Procédures modérées
Étude préclinique des anticorps anti-PD1 sur les lymphomes T
- Recherche fondamentale
- Oncologie
1 079 souris immunodéficientes vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. Greffées avec des cellules tumorales prélevées sur des patients atteints d'un lymphome cutané, elles subissent une prise de sang par semaine sous anesthésie jusqu'à leur mort, une injection de cellules immunitaires humaines, puis un anticorps anti-PD1 chaque semaine pendant un mois. La mise à mort intervient quand la tumeur atteint le volume maximal toléré, ou six semaines après le traitement si la tumeur ne se développe pas. Le porteur écrit que la croissance tumorale "ne semble pas induire de souffrance pour l'animal" jusqu'à cette limite.
Objectifs
Les lymphomes T périphériques représentent un large groupe d’hémopathies malignes issus de lymphocytes mature T. Nous nous intéressons particulièrement au syndrome de Sézary, un lymphome T lymphome cutané rare, caractérisé par une prolifération maligne des lymphocytes T dans la peau. Il représente environ 3 % des lymphomes cutanés des cellules T. Cependant, le pronostic est généralement défavorable, avec un taux de survie moyen de 2 à 4 ans après le diagnostic. Des tests préliminaires in vitro ont démontré que des anticorps anti-PD1 sont capables de recruter les cellules immunitaires pour induire la mort des cellules tumorales. Cette preuve de concept in vitro nous a permis de conclure que l’anticorps anti-PD1 permet de détruire les cellules tumorales par un recrutement des cellules immunitaires. Pour passer en phase préclinique, nous devons tester cet anticorps anti-PD1 sur des souris. Nous utilisons un modèle de souris immunodéficientes, sans système immunitaires pour permettre la prise des greffes de tumeurs. Ensuite, nous allons injecter l’anticorps anti-PD1 et des cellules immunitaires humaines. Ce duo nous permettra de tuer les cellules immunitaires. Ce projet permettra de montrer l’efficacité de ce nouveau traitement contre les lymphomes T exprimant la cible PD1 et d’ainsi obtenir un traitement possible contre les lymphomes T.
Bénéfices attendus
Le projet vise à proposer des immunothérapies innovantes pour les lymphomes à cellules T dont le syndrome de Sézary. Les lymphomes à cellules T sont des maladies rares avec peu de traitements efficaces sur le marché. Ce projet nous permettra de démontrer la preuve de concept des anticorps thérapeutiques anti-PD1 sur un modèle de souris patient-derived-xenograft (PDX). Si les résultats sont concluants, et en association avec les résultats de toxicologie, ce projet pourra conduire à un essai de phase I chez l’Homme.
Procédures
Pour visualiser l’effet des traitements sur les cellules tumorales, nous ferons des prises de sang toutes les semaines sur des souris anesthésiées (conformément aux recommandations) pour réduire leur souffrance. Les souris auront des prélevments de sang jusqu'à la mort de la souris une fois par semaine. De plus, les souris subiront une injection de cellules immunitaires au dès qu'elles auront des cellules tumorales dans le sang. Elles seront alors traitées une fois par semaine par injection intraveineuse d'anti PD1 pendant 1 mois sur souris endormie. Ainsi une fois par semaine, pendant la phase traitement (1mois) , les souris seront anesthésiées et auront un prélevement de sang et un traitement anti-PD1 par semaine.
Impact sur les animaux
Nous allons injecter des cellules tumorales et des cellules immunitaires en intrapéritoénale sur des souris endormies ce qui provoquera une douleur légère aux souris. 2 semaines après l'injection, nous allons leur prélever du sang quand les souris seront endormies. Cela leur provoquera une douleur modérée. Nous mettrons à mort les souris sous anesthésie.
Devenir
Pour l'ensemble de ces procédures, les souris seront mises à mort quand le volume tumoral attendra le maximum tolérable. À noter, ces modèles de lymphome sont largement documentés et la croissance tumorale ne semble pas induire de souffrance pour l'animal jusqu'à cette limite. En cas de non-développement ou de régression de la tumeur, les souris seront conservées pour une durée de 6 semaines après traitement (durée la plus couramment publiée) puis mis à mort pour analyse.
Remplacement
Il a été démontré en culture cellulaire, que l’anticorps anti-PD1 pouvaient induire la mort de cellules tumorales en recrutant les cellules immunitaires. Nous devons donc maintenant tester cet anticorps dans notre modèle PDX in vivo. Cela nous permettra de confirmer l’intérêt thérapeutique de cet anticorps et sa capacité à induire une forte régression tumorale. Si les résultats sont concluants, et en association avec les résultats de toxicologie, ce projet pourra conduire à un essai de phase I chez l’Homme.
Réduction
Pour limiter le nombre de souris utilisées, des tests préliminaires in vitro ont été fait pour démontrer l’effet de l’anticorps anti-PD1. Pour déterminer le nombre de souris nécessaires, nous avons utilisé des calculs statistiques ce qui nous a permis de déterminer le nombre de souris par groupe par traitement. Ainsi, nous avons besoin d'au moins 11 souris par groupe pour garantir la validité des tests. De plus, nous voudrions tester cet anticorps anti-PD1 sur 7 modèles de PDX pour voir l’efficacité de ce traitement sur différents profils mutationnels de lymphome T.
Raffinement
Afin de limiter la souffrance et la douleur des animaux, des points limites précis ont été définis (volume maximum de la tumeur , perte de poids...). Aussi, lors des phases d'implantation des PDX, les souris seront anesthésiées. Nous mettons en place des conditions d'hébergement optimales et des stratégies de raffinement rigoureuses pour améliorer le bien-être des souris. Les cages sont spacieuses et équipées de litières absorbantes et non toxiques, renouvelées régulièrement pour assurer un environnement propre. Nous fournissons également des enrichissements environnementaux, tels que des tunnels, des matériaux de nidification, pour favoriser les comportements naturels et réduire le stress. Les souris sont maintenues à une température et une humidité contrôlée, avec un cycle lumière/obscurité approprié pour respecter leur rythme circadien. De plus, nous effectuons des évaluations régulières de la santé et du comportement des animaux, et ajustons les conditions d'hébergement en fonction des besoins spécifiques identifiés. Ces pratiques de raffinement sont essentielles pour garantir le bien-être des souris tout en obtenant des résultats expérimentaux fiables et reproductibles.
Choix des espèces
Nous utilisons des souris pour vérifier l’efficacité des traitements et obtenir des données pharmacocinétiques. Cela permet de voir si les traitements vont diminuer la taille des cellules tumorales. Toutes les études préliminaires ont été mises en place sur des cellules de patients ou des lignées cellulaires. Les souris sont génétiquement modifiées pour être partiellement ou totalement immunodéficientes ce qui permet de greffer de tumeurs humaines, y compris les lymphomes T humains et d'éviter les réactions de rejet de greffes. Nous allons sélectionner des jeunes adultes de 6 à 10 semaines. Ces souris ont fini leur croissance et refléteront au mieux la physiopathologie du lymphome cutané à cellules T dont les tumeurs surviennent principalement chez l'adulte. La standardisation de l'âge permettra une meilleure reproductibilité expérimentale.
Identification des composés sémiochimiques (odeurs) et des voies neuronales impliqués dans les régulations sociales de la fonction de reproduction chez la brebis – Partie 02
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
- Système endocrinien
Deux anesthésies générales, deux intubations, une endoscopie de vingt minutes, une heure d'imagerie et huit prélèvements sanguins : 60 brebis sont soumises à cet enchaînement, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Les 60 béliers subissent six prélèvements sanguins d'un niveau de souffrance léger et retournent ensuite dans leur troupeau, tandis que les brebis sont tuées pour des analyses de biologie moléculaire. L'objectif est d'identifier les odeurs par lesquelles un bélier rendu sexuellement actif déclenche la reproduction des femelles hors saison, pour remplacer les traitements hormonaux utilisés en élevage depuis les années 1970. Le porteur présente cette voie comme "plus responsable" et "plus éthique", la finalité restant de lisser sur l'année la production de lait et de viande.
Objectifs
Chez les petits ruminants, la saisonnalité de la reproduction conduit à des variations annuelle de la disponibilité et du prix des produits (lait et viande) sur le marché. La maîtrise de la saisonnalité de la reproduction chez ces animaux est donc un enjeu majeur pour les éleveurs. Depuis les années 1970, les traitements hormonaux sont utilisés pour désaisonner la reproduction et ils restent le seul moyen efficace pour contrôler la reproduction à ce jour. L’utilisation d’hormones dans les élevages est cependant un sujet de préoccupation majeur et un enjeu de santé publique. Dans ce projet nous proposons d’approfondir la compréhension d’un processus biologique naturel qui pourrait apporter une solution aux traitements actuels : l’effet mâle (EM). En effet, chez les ovins, un mâle rendu sexuellement actif via un traitement photopériodique va, via l’émission de molécules odorantes être capable de désaisonner les femelles qui interagissent avec lui. Dans ce projet nous proposons d’identifier les molécules à l’origine de l’EM mais également de mieux comprendre comment le cerveau des femelles intègrent ces signaux pour développer de nouvellesapproches agroécologiques, bassée surl'olfaction qui pourraient être plus responsables et plus éthiques. Ce projet sera réalisé dans deux unités expérimentales différentes.
Bénéfices attendus
Le présent projet vise à étudier les mécanismes biologiques de l'effet Male avec pour but ultime de remplacer les traitements pharmacologiques hormonaux dans les exploitations. Une meilleure compréhension des mécanismes de contrôle de la reproduction chez les ovins est néanmoins indispensable pour tenir cet objectif de remplacement.
Procédures
Six prélèvements sanguins seront réalisés sur les mâles inclus dans cette étude dans EU1. Huit prélèvements sanguins, deux anesthésies générale 2 intubations, une endoscopie et séances d'imagerie seront réalisées sur les femelles inclues dans cette étude dans l'UE2. Les prélèvements sanguins durent quelques secondes et seront suivis d'une récompense. Les anesthésies générales et les intubations durent moins de 1h30. L'endoscopie dure 20 minutes environ et les séances d'imagerie durent environ 1heure.
Impact sur les animaux
Les différentes injections nécessaires pour l'anesthésie générale nécessite une contention légère qui peut induire un stress minime. Les différentes étapes de transport peuvent également engendrer un stress minime pour les animaux. La procédure d'endoscopie peut générée une douleur légère durant quelques heures. La procédure de prélévement sanguin nécessite une contention qui peut induire un stress léger.
Devenir
Les mâles seront réintroduits dans le troupeau d'origine de l'unité expérimentale. Les femelles seront euthanasiées pour les besoins d'étude en biologie moléculaires afin d'affiner notre compréhension du mécanisme.
Remplacement
L'effet mâle est une pratique utilisée en élevage pour induire l'activation de la fonction de reproduction en dehors de la saison sexuelle chez les animaux d'élevages. L'étude de l'effet mâle et des processus neurologiques mis en jeu nécessitent, de fait, l'utilisation d'animaux vivants et ne peux être substitué par une approche alternative. Le modèle choisi est le modèle de référence pour étudier effet. Les résultats acquis par le présent projet viendront donc s'ajouter à la masse de connaissances sur le sujet afin de nourrir la compréhension de ce processus physiologique.
Réduction
Notre protocole expérimental a été mis en place de sorte à réduire au maximum le nombre d'animaux utilisés et la moitié seront réintroduit au sein du troupeau de l'EU2. S'agissant d'exposition des femelles exposées aux mâles actifs avec une finalité d'analyse en biologie moléculaire, les animaux seront euthanasiés. Pour les besoins de l'analyse statistique, en se basant sur la variabilité intrinsèque des méthodes de quantifications utilisées dans ce projet, 15 animaux par groupe seront nécessaires à l'étude.
