour chaque animal, afin d’utiliser le nombre minimal d’animaux nécessaires pour répondre à l’ensemble des questions de l’étude.

Raffinement

Les animaux utilisés dans ce projet n’ont pas de système immunitaire, ils sont donc incapables de lutter contre des infections virales ou bactériennes. Ils doivent être hébergés dans un environnement protégé pour éviter toutes contaminations. Les analyses de croissance des tumeurs sont non-invasives (mesure au pied à coulisse) et ne requièrent pas d'injection d'anesthésiant ou d'antalgique. L'effet des composés sur l'état physiologique des souris est suivi par l’observation quotidienne des animaux par des personnes compétentes, par la pesée des animaux et la mesure du développement tumoral. Des points limites adaptés sont définis de manière objective, incluant des critères d'arrêt de l'expérience en cas de souffrance. Aucun effet indésirable lié à l’injection des cellules immunitaires humaines dans le modèle de souris utilisé n’est attendu. Le prélèvement sanguin peut entrainer une douleur, pour pallier cela les animaux sont traités par un anesthésique local quelques minutes avant le prélèvement.

Choix des espèces

Les souris utilisées correspondent au modèle majoritaire pour l’évaluation de l’efficacité des thérapies cellulaires utilisant des cellules immunitaires puisqu’elles permettent la greffe de cellules tumorales humaines et l’injection de cellules immunitaires humaines en l’absence de cellules immunitaires de souris. Ce modèle est le seul modèle vivo disponible dans le cadre de notre projet, aucune alternative non-animale n’est aujourd’hui disponible pour s’assurer de la fonctionnalité des cellules immunitaires transférées in vivo, ce qui est l’objectif de cette étude. Les animaux utilisés seront à l’âge de 6-8 semaines afin de pouvoir réaliser les greffes sous-cutanées et l’injection en intraveineuse des cellules immunitaires dans des conditions optimales.

Les expérimentateurs injectent des cellules cancéreuses dans le coussinet graisseux de la glande mammaire, sans anesthésie, geste qu'ils décrivent comme rapide et précis. 780 souris vont être utilisées, toutes tuées pour prélever les tumeurs, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, avec cinq minutes d'irradiation sous anesthésie par animal. Les tumeurs peuvent provoquer une perte de poids, une mobilité réduite et des ulcérations traitées localement, la mise à mort intervenant quand l'ulcération ne s'améliore pas en trois jours. Le porteur écrit par ailleurs que l'irradiation externe n'induit pas d'effet indésirable connu chez la souris.

Objectifs

La radiothérapie aide le système immunitaire à combattre les tumeurs en libérant de l'ADN tumoral. Cet ADN est capté par des cellules spéciales qui activent les lymphocytes, des cellules qui éliminent les cellules tumorales. Ce processus se produit même en dehors de la zone irradiée. Cependant, on ne comprend pas encore bien comment l'ADN tumoral stimule le système immunitaire pendant la radiothérapie. Une enzyme appelée DNASE1L3 dégrade l'ADN libre et empêche normalement une réaction immunitaire. Cette enzyme est produite par certaines cellules du système immunitaire. Des études préliminaires ont montré que, chez des souris avec des tumeurs mammaires, l'absence de DNASE1L3 réduit l'efficacité de la chimiothérapie et la réponse immunitaire. Dans le contexte du cancer, DNASE1L3 pourrait aider à renforcer l'effet de l'ADN tumoral libéré par les traitements anticancéreux. Le projet vise à comprendre le rôle de cette enzyme dans la stimulation du système immunitaire par l'ADN tumoral après radiothérapie, en utilisant un modèle de cancer du sein triple négatif. Pour cela, des tumeurs seront greffées sur des souris avec et sans cette enzyme, puis irradiées. Les tumeurs seront analysées pour comprendre l'impact de l'enzyme sur le traitement par radiothérapie.

Bénéfices attendus

Sur le court terme, notre projet permettra de mieux comprendre le rôle de la DNASE1L3 sur l’ADN tumorale relargué après irradiation. Ce projet permettra d’améliorer la compréhension de l’effet de l’irradiation sur les tumeurs. A long terme, il permettra d’apprécier de nouvelle piste thérapeutique, plus spécifiquement dans le cadre du cancer du sein triple négatif, qui aujourd’hui reste encore très difficile à traiter par les traitements classiques. Ce projet pourrait déboucher sur un traitement basé sur la supplémentation Dnase1l3 pour les patientes atteintes par ce type de cancer.

Procédures

Tous les animaux seront injectés avec des cellules cancéreuses au niveau du coussinet adipeux de la glande mammaire. Ce geste est rapide et précis, et ne nécessite pas que les animaux soient anesthésiés. Les animaux seront anesthésiés pendant l’irradiation qui durera 5 minutes par souris. Les souris seront maintenues en contentions maximum 1 minute pour la greffe et pour le suivi clinique.

Impact sur les animaux

La greffe de tumeurs orthotopiques dans le coussinet adipeux de la glande mammaire peut induire une perte de poids des souris et une mobilité réduite suivant la taille de la tumeur et sa localisation de prise sur la souris. Pour ce modèle, nous avons fixé le volume de tumeur maximum au-delà desquels les souris devront être euthanasiées pour éviter des douleurs importantes. Pour ces raisons, nous avons mis en place des stratégies d'expérimentation et d'observation nous permettant de déterminer des points limites suffisamment précoces afin de limiter la douleur au maximum. A cette fin, les animaux seront surveillés quotidiennement. Les tumeurs sont mesurées deux à trois fois par semaine à partir de l’injection des cellules. Aussi, des signes de souffrance manifestes comme la piloérection, une perte de mobilité ou la prostration de l’animal sont également des points limites adaptés. De plus, nous considérons qu’une souris isolée du reste du groupe est un signe de souffrance et un point limite suffisamment précoce. L’irradiation externe n’induit pas à notre connaissance d’effet indésirable chez les souris.

Devenir

Il est nécessaire d’euthanasier les animaux afin de prélever les tumeurs mammaires et de les utilisés à de fins expérimentales.

Remplacement

Afin d’étudier la fonction de la composante d’intérêt dans l’immunité antitumorale et dans la régulation de l’efficacité thérapeutique de traitements anti-cancéreux nous utilisons des animaux de phénotype sauvage et déficient en cette composante d’intérêt. Ainsi cette étude ne peut pas être réalisée avec des échantillons humains. De plus nous étudions l’interaction entre le système immunitaire et les cellules tumorales dont la modélisation dans un système d’organoïdes n’est pas à ce jour optimale et ne peut remplacer les modèles in vivo.

