Procédures modérées

Capturées au filet maillant dérivant, démaillées en sectionnant les mailles autour de leur corps, endormies à la benzocaïne puis équipées d'un émetteur acoustique poussé dans l'estomac par la bouche à l'aide d'un tube. 300 grandes aloses vont être utilisées ainsi, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, avec une trentaine de minutes de captivité par individu. L'espèce est classée en danger critique d'extinction sur la liste rouge de l'UICN, et le projet cherche à mesurer combien de géniteurs meurent en remontant la Loire, entre les barrages et les silures. Toutes sont remises à l'eau à l'endroit exact de leur capture, quelques minutes après le marquage, malgré un risque d'écaillage et de cisaillement que le porteur dit réduit au minimum.

Objectifs

Ce projet a pour but d’estimer la population entrante des grandes aloses Alosa alosa - espèce de poisson migrateur - et de quantifier la répartition de la population et les principales pressions majeures rencontrées lors de leur migration (taux de perte sur la migration (mortalité)), depuis l’estuaire jusqu'aux frayères du bassin versant pendant 2 ans (2025-2026).

Bénéfices attendus

Au niveau local, la mise en place de mesures de conservation pour les grandes aloses (Alosa alosa) doit se faire sur la base d’une identification scientifique, avérée et robuste des pressions affectant la survie des reproducteurs de l’espèce. A ce titre, il est attendu de cette étude de délivrer des informations fiables sur : 1. L’estimation du recrutement de géniteurs de grandes aloses dans l’estuaire d’un grand fleuve (hors procédure). 2. Le taux de pertes sur la migration (mortalité) en pourcentage d’individus marqués par kilomètre du cours d’eau. Il permettra aussi de visualiser spatialement où sont situés les pertes et la part des différentes pressions ciblées qui sont établies par : - Le taux de prélèvement des grandes aloses par la pêcherie professionnelle de l’estuaire (hors procédure) ; - L’évaluation du taux de franchissement par les grandes aloses de 4 seuils sur le fleuve et ses affluents (objet de la présente demande) ; - La contribution relative des grandes aloses dans le régime alimentaire du silure glane à fine échelle temporelle (mensuelle) et large échelle spatiale (2 sites). Cette contribution sera estimée pour la période de migration (février à juin) et durant la reproduction (mai à juillet). 3. Des indications sur le comportement des grandes aloses sur les frayères à fine échelle temporelle (mensuelle) et large échelle spatiale. Ces données seront utilisées dans les plans de gestion des poissons migrateurs et devront in fine permettre d’obtenir des mesures de gestion efficaces pour sauvegarder cette espèce sensible, classée CR (danger critique) sur la liste rouge des espèces menacées en France (Union Internationale de la Conservation de la Nature).

Procédures

Les animaux seront soumis à des procédures de marquages gastriques (sans chirurgie) sous anesthésie pour l'implantation des émetteurs. Il n'y aura qu'une procédure par individu qui durera moins de 30 minutes. Les poissons seront capturés au filet maillant dérivant et démaillés immédiatement après la capture en sectionnant les mailles autour de l’individu. Le démaillage sera donc très bref et effectué dans l’anesthésiant pour la majorité des individus. Un risque de blessure (écaillage, cisaillement) par l’engin de pêche est présent mais réduit à son minimum car les temps de pêche seront réduits au minimum : dès que le filet est posé entièrement, celui-ci est relevé à partir du début de la pose, soit environ 10 minutes. Le temps de captivité temporaire est estimé en moyenne à 30 minutes, incluant la capture, le marquage, la surveillance jusqu’à la relâche.