Raffinement
Nous raffinerons chaque procédure dans le but de réduire au maximum l'inconfort, la douleur ou l'angoisse subie par les animaux. Les animaux seront hébergés en groupes lors des procédures afin de réduire le stress au maximum. Aussi, la priorité sera mise sur l'habituation des animaux au maniements et aux différents déplacements nécessaires à l'étude (déplacement pour rejoindre les enclos, déplacement entre les unités expérimentales pour les besoins de l'imagerie). Les habituations seront menées par une mise en contact quotidienne des animaux avec le matériel de transport (petite remorque spécifique pour le transport d'animaux utilisée par le personnel animalier), les animaux seront déplacés à minima par deux, pour éviter la sensation d'isolement pour réduire le stress au maximum et d'obtenir des résultats de qualité. Le comportement (notamment l'isolement du groupe, grincement des dents), l'état clinique des brebis et la prise alimentaire des animaux seront surveillés tout au long de l'expérimentation. Ce suivi permettra d'évaluer le bien-être des animaux et de décider de la prise en charge adéquate avec l'appui d'un avis vétérinaire.
Choix des espèces
L'effet mâle est une pratique qui est utilisée en élevage pour induire l'activation de la fonction de reproduction en dehors de la saison sexuelle chez les animaux d'élevage. L'étude de l'effet mâle et des processus neurologiques mis en jeux nécessite, de fait, l'utilisation d'animaux vivants et ne peux être substitué par une approche alternative. Le modèle choisi ici, est celui pour lequel cet effet a été le plus caractérisé. Les résultats acquis par le présent projet viendront donc s'ajouter à la masse de connaissances sur le sujet afin de nourrir la compréhension du phénomène physiologique. L'étude nécessite des animaux ayant une fonction de reproduction mature, donc des animaux ayant passé le stade de la puberté.Ainsi les animaux utilisés seront adultes.
Evaluation par imagerie de l’état de la barrière sang-cerveau après traitement par un anticorps chez la souris
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
- Système nerveux
Issues d'un élevage de souris génétiquement modifiées dont la totalité des naissances est utilisée, y compris celles qui ne portent pas la mutation et deviennent des témoins, 144 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, 12 d'entre elles étant anesthésiées puis tuées sans réveil. Elles subissent une biopsie de la queue pour génotypage, jusqu'à cinq injections intrapéritonéales, jusqu'à trois injections intraveineuses et deux séances d'anesthésie gazeuse d'une heure. L'objet est de suivre par imagerie l'ouverture puis la refermeture de la barrière sang-cerveau provoquée par un anticorps. Le porteur affirme que la complexité de cette barrière ne peut pas être répliquée in vitro, sans dire ce qui a été tenté.
Objectifs
Le cerveau est un organe sensible aux contaminants chimiques ou biologiques éventuellement transportés par le sang. Afin de le protéger, les vaisseaux sanguins du cerveau sont plus imperméables que ceux du reste du corps et leur paroi forme une véritable barrière. D'un autre côté cette barrière représente un véritable obstacle à l'utilisation de médicaments pour traiter les maladies se développant dans le cerveau, comme les maladies neurodégénératives ou les cancers du cerveau. Certaines stratégies thérapeutiques, bien qu'efficaces pour les organes périphériques, échouent pour les maladies du cerveau car les médicaments ne peuvent atteindre leur cible intracérébrale. L'ouverture de la barrière sang-cerveau de manière ciblée, contrôlée et temporaire, pourrait ouvrir des perspectives énormes pour des maladies jusqu'ici incurables. Un anticorps thérapeutique a été développé récemment le permettant. Son développement nécessite cependant des méthodes précliniques pouvant être utilsées dans le futur chez les patients de manière à suivre précisément l'ouverture et la bonne refermeture de cette barrière. L'imagerie médicale non invasive permet ce suivi. Le but de ce projet est l’étude par imagerie médicale chez la souris de l’ouverture de la barrière sang-cerveau induite par un anticorps thérapeutique.
Bénéfices attendus
De nombreuses stratégies thérapeutiques efficaces sur cellules ex vivo ou in vivo sur les organes périphériques sont impossibles pour le traitement de maladies cérébrales, telle que alzeihmer ou les cancer du cerveau à cause de la barrière sang-cerveau. Les résultats obtenus au cours de ce projet permettront de mieux comprendre le fonctionnement de cette barrière, valideront la stratégie permettant de l'ouvrir temporairement et de façon contrôlée et permettrons la mise au point d'une méthode d'imagerie médicale pouvant être, en cas de succès, utilisée en clinique. Ce projet et ces études sur la barrière sang-cerveau pourront permettre à plus long terme de comprendre comment soigner des maladies cérébrales jusqu'ici incurables.
Procédures
Un premier groupe de souris subira : Anesthésie gazeuse (maximum 1h) 1X par animal, Injection intraveineuse anesthésié (
Impact sur les animaux
Au cours des injections, les animaux peuvent ressentir du stress et de l’inconfort à cause de la manipulation, ainsi qu'une douleur légère et de courte durée lors des injections. Un stress léger et de courte durée peut également être généré lors des examens d'imagerie médicale qui nécessitent manipulation et anesthésie. Les biopsies caudales pour génotypage, c'est à dire identification des animaux porteurs d'une mutation nécessaire à cette étude, entraînent une nuisance légère et de courte durée.
Devenir
Les souris seront mises à mort à la fin des procédures pour analyses post-mortem.
Remplacement
La complexité de la barrière sang-cerveau et les effets globaux que son ouverture entraine ne peuvent pas être totalement répliqués in vitro. De plus, la procédure d'ouverture de la barrière sang-cerveau et les méthodes d'imagerie non invasive testées dans ce projet sont des méthodes thérapeutiques et d'imagerie médicale qui ont vocation à être appliquées ensuite chez l'homme. Ce projet ne peut donc pas être réalisé in vitro.
Réduction
Les effectifs ont été determinés et les resultats seront analysés à l'aide de tests statistiques adaptés. Le nombre d’animaux sera réduit au minimum, mais sera suffisant pour conclure de manière robuste au succès ou non de notre étude. En ce qui concerne les animaux transgéniques élevés, nous utiliserons tous les animaux de l'élevage car les souris ne portant pas la mutation d’intérêt seront utilisées comme contrôles négatifs.
Raffinement
Pour le génotypage, c’est-à-dire l’identification, des souris génétiquement altérées modèles, nous utilisons une méthode éprouvée, précise, rapide et standardisée qui limite les effets indésirables, le stress et la douleur. Les méthodes d'imagerie que utilisées dans ce projet sont non invasives et non douloureuses. Elles nécessitent l'anesthésie des animaux afin qu'ils restent immobiles pendant l'examen. Durant les anesthésies, les souris seront chauffées, leur rythme respiratoire surveillé et du gel oculaire leur sera appliqué pour éviter le déssèchement des yeux. Afin de prévenir au maximum la souffrance et le stress infligés aux animaux, des points limites ont été établis dans les différentes procédures, entraînant la mise à mort anticipée de l’animal si nécessaire. Le bien-être animal passera également par de bonnes conditions d'hébergement selon la réglementation en vigueur avec un enrichissement du milieu.
Choix des espèces
Cette étude de l'ouverture de la barrière sang-cerveau par imagerie médicale non invasive a pour but d'améliorer l'administration de médicament au cerveau. Cette barrière est contrôlée par les mêmes protéines chez l'homme et la souris. Par ailleurs il existe chez la souris des lignées transgéniques avec des mutations impliquées dans le contrôle de la barrière sang-cerveau permettant de mieux comprendre ce phénomène. Les souris transgéniques seront identifiées à 3 semaines. Pour les procédures expérimentales, des souris adultes seront utilisées.
Rôle des protéines de la membrane basale et des récepteurs transmembranaires dans le développement et la maturation de l’intestin
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système gastrointestinal
- Système musculosquelettique
- Système nerveux
Des souriceaux reçoivent jusqu'à dix administrations par gavage ou par piqûre au cours de leurs quatre premières semaines de vie, avant d'être tués à des âges échelonnés de deux à vingt-huit jours. 3 155 souris vont être utilisées, 2 995 dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré et 160 d'un niveau sévère. Le porteur qualifie chacun des produits administrés de "non toxique et non irritant" et ramène la nuisance à "une gêne d'une courte durée", tout en attendant diarrhées, déshydratation et variations de poids. Une partie des animaux appartient à une lignée qui développe une dystrophie musculaire congénitale et perd l'usage des pattes arrière, et toutes sont tuées pour analyses post-mortem.
Objectifs
L’intestin est composé de plusieurs couches : l’épithélium, la membrane basale et le tissu conjonctif. L'épithélium est une barrière qui protège l'organisme de l'environnement hostile qui se trouve à l’intérieur de l’intestin. Il empêche le passage des toxines, des agents pathogènes et des déchets, tout en permettant l'absorption des nutriments et des ions. Pour maintenir l'intégrité de l’organe, l'ensemble de l'épithélium est remplacé en une semaine (ce qui en fait l’organe le plus régénératif du corps). L'épithélium recouvre des protubérances en forme de doigts qui s'étendent à l’intérieur de l’intestin (appelées villosités) et des invaginations qui descendent dans le tissu conjonctif (appelées cryptes). Si la formation initiale de l'intestin est un processus embryonnaire (avant la naissance), les principaux changements morphologiques, tels que l'invagination des cryptes ou le début de la migration cellulaire, ne se produisent qu'au cours de la période postnatale (après la naissance), de même que la maturation des cellules épithéliales, qui est cruciale pour la capacité à digérer des aliments solides après le sevrage. Tout au long de leur vie, les cellules épithéliales restent attachées à la membrane basale (BM) par l'intermédiaire de récepteurs spéciaux (intégrines). Celle-ci est composée principalement de protéines qui s'auto-assemblent pour former une structure en forme de feuille. La BM fournit un soutien structurel à l'épithélium, favorise l'attachement des cellules et maintient leur orientation. Cependant, la composition des protéines de la BM n'est pas uniforme et change au cours de la vie et également lors de la survenue de maladies. Le rôle joué par la composition de la BM dans le comportement et la maturation des cellules épithéliales reste inexploré. Dans ce projet, nous visons à évaluer comment certaines des protéines qui composent la membrane basale, et les récepteurs que les cellules utilisent pour se fixer à celle-ci, influencent le comportement et la maturation des cellules au cours du développement.
Bénéfices attendus
Différentes pathologies sont possibles lorsque l'homéostasie intestinale n'est pas maintenue. Il s'agit notamment de problèmes digestifs, de maladies inflammatoires de l'intestin et de cancers. L'implication de la membrane basale dans ces pathologies n'a pas été étudiée. Comprendre le rôle de la membrane basale dans le maintien de l'homéostasie peut apporter un éclairage nouveau sur des pathologies connues. Bien que ce projet relève de la "recherche fondamentale", la compréhension du rôle régulateur de la membrane basale en général peut offrir de nouvelles pistes pour la recherche de pathologies dans l'intestin et, par conséquent, pour la découverte de nouvelles voies de traitement.