Réduction

Le nombre d’animaux a été fixé à 15 par groupe afin d’avoir une analyse statistique robuste, tenant compte de l’hétérogénéité dans la prise tumorale. Les différentes analyses statistiques seront réalisées à l’aide d’un logiciel statistique. Concernant la colonie nécessaire à ce projet, les souris femelles seront utilisées pour le modèle de carcinome mammaire, tandis que les souris mâles seront utilisées pour d’autre projet faisant l’objet d’une autre DAP dans un autre institut.

Raffinement

Nous avons établi des point limites gradés, précis et adaptés pour toutes les procédures (décrits dans la section procédure) mises en œuvre au cours de ce projet. Si les animaux atteignent ces points limites, cela constitue un critère d’arrêt de l’expérimentation et les animaux seront euthanasiés par dislocation cervicale. L’approche des points limites entrainera une surveillance accrue des animaux (suivi journalier du poids, du volume tumoral et du comportement) afin réduire au minimum les nuisances sur le bien-être des animaux. Concernant l’enrichissement du milieu, les souris disposent de carrés en cellulose pour la formation d’un nid commun confortable. En cas d’isolement forcé d’une souris dans une cage, un abri supplémentaire sera également fourni. Dans les cas d’apparition d’une ulcération au niveau de la tumeur, un traitement local pourra être appliqué pour traiter l’ulcération. Si celle-ci ne s’améliore dans les 3 jours, la souris sera euthanasiée.

Choix des espèces

Les études débuteront quand les souris auront à minima 8 semaines afin de garantir un système immunitaire mature, et dans le cas du modèle de carcinome mammaire ce délais correspond la maturité sexuelle des souris femelles pour l’injection des lignées E0771-HER2, pour une meilleure vraisemblance avec les cancers du sein humains.

Sorties de leur aquarium, anesthésiées, posées sur un champ glacé, 107 xénopes femelles subissent le prélèvement d'une partie d'un ovaire, opération de quatre à dix minutes répétée jusqu'à trois fois dans leur vie, à six mois d'intervalle au moins. Les procédures impliquent un niveau de souffrance modéré et le projet en prévoit 43 par an. Elles vivent ensuite un à trois ans dans l'animalerie, tant que leurs ovaires reconstituent leur stock d'ovocytes. Sur les 107 animaux, 72 seront tuées parce que leurs ovaires ne régénèrent plus, et 35 seront réutilisées.

Objectifs

Le projet vise à comprendre les divisions méiotiques de l'ovocyte. Tous les êtres vivants se développent grâce aux divisions de leurs cellules : la cellule duplique son génome puis en redistribue une copie dans chacune des deux cellules filles. La méiose est un mode de division spécialisé spécifique aux cellules reproductrices. Chez les femelles, dans les ovaires, les ovocytes sont bloqués en début de méiose. Cet arrêt permet à l’ovocyte d’accumuler les composants nécessaires au développement du futur embryon. Lors de l’ovulation, un signal hormonal lève le blocage et l’ovocyte réalise les divisions de méiose. Notre équipe s’intéresse aux mécanismes moléculaires déclenchés par l’hormone qui conduisent à la division. Ces mécanismes sont encore inconnus et leur étude est très importante pour comprendre la formation de la cellule reproductrice femelle, qui est à la base de la reproduction des individus. Notre étude renseigne aussi sur la division des cellules, qui assure le développement et le maintien de l’intégrité des organismes vivants. Chez l’amphibien Xénope qui est utilisé dans ce projet, la progestérone déclenche dans l’ovocyte l’activation en cascade de différentes protéines, ce qui aboutit à la reprise de la méiose. Sur le plan moléculaire, le blocage de l’ovocyte dépend d’une enzyme qui phosphoryle les protéines. La progestérone induit une diminution de son activité. Ceci provoque la synthèse de nouvelles protéines qui conduisent aux divisions de méiose. Le projet vise à identifier les cibles de l’enzyme et à élucider le mécanisme par lequel elles déclenchent la division. Ce projet a des retombées importantes dans deux domaines : celui du cancer, qui résulte d’une dérégulation de la prolifération cellulaire, et celui de l’infertilité humaine, qui repose en grande partie sur la dérégulation des divisions de l’ovocyte.

Bénéfices attendus

Notre projet est lié à trois domaines d’enjeux majeurs en santé : infertilité, anomalies fœtales, cancer. La fréquence de l’infertilité n’a cessé d’augmenter ces 20 dernières années. La compréhension de ses causes est l’un des axes prioritaires de la stratégie européenne de recherche. Chez la femme, elle est souvent associée à des défauts de formation de l’ovocyte. C’est pourquoi il est important de comprendre les étapes de formation de l’ovocyte, qui est l’objectif de ce projet. Il est impossible de mener des expériences sur les ovocytes humains. Le modèle murin est assez inadapté car le contrôle de la différenciation de l’ovocyte présente des différences importantes avec les autres vertébrés. Le projet utilise les ovocytes de l’amphibien Xénope, très utilisé pour sa ressemblance génétique avec l'homme. Il permettra d’identifier des gènes importants impliqués dans les infertilités. Ce projet permettra aussi l’identification des protéines de l’ovocyte qui assurent le bon développement de l’embryon. Leur connaissance contribue à comprendre les défauts de l’embryon qui sont à l'origine d'interruptions de grossesses ou d'anomalies congénitales. Enfin, le projet s’inscrit au cœur de la cancérologie. La méiose utilise en effet les mêmes gènes que ceux de la division cellulaire, et le génome du Xénope est très proche de celui de l'espèce humaine. Ces études révèlent donc de nouvelles protéines qui, quand elles sont dérégulées, entraînent la tumorigenèse. L’atout majeur de l’utilisation du Xénope dans ce domaine a d’ailleurs été à l’origine de l’attribution du Prix Nobel en 2001.

Procédures

Les interventions consistent en un prélèvement d’une partie d’un ovaire, effectué sur un animal anesthésié en conditions stériles et placé sur un champ froid qui supprime la douleur. L’opération dure 4 à 10 min. Seules les extrémités des ovaires sont prélevées pour éviter tout saignement. L’ouverture est suturée sans contraindre les tissus ce qui évite les risques d’hématomes et d’abcès. Le réveil s’effectue en 20 à 30 min, et l’animal est ensuite surveillé pour vérifier la bonne cicatrisation cutanée. Puis il regagne son aquarium. Le projet requiert 43 opérations par an. Chaque femelle est opérée au maximum 3 fois pendant sa vie, chaque opération étant espacée d'au moins 6 mois.