Impact sur les animaux

Afin d’estimer le taux de mortalité pendant la migration due à la prédation par le silure glane, mais aussi lors du franchissement d’obstacles formés par les constructions humaines, les grandes aloses sont marquées d’émetteur acoustique. Les poissons sont capturés au filet maillant dérivant. Le stress lors de la capture doit être pris en compte et un risque de blessure (écaillage, cisaillement) est présent, mais fortement diminué par le protocole utilisé. En effet, le temps de présence dans le filet par individu est réduit à son minimum car une relève du filet pour démaillage est déclenchée dès qu’un poisson est observé dans le filet. Après avoir libéré des mailles le poisson, celui-ci est transféré dans le bac d’anesthésie (benzocaïne) ou dans un bac d’attente, en restant constamment immergé. Le transfert de l’individu dans les différents bacs (bac d’anesthésie, bac d’attente, etc.) peut induire un stress chez le poisson. La mesure de la longueur de l’individu est faite sous anesthésie (poisson toujours immergé) et le marquage gastrique est fait de la manière suivante : l’émetteur acoustique est inséré dans l'estomac par la bouche à l’aide d’un tube flexible transparent. Une fois l’émetteur placé dans l’estomac, il est relâché via un poussoir. Malgré les précautions prises, lors du marquage par l’insertion gastrique cela peut générer une inflammation de la paroi intestinale dû aux frottements. Mais l’expérience de l’équipe et la robustesse du protocole déjà mis en pratique lors d’une étude précédente en 2022-2023 nous pousse à être confiant sur les faibles effets nuisibles du marquage sur leur migration. Lors de cette étude, la reprise de migration vers l’amont d’individus marqués a été élevée (95%). Pour ce marquage, malgré l’anesthésiant qui agit aussi comme analgésique, le ressenti d’une douleur par l’individu marqué n’est pas à exclure. Le temps de captivité temporaire est estimé en moyenne à 30 minutes, incluant la capture, le marquage, la surveillance jusqu’à la relâche. Aucun effet indésirable est attendu sur l’alimentation du poisson durant cette captivité, car celui-ci ne s’alimente plus lors de sa migration vers les frayères.

Devenir

Tous les animaux marqués seront replacés dans leur milieu naturel, à l'endroit précis de leurs capture, quelques minutes seulement après.

Remplacement

La mortalité sur l’ensemble du trajet de la migration de la grande alose, depuis l’estuaire jusqu’aux lieux de reproduction en amont d’un fleuve, reste trop peu connue en France. Il n’est donc pas possible de remplacer ce modèle écologique par des modèles numériques et/ou physique et/ou de l’analyse de données existantes.

Réduction

Sont compris dans la procédure de la demande d'autorisation de projets de cette étude l’évaluation de la mortalité durant la migration des grandes aloses (Alosa alosa) jusqu’à l’atteinte des zones de reproduction par l’évaluation du franchissement des barrages et de la prédation par le silure glane. Ce taux de perte sur la migration, s’il existe, pourrait être variable en fonction des années, car l’espèce est soumise aux variations des conditions hydrologiques et aux variations de facteurs de mortalité du début (estuaire) à la fin (lieu de reproduction) du trajet de migration : les prélèvements par la pêcherie professionnelle (hors procédure), la prédation par les silures et la rupture de connectivité par les barrages. Ainsi, l’étude doit porter sur une longue durée (deux périodes de migration), avec un effectif suffisant. En 2024, plus de 9 tonnes d’aloses ont été prélevés sur l’estuaire du fleuve. Nous avons choisi de marquer 6 lots de 50 individus sur deux ans, soit 150 individus par an, ce qui équivaut à environ 120 kg. Compte tenu du taux de perte sur la migration (mortalité) estimé en se basant sur celui précédemment estimé sur d’autres espèces migratrices, cet effectif est le minimum pour avoir un effectif final suffisant pour qualifier et quantifier par télémétrie acoustique les différentes pressions présentes (prédation lors de la migration et barrages). Le protocole utilisé permet aussi cette réduction du nombre d’individus à marquer car il y a peu perte immédiate, dues à la pêche et au marquage. Sur une étude récente (2022-2023), 110 grandes aloses ont été pêchées, marquées suivant le même protocole. Cette étude a montré aucun rejet de marque, et un bon taux de reprise de migration, à hauteur de 95%, confirmant la fiabilité et un faible impact de la méthode. Donc 300 grandes aloses (Alosa alosa) seront marquées sur l’ensemble de la période in situ du projet (2025-2026).