Procédures
Une première cohorte d’animaux sera divisée en 5 groupes à des stades précoces du développement : - Un premier groupe auquel on administrera jusqu’à 7 fois au cours de l’expérience avec 3 produits non toxiques et non irritants différents puis les animaux seront mis à mort à 4 temps différents - Un deuxième groupe auquel on administrera jusqu’à 10 fois au cours de l’expérience avec 4 produits non toxiques et non irritants différents puis les animaux seront mis à mort à 1 temps précis - Un troisième groupe auquel on administrera jusqu’à 5 fois au cours de l’expérience avec 2 produits non toxiques et non irritants puis les animaux seront mis à mort à 1 temps précis - Un quatrième groupe auquel on administrera jusqu’à 5 fois au cours de l’expérience avec 1 produit non toxique et non irritant puis les animaux seront mis à mort à 1 temps précis - Un cinquième groupe auquel on administrera jusqu’à 5 fois au cours de l’expérience avec 1 produit non toxique et non irritant puis les animaux seront mis à mort à 1 temps précis Une seconde cohorte d’animaux sera divisée en 4 groupes à des stades avancés du développement : - Un premier groupe auquel on administrera jusqu’à 7 fois au cours de l’expérience avec 3 produits non toxiques et non irritants puis les animaux seront mis à mort à 8 temps différents - Un deuxième groupe auquel on administrera jusqu’à 10 fois au cours de l’expérience avec 4 produits non toxiques et non irritants différents puis les animaux seront mis à mort à 2 temps différents - Un troisième groupe auquel on administrera jusqu’à 5 fois au cours de l’expérience avec 1 produit non toxique et non irritant puis les animaux seront mis à mort à 1 temps précis - Un quatrième groupe auquel on administrera jusqu’à 5 fois au cours de l’expérience avec 1 produit non toxique et non irritant puis les animaux seront mis à mort à 1 temps précis
Impact sur les animaux
Dans ce projet, nous utiliserons plusieurs modèles de souris dont la lignée Lama2-dyw (perte de la protéine Lama2 dans la membrane basale). Un modèle inductible qui limiterait la mutation au système gastro-intestinal n’existe pas actuellement. Les animaux Lama2-dyw développent une dystrophie musculaire congénitale lors des premières semaines après la naissance. L’espérance de vie pour ce modèle est de 8 à 14 semaines, ici nous l’utiliserons seulement jusqu’à 4 semaines maximum. Jusqu’à cet âge, les animaux sont attendus plus petits que les animaux témoins (qui ne développent pas la maladie) mais ne subissent aucune perte de poids. Ils peuvent montrer des difficultés à se mouvoir dû à une faiblesse musculaire au niveau des membres postérieurs. Lorsque c’est possible, nous utiliserons un modèle de souris inductible où la mutation peut être limitée au système gastro-intestinal. Dans ce cas là, les animaux vont recevoir différents traitements (produits non toxiques et non irritants) par gavage orale ou par une piqûre. Les nuisances attendues sont donc une gêne d’une courte durée au point d’injection ou dans la gorge. Suite à l'administration de ces produits, nous nous attendons à observer des changements dans l’intestin et l’épithélium intestinal des souris. Ces changements pourraient entraîner une perte ou un gain de poids, une diarrhée et une déshydratation ou une constipation.
Devenir
Les animaux sont mis à mort pour des analyses post-mortem.
Remplacement
L’intestin est un système physiologique complexe impliquant de nombreux composants : bactéries, sang, lymphe, neurones, muscles, tissu conjonctif, membrane basale et différents types de cellules. L’objectif principal de ce projet étant d’identifier la régulation de la membrane basale (BM) sur l’homéostasie et le développement de l’intestin, la réduction au système in vitro seulement pourrait nous empêcher d’identifier les effets régulateurs sur les différentes parties qui composent l’intestin. L’objectif du projet est d’identifier le rôle des protéines dans la régulation de la BM et de déterminer comment la BM est impliquée dans les problèmes digestifs (maladie ou cancer). Cependant, le rôle de la BM dans l’intestin pourrait être secondaire à son effet sur le système musculaire ou sur le système neuronal. Nous aurions besoin d’un modèle murin pour identifier les différents composants affectés par l’absence de protéines, et comment ces autres systèmes affectent le petit intestin. Nous utiliserons des organoïdes et des explants de tissus en supplément, mais ils ne peuvent pas répondre à toutes nos questions de recherche car il n’existe aucun moyen de reproduire la membrane basale (sa composition et sa structure) in vitro, mais seulement certains de ses composants de base (en fonction de notre protéine d’intérêt elle est ou non présentes dans la culture in vitro). Pour l’utilisation des organoïdes, nous produirons un stock d’organoïdes provenant des mêmes souris d’intérêts et contrôles pour les études de fonctionnalisation in vitro. Ces organoïdes peuvent être étendus, presque indéfiniment, pour diminuer le nombre d’animaux.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés est ajusté au plus bas mais compatible avec l’obtention de résultats statistiquement fiables. Tous les animaux, quel que soit leur génotype et leur sexe seront utilisés, ce qui permet d’avoir à la fois des animaux contrôles et des animaux d’intérêts. Pour réduire la variabilité de l’échantillon, nous utiliserons autant que possible des compagnons de portée aux caractéristiques similaires. Les croisements de souris seront optimisés pour produire le plus grand nombre d’animaux de tous les génotypes d’intérêts. Plusieurs types d’analyses seront effectués sur la même souris. Cela permettra de réduire le nombre de souris nécessaires pour ces procédures. Des outils statistiques seront utilisés pour déterminer le nombre minimal de souris nécessaires pour chaque expérience, afin de produire des résultats statistiquement significatifs.
Raffinement
Les femelles gestantes seront séparées 2 à 3 jours avant la mise à bas pour le bon déroulement de la procédure Pour réduire et limiter le stress, aucun changement de cage ne sera effectué pendant la première semaine suivant la naissance. De plus, la mère sera manipulée avant les jeunes, afin d’incorporer son odeur sur les gants, pour éviter tout risque d’abandon de la part de la mère. La bonne manipulation des jeunes par la mère sera vérifiée. Pour les animaux développant la dystrophie, ils seront monitorés tous les jours (week-end compris) et auront à disposition de la nourriture et de l’eau accessible directement au fond de la cage pour faciliter la prise alimentaire. L’espérance de vie des animaux atteints de cette maladie est de 8 à 14 semaines, ici nous les utiliseront maximum à 4 semaines (P28) donc nous n’effectuerons pas de sevrage (normalement à P21) afin de faciliter le développement jusqu’à la mise à mort. Pour tous les animaux, une grille de score est établie pour évaluer l’état des animaux de façon objective.
Choix des espèces
Il n’est pas possible d’étudier le développement des tissus intestinaux à partir d’études in vitro, le seul moyen approprié reste l’utilisation d’un modèle évolutif et ressemblant au modèle humain, comme c’est le cas pour la souris. La souris de laboratoire est largement utilisée dans la recherche gastro-intestinale. Ses similitudes avec l’Homme, tant au niveau génétique qu’au niveau de la physiologie, de la morphologie et de la structure de l’organe, font qu’il est facile de relier les résultats obtenus chez la souris à ceux obtenus chez l’Homme. Enfin, la disponibilité d’une variété d’outils génétiques, ainsi qu’un assemblage complet et annoté du génome, de même qu’une reproduction rapide en font un bon modèle pour ce projet et même le seul modèle animal disponible puisqu’il n’existe pas encore d’autres modèles utilisables pour cette étude. Nous utiliserons des souris âgées de P2, P7, P14, P21 et P28 (P = jour après naissance) pour évaluer le rôle de notre protéine d’intérêt dans le développement de l'intestin. À ces âges, la morphologie de l'intestin change radicalement, et nous testerons l'implication de la membrane basale dans la régulation de ces changements. De plus, nous utiliserons des stades précoces du développement pour déterminer le rôle de la protéine durant l’embryogénèse à E13,5, E15,5 et E18,5 (E = jour après fécondation) en utilisant des souris adultes gestantes. Enfin nous utiliserons des souris adultes pour étudier le rôle de nos protéines d’intérêts, soit entre 8 et 16 semaines pour avoir un système gastrointestinal mature.
Techniques d’imageries expérimentales non invasives chez les rongeurs
- Recherche appliquée
- Cancers
- Diagnostic des maladies
- Troubles cardiaques
- Troubles musculosquelettiques
- Tests réglementaires
- Toxicologie et autres tests de sécurité
Rats : 200
Jusqu'à quatre-vingt-dix administrations de traitement en trois mois, neuf séances d'imagerie de quatre-vingt-dix minutes sous anesthésie et douze prélèvements sanguins par animal : 3 600 souris et 200 rats vont être utilisés dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, tous tués à la fin pour prélever sang, tumeur et organes. Certains reçoivent une greffe tumorale, et les séances d'imagerie peuvent être précédées d'une mise à jeun de quinze heures. Le laboratoire vend ces prestations d'imagerie et de radiothérapie interne à des équipes extérieures, en mettant en avant des équipements "équivalents voire supérieurs" à ceux de l'imagerie humaine. Une partie des souris est immunodéprimée pour faciliter la prise des greffes de tumeurs humaines, d'autres sont génétiquement modifiées pour développer les pathologies étudiées.
Objectifs
Le laboratoire prend en charge des projets scientifiques en proposant plusieurs techniques d’imageries expérimentales chez l’animal de laboratoire, avec des performances technologiques équivalentes voire supérieures à celles des équipements correspondants pour l’imagerie humaine. Des agents de contraste ou des radiotraceurs sont utilisables pour chacune des modalités, et se caractérisent notamment par leur capacité à marquer les espaces vasculaires et interstitiels, ou des évènements moléculaires et cellulaires spécifiques de pathologies (cancéreuses, cardiovasculaires, rénales, métaboliques, neurologiques). L’imagerie anatomique de scanner par rayons-X est en général choisie pour sa grande résolution spatiale. Elle apporte des informations structurelles dans les pathologies affectant le squelette. En effet, elle est largement utilisée pour étudier la structure et la densité osseuse chez les rongeurs. L’imagerie nucléaire permet-elle de l’imagerie fonctionnelle moléculaire et cellulaire et présente la sensibilité la plus importante pour détecter des tissus dont les caractéristiques métaboliques ou biologiques sont anormales. Elle permet de mesurer l’activité métabolique ou moléculaire d'un organe ou d’un tissu grâce à un produit radioactif injecté au préalable (traceur). Cette approche d’imagerie est non invasive. Le laboratoire propose également la réalisation d’études théranostiques, c’est-à-dire de diagnostic couplé à la thérapie. En effet, une thérapie spécifique peut être envisagée de type chimiothérapie, immunothérapie, hormonothérapie ou bien encore le radiotraceur peut être thérapeutique (thérapie innovante appelée : radiothérapie interne vectorisée). Les études d’imageries pourront permettre de suivre l’efficacité de ces traitements. L’objectif de ce projet est donc de pouvoir prendre en charge des études nécessitant de l’imagerie anatomique ou nucléaire, couplée ou non à de la thérapie.
Bénéfices attendus
Les bénéfices de ce projet sont a) de réaliser des études d'imageries innovantes et non invasives permettant d'utiliser moins d'animaux pour obtenir des résultats fiables b) d'utiliser ces résultats chez l'Homme pour proposer des thérapies classiques adaptées ou des thérapies très innovantes comme la radiothérapie ciblée qui détruit précisément les cellules malades tout en limitant les effets sur les tissus sains.
Procédures
Les animaux pourront avoir une greffe tumorale (sous anesthésie, 1 fois, 10 minutes). Les animaux seront suivis par imagerie non invasive (sous anesthésie, 3 fois par semaine maximum et au total 9 imageries possible sur tout le protocole, 90 minutes maximum). Ces imageries pourront être précédées d'une mise à jeun de 15h maximum. Ils pourront également suivre une thérapie (animal vigile ou anesthésié suivant la voie de thérapie, 90 fois maximum pendant 3 mois pour certaines administrations, quelques minutes, 24 fois maximum pour d'autres) avec un suivi par prélèvement sanguin (animal vigile, 12 fois maximum pendant 3 mois, quelques minutes). En fin d'étude un dernier prélèvement de sang sera réalisé (animal anesthésié, 1 fois, quelques minutes).