Impact sur les animaux

Les nuisances et effets indésirables attendus en post-opératoire portent sur la douleur, le stress et des risques de complication dûs à l’opération. Le stress peut être provoqué par le prélèvement de l’animal dans l’aquarium et l’opération chirurgicale. À noter que le stress thermique potentiellement lié à l’anesthésie, le stress social qui serait engendré par l’isolement post-opératoire et le stress du jeûne pré-opératoire de 5 heures ne sont pas applicables : animal poïkilotherme « à sang froid », à vie solitaire, et nourri tous les 3 jours en conditions normales. La douleur peut être induite par la chirurgie. Les risques de complication sont de légers saignements temporaires de la cicatrice.

Devenir

Les animaux sont gardés en vie tant qu’ils régénèrent leurs ovocytes suite aux opérations (maximum de 3 opérations par animal, aucun animal n’est opéré plus de 3 fois). Ils demeurent en vie dans l’animalerie entre 1 et 3 années. Ils sont euthanasiés par une méthode réglementaire de façon à lui éviter toute douleur. L’euthanasie est justifiée quand, après une seconde ou une 3ème ovariectomie partielle, les ovaires ne régénèrent plus leur contenu. Le projet reposant intégralement sur l’étude des ovocytes, les animaux ne produisant plus d’ovocytes ne sont donc plus utilisables pour le projet. À l’issue des 5 années du projet, 72 des 107 animaux du projet auront été euthanasiés. 35 seront encore en vie, après avoir subi une ou deux opérations. Ils seront ré-utilisés.

Remplacement

Notre objet d'étude est l’ovocyte, la cellule reproductrice femelle. Cette cellule est extrêmement spécialisée. Son organisation interne très complexe lui permet de réaliser les divisions qui vont lui permettre d’être fécondé par un spermatozoïde. Ces divisions particulières sont également importantes pour les premières étapes de la vie de l’embryon qui sera issu de la fécondation. L’ovocyte n’est donc comparable à aucune autre cellule, et ne peut être reproduit ou « créé » artificiellement par synthèse ou par des cellules souches ou par une modélisation virtuelle. C’est pourquoi nous sommes dans l'obligation d'utiliser des ovocytes intacts issus d’animaux, dans notre cas les Xénopes (des amphibiens), pour les étudier ensuite en laboratoire. Le modèle Xénope lui-même s’inscrit dans une stratégie de remplacement. L’autre modèle utilisé dans les laboratoires pour l’étude du même sujet, la formation de l’ovocyte, est la souris (ou le rat). Les ovaires de Xénope contiennent chacun jusqu’à 6000 ovocytes (contre une vingtaine chez la souris) et ont la capacité de régénérer (ce qui n’existe pas chez la souris). Utiliser le Xénope au lieu de la souris permet donc de limiter énormément le nombre d’animaux utilisés en laboratoire. Enfin, en parallèle à l’utilisation expérimentale des ovocytes, nous utilisons des outils bioinformatiques très récents (moins de cinq ans), basés sur l'intelligence artificielle, en amont des expériences. Ils permettent de guider et cibler les expériences au lieu de travailler de manière exploratoire comme par le passé. Cela permet de limiter le nombre de cellules utilisées, et donc d'animaux.

Réduction

Les expériences de l’ensemble des membres de l’équipe sont planifiées, coordonnées et synchronisées de façon à n’opérer qu’un minimum d’animaux. Les besoins en ovocytes pour les expériences d’une semaine de travail sont précisément estimés, et oscillent entre 1000 et 2000 ovocytes. En conséquence, une seule femelle est opérée chaque semaine. Les 1000 à 2000 ovocytes requis correspondent à un à deux tiers du contenu d’un ovaire. Le contenu de l’ovaire n’est jamais vidé entièrement de façon à préserver les cellules souches qui vont assurer la régénération. En outre, les Xénopes ont la capacité de renouveler leur stock d’ovocytes au bout d’une période minimale de 6 mois : nos statistiques indiquent que 81 pour cent des animaux régénèrent après une opération, et 57 pour cent d’entre eux après une seconde. Ces capacités régénératives nous permettent de ré-utiliser une même femelle jusqu’à trois fois, limitant le nombre d’animaux utilisés. Le nombre total de femelles utilisées par le projet est de 107. Enfin, des outils statistiques et des modèles prédictifs sont utilisés en amont des expériences et permettent d’orienter les expériences nécessaires à réaliser, au lieu de travailler de manière exploratoire en multipliant les expériences comme par le passé. Ainsi, la propriété de régénération du Xénope, la synchronisation des demandes d’ovocytes de tous les membres de l’équipe et les nouveaux outils bioinformatiques disponibles réduisent considérablement le nombre d'animaux utilisés.

Raffinement

Les animaux sont maintenus en aquarium de 25 L d’eau déchlorée, filtrée, oxygénée, à 20 degrés. Au-delà de 25 degrés, l’animal entre en léthargie. Des sondes surveillent en temps réel température, acidité et conductivité. Les aquariums sont enrichis par des tubes PVC où certains animaux aiment à se cacher, bien que le comportement préféré soit de rester allongé sur le fond de l’aquarium. La nourriture non consommée et les fèces sont éliminées quotidiennement. Un nettoyage des parois des aquariums avec une brosse ou une lingette est effectué tous les 15 jours. 6 à 12 animaux sont regroupés par aquarium. Dépasser 12 peut induire un stress. Aucun stress n’est relevé si le groupe est réduit ou l’individu isolé, car les individus sont solitaires chez cette espèce. À leur arrivée, les animaux sont mis en quarantaine pendant 4 semaines. Ils sont ensuite acclimatés en aquarium pendant au moins 2 semaines avant d’être intégrés à un protocole expérimental. Ils sont nourris à satiété 2 fois par semaine (vers de vase, cœur de bœuf et granulés de poisson). Ils sont prélevés à la main ou avec une épuisette, en évitant tout mouvement brusque afin de ne pas les stresser. Une grille de cotation répertorie toute anomalie et lui attribue un chiffre, de 1 à 3 : 1, surveillance attentive ; 2, surveillance accrue, isolement de l’animal pendant une semaine et soins éventuels, puis réévaluation de l’état de l’animal ; 3, point limite, euthanasie. À un niveau 2, des soins portant sur les affections cutanées peuvent être apportés. L’anesthésie, le prélèvement et l’euthanasie sont pratiqués dans une pièce isolée afin de ne pas stresser les autres animaux. La durée de la chirurgie est minimisée (4 à 10 min). Les opérations sont pratiquées sous anesthésie. L’animal est placé sur le dos sur un champ glacé, ce qui a un effet analgésique. Une surveillance post-opératoire est effectuée pendant 2 semaines.