Raffinement

Plusieurs mesures sont mises en place afin de limiter les nuisances décrites en amont : stress de la captivité et de la manipulation (capture, transfert du filet vers les bacs de stabulation et d'anesthésie), stress et douleur lors de l'implantation d'une petite balise acoustique dans l'estomac. La capture se fera avec des filets dérivants, afin de limiter les blessures lorsque l’individu se bloque dans les mailles avec un fort courant. De plus, afin de réduire le stress pendant la capture, les temps de pêche seront réduits au minimum : dès que le filet est posé entièrement, celui-ci est relevé à partir du début de la pose, soit environ 10 minutes. Le démaillage sera très rapide. Il se fera par section du filet autour de l’animal pour ainsi limiter les manipulations, diminuer le temps de démaillage et ainsi limiter le stress du poisson. Les marquages gastriques se feront sous anesthésie générale dans une civière de chirurgie remplie d'un bain de benzocaïne et oxygéné par bulleur afin de limiter le stress et la douleur du poisson. Pendant l'endormissement, un opérateur est dédié au maintien et à la surveillance de l’individu immergé, orienté sur le dos contre la paroi de la civière lors du marquage. Le poisson est gardé sous l’action de l’anesthésiant par ventilation mécanique des branchies avec l’eau dans la civière. Un second opérateur sera dédié à l'insertion de l'émetteur acoustique dans l'estomac. De la vaseline est utilisée pour réduire les frottements lors de l’insertion de l’émetteur. En cas de mouvement de l’individu, l’opération est arrêtée et la dose d’anesthésiant est immédiatement augmentée par l’ajout de 25 mg.l-1. L’opération est reprise dès lors que l’animal ne répond plus aux stimulations réflexes (plus précisément dès l’atteinte du stade 4 de l’anesthésie). Si un second ajout de benzocaïne est nécessaire, alors on estimera que le bain n’est plus assez efficace et il sera obligatoirement changé pour les poissons suivants. Après marquage, chaque individu est gardé en surveillance dans un bac de réveil jusqu’à dissipation totale des effets de l’anesthésiant (en moyenne 10 min). Sur l’ensemble des manipulations sur le poisson, de la récupération dans le filet jusqu'à la relâche, celui-ci reste immergé en continue afin de limiter le stress lors des manipulations.

Choix des espèces

La grande alose (Alosa alosa) est une espèce amphihaline classée en danger critique d'extinction (Liste rouge UICN) au niveau national français depuis 2019 ("Critically Endangered" - CR) et depuis 2008 sur le bassin de la Loire. Le stade géniteur est ciblé car il correspond au stade de migration des océans vers les frayères en rivières, période la plus vulnérable du cycle de vie de l'espèce. Toutes les mesures visant à alléger les pressions subies par cette espèce doivent donc être mises en place de manière rapide.

Pour distinguer ce que la perte de dopamine abîme dans la motricité et ce qu'elle abîme dans la prise de décision, 860 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacun subit une chirurgie intracérébrale d'une heure trente, puis des tests quotidiens de 45 minutes pendant 21 jours, répétés trois fois à quatre semaines d'intervalle, avec une restriction alimentaire à 15 ou 16 grammes de croquettes par jour sur toute la durée du test. 172 rats sont opérés une dernière fois sous anesthésie sans réveil, pour prélever leur cerveau. Le RNT annonce 200 rats rendus à l'élevage dans son champ chiffré et 20 animaux replacés vers d'autres projets dans sa narration, sans expliquer l'écart.

Objectifs

La maladie de Parkinson est une maladie qui affecte le système nerveux, entraînant la perte de cellules responsables de la production de dopamine, une substance chimique essentielle pour contrôler les mouvements et certaines fonctions cognitives. Des recherches précédentes sur des rats ont montré que la perte de ces cellules peut nuire à leur capacité à s'adapter à des changements, appelée flexibilité comportementale, ce qui affecte à la fois leurs mouvements et leurs décisions. Ce projet vise à explorer comment la maladie de Parkinson impacte différents circuits neuronaux dans le cerveau, en se concentrant sur deux fonctions principales : la motricité (comment nous bougeons) et les fonctions exécutives (comment nous prenons des décisions). Plus précisément, ce projet cherche à déterminer si la perte de dopamine, selon la flexibilité comportementale initiale des animaux, entraîne des problèmes dans ces deux domaines.