Impact sur les animaux
Les animaux pourront développer un phénotype dommageable pouvant entrainer une sensibilité accrue aux infections, ou des douleurs modérées ou une réduction de la mobilité. Les animaux seront soumis à des anesthésies (greffe, imageries) qui pourront engendrer une baisse de la thermorégulation et dans de rares cas une détresse cardio-respiratoire. Ils pourront également ressentier de la douleur modérée et une perte légère de mobilité suite à la croissance des tumeurs greffées. L'administration des traitements pourront induire un stress aux animaux. Les injections intrapéritonéales et intramusculaires pourront induire une douleur légère au point d'injection. Les injections intraveineuse pourront induire une douleur légère au point d'injection et une irritation de la queue. Les administrations par voie orale pourront induire une irritation de l'oesophage et une fausse route dans de rares cas. Les traitements pourraient induire une perte de poids avec une altération de l'état général des animaux. Les prélèvements sanguins pourront induire une douleur légère de courte durée au point de prélèvement et un hématome dans de rares cas.
Devenir
Les animaux seront euthanasiés en fin de procédure afin de réaliser des prélèvements pour analyse (sang, tumeur, organes).
Remplacement
Pour étudier la cinétique de biodistribution de nouveaux radiotraceurs, il n'existe aujourd'hui aucun modèle non vivant qui pourrait mimer le modèle animal vivant. Nous n'avons donc pas la possibilité de remplacer le modèle vivant utilisé.
Réduction
Ce projet nécessitera 3600 souris et 200 rats maximum sur les 5 ans d'autorisation. Ce nombre permettra de pouvoir conclure sur l'interêt d'un radiotraceur ou d'un traitement dans une certaine pathologie grâce à une bonne puissance statistique. Le nombre d'animaux a été réduit, notamment par l’utilisation de l’imagerie non invasive sous anesthésie qui permet des analyses corps entier en 3D et un recueil de données longitudinales.
Raffinement
Tous les animaux bénéficieront d'une période d'acclimatation à l'animalerie d'au moins 7 jours. Pour minimiser les dommages aux animaux, ils bénéficieront d’un environnement enrichi (outil de nidification, maisonnettes, ou batonnets à ronger) et du maintien de l’interaction sociale en étant groupés, et resteront sous surveillance tout au long du projet. Les conditions d’hébergement sont conformes à la réglementation, les animaux disposent de nourriture et d’eau ad libitum. Plusieurs indicateurs physiologiques et comportementaux permettront de suivre le bien-être de l’animal. Le projet a été mis au point afin de permettre une interprétation fiable des résultats dans le respect du bien-être animal. La douleur et le stress sont limités en apportant une anesthésie gazeuse pour les actes techniques ainsi qu’une surveillance attentive accompagnée de points limites suffisamment prédictifs et précoces.
Choix des espèces
Nous travaillons avec des souris immunodéprimées car les greffes de tumeurs humaines sont facilitées et validées sur ces animaux. Nous utiliserons également des souris avec un système immunitaire actif pour les greffes de tumeurs murines. Nous utiliserons des animaux génétiquement modifiés suceptibles de développer certaines pathologies afin de les étudier grâce à l'imagerie. Nous utiliserons des rats pour réaliser des tests d'imagerie de radiotraceurs et ou produits de contraste sur des plus gros rongeurs. Les rats seront utilisés à l'âge de 12 semaines au stade de jeunes adultes et jusqu'à 17 semaines de vie maximum. Les souris seront utlisées à l'âge de 4 à 5 semaines au stade de jeunes adultes ou entre 1 et 3 mois de vie suivant le développement du phénotype le cas échéant. Le stade jeune adulte pour les rongeurs facilite la prise des greffes. Pour les lignées transgéniques, l'âge sera justifié par le développement du phénotype (entre 1 et 3 mois).
Atténuation du déclin cognitif dans la maladie d’Alzheimer par l’exercice physique : corrélats biologiques chez la souris modèle
- Recherche appliquée
- Autres troubles humains
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
- Système gastrointestinal
- Système nerveux
Toutes tuées à l'issue pour des analyses histologiques, 900 souris porteuses d'une mutation qui reproduit la maladie d'Alzheimer vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance léger à modéré. Certaines subissent une chirurgie cérébrale d'une heure pour marquer les nouveaux neurones, d'autres un gavage suivi de quatre prélèvements espacés d'une heure, dont le porteur reconnaît que la douleur dure quelques jours jusqu'à cicatrisation. L'objet est de comparer l'effet d'un accès volontaire à une roue d'exercice selon qu'il commence à l'adolescence ou à l'apparition des troubles de mémoire. Les roues sont retirées la journée, et les trois tests comportementaux censés mesurer la mémoire ne sont pas nommés.
Objectifs
Le projet vise à étudier si l'exercice physique volontaire, pratiqué avant ou après le développement post-natal du cerveau, c’est à dire pendant ou après l’adolescence, déclenche des mécanismes biologiques différents et responsables d’effets bénéfiques sur le cerveau. Des données cliniques et épidémiologiques montrent que l'activité physique est une stratégie efficace pour promouvoir le vieillissement en bonne santé et ralentir le déclin de mémoire lié à certaines maladies neurologiques, comme la maladie d'Alzheimer (MA). L'exercice, tant chez les animaux que chez les humains, est une composante accessible de l’hygiène de vie. Il favorise un état anti-inflammatoire, améliore la fonction antioxydante et stimule la plasticité du cerveau. De plus, des facteurs sanguins sécrétés après l'exercice contribuent à son action neuroprotectrice : une étude a montré que le transfert de sang d'une souris active à une souris sédentaire imite les effets de l'exercice au niveau du cerveau, soulignant son effet systémique. Le microbiote intestinal, modifié par l'exercice, pourrait également jouer un rôle crucial dans la promotion de la santé. Comprendre quand et comment l'exercice retarde l'apparition de la MA est crucial pour développer des stratégies thérapeutiques efficaces. Nous faisons l’hypothèse que la période de la vie durant laquelle l'activité physique est pratiquée a une influence sur les bénéfices engendrés pour prévenir ou ralentir le déclin de mémoire. Des données de la littérature suggèrent que comparé à l'exercice à l'âge adulte, l'exercice à l'adolescence affecte différemment les processus de mémoire et la plasticité du cerveau chez les rats adultes. Ainsi, nous examinerons d’abord si une activité physique volontaire à l'adolescence ou au début de l'âge adulte entraîne un effet optimal sur le ralentissement du déclin de mémoire dans le modèle murin de la MA, à l’aide de tests comportementaux. Ensuite, nous explorerons les changements biologiques (centraux et périphériques) induits par l'exercice, susceptibles d’engendrer des effets différents sur la mémoire, à l'âge adulte.
Bénéfices attendus
Cette étude vise à fournir des perspectives complètes sur l’impact de l'exercice physique dans la maladie d'Alzheimer (MA) en utilisant un modèle murin. En comparant l’impact de l’activité physique initiée pendant l'adolescence ou au début des symptômes de la MA sur la mémoire, nous déterminerons la période de vie pendant laquelle l’activité sportive a un effet optimal. Les investigations moléculaires rechercheront des changements dans certains mécanismes cérébraux décisifs pour les processus de mémoire, qui sont affectés dans la MA et qui pourraient être rétablis par l’exercice physique. L’étude de marqueurs périphériques circulants permettra d’identifier des mécanismes spécifiques activés par l'exercice ayant pour effet de protéger le cerveau. L’analyse des changements du microbiote permettra d’établir des profils de présence et/ou absence de certains marqueurs (changement dans la proportion de bactéries, changement dans la perméabilité intestinale …) en fonction des différents groupes. Finalement, cette recherche vise à approfondir notre compréhension du décours et des mécanismes induits par l'exercice physique et permettant d’améliorer la résistance du cerveau malgré la MA, ce qui pourrait éclairer de futures stratégies thérapeutiques.
Procédures
Certains animaux auront un gavage oral qui dure 30 secondes. Ces mêmes animaux auront 4 prélèvements espacés de 1h chacun. Pour certains animaux, 3 tests comportementaux seront effectués au cours de 2 à 3 semaines. Ils peuvent induire du stress du fait du déplacement des souris vers de nouvelles pièces et de la mise en contact avec de nouveaux objets. Pour limiter ce stress, les souris disposeront de périodes d’habituation aux pièces et aux dispositifs expérimentaux. Pour chaque souris, le temps maximal de tests sera limité à 1h30 par jour. Deux jours de manipulation sont également prévus afin que les souris s’habituent à l’expérimentateur dans la salle des tests comportementaux. Pour certains animaux, une injection sera réalisée par jour, pendant 4 jours consécutifs. La prise en contention et l’injection sont susceptibles de causer un stress léger, ainsi qu’une douleur légère qui dure environ 2 minutes. Finalement, certains animaux seront soumis à une chirurgie permettant de marquer des nouveaux neurones. Chaque chirurgie durera 1h maximum.
Impact sur les animaux
Les nuisances ou effets indésirables peuvent être dus à l’activité physique qui peut induire une légère perte du poids. Aussi, la prise en contention des animaux est susceptible de causer un stress léger. Certains animaux recevront une substance par gavage oral. Cette procédure représente une nuisance légère pour l’animal en raison de l’insertion d'une sonde dans l'œsophage. Ces mêmes animaux, auront des prélèvements qui peuvent induire une douleur légère. Ces prélèvements sont répétés 4 fois, avec un intervalle de 1h entre chaque. La douleur due aux prélèvements dure quelques jours jusqu’à cicatrisation de la plaie. Ceci représente une nuisance modérée car les prélèvements sont réalisés juste après le gavage. Certains animaux seront évalués dans des tests comportementaux. Ceux-ci ne provoquent qu’un stress léger ou modéré pour les animaux. De plus, pour quelques animaux, des injections sont susceptibles de causer une légère douleur. Ceci représente une nuisance légère. D’autres souris seront soumises à une chirurgie. Des effets indésirables de cette procédure peuvent se traduire par une altération de l’état général de l’animal : isolement, indifférence par rapport au milieu extérieur, diminution du comportement exploratoire ou une perte de poids. De plus, les chirurgies peuvent induire une douleur modérée au stade post opératoire durant quelques jours. Ceci représente une nuisance modérée.
Devenir
A l’issue des procédures expérimentales, les animaux seront mis à mort en vue d’analyses histologiques quantitatives.
Remplacement
Le projet a pour but d’évaluer, in vivo, l’impact de la période de la vie de l’animal (à l’adolescence ou au début des symptômes mnésiques à l’âge adulte) où l’exercice physique ralenti de façon optimale le déclin de mémoire associé à la MA. Un aspect important de ce projet est donc de pouvoir mesurer les capacités mnésiques des souris après l’exercice physique. Pour cela, un modèle animal est indispensable. De plus, nous allons étudier l’impact de l’activité sportive sur la physiologie de l’animal au niveau central (cerveau) et périphérique (sang, intestin…) où un dialogue et des interactions complexes se produisent entre le cerveau et les organes, des processus qui ne sont pas modélisables à ce jour.
Réduction
Le nombre d’animaux par groupe (n= 15) a été déterminé sur la base de nos études antérieures chez ce modèle murin et à l’aide de la littérature correspondante. Ce nombre est réduit au minimum pour permettre d’obtenir une puissance statistique suffisante pour les analyses statistiques nécessaires aux comparaisons intergroupes (8 groupes) et intra-groupes (comparaison des prélèvements à différents moments de la vie de l’animal). Ce nombre prend également en compte l’éventualité certains animaux ne montreront pas d’exercice physique volontaire en présence de la roue et seront donc retirés de l’étude. Ce nombre prend aussi en compte l’existence d’une variabilité inter-individuelle dans les études comportementales. Afin de réduire au maximum le nombre d’animaux utilisés, les animaux seront testés dans plusieurs tests comportementaux et nous utiliserons les mêmes animaux pour les études comportementales et post-mortem.