Choix des espèces

L’ovocyte de Xénope (une espèce de crapaud) est un modèle très adapté pour l’étude de la division des cellules, en particulier les cellules reproductrices femelles (appelées ovocytes). Comprendre la formation de ces cellules est important pour trouver des thérapies soignant l’infertilité humaine et le cancer. Chaque ovaire de Xénope contient des milliers d’ovocytes de très grande taille et très riches en molécules. Ceci permet des approches au niveau des cellules mais aussi des molécules qui sont impossibles chez les espèces mammaliennes. Le Xénope est donc la seule espèce de laboratoire permettant d'étudier la cellule reproductrice femelle en combinant ces deux puissantes approches. Une autre originalité propre au Xénope est que ses ovaires sont capables de régénérer leur stock d'ovocytes, ce qui limite le nombre d'animaux utilisés. Enfin, l’ovocyte de Xénope est plus proche de l'ovocyte humain que ne l'est celui de la souris en ce qui concerne les mécanismes de la division, ce qui le rend incontournable pour la découverte de nouveaux gènes impliqués dans les défauts de fertilité chez la femme. Les animaux utilisés sont des femelles adultes parce qu’elles ont des ovaires pourvus en ovocytes, les cellules que nous étudions. Les embryons et les têtards en sont dépourvus. Les femelles achetées chez un fournisseur agréé ont entre 2 et 3 ans, âge de la maturité sexuelle chez le Xénope.

Tués pour prélèvement d'organes, 3 750 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Vingt-quatre injections d'un agent inducteur, une tous les trois jours pendant huit semaines, leur provoquent une fibrose du foie, avant l'administration des composés à tester pendant quatre à huit semaines. S'y ajoutent des prélèvements de sang sur animaux vigiles, jusqu'à trois dans la même journée. Le porteur qualifie la fibrose hépatique de pathologie silencieuse qui ne déclenche aucun signe clinique douloureux, et conclut que le modèle rat est "incontournable".

Objectifs

La fibrose hépatique représente un enjeu majeur de santé publique dont l’importance ne cesse de s’accroitre. Cette dernière est une maladie complexe qui résulte d’une augmentation de la fibrose du foie dont l'évolution conduit à la greffe d'organe ou à la létalité. Ce projet vise à tester des composés dans un modèle de fibrose hépatique chez le rat, modèle très proche de la pathologie humaine.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de tester et développer de nouvelles approches thérapeutiques innovantes ayant le potentiel d’améliorer la prise en charge thérapeutique des patients atteints de fibrose hépatique.

Procédures

1) l’injection d’agent inducteur tous les 3 jours pendant 8 semaines (24 injections de 1ml en moins de 10 sec) 2) Un prélèvement de sang de 200 µL (moins de 30 secondes) pourra également être réalisé après 4 semaines afin de pouvoir randomiser les animaux sur leurs taux de transaminase. 3) Afin de relier l’efficacité des composés à leurs taux sériques, une pharmacocinétique pourra être effectuée une fois par étude. Ainsi, au maximum 3 prélèvements d’environ 30μL de sang par rat (en moins de 30 secondes) seront réalisés pendant la même journée ou étalés sur 2 journées. Le volume total de ces prélèvements n’excédera pas 10% du volume sanguin du rat et les prélèvements seront effectués sur animaux vigiles. 4) Les composés et leurs solvants seront administrés pendant 4 à 8 semaines maximum : moins d’une minute à chaque administration, sur animal vigile.

Impact sur les animaux

Le degré de sévérité de la procédure expérimentale dans laquelle sont inclus les animaux est modéré. La fibrose hépatique est une pathologie silencieuse qui ne déclenche pas de signe clinique douloureux chez l’Homme ou l’animal. Les injections et les prélèvements sanguins induisent une douleur de courte durée. L’animal peut subir un stress au cours de l’anesthésie ou lors de l’administration par gavage ou lors des injections.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort pour prélèvement d’organes.

Remplacement

Les modèles animaux représentent un outil incontournable dans l’étude des mécanismes immuno-pathologiques et fibrotiques. Aucun modèle alternatif in vitro n’est disponible pour étudier les mécanismes cellulaires complexes intervenant dans la physiopathologie de la fibrose hépatique. Le rat représente un modèle très performant et hautement informatif car la fibrose ressemble beaucoup à la fibrose observée chez l’Homme. Étant donné que le paramètre principal étudié dans ce projet est la survenue d’une maladie résultant d’un ensemble complexe d’acteurs cellulaires et de médiateurs solubles, l’utilisation du modèle rat est incontournable.

Réduction

Nous utiliserons un modèle bien établi dans la littérature afin de limiter la phase de mise au point et ainsi de réduire le nombre d’animaux. Le nombre de rat utilisé par groupe sera réduit au minimum tout en permettant une bonne analyse statistique.

Raffinement

La fibrose hépatique est une pathologie silencieuse qui ne déclenche pas de signe clinique douloureux chez l’Homme ou l’animal. Les injections et les prélèvements sanguins peuvent induire une douleur de courte durée de ce fait, un analgésique local pourra être ajouté avant la réalisation des prochaines. Les points limites pour chaque procédure ont été établis afin d’éviter toute souffrance indésirable des rats, cette grille de points limites sera appliquée tout au long du projet. De plus, Les animaux sont hébergés dans des cages adaptées, pour préserver leurs interactions sociales et limiter les phénomènes de disputes ou de stress engendrés par une surpopulation. L’environnement est enrichi par des objets adaptés à l’espèce. Les animaux sont observés quotidiennement par le personnel de l'animalerie formé au bien-être des animaux et par les expérimentateurs.

Choix des espèces

L'utilisation de rat est basée sur une littérature abondante décrivant les différents modèles de fibrose hépatique chez le rat, cette dernière étant très proche de celle observée chez l’Homme. Les animaux seront utilisés au stade adulte afin d’évaluer les composés d’intérêt sur un organe mature.