Raffinement
Les souris sont hébergées par 4 ou par 2 dans des cages contenant du matériel de nidification ainsi qu’une buchette pour l’enrichissement. Les roues d’exercice seront retirées pendant la période d’inactivité (la journée) pour encourager le repos des animaux. Pour limiter le stress lié au déplacement des souris vers de nouvelles pièces et à la mise en contact avec de nouveaux objets lors des tests comportementaux, les souris disposeront de périodes d’habituation aux pièces et aux dispositifs. Pour chaque souris, le temps maximal de tests sera limité à 1h30 par jour. Deux jours de manipulation sont également prévus afin que les souris s’habituent à l’expérimentateur dans la salle des tests comportementaux. Une attention particulière sera portée aux souris pendant les périodes d’exercice physique où le poids sera surveillé 1 fois par semaine et comparé au poids de référence avant le début de l’activité sportive. De plus, les animaux seront suivis quotidiennement par des personnes formées au soin. Les critères évalués sont l’aspect général de l’animal (pelage, peau, yeux, bouche), les fonctions corporelles (respiration), le comportement (posture, locomotion, réaction à la manipulation, isolement) et le poids (pesée une fois par semaine). Pendant les chirurgies, les animaux seront placés sur une couverture chauffante permettant de contrôler leur température corporelle. Un gel oculaire sera appliqué afin d’éviter le dessèchement des yeux. Les animaux seront surveillés jusqu'à leur réveil complet (déplacements spontanés dans la cage, prise d'eau et de nourriture) et 6 heures plus tard. Après l’opération, l’animal sera isolé dans une cage propre contenant du papier ; il sera maintenu au chaud en prêtant une attention particulière à son hydratation et son état sera contrôlé. Les souris recevront une injection d'anti-inflammatoire après la chirurgie et le lendemain pour éviter les éventuelles douleurs post-opératoires. La cicatrisation de la plaie sera également contrôlée dans les jours suivant la chirurgie.
Choix des espèces
Dans cette étude, nous utiliserons une lignée de souris transgéniques modèles de la maladie d’Alzheimer (MA). Cette lignée est l'un des modèles précliniques de MA les plus étudiés, en raison de l’évolution progressive de la pathologie, qui ressemble à ce qui est observé chez les patients atteints de MA. Les souris de cette lignée développent avec l’âge des plaques amyloïdes, comme chez le patient. Cette lignée constitue donc un modèle idéal pour étudier l’impact de l’exercice physique à diverses périodes de la vie, sur le déclin de mémoire lié à l’âge dans la MA. Les animaux les plus jeunes inclus dans le projet auront 28 jours (P28) (soit plusieurs jours après le sevrage) et les animaux les plus vieux auront 10 mois (adulte). Nous allons évaluer l’impact de l’exercice physique sur le déclin de mémoire lié à la MA en fonction la période de vie à laquelle l’exercice est pratiqué : pendant le développement post-natal (P28) ou au début des symptômes cognitifs (à 6 mois). Ceci explique que des animaux jeunes mais sevrés (P28) soient nécessaires.
Etudes d’Imagerie et de Spectroscopie par Résonance Magnétique Nucléaire des muscles squelettiques et cardiaque dans les modèles canins de maladies neuromusculaires
- Recherche fondamentale
- Système musculosquelettique
129 chiens vont être utilisés dans des procédures d'un niveau de souffrance léger à modéré, puis renvoyés à leur établissement d'origine : 49 mâles atteints de dystrophie musculaire, 40 femelles porteuses de la mutation et 40 chiens sains. Chaque examen d'IRM dure jusqu'à trois heures sous anesthésie générale, avec induction par injection, intubation et parfois injection d'un produit de contraste. Le porteur décrit une méthode non invasive et atraumatique, tout en listant le stress de la pose de voie veineuse, l'irritation liée à l'intubation et le risque d'hypothermie. Il affirme qu'aucun modèle in vitro ne reproduit la structure du muscle squelettique ou du cœur, et conclut que les modèles canins restent "irremplaçables".
Objectifs
Les objectifs principaux de ce projet sont l'évaluation des méthodes non invasives pour caractériser structure et fonction des muscles dans des modèles pertinents de pathologies musculaires et établir des mesures fiables, voire des biomarqueurs qui décrivent le stade d'avancement de la maladie et son évolutivité. D'autre part, ces modalités seront utilisées pour evaluer un traitement innovant visant à rduire la fibrose musculaire
Bénéfices attendus
L’imagerie et la spectroscopie par résonnance magnétique représentent des techniques d’évaluation intrinsèquement non invasives et atraumatiques. L’utilisation d’un scanner à tunnel large et haute résolution permettent une évaluation corps entier ce qui permet donc d’avoir une bonne appréhension de la répartition des lésions musculaires. Le recours à diverses séquences permet d’obtenir divers contrastes ce qui traduit diverses propriétés des muscles. L'IRM devrait à terme aboutir à la définition de nouveaux biomarqueurs et d'établir des données de références permettant un diagnostic précoce par une méthode non invasive. Le développement de séquences entrelacées permet un raffinement supplémentaire de ces approches en raccourcsissant les durée d'examen. Le développement de nouveaux biomarqueurs devrait aider à l'évaluation de traitements innovants qui font encore défaut dans le contexte des maladies neuromusculaires.
Procédures
Une cohorte de chiens sera utilisée pour evaluer et valider de nouvelles méthodes d'imagerie médicale. Elle se décompose en chiens sains (M et F), de chiennes porteuses de la mutation et de chiens mâles atteints de la maladie. L’examen IRM (imagerie par résonnance magnétique), du fait de sa nature non invasive n’induit pas de douleur, mais une sédation est requise pour éviter les mouvements durant les acquisitions de données et améliorer le confort de l’animal. Les chiens seront donc endormis par médicament injectable, intubés et l'anesthésie entretenue par inhalation d’un anesthésique sous forme gazeuse. La durée de prépartion d'un chien est d'environ un quart d'heure. Un monitorage cardio-respiratoire continue ainsi que la surveillance de la température corporelle sont mis en place durant tout l'examen. Certaines séquences d'imagerie font appel à l'injection d'un produit de contraste. La durée d'un examen complet est limitée à 3 heures.
Impact sur les animaux
L’imagerie par résonnance magnétique (IRM) est certes non invasive et non douloureux, mais nécessite l’immobilité, d’où le besoin d’une anesthésie. L’induction de l’anesthésie par injection pourrait être source de stress et d’une douleur de courte durée au point de ponction de la voie intraveineuse. De même, la nécessité d’intuber pourrait causer une légère irritation. L’anesthésie nécessaire pour l’imagerie pourrait entrainer une hypothermie liée à l’immobilité et dans de rares cas de complications. Certaines séquences d’imagerie pourront nécessiter l’injection de produit de contraste pour l’IRM, ce qui ne devrait pas impacter l’animal (produit utilisé en pratique vétérinaire clinique).
Devenir
Tous les animaux retourneront à leur établissement d'origine qui gère la surveillance des chiens. La gestion des animaux en dehors de l'imagerie reste sous la responsabilité de l'équipe vétérinaire et n'implique pas le laboratoire de RMN. L'imagerie in vivo par une méthode non invasive comme l'IRM s'incrit dans ce contexte.
Remplacement
L’imagerie/spectroscopie par RMN répond au critère ‘remplacement’ de la règle des 3R en permettant de s’affranchir des prélèvements pour un grand nombre d’évaluations du tissu musculaire ; l’histologie tout comme la biochimie restent des méthodes invasives pouvant nécessiter l’euthanasie de l’animal pour le prélèvement. Cependant, à ce jour, il n’existe pas de modèle in vitro qui imite la structure complexe et le métabolisme énergétique du muscle, qu’il soit squelettique ou cardiaque. Le recours à des modèles animaux présentant un phénotype cliniquement patent est donc indispensable pour une meilleure compréhension de sa physiopathologie et découvrir de nouvelles cibles thérapeutiques. Les modèles canins gardent ainsi une place irremplaçable aussi bien pour la recherche fondamentale que pour les études précliniques en thérapeutique. car ils présentent des similitudes phénotypiques avec les pathologies humaines (fibrose, cycles de dégénérescence / régénérescence des fibres musculaires, atteinte cardiaque et respiratoire, …).
Réduction
La complémentarité des techniques d’imagerie et de spectroscopie permet d’acquérir des données multiparamétriques chez l’animal vivant, et représente une des caractéristiques singulières de la méthode RMN. Il est ainsi possible à partir d’un même examen, consistant en acquisitions de plusieurs séquences d’imagerie er de spectroscopie, d’extraire plusieurs caractéristiques du tissu musculaire. De plus, la nature non-invasive de l’examen par RMN autorise l’observation du tissu musculaire sans induire de modifications durables de ce dernier. Par son caractère atraumatique, la RMN offre la possibilité de répéter un examen sur un même animal sans effets nocifs pour celui-ci rendant possible le suivi longitudinal de l’évolution des pathologies et l’étude de l’efficacité dans le cadre d’essais thérapeutiques. Ces trois spécificités de la RMN permettent dans le cadre de l’expérimentation in vivo de ‘réduire’ le nombre d’individus nécessaires à une expérience comme le stipule la règle des 3R. Les nouvelles modalités d’imagerie/spectroscopie par RMN nécessiteront une validation chez des animaux sains (mâles et femelles (20 + 20), des femelles porteuses de la mutation (40) et des animaux malades mâles (49), soit un total de 129 chiens. De ce sous-groupe de chiens ayant la maladie génétique, une cohorte (9) sera incluse dans un essai thérapeutique basée sur une approche de thérapie cellulaire. Le nombre total d’individu est estimé de façon à avoir un nombre suffisant d’individus par groupe pour réaliser des tests statistiques.
Raffinement
L’inclusion des animaux se fera selon des critères d’inclusion qui sont clairement établis en amont des examen RMN par l’équipe promotrice. En résumé, le statut génétique est établi et un examen clinique doit permettre d’établir un phénotype clairement décrit. Les animaux prévus ici devraient ainsi présentés un phénotype modéré. Toutefois en cas de dégradation de l’état clinique lié à la pathologie ou de survenue d’une pathologie intercurrente, les animaux seront exclus de notre protocole. En soi l’imagerie/spectroscopie par RMN est un examen non invasif et atraumatique. La RMN répond donc au critère de ‘Raffinement’, grâce au développement constant des outils méthodologiques couplé aux progrès technologiques. Toutes les expérimentations RMN se feront sous anesthésie par inhalation afin de maintenir les animaux immobiles pendant les acquisitions et réduire ainsi tout stress lié à l’examen. L’anesthésie bénéficie d’un monitorage cardio-respiratoire continue jusqu’au réveil de l’animal. Certains examens peuvent nécessiter l’injection d’un produit de contraste. La température corporelle de l’animal est maintenue autour de 38 degrés à l’aide d’un tapis chauffant. Fréquence respiratoire et saturation périphérique en oxygène sont contrôlés en permanence pendant toute la durée de l’examen. La surveillance clinique est assurée jusqu’au réveil complet de l’animal et les animaux pourront retourner à leur lieu d’hébergement habituel. Les chiens restent donc sous la surveillance constante du vétérinaire qui aura toute liberté d’interrompre un examen s’il le juge nécessaire.
Choix des espèces
Le muscle est un ensemble organisé de fibres musculaires, cellules hautement différenciées et spécialisées, et de tissu interstitiel. La fonction musculaire est dépendante du fonctionnement des cellules musculaires, mais aussi d’une combinaison des fonctions vasculaire et nerveuse de l’individu. Cependant, à ce jour, il n’existe pas de modèle in vitro qui imite la structure complexe et le métabolisme énergétique du muscle, qu’il soit squelettique ou cardiaque. Le recours à des modèles animaux présentant un phénotype cliniquement patent est donc indispensable pour une meilleure compréhension de sa physiopathologie et découvrir de nouvelles cibles thérapeutiques. La règlementation sur le développement médicamenteux prescrit le recours à une expérimentation in vivo pertinente pour la pathologie humaine ciblée. Les modèles canins des maladies neuromusculaires, tels que le chien GRMD (Golden Retriever Muscular Dystrophy), sont très utilisés dans la recherche sur les pathologies neuromusculaires. En effet, le phénotype sévère lié à l’absence de dystrophine, observé chez ces animaux, présente des similitudes importantes avec l’expression de la maladie chez l’homme. Afin de diagnostiquer le plus tôt possible la pathologie neuromusculaire, les examens qui vont être évaluer ont recours à des chiens peu symptomatiques, d'un âge adultes jeunes.
Etude par imagerie de l’épilepsie
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Multisystémique
- Oncologie
- Système nerveux
138 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, chacune pouvant subir jusqu'à six séances d'imagerie de deux heures sous anesthésie gazeuse et quinze tests comportementaux. 75 d'entre elles reçoivent un composé qui déclenche une épilepsie, les 63 autres formant le groupe témoin. Les crises attendues sont focales et non convulsives, les souris cessant leur activité en cours, et les tests mesurent l'activité motrice, la dépression et l'anxiété. Toutes sont tuées à la fin pour prélever leurs organes et corréler l'imagerie aux analyses immunohistochimiques.
Objectifs
L'épilepsie, une maladie neurologique fréquente touchant environ 1% de la population et générant 100 nouveaux cas annuels pour 100 000 habitants, demeure une condition potentiellement sérieuse dont les mécanismes moléculaires et cellulaires restent encore mal compris. De fait, les traitements médicamenteux actuels se limitent principalement à des approches symptomatiques. Notre démarche vise à approfondir notre compréhension de l'épilepsie tout en identifiant de nouvelles voies thérapeutiques potentielles, en mettant particulièrement l'accent sur l'étude des mécanismes cellulaires et moléculaires cérébraux. L’imagerie fonctionnelle se présente comme un outil puissant pour explorer in vivo divers mécanismes cérébraux. Ainsi, la tomographie par émission de positons (TEP), largement utilisée en médecine nucléaire, permet de suivre au cours du temps différents paramètres dans les différentes régions du cerveau. Dans le cas de l’épilepsie, la TEP est particulièrement intéressante pour observer : • Le métabolisme des cellules du cerveau, un indicateur de leur activité ; • La concentration en synapses, ces zones de transmission d’information entre neurones ; • L’intégrité de la barrière hémato-encéphalique, la barrière naturelle qui protège le cerveau. Le choix du radiotraceur varie en fonction du paramètre que l’on souhaite suivre. L'objectif de ce travail consiste à appliquer cette méthode d'imagerie, déjà développée et appliquée dans notre laboratoire, y compris chez l'Homme, à un modèle rongeur d'épilepsie bien caractérisé. Cette approche permettra d'identifier les mécanismes physiopathologiques à l'origine des dysfonctionnements cérébraux observés dans cette maladie neurologique, ouvrant ainsi la voie à de nouvelles perspectives diagnostiques et thérapeutiques. De plus, nous réaliserons des tests de comportement afin de corréler les données de l’imagerie à des symptômes cliniques. Les tests de comportement, tels que l'évaluation de l'anxiété, de la dépression et de l’activité motrice, sont essentiels pour comprendre les comorbidités neurocomportementales de l’épilepsie. Ils permettent de mesurer l'impact des crises sur le comportement et de développer des interventions thérapeutiques adaptées.
Bénéfices attendus
Ce projet vise à élucider les mécanismes physiopathologiques à l'origine des dysfonctionnements cérébraux observés dans l'épilepsie, en établissant une corrélation entre ces dysfonctionnements et les comportements manifestés par les animaux. De plus, cette approche permettra d'identifier la méthode d'imagerie la plus pertinente pour une poursuite du développement chez l'homme. À terme, cette étude ouvrira la voie à l'exploration in vivo de ces mécanismes chez des patients atteints d'épilepsie, avec l'objectif de découvrir de nouvelles cibles thérapeutiques. Cette approche pourrait ainsi contribuer à l'avancement des traitements et à l'amélioration de la qualité de vie des personnes touchées par ces pathologies.
Procédures
Les interventions prévues sur les animaux sont listées ci-dessous : - Administration (75 animaux, durée 25 minutes) d’un composé induisant une épilepsie pour le groupe épilepsie tandis que le groupe témoin (63 animaux, durée 25 minutes) ne recevra pas de composé induit une épilepsie. - Réalisation de sessions d’imagerie sous anesthésie gazeuse (durée 120 minutes au maximum, 6 imageries maximales par animal) - Injection d’un radiotraceur (1 minute) - Les rongeurs seront soumis à plusieurs tests comportementaux afin de mesurer 1) l'activité motrice (durée du test = 10 minutes, 15 tests comportementaux maximales par animal), 2) la dépression (test de 6 minutes) et 3) l’anxiété (test de 5 minutes).
Impact sur les animaux
Les effets indésirables prévus sur les animaux : - des crises épileptiques principalement focales et non convulsives (les souris cessent leur activité en cours) ; - Possible stress et désorientation au réveil de l’anesthésie relativement longue. - Stress possiblement induit par les tests de comportement
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés à la fin de la procédure afin d’extraire les organes et réaliser des analyses immunohistochimique permettant de corréler les mécanismes biologiques, la distribution des biomarqueurs d’intérêt avec les données en imagerie.
Remplacement
Ce projet a pour objectif d’identifier les différents mécanismes physiopathologiques impliqués dans le dysfonctionnement cérébral observé dans l’épilepsie et d’établir un score de corrélation entre ces dysfonctionnements cérébraux et les comportements observés chez ces animaux. Les études in vivo sont essentielles pour comprendre pleinement les mécanismes d’un dysfonctionnement cérébral. Les modèles animaux permettent d'observer les effets des interventions dans un organisme entier, incluant la distribution, le métabolisme, et l'élimination des composés, ainsi que les interactions avec divers systèmes biologiques. Il n’existe pour l’instant pas de méthode alternative capable de faire ces observations.
Réduction
Dans la mesure du possible, un même animal passera plusieurs examens d’imagerie sur plusieurs jours d’une même semaine (2 au maximum), ce qui permet de limiter le nombre d’animaux. De plus, le nombre d'animaux par groupe a été déterminé pour qu’il soit le plus petit possible tout en ne compromettant pas une analyse statistique fiable des résultats.
Raffinement
Les souris, âge de 4 semaines, seront hébergées par groupe dans une cage enrichie avec un tunnel de camouflage, des bâtonnets de bois et du matériel pour la fabrication de nids. Les animaux seront observés quotidiennement par les zootechniciens en charge de leurs soins et par les expérimentateurs. Deux semaines d’acclimatation sont prévues après la livraison et avant de débuter le protocole. Un suivi régulier permettra de repérer une éventuelle souffrance animale et de prendre en charge l’animal concerné dans les plus brefs délais. Les animaux feront l’objet d’une surveillance journalière et d’un suivi hebdomadaire du poids. Toutes les interventions invasives (injections intraveineuses) sont réalisées sous anesthésie générale par voie gazeuse afin de minimiser le stress de l’animal et les douleurs liées aux interventions. Des analgésiques seront également administrés avant et après la chirurgie. En cas de complications, le vétérinaire de l’installation sera alerté afin de mettre en œuvre des traitements appropriés. L’étude comportementale sera réalisée avec des animaux vigiles mais sera conduite de manière la plus brève possible afin d’éviter tout stress supplémentaire aux animaux. Des points limites sont définis pour éviter toute souffrance animale.
Choix des espèces
Ce projet a pour objectif d’évaluer l’impact sur le cerveau d’affections neurologique. La souris est l’animal de choix car plusieurs modèles ont déjà été développés sur cette espèce pour reproduire des dysfonctionnements observés dans cette pathologie. Cette espèce présente également l’avantage d’être particulièrement adaptée aux études d’imagerie par TEP ainsi qu’à l’étude comportementale. Plus particulièrement : - les rongeurs sont particulièrement appropriés pour ce type d'étude en raison de leur taille, de leur facilité d'hébergement et de manipulation ; - il existe de nombreux tests comportementaux standardisés chez les rongeurs pour mesurer les comportements dépressifs et anxieux. Ces tests permettent de corréler efficacement les données d'imagerie avec les symptômes cliniques observés dans l'épilepsie, offrant ainsi une compréhension plus complète des mécanismes physiopathologiques et des comorbidités comportementales associées à cette maladie. Les souris utilisées seront au stade adulte quand le cerveau a atteint sa maturité et son développement complet (5 semaines à 8 semaines).
Etude des mécanismes conduisant à l’élimination rapide des plaquettes transfusés lors d’un état réfractaire
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
600 souris sont saignées à l'aorte sous anesthésie générale puis tuées sans reprendre conscience, leurs plaquettes étant transfusées à 198 autres souris, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Ces dernières subissent cinq prélèvements à la queue étalés sur les deux heures qui suivent la transfusion, une partie recevant d'abord une injection par semaine pendant trois semaines pour provoquer une réaction immunitaire. Pour les donneuses, le porteur retient des mâles, à âge égal plus lourds que les femelles et donc porteurs d'un volume sanguin plus grand. Aucune n'est gardée en vie, le prélèvement étant terminal et les receveuses ne pouvant plus être réutilisées une fois leur système immunitaire stimulé.
Objectifs
.Les patients pris en charge dans le cadre d'une chimiothérapie myelosuppressive ont besoin d'un support transfusionnel plaquettaire important et itératif. Cependant, dans certains cas, les plaquettes transfusées sont très rapidement éliminées de la circulation sanguine du receveur et la transfusion se révèle inefficace sur un plan thérapeutique, c'est ce qu'on appelle un état réfractaire. Les mécanismes liés à cette élimination ne sont pas totalement compris et cette absence de connaissances représente donc un réel frein au développement de stratégies thérapeutiques. Les objectifs de ce projet sont donc de pouvoir étudier finement les mécanismes qui conduisent à l'élimination des plaquettes transfusées. Pour atteindre cet objectif, il est nécessaire de modéliser l'état réfractaire chez le rongeur afin de pouvoir disposer d'un modèle pré-clinique qui nous permettra de tester différentes stratégies thérapeutiques dans le cadre de la prise en charge des patients en état réfractaire.
Bénéfices attendus
La prise en charge des patients en état réfractaire repose actuellement sur la transfusion d'un produit plaquettaire dit "compatible" avec le receveru. C'est une solution qui n'est pas satisfaisante car elle ne peut pas être mise en place en cas d'urgence et requiert des ressources qui sont par définition limitées (le nombre de produit compatible par receveur est extrêmement restreint). Le bénéfice de ce projet à long terme pourra être une meilleure prise en charge des patients présentant un état réfractaire en utilisant des stratégies thérapeutiques efficaces pour amilorer l'efficacité transfusionnelle.
Procédures
Il n'y aura aucune procédure faite sur animaux vigiles, les animaux recevront une anesthésie . Il n'y a pas de procédures chirurgicales avec réveil, les animaux subiront sous anesthésie générale un prélèvement à l'aorte (souris donneuses de plaquettes) qui dure moins de 5 minutes. Les souris receveuses subiront (sous anesthésie) une transfusion de plaquettes sanguines avec ou non un traitement pharmacologique puis des prélèvements à la queue itératifs sur les 2h suivant la transfusion (prélèvements à 1', 5', 15', 30', 2h).
Impact sur les animaux
Pour toutes les procédures, un stress lié aux manipulations est possible ainsi qu'un effet de l'anesthésie sur le rythme respiratoire (irrégulier ou apnée). Dans le cadre de la procédure liée à l'alloimmunisation, les injections répétées (une injection par semaine pendant 3 semaines consécutives) peut être associée à un risque de lésion au niveau du site d'injection. Il n'y a pas de nuisance attendue aux différents traitements reçus pour prévenir l'état réfractaire.