Pour tester un anticorps couplé à une chimiothérapie censé tuer les cellules immunitaires régulatrices installées dans les tumeurs, 244 souris transgéniques vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. Une injection de cellules tumorales sous anesthésie locale ouvre le protocole, suivie d'une à quatre injections du produit selon les groupes. Le porteur indique que la tumeur peut provoquer une gêne modérée, douleur et perte d'appétit, en fin de procédure quand le traitement reste inefficace, et qu'une toxicité modérée du produit est possible. Les points limites annoncés sont qualifiés de précis et précoces, sans être détaillés.

Objectifs

Une immunothérapie est actuellement approuvée pour le traitement de nombreux cancers localisés et métastatiques. Cependant, de nombreux effets secondaires sont liés à ce traitement. Pour remédier à cela, l'administration intratumorale d'immunothérapies est apparue comme une solution potentielle, visant à atténuer les effets secondaires grâce à une exposition systémique réduite tout en augmentant l'efficacité. Certaines cellules jouent un rôle clé dans la prévention des maladies auto-immunes et inflammatoires. Cependant, leur accumulation dans les tumeurs supprime l'immunité anti-tumorale et ils ont donc un rôle délétère dans le traitement des cancers. L'objectif de notre projet est de démontrer qu'un ciblage thérapeutique ciblant et tuant spécifiquement ces cellules intratumorales permettrait de développer des réponses immunitaires anti-tumorales plus spécifiques contre le cancer et moins toxiques pour les tissus sains. Pour cibler ces cellules, nous avons développé une construction comprenant un anticorps (ciblant une protéine spécifiquement exprimé par les cellules immunitaires activées) relié à une molécule de chimiothérapie. Ce médicament pénètrera dans la cellule cible, relarguera la chimiothérapie dans la cellule et entraînera sa mort. Nous avons développé un tel médicament dans le but de cibler et de tuer les cellules d'intérêt. De plus, l'administration intra-tumorale de ce médicament permettrait de maximiser l’efficacité locale du traitement tout en minimisant sa toxicité systémique. L’objectif de ce projet est donc de montrer l’efficacité de notre médicament dans sa capacité à réduire la tumeur, de trouver la combinaison d'anticorps+molécule de chimiothérapie la plus efficce possible et de déterminer la dose minimale efficace dans un modèle murin transgénique humanisé.

Bénéfices attendus

L’objectif de ce projet est de montrer l’efficacité d’un nouveau médicament contre le cancer. En conjuguant un médicament d'immunothérapie à une chimiothérapie, une amélioration du traitement est attendue tout en limitant les effets secondaires. Ce nouveau traitement via son mode d'administration et sa nature pourrait donc être plus efficace et moins toxique que les traitements conventionnels actuels. Par conséquent, les bénéfices attendus sont importants car ce nouveau traitement pourrait avoir un impact significatif sur la vie de nombreux patients. En effet, étant donné que ce nouveau médicament agit sur des cellules immunitaires potentiellement présentes dans tous les types de cancer, il pourrait être utilisé dans de nombreuses indications et changer la vie de nombreux malades.

Procédures

Injection de cellules tumorales, 1 par souris, durée 30 secondes, sous anesthésie locale. Traitement sous anesthésie générale ou locale en fonction des traitements et 4 injections/souris ou 1injection/souris en fonction des groupes. L'injection dure moins de 1 min.

Impact sur les animaux

Les injections de cellules tumorales et les traitements entraîneront un stress physique et transitoire (préhension) et une douleur et une contrainte légère et transitoire lors de l’injection du produit. Les injections se feront sous anesthésie locale ou générale en fonction du type d'injection. Les tumeurs peuvent entraîner une gène légère pour les souris recevant des traitements et une gêne modérée (douleur modérée, perte d'appétit potentielle) en fin de procédure si le traitement est inefficace. Une toxicité modérée du traitement pourrait être observée (fatigue accrue, douleurs).

Devenir

En fin de procédure, tous les animaux sont euthanasiés car ils seront tous porteurs de tumeurs et les organes seront utilisés pour faire des analyses sur tissus post-mortem.

Remplacement

Les modèles cellulaires alternatifs ne permettent pas d’appréhender le comportement tumoral dans toute sa complexité notamment dans le cadre d’injection d’immunothérapies qui font intervenir le système immunitaire et qui nécessitent un organisme vivant entier. L’utilisation des modèles appliqués in vivo reste indispensable. Cependant, le choix de la chimiothérapie qui va composer l'ADC a été basé sur des études in vitro réalisées sur des lignées cellulaires. Nous étudierons également la toxicité induite par l'ADC ce qui implique l'utilisation de modèles in vivo puisqu'il n'est pas possible d'évaluer la toxicité sur des modèles cellulaires in vitro.

Réduction

Afin de limiter le nombre d'animaux utilisés, d'après les données bibliographiques et nos connaissances sur ces types cellulaires, le taux de prise de ces lignées est estimé à 80%. Cette valeur pourra être affinée lors des premières étapes du projet, pour diminuer le nombre d'animaux utilisés. Compte tenu de la prise de greffe, des critères objectifs d'efficacité de traitement ont été définis. Concernant l'analyse des critères d'évaluation de l'efficacité anti-tumorale, une étude statistique préliminaire a permis d'établir le nombre d'animaux greffés.

Raffinement

Les souris sont greffées sous anesthésie générale. Les administrations intratumorales seront réalisées sous anesthésie générale et les injections intraveineuses sous anesthésie locale. Les animaux seront surveillés quotidiennement afin de détecter précocement le développement de la tumeur ou l'apparition de signes cliniques. Des points limites précis et précoces ont été définis et seront strictement respectés. Si des signes de douleur sont détectés, un analgésique adapté sera administré. Les animaux seront hébergés en groupe. Un enrichissement adapté sera présent dans toutes les cages. En cas de suspicion de mal-être, un enrichissement supplémentaire sera ajouté.

Choix des espèces

La souris est le modèle le plus utilisé en oncologie. Leur système immunitaire a été très largement caractérisé. L'utilisation d'une souche transgénique pour la protéine d'intérêt permettra de tester notre candidat médicament (composé de l’anticorps humain) sur lequel nous avons déjà fait des études in vitro et de réutiliser ces données dans le cadre d’études in vivo. Les animaux seront utilisés à l'âge adulte correspondant à un développement optimal du système immunitaire.