Devenir
Tous les animaux sont mis à mort à la fin des procédures. Les animaux subissent en effet soit un prélèvement sanguin terminal ou des transfusions plaquettaires. Pour ces derniers, il n'est pas possible de les réutiliser dans d'autres expériences car il y a eu une stimulation du système immuniataire (production d'anticorps).
Remplacement
L'objectif principal de ce projet est de comprendre les mécanismes d'action des anticorpsconduisant à l'élimination des plaquettes transfusées. Cette question ne peut être abordée qu'in vivo Cette question ne peut être abordée qu'in vivo puisque l’élimination des plaquettes se fait dans un système intégré (circulation sanguine, composés plasmatiques, macrophages tissulaires). Cependant, nous avons mis au point des tests d'activation plaquettaire en réponse aux anticorps in vitro. ces tests seront mis à profit pour déterminer les doses des différentes molécules candidates à administrer pour prévenir l'état réfractaire.
Réduction
Le projet se fera par étapes, comme indiqué dans le déroulé du projet. Si l’état réfractaire est totalement inhibé avec une des approches, les conditions où plusieurs approches sont combinées ne seront pas testées. Le critère recherché est le temps de circulation de plaquettes in vivo. Nous effectuons donc une comparaison des courbes d’élimination des plaquettes en fonction du temps dans les souris traitées versus les souris non traitées Les effectifs ont été calculés au plus juste en tenant compte de la variabilité déjà observée dans ce genre d'expériences. Afin de réduire au maximum le nombre de souris donneuses, nous privilégierons les souris donneuses mâles. A âge équivalent, elles ont un poids plus important que les souris femelles et donc un volume sanguin plus important, ainsi nous pouvons isoler une quantité suffisante de plaquettes sanguines en utilisant moins d’animaux.
Raffinement
Une période d’acclimatation de 2 semaines entre l’arrivée des souris à l’animalerie et leur utilisation sera respectée. Pour réduire le stress provoqué par la manipulation des animaux, ceux-ci auront une phase d’habituation à la contention et à la manipulation. Le stress et la douleur de tous les animaux utilisés dans ce projet seront diminués au minimum: • Par l’hébergement dans des cages en fonction des groupes expérimentaux 3 jours avant l’expérimentation. Ces cages seront munies de particules de bois et enrichies avec des carrés de cellulose, bâtonnets de coton, frisure de papier, ce qui leur permet d’organiser leur environnement selon leurs besoins. Les animaux sont entre 2 et 5 par cage afin d’éviter le stress causé par l’isolement. • Par la mise en place de nourriture de type « pâté » 3 jours avant le début des expérimentations faisant intervenir une chirurgie • Par une anesthésie de l’animal avant et pendant la durée de l’opération • Par l’installation de l’animal sur une plaque chauffée à 38°C afin lutter contre l’hypothermie pendant l’expérimentation. • Par l’injection d’analgésique et d’antalgique avant chaque procédure chirurgicale • Par application d’ocrygel sur les yeux lors de l’anesthésie afin de les protéger. • Pendant toutes les expérimentations, les animaux sont surveillés par du personnel entrainé pour vérifier l’absence de signes de douleur grâce à des points limites spécifiques établis pour chaque procédure . Ces points limites permettront de soustraire l’animal aux procédures expérimentales et ainsi limiter sa souffrance et son inconfort.
Choix des espèces
La souris est un animal pour lequel les modèles d’étude in vivo sont maitrisés, notamment les modèles de transfusion. Puisque nous souhaitons mimer la différence d’haplotype entre un donneur et un receveur, nous devons travailler avec des souris de fond génétique différents et très bien caractérisés au laboratoire. De plus,le modèle d’allo-immunisation post transfusionnelle est bien caractérisé et maîtrisé au laboratoire ce qui rend l’utilisation de la souris dans ce projet très pertinente. Les souris donneuses de plaquettes seront utilisées au stade adulte entre 2 et 6 mois. Cet âge correspond à la période utilisant des souris pubères et ne présentant pas encore de vieillissement. Les souris receveuses seront utilisées au stade adulte entre 7 et 20 semaines. Cet âge correspond à l'âge adulte et à une période où les souris n'ont pas un poids trop important qui nécessiterait d'injecter beaucoup plus de plaquettes et/ou des différentes molécules testées dans ce projet (nous utiliserons des souris dont le poids est compris entre 18 et 25g)
Activation synergique de récepteurs nucléaires par des contaminants alimentaires
- Recherche appliquée
- Toxicologie (hors obligations réglementaires)
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système gastrointestinal
Gavées chaque jour pendant trois jours, ou nourries pendant quatre-vingt-dix jours avec des contaminants alimentaires, 1 048 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance léger à modéré. Elles subissent des prélèvements à la veine faciale sous anesthésie, sept prises de sang lors d'un test de tolérance au glucose et des pesées hebdomadaires, pour mesurer si perfluorés, phtalates, bisphénols et pesticides activent ensemble des récepteurs impliqués dans l'obésité. La plupart sont tuées par dislocation cervicale, une partie des femelles étant gardée pour l'entretien de la lignée et une partie des animaux surnuméraires utilisée pour l'entraînement aux gestes techniques. Le porteur écrit n'attendre "pas de nuisances particulières", sans expliquer ce qui vaut à 256 d'entre elles un niveau de souffrance modéré.
Objectifs
Les maladies métaboliques, telles que le diabète et l’obésité, sont en constante augmentation dans les pays industrialisés. L'origine de ces maladies est complexe et multifactorielle. Les causes premières d’apparition de ces troubles, lorsqu’ils ne sont pas d’origine génétique, sont liées à une alimentation riche en sucre et en gras et à un mode de vie sédentaire. L’exposition à certains produits chimiques, dits « obésogènes environnementaux » est également suspectée de jouer un rôle dans l’apparition et/ou l’évolution de ces maladies. Un certains nombre de senseurs appelés les récepteurs nucléaires jouent un rôle important dans la régulation de l'équilibre énergétique et pourraient être des médiateurs des effets de ces « obésogènes environnementaux » sur le développement de troubles métaboliques. Les contaminants étudiés sont les composés perfluorés, les phtalates, les bisphénols, les organoétains et les pesticides connus pour leur caractère obésogène et identifiés sur la base tests en laboratoire sans animaux, réalisé par un partenaire du projet. Ces composés seront administrés seuls puis en mélange par gavage oral à des souris exprimant ou non certains récepteurs nucléaires en aigu (3 jours) ou en chronique (90 jours). Des analyses sur les perturbations métaboliques induites par l’exposition à ces contaminants seront réalisées.
Bénéfices attendus
Ces données permettront d’évaluer l’impact d’expositions à des contaminants alimentaires sur l'activation des récepteurs nucléaires et sur les perturbations métaboliques qui en découlent. Les expositions aiguës permettront de mettre en évidence un éventuel effet combiné dans l'activation d'un récepteur nucléaire donné. Les expositions chroniques de 90 jours permettront de déterminer si les mêmes récepteurs sont activés de la même manière lors d'expositions à plus faibles doses sur des temps plus longs et de rechercher les différentes perturbations métaboliques qui peuvent en découler.
Procédures
Pour les 3 expositions aiguës, les souris seront exposées à des contaminants par gavage quotidien (30 secondes) pendant 3 jours. Un prélèvement à la veine faciale submandibulaire sera effectué sous anesthésie générale (30 secondes). Pour l'exposition chronique, les souris seront exposées à des contaminants par l'alimentation pendant 90 jours. Elles seront pesées chaque semaine pendant toute la durée de l'expérimentation (ce qui correspond à environ 13 pesées de 30 secondes). Sept prélèvements d'une goutte de sang seront réalisés pendant le test de tolérance au glucose, sous pommade anesthésique. Un prélèvement à la veine faciale submandibulaire sera effectué sous anesthésie générale. Ce prélèvement dure environ 30 secondes.
Impact sur les animaux
Nous n’attendons pas de nuisances particulières chez les animaux exposés. Les expositions seront à des doses ne présentant pas de toxicité pour les animaux. Un stress peut être généré par la manipulation et la contention des souris.
Devenir
Les animaux ayant servi à l'expérimentation sont euthanasiés par dislocation cervicale au terme de l'expérimentation. Nous conserverons une partie des femelles pour l’entretien de la lignée et une partie des animaux surnuméraires sera utilisée pour de la formation aux gestes techniques.
Remplacement
Les tests en laboratoire sans animaux, réalisés par une équipe partenaire permet une sélection de seulement 16 molécules ayant montré un potentiel synergique auxquelle s'ajouteront 4 molécules de référence. Cependant, seule une approche avec des organismes vivants entiers est capable d’évaluer les conséquences de l'activation synergique de récepteurs nucléaires et les dérégulations métaboliques qui en découlent.
Réduction
Chaque étape de protocole vise à sélectionner les molécules présentant un potentiel synergique élevé pour les étapes suivantes passant de 20 molécules avec 5 doses à 8 molécules avec une seule dose. Si aucune molécule ne synergise ou n'active un récepteur donné, aucune molécule ne sera sélectionnée pour ce récepteur, réduisant ainsi le nombre de lots prévu lors des procédures suivantes.
Raffinement
La mise en place de d'abris en inox permettra aux animaux de s'isoler au besoin. Les animaux seront observés quotidiennement par les zootechniciens et/ou les expérimentateurs. Les animaux seront habitués à la préhension par les zootechniciens. Un analgésique local est prévu pour les prélèvements de sang pendant le test de tolérance au glucose. Une anesthésie générale est prévue pour les prélèvements de sang précédant la mise à mort. En cas d’atteinte d’un des points limites établis, l'animal sera retiré de l'étude, anesthésié et euthanasié si les lésions observées sont jugées irréversibles . Les animaux seront hébergés sans dépasser 6 adultes par cage conformément recommandations liées au bien-être animal.
Choix des espèces
Nous utiliserons pour ce projet des souris d'une lignée particulièrement adaptée aux les études de perturbations métaboliques. Ce fond génétique nous permet d’utiliser des souris invalidées pour les récepteurs nucléaires d'interet, de manière à mieux évaluer leurs rôles dans les perturbations métaboliques induites par l’exposition aux contaminants alimentaires. Les animaux seront utilisés à l’âge adulte car nous nous intéressons à l'effet des contaminants sur le métabolisme de l'individu adulte.
Développement de l’imagerie couleur (K-edge) des processus fonctionnels des maladies pulmonaires en combinaison avec des agents de contraste dédiés dans les modèles animaux rats, lapins et porcs.
- Recherche fondamentale
- Système respiratoire
Lapins : 220
Cochons : 84
Jusqu'à neuf séances d'imagerie sous anesthésie pour les rats, une chirurgie puis jusqu'à sept séances de deux heures trente pour les lapins et les cochons : 336 animaux non-humains, 32 rats, 220 lapins et 84 cochons, vont être utilisés dans des procédures dont la gravité déclarée va de l'anesthésie sans réveil au niveau de souffrance sévère. Le projet vise à mettre au point des agents de contraste pour un scanner capable d'analyser la composition des tissus pulmonaires, appliqué à l'embolie et à la fibrose. Le porteur choisit les lapins pour des volumes respiratoires et sanguins "comparables à ceux d'un enfant de 4kg", les cochons pour leur taille et leur anatomie respiratoire. Tous sont tués pour prélever leurs organes. La déclaration de gravité monte jusqu'au niveau sévère, quand le porteur ne décrit qu'un "inconfort temporaire" et une "légère douleur passagère".