Deux incisions de six millimètres sont pratiquées dans la peau du dos de 164 souris pour déclencher la formation de neurofibromes, tandis que 196 puis 32 autres sont isolées quinze jours en cage individuelle, au sevrage ou à un an. L'effectif déclaré est pourtant de 188 souris, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue pour que leur peau soit disséquée. Le porteur annonce une douleur aiguë et une baisse d'activité après les incisions, malgré la lidocaïne appliquée au préalable, ainsi qu'un stress lié à l'isolement. Il conclut néanmoins que les tumeurs développées par ces souris n'entraînent "pas de phénotype dommageable", au motif qu'elles restent invisibles à l'œil nu, quand les mêmes tumeurs chez les patients humains provoquent, selon son propre texte, démangeaisons et douleurs.

Objectifs

La neurofibromatose de type I est une maladie génétique qui touche environ 1 personne sur 3000. Elle se caractérise par l'apparition de nombreuses tumeurs bénignes appelées neurofibromes cutanés, qui se développent au niveau des terminaisons nerveuses de peau. Ces tumeurs, dont le nombre peut atteindre des milliers peuvent causer des démangeaisons et des douleurs et ont un impact majeur sur la qualité de vie du patient. Les mécanismes responsables de leur développement sont mal connus, et il n'existe pas de traitement efficace pour prévenir ou stopper leur développement. A l’aide d’un modèle murin de la Neurofibromatose de type 1 nous avons récemment montré que (i) le trauma de peau induit le développement de neurofibromes cutanés, (ii) le développement des neurofibromes cutanés est transitoire et suit 3 phases : initiation, progression et stabilisation, chacune caractérisée par des changements cellulaires et moléculaires. En caractérisant ces différentes phases, nous avons identifié deux protéines comme potentielles cibles thérapeutiques pour traiter les neurofibromes cutanés en phase de progression (croissance) et en phase de progression (croissance) ou de stabilisation (stade mature), respectivement. Le but de la première partie de ce projet est ainsi d’explorer le rôle et potentiel thérapeutique de ces deux protéines dans le développement des neurofibromes cutanés. Pour cela nous utiliserons le modèle murin de la Neurofibromatose de type 1 développant des neurofibromes cutanés en combinaison avec des outils génétiques ou pharmacologiques. De plus, nous avons observé que dans la peau saine de souris mutantes de la Neurofibromatose de type 1 sans trauma et sans neurofibromes cutanés, la densité de cellules de Schwann (cellules à l'origine des neurofibromes cutanés) était plus importante que dans la peau saine d’animaux sains (contrôles). La deuxième partie de ce projet vise ainsi à caractériser plus en détail la peau saine des souris mutantes pour la neurofibromatose de type 1 et la comparer à celle de souris saines (contrôles).

Bénéfices attendus

Les mécanismes responsables du développement des neurofibromes cutanés sont mal connus, et il n'existe pas de traitement efficace pour prévenir ou stopper leur développement. Les rôles de deux protéines: la Ténascine-C et la Périostine dans leur développement n’ont jamais été explorés et constituent de nouvelles pistes mécanistiques et thérapeutiques. La peau saine d’individus atteints de la Neurofibromatose de type 1 n’a jamais été caractérisée en détails bien que ce soit une question importante puisque à ce jour, l’hétérogénéité en nombre, taille et localisation des neurofibromes cutanés observée chez les patients reste inexpliquée.

Procédures

Les animaux seront soumis à une procédure chirurgicale courte (de l’ordre de 10 min) correspondant à l'induction de deux petites lésions incisionnelles manuelles de 6 mm de longueur et moins de 1 mm de profondeur (l'incision est réalisée sur l'épaisseur totale de la peau de la souris qui est très fine, de l'ordre de moins d'1 mm). Cela concerne 164 animaux. Certains animaux seront isolés dans des cages individuelles dès le sevrage à 1 mois, pendant 15 jours avant d’être mis à mort, cela concerne 196 animaux. Finalement 32 animaux seront isolés dans des cages individuelles à partir de l'âge d'un an, pendant 15 jours avant d'être mis à mort.

Impact sur les animaux

Les neurofibromes cutanés développés par les souris mutantes NF1 sont des tumeurs qui restent superficielles et se développent en région dorsale à partir de 2 mois. Elles sont plates et peuvent atteindre un diamètre de quelques millimètres mais leur épaisseur demeure très fine (de l’ordre de 1 mm maximum), ce qui les rends non détectables à l’oeil nu sans utilisation d’une loupe à épifluorescence. Leur volume est donc négligeable par rapport à celui de la souris. Leur nombre peut être d’une quinzaine par souris. Aucun effet nuisible ou indésirable lié à l’absence de Ténascine-C ou à l’inhibition de Périostine n'est attendu en prenant en compte des travaux similaires récemment publiés. Des nuisances sont cependant à prévoir suite à l'induction de lésions manuelles (douleur aigüe, diminution des mouvements et de l’activité normale due à l’inconfort), bien que de la lidocaïne soit appliquée préalablement pour en atténuer les effets. Des nuisances liées au stress des manipulations, à la contention des souris, à l’anesthésie générale et aux gestes techniques d’injections sont également à prévoir. Enfin, lorsque les souris seront gardées seules dans des cages isolées, du stress est à prévoir.

Devenir

A la fin de chaque procédure tous les animaux seront mis à mort pour que leur peau puisse être disséquée et analysée.

Remplacement

Pour le Remplacement ; à notre connaissance, il n’existe aucun autre modèle animal, ni système in vitro, récapitulant le développement des neurofibromes cutanés et permettant d’évaluer le rôle de ces deux protéines dans ce processus. De plus, il n’existe pas d’inhibiteur pharmacologique pour inhiber l’activité de la Tenascine-C, il est donc nécessaire d’utiliser les animaux mutants pour inactiver la Ténascine-C de façon génétique et évaluer son rôle dans le développement des neurofibrmes cutanés. Enfin, l’hébergement des souris en isolation est le seul moyen de prévenir les morsures et donc les lésions de peau induisant le développement des neurofibromes cutanés.

Réduction

Pour la réduction du nombre d'animaux dans ces procédures expérimentales, nous nous sommes basés sur des expériences similaires déjà documentées dans la littérature. En effet, la connaissance approfondie du modèle de souris NF1, le traitement à la cilengitide, l'inactivation génétique de la Tenascin-C, ainsi que la réalisation de lésions cutanées nous permet d’utiliser des modèles maîtrisés. Cela évite les mises au point préalables, réduisant ainsi le nombre d'animaux nécessaires. De plus, en se basant sur une analyse statistique, le nombre d'animaux est optimisé pour garantir des résultats statistiquement significatifs avec le minimum d'animaux nécessaires. Cela inclut l'utilisation de techniques comme l'analyse de puissance pour déterminer le nombre d'animaux requis.

Raffinement

Pour le Raffinement ; de la lidocaïne sera appliquée sur la peau du dos des souris avant la réalisation des lésions afin de limiter la douleur liée à cette procédure. À la suite des lésions, l’état des souris sera évalué une fois par jour pendant une semaine puis deux fois par semaine pour le reste de la durée du suivi (1 mois). Lors de ces visites le poids, l’activité, d’éventuels signes d’inflammation au niveau des points d’injection, une éventuelle paralysie, l’état de stress et de douleur des souris (poils hérissés) seront évalués. En présence de tels signes persistants (plus de 24h), les souris seront mises à mort via une anesthésie générale par dislocation cervicale. Le personnel de l’animalerie nous informe également régulièrement (lors des changements de cages notamment) de l’état de santé des souris. Pendant toute la durée de l’expérimentation les animaux seront hébergés dans des cages contenant du coton ainsi que des maisons et rouleaux en carton. Contrairement aux patients atteints de la Neurofibromatose de type 1, les souris mutantes pour la Neurofibromatose de type 1 développent des neurofibromes cutanés dont la taille est limitée (les tumeurs ne sont pas visibles à l’oeil nu sans utilisation d’une loupe à épifluorescence) n’entrainant donc pas de phénotype dommageable. Au cours de l’anesthésie générale, pour éviter l’hypothermie, les souris seront maintenues sur un tapis chauffant. Leurs yeux seront également enduits d’un onguent ophtalmique dès la perte de conscience afin de prévenir un dessèchement de la cornée. Les souris gardées seules dans des cages isolées seront hébergées dans un environnement enrichi contenant du coton ainsi que des maisons et rouleaux en carton. Ces animaux sont également gardés dans des cages transparentes permettant le contact visuel avec les animaux des cages voisines. De plus, les expériences seront réalisées rapidement après isolation, ce qui limitera le temps passé en isolation.

Choix des espèces

Nous avons récemment concu un modèle de souris génétiquement modifiées qui récapitule fidèlement le développement des neurofibromes cutanés et qui sera utilisé dans ce projet. A notre connaissance, il n’existe aucun autre modèle animal, ni système in vitro, permettant d’étudier les NFc et le rôle de la Ténascine-C et de la Périostine dans leur développement, ou d'étudier la peau saine mutante NF1. Des animaux adultes âgés de 6 semaines seront utilisés pour qu'ils n'aient pas encore développé de neurofibromes cutanés. Des animaux adultes âgés de 1 an seront également utilisés afin qu'ils aient développé des neurofibromes cutanés matures.

180 souris femelles vont être utilisées pendant vingt-huit semaines, chacune soumise à un régime gras, 72 d'entre elles subissant en plus l'ablation des ovaires, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le protocole enchaîne échographies cardiaques et IRM sous anesthésie, cathétérisme invasif pour 150 souris, tests d'effort sur tapis de course, mesures de pression à la queue et 72 heures en cage métabolique individuelle, posées sur une grille destinée à recueillir les urines. Toutes sont tuées à l'âge de 37 semaines pour prélever leurs organes. Le bénéfice annoncé se limite à des données précliniques en faveur d'un médicament bloquant l'action de l'aldostérone.

Objectifs

Nos souhaitons déterminer, chez des souris femelles obèses et atteintes d’insuffisance cardiaque suite à l’administration pendant 12 semaines d’un régime riche en graisse, si la suppression définitive des ovaires (ovariectomie), mimant la ménopause, provoque une accélération de l’aggravation progressive de leur insuffisance cardiaque. En effet, la ménopause est responsable d’un effondrement des taux d’œstrogènes, susceptible d’aggraver les conséquences de l’obésité et de l’insuffisance cardiaque. De plus, nous déterminerons si un médicament permettant de bloquer les récepteurs (et donc l’action) d’une hormone nommée aldostérone, permet d’empêcher ou de freiner cette aggravation de l’insuffisance cardiaque. Nous étudierons donc la fonction cardiaque des souris (par échographie et cathétérisme), la fonction des artères coronaires qui perfusent le cœur (par IRM), et leur pression artérielle. Nous étudierons également le métabolisme des souris obèses (mesure du glucose dans le sang après ingestion d’un excès de glucose ou après administration d’insuline) et le risque d’insuffisance rénale (via des mesures dans les urines). Nous étudierons également la possible aggravation par l’ovariectomie et l’action espérée du médicament sur le confort de vie des animaux, en mesurant leur activité spontanée (mesure des déplacements libres), leur capacité d’exercice (sur tapis de course) et leur anxiété (comportement lors de l’exploration d’un espace inconnu). Enfin, des analyses post-mortem du remodelage du cœur et des vaisseaux, et des mesures de l’expression cardiaque de nombreux gènes et protéines impliquées dans la maladie et/ou cibles de l’action du médicament, seront réalisées pour compléter et apporter des explications aux études réalisées chez les souris.

Bénéfices attendus

Acquisition de données précliniques en faveur d'un traitement pharmacologique par ARM pour améliorer l'Insuffisance cardiaque à fraction d'éjection préservé chez femelles en conditions ou non de post-ménopause et atteintes d'un Syndrome métabolique et, en particulier l'amélioration de paramètres fonctionnels cardiaques, vasuclaires et possiblement métaboliques. Une insuffisance cardiaque correspond à l’incapacité du cœur à répondre aux besoins de perfusion sanguine pour les différentes fonctions d’organes. La fraction d’éjection est la quantité de sang éjectée à chaque battement cardiaque par rapport au volume de remplissage du cœur (en particulier pour le ventricule gauche qui éjecte le sang oxygéné pour tout l’organisme sauf les poumons). Quand la fraction d’éjection est préservée à l’état de base, les malades en activité basale ne se rendent pas compte de leur maladie, qui ne se révèle, par une douleur et un essoufflement, que lors d’un exercice intense, d’une période de grosse fatigue ou d’un stress aigüe (la fraction d’éjection se réduisant dans ces conditions).