Objectifs
Certaines maladies pulmonaires, comme l'embolie pulmonaire et la fibrose pulmonaire, altèrent la respiration et peuvent mettre en danger la vie des patients. Pour mieux comprendre ces maladies et améliorer leur diagnostic, ce projet utilise un scanner médical avancé capable d’analyser la composition des tissus pulmonaires avec une grande précision. Cette nouvelle technologie nécessite la mise au point de nouveaux agents de contraste innovants. Pour cela, des études seront menées sur des modèles animaux dont l’anatomie pulmonaire est proche de celle des humains
Bénéfices attendus
Ce projet vise à améliorer les techniques d’imagerie médicale pour mieux détecter certaines maladies pulmonaires. Grâce à l’utilisation de nouveaux produits de contraste, il pourrait permettre d’identifier plus précisément les zones touchées et d’obtenir des informations plus détaillées sur l’évolution de ces maladies. En apportant une meilleure visibilité des atteintes pulmonaires, cette avancée pourrait améliorer le diagnostic et le suivi des patients à l’avenir
Procédures
Rats : 32 animaux ont subi 1 administration de produit sous anesthésie et 9 séances d’imagerie sous anesthésie (1h à J0 et 15 minutes à J1 et J7 ). Lapin : Modèle 1 (4h sans réveil) 101 animaux ont subi 1 intervention chirurgicale sous anesthésie (durée 1h30), 5 administrations de produit sous anesthésie, et 7 séances d’imagerie sous anesthésie (2h30). Modèle 2 J0 (3h) 119 animaux ont subi 1 intervention chirurgicale sous anesthésie (45 minutes), 5 administrations de produit sous anesthésie, et 6 séances d’imagerie sous anesthésie (2h30). Modèle 2 J21 (3h) : 119 animaux ont subi 1 intervention chirurgicale sous anesthésie (45 minutes) 8 administrations de produit sous anesthésie, et 5 séances d’imagerie sous anesthésie (2h30). Porcs : Modèle (4h sans réveil) 33 animaux ont subi 1 intervention chirurgicale sous anesthésie (durée 1h30) 5 administrations de produit sous anesthésie, et 7 séances d’imagerie sous anesthésie (2h30). Modèle 2 J0 (3h) 51 animaux ont subi 1 intervention chirurgicale sous anesthésie (45 minutes), 8 administrations de produit sous anesthésie, et 5 séances d’imagerie sous anesthésie (2h30). Modèle 2 J21 (3h) : 51 animaux ont subi 1 intervention chirurgicale sous anesthésie (45 minutes) 5 administrations de produit sous anesthésie, et 4 séances d’imagerie sous anesthésie (2h30).
Impact sur les animaux
Certaines étapes du projet peuvent entraîner un inconfort temporaire pour les animaux. Les injections et prises de sang peuvent provoquer une légère douleur passagère. La préparation de la peau pour la tonte peut générer un stress léger de courte durée. L’anesthésie et la chirurgie peuvent causer un stress modéré, parfois accompagné d’effets secondaires légers, comme une gêne respiratoire passagère. L'administration de certains traitements peut aussi entraîner une fatigue ou une diminution temporaire de l’appétit.
Devenir
Tous les animaux sont euthanasiés car des organes doivent être prélevés pour analyse en microscopie, histologie
Remplacement
Le projet se fonde sur l'imagerie du poumon grâce à de nouveaux agents de contraste. La faisabilité de ces agents de contraste à interagir avec l'organisme in vivo ainsi que de marquer les processus recherchés du projet (ventilation, perfusion, inflammation) est à ce jour inconnue. Avant d'utiliser des animaux vivants, des tests sont faits sur des poumons provenant de l'industrie alimentaire (lapins, cochons). Cela permet d'améliorer la précision des tests sur les animaux vivants et de réduire leur nombre nécessaire pour l’étude.
Réduction
Ce projet implique l'utilisation de 336 animaux dont une phase pilote sur la biodistribution et la biotolérances de 8 agents de contraste chez les rats. Pour les lapins, le nombre d'animaux a été calculé pour s'assurer qu'on puisse détecter des différences significatives dans les images, comme celles entre un animal malade et un animal en bonne santé. Cela permet de garantir que les résultats soient fiables. Pour les porcs un effort de réduction est entrepris puisque un certain nombre seront utilisés pour les 4 agents de contrastes et les 2 voies d’administration. Le nombre d’animaux a été déterminé en tenant compte de deux contraintes : la quantité d’agent de contraste nécessaire et les différences naturelles entre chaque individu observées dans les études précédentes. Les techniques d’imagerie non invasive, permettent de suivre les mêmes animaux dans le temps, réduisant le besoin de grands effectifs pour des études distinctes.
Raffinement
Les animaux seront hébergés en collectivité, au sol dans des boxes (lapins et porcs) et des cages (rats) dédiés avec alimentation et eau ad libitum. Les animaux seront suivis de manière quotidienne, manipulés par le personnel de zootechnie pour réduire toute forme de stress. Ils seront pesés pour un suivi de gain de poids qui permettra le bon calcul des doses à administrées le jour de l’expérimentation. Les paramètres environnementaux de la pièce seront également relevés quotidiennement. Le raffinement est appliqué, par l’utilisation de boxes/cages enrichis : foin, abris, bâton et bloc de cellulose à ronger pour les lapins. Foin et jouets de différentes textures pour les cochons. Tunnel, abri, nid et bloc de bois à ronger pour les rats. Ceux-ci leur permettent d’exprimer au mieux leur comportement naturel. La règle de raffinement est aussi mise en place au cours de la procédure via des traitements analgésiques, anti-inflammatoires et une grille de suivi adaptés.
Choix des espèces
• Rat : stade adultes, 300 à 450 g, Choisi dans un premier temps pour les tests initiaux de faisabilité et pour sa taille qui est adaptée à la résolution du scanner. Ils permettent d’obtenir des données préliminaires avant de passer à des espèces plus proches de l'Homme. • Lapin : stade jeunes adultes, d’environ 3 à 6 mois, de 3-4 kg Choisi pour sa physiologie pulmonaire proche de celle de l'Homme, ce qui permet de simuler des conditions humaines avec des volumes respiratoires et sanguins comparables à ceux d'un enfant de 4kg. • Porc : stade jeunes adultes, d’environ 3 mois, ayant un poids entre 30 et 40 kg. Le porc est un modèle adapté pour la recherche clinique, car sa taille, son poids et son anatomie, notamment le système respiratoire, sont proches de ceux de l’Homme. C’est une espèce clé pour les tests précliniques qui visent à transposer les résultats chez l'Homme.
L’implantation sous-cutanée chez le rat : un modèle pour évaluer la biocompatibilité de matériaux destinés à la régénération osseuse
- Recherche appliquée
- Autres troubles humains
Pour tester la biocompatibilité de biomatériaux destinés à la régénération osseuse, 15 rats Wistar adultes vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacun subit une chirurgie dorsale d'environ trente minutes, au cours de laquelle huit échantillons sont implantés sous sa peau, avec un risque d'infection ou de réouverture de la plaie. Les rats sont tués groupe par groupe, à chaque temps expérimental, pour l'analyse histologique des implants. Le porteur justifie le choix du rat parce qu'il "est utilisé dans de nombreuses études", et annonce déjà, si les résultats sont satisfaisants, une validation "chez le gros animal".
Objectifs
Les pertes de substances osseuses représentent un défi en chirurgie orale et orthopédique. En clinique, l'utilisation de greffe autologue est très répandue mais présente certains inconvénients (chirurgie additionnelle, morbidité du site donneur...). Ainsi, le développement de biomatériaux en régénération osseuse est indispensable pour pallier ces limitations. Pour évaluer la biocompatibilité des biomatériaux étudiés, nous souhaiterions avoir recours à un modèle animal déjà développé et maîtrisé au sein de notre unité. Ce modèle est facile à mettre en œuvre et reproductible. Le modèle sous-cutané chez le rat adulte réalisé au niveau dorsal est le modèle choisi afin d’évaluer la bicompatibilité des biomatériaux implantés.
Bénéfices attendus
Ce projet permettrait le développement de nouveaux dispositifs médicaux (membranes pour la régénération osseuse guidée) dans le domaine de l'ingénierie tissulaire osseuse dans la perspective d’une utilisation en clinique.
Procédures
Les animaux auront une chirurgie cutanée au niveau dorsal (implantation sous-cutanée de conditions expérimentales). L’intervention a lieu une seule fois et dure environ 30 mn par animal.
Impact sur les animaux
L'implantation en site sous-cutané peut entraîner une douleur modérée. De rares complications post-opératoires sont à envisager : infection, notamment en cas de rejet du matériel implanté, ou réouverture de la plaie.
Devenir
Après l'implantation, les animaux de chaque lot correspondant à un temps expérimental donné seront mis à mort à l’issu de ce temps expérimental. Des analyses histologiques seront ensuite réalisées sur ces animaux.
Remplacement
La cytotoxicité des matériaux utilisés aura au préalable était évaluée in vitro selon les recommandations de la norme NF EN ISO 10993. En suivant, les produits destinés à être implantés chez l'humain doivent nécessairement être testés chez l'animal avant les essais cliniques. Les matériaux doivent être d'abord testés dans modèle de rat, et si les résultats obtenus sont satisfaisants, d'autres essais seront envisagés permettant de valider tous les aspects nécessaires à une future application chez l'Homme. Ces différentes phases ne peuvent être remplacées actuellement dans le processus de validation d'un nouveau dispositif médical.
Réduction
Ne seront testés in vivo que les matériaux ayant démontré une absence de cytotoxicité in vitro , et une seule lignée de rats sera utilisée. De plus, afin de réduire le nombre de rat, 8 échantillons seront implantés par animal. Enfin, la même lignée de rats que celle déjà utilisée au sein de notre unité est choisie, afin de diminuer le nombre de conditions à évaluer et d'éviter l'ajout de rats supplémentaires pour cette évaluation.
Raffinement
Pour réduire l’angoisse : une période d’adaptation d’une semaine sera respectée avant le début des expérimentations. Une cage après l’autre sera amenée à la salle de chirurgie, séparée de la zone d’hébergement des animaux pour éviter toutes sources de stress des animaux opérés et des animaux à opérer. Avant la chirurgie, les animaux recevront des analgésiques afin de prévenir toute douleur lors de l'opération. Ils seront ensuite anesthésiés dans une chambre à induction puis maintenue anesthésiés au masque avec de l'isoflurane. Après la chirurgie, chaque rat se réveille dans une cage à part pour éviter le contact avec des congénères non anesthésiés. Après le réveil complet, le rat sera réintégré à sa cage d’origine. Les animaux seront ensuite observés sur une semaine. Toutes les modifications de comportement et d’aspect seront consignées dans un fichier informatique par les personnes impliquées directement dans ce projet. Une grille de score basée sur des critères significatifs sera mise en place et des points limites adaptés seront utilisés. Un arbre décisionnel sera suivi pour déterminer la conduite à tenir, incluant la mise à mort en fonction de critères d'arrêt de souffrance définis. Un raffinement est également mis en place lors de l'hébergement : les animaux sont avec leurs congénères avec présence de litière en copeaux de peupliers et de jouets, ainsi que des bâtons à ronger qui sont régulièrement mis dans les cages.
Choix des espèces
Le Rat est une espèce adaptée à la première étape de validation chez l'animal de matériaux destinés au traitement des pertes osseuses. Le rat permet de valider la biocompatibilité du produit. De plus, il est utilisé dans de nombreuses études. La lignée choisie est d’ailleurs volontairement identique à celle utilisée par d’autres travaux réalisés également au sein de notre unité, permettant la comparaison des résultats ainsi que la diminution du nombre d’animaux nécessaires, par la reprise de données déjà disponibles. En cas de résultats satisfaisant et supérieurs à ce qui est obtenu avec les produits de référence actuellement sur le marché, une validation chez le gros animal sera nécessaire. Des rats Wistar adultes de 9 à 10 semaines, d'un poids d'environ 350 g seront utilisés. En effet les animaux utilisés doivent avoir achevé leur développement et leur croissance.