Procédures

Des souris femelles de 9 semaines seront placées sous régime gras induisant une obésité (durée du protocole : 28 semaines). Un groupe de souris contrôles sera maintenu sous régime standard. Après 16 semaines de régime gras, les souris seront ou non ovariectomisées, puis mises ou non sous traitement pharmacologique pendant 12 semaines pour limiter la progression de l’Insuffisance cardiaque liée à l’obésité. Les souris seront suivies par échocardiographie sous anesthésie au gaz. Les mesures seront réalisées après 16 semaines de régime gras puis 6 semaines après ovariectomie et après 12 semaines de traitement. Les animaux subiront différentes techniques : chirurgie ovariectomie chez l'animal anesthésié durée 20 minutes/animal (Nombre : 72 souris) , Échographie cardiaque chez l'animal anesthésié durée 30 minutes/ animal ( Nombre : 180 souris), Test de glucose tolérance par prélèvement sanguin sur les animaux vigiles durée 5 minutes/animal (Nombre: 90 souris), IRM chez l'animal anesthésié durée 30 minutes/animal (Nombre : 30 souris), Hémodynamique invasive (évaluation de la fonction systolique et diastolique) chez animal anesthésié durée de 30 minutes/animal (Nombre: 150 souris ), Pléthysmographie (pression a la queue) sur animaux vigile durée 20 minutes / animal (Nombre : 90 souris), test a l'effort sur animaux vigile durée 30 minutes/animal (Nombre: 90 souris), activité spontané chez animaux vigile durée 72 heure (Nombre: 90 souris) (Une fois) , Openfield (test expérimental utilisé pour évaluer les niveaux généraux d'activité locomotrice , l'anxiété et la volonté d'explorer) animaux vigile durée 15 minutes / animal (Nombre : 90 souris) et cage metabolique (Récuperation dans feces et urines) animaux vigile sur une durée de 12 heures (Nombre : 60 souris). Toutes les interventions serons réalisé une seule fois chez chaque animal.

Impact sur les animaux

Douleur post-opératoire après l’ovariectomie. Tapis de course le teste a l'effort peut entraine un stress. Mais aussi Stress lié à la contention lors de la mesure de la pression artérielle. Stress et inconfort liés à la mise en cage à métabolisme individuelle pendant une nuit (12h00), les souris étant posées sur une grille permettant de collecter les urines au travers. Inconfort ou douleur lors des phases de réveil après anesthésie générale. Ces anesthésies générales suivies d’une phase de réveil concernent les opérations d’ovariectomie, échographie cardiaque et les examens par IRM.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort afin de prélever différents organes qui seront analysés par différentes approches

Remplacement

Les expériences réalisées in vivo ne peuvent être remplacées par des études in vitro en raison de la complexité de la pathologie d'Insuffisance cardiaque à fraction d'éjection nécessitant des analyses fonctionnelles et physiopathologiques complexes, en particulier dans le contexte intégratif de comorbidités telles qu’un diabète de type 2, une dysfonction endothéliale, une dysfonction du tissu adipeux, le risque d’une insuffisance rénale ou hépatique, et en présence de remodelages tissulaires et d’une inflammation chronique. Dès lors, l'utilisation d'animaux ne saurait à ce jour être remplacée par des méthodes alternatives aboutissant à laprécision requise quant à la qualité et à la précision attendues des mesures expérimentales, et quant à l'hypothèse d'une amélioration de la santé des animaux placés sous traitement pharmacologique .

Réduction

L'ensemble du protocole a été conçu pour minimiser le nombre d'animaux, en tenant compte de l’exigence et des contraintes des tests statistiques utilisés. Notre habitude des actes expérimentaux envisagés nous permet de connaître le nombre d’animaux requis pour atteindre la puissance statistique nécessaire à mettre en évidence une différence entre les groupes. Le nombre d'animaux demandé pour tout le protocole (deux séries de souris avec n=90 souris incluant 5 groupes avec n=18/groupe) correspond également à une volonté de ne pas soumettre les animaux à une fréquence trop élevée d'actes expérimentaux qui génèrerait un excès de stress expérimental et un risque accru de souffrance.

Raffinement

Pour s'assurer de bonnes conditions de vie des souris, une observation rigoureuse est indispensable. Les souris sont hébergées dans une animalerie conventionnelle à 5 souris/cage, en portoirs ventilés avec accès ad-libitum à la nourriture et à l’eau de boisson, plus un enrichissement du milieu (plaque de cellulose, tunnel cartonné). Pour le maintien des conditions d'hygiène, le change est réalisé une fois par semaine. Un suivi des animaux est réalisé quotidiennement par les soigneurs et au moins de manière hebdomadaire par le responsable du protocole et/ou ses collaborateurs, pour déceler le moindre signe de souffrance. Le protocole est initié une semaine après l’arrivée des animaux à l’animalerie pour respecter un temps d’adaptation suite au transport. La procédure de réveil, dans un espace dédié, répond aux mêmes exigences, sous observation de l'expérimentateur pour pouvoir procéder à une analgésie en cas d'observation de signes de souffrance. Les conditions de soin sont destinées réduire autant que possible la douleur ou l’angoisse que pourraient ressentir les animaux. Pour les procédures réalisées avec des souris vigiles, des phases d'habituation progressive au dispositif expérimental sans mesure sont réalisées afin de minimiser le stress des animaux. Les point limite sont mise en place our évalué la douleur de l'animal et cette grille de score sera appliqué a chaque animal.

Choix des espèces

Le choix de l’espèce animale (souris ) se justifie par une longue expérience du laboratoire concernant les modèles d’insuffisance cardiaque chez la souris, notamment l’l'Insuffisance cardiaque à fraction d'éjection après administration d’un régime riche en graisse. De plus, nous disposons d’une animalerie moderne avec des portoirs ventilés facilitant l’hébergement et favorisant le confort et la sécurité sanitaire des souris. Enfin, nous disposons d’une excellente expérience des évaluations fonctionnelles et structurelles cardiaques et vasculaires, in vivo et ex vivo, chez la souris. Les souris utilisées seront des souris matures âgées de 9 semaines au moment de l'inclusion dans le protocole et âgées de 37 semaines au moment de la mise à mort. La durée du protocole implique 16 semaines sous régime alimentaire pour obtenir une Insuffisance cardiaque à fraction d'éjection , préalablement à l'ovariectomie et à l'observation de ses potentiels effets agravants, qui seront suivis au cours des 12 semaines suivant la chirurgie, de même que seront observés au cours de cette période les effets préventifs espérés d'un traitement.