Bénéfices attendus

En comprenant mieux les déficits cognitifs et moteurs, des interventions plus efficaces pourraient être mises en place, améliorant ainsi la qualité de vie des patients. Ces expériences devraient aider à mieux comprendre les mécanismes qui sous-tendent la maladie de Parkinson et comment ces mécanismes se traduisent par des difficultés à la fois dans les mouvements et la prise de décision. Ce projet pourrait non seulement enrichir notre connaissance de la maladie, mais aussi avoir sur le long terme des retombées concrètes sur la prise en charge des patients.

Procédures

Tous les animaux vigiles réaliseront 2 tests comportementaux : 1 test d'une durée de 3 minutes tous les jours pendant 3 jours et 1 autre test d'une durée de 45 minutes tous les jours pendant 21 jours avec 3 répétitions espacées de 4 semaines. Tous les animaux, anesthésiés et sous couverture antalgique, auront une chirurgie intracérébrale d'une durée d'1 heure et 30 minutes. En amont et après la chirurgie, tous les animaux vigiles recevront au total 2 injections sous cutanée d'antalgique (durée de l'intervention : 15 secondes). 172 animaux anesthésiés avec antalgie auront 1 chirurgie sans réveil pour le prélèvement du cerveau.

Impact sur les animaux

Les tests comportementaux peuvent induire un léger stress transitoire dû à l'isolement de l'animal au cours de la réalisation du test 2 et à la légère contention au cours du test 1. La chirurgie peut induire un léger stress au réveil des animaux ainsi qu'une légère perte de poids et des douleurs/un inconfort au cours de premiers jours suivant l'acte chirurgical qui sont minimisés par une couverture antalgique. L’induction de la maladie va induire un ralentissement global de l’activité locomotrice et des difficultés de motricité fine. Inconfort transitoire de la contention ou léger stress lors de la pesée hebdomadaire. Lors du suivi post chirurgical, l’animal peut ressentir un inconfort lors de l’injection d’analgésique en sous cutané. La restriction alimentaire (15-16g de croquettes/ animaux/jour) durant 21 jours lors de la phase du test 2 peut induire un léger stress.

Devenir

Tous les animaux de la procédure seront mis à mort en fin afin de récupérer les cerveaux pour analyse 20 animaux seront replacés pour être utilisés dans d’autres projets. La décision est prise par le porteur de projet.

Remplacement

Les approches de modélisations informatiques ou basées sur des cultures cellulaires sont impossibles à mettre en place dans ce projet puisque nous nous intéressons aux modifications de réseaux neuronaux et aux comportements associés.

Réduction

Le nombre d’animaux dans chaque groupe expérimental a été calculé à l'aide d'un test statistique qui tient compte de la variabilité du vivant et permet d'obtenir des résultats robustes. La standardisation des conditions expérimentales et la maitrise des facteurs environnementaux décrits dans le paragraphe raffinement contribuent à limiter la variabilité.

Raffinement

Les expérimentations sont réfléchies de façon à minimiser au maximum l’inconfort, la douleur, la détresse ou l’angoisse des animaux au cours des différentes procédures de ce projet. Lors de la chirurgie nous aurons recours à l’anesthésie générale (gazeuse, facilement modulable et permettant un réveil rapide et plus confortable) avec surveillance de la température corporelle, additionnée d’une anesthésie locale en présence d’antalgique. Le traitement antalgique sera poursuivi au lendemain de la chirurgie soit 48h de couverture antalgique. Des points limites gradés, précis et adaptés ont été définis de façon à obtenir un arbre décisionnel en fonction des observations faites et aboutir à une gestion optimale de ceux-ci. Des critères d'arrêt de souffrances sont définis. Les animaux sont hébergés deux par cage avec eau et nourriture ad libitum. L’hébergement en animalerie est réalisé en portoir ventilé, dans des pièces à température et hygrométrie régulées et contrôlées selon les normes en vigueur. Un enrichissement avec des bâtons de bois est mis dans les cages d'hébergement permettant aux rats d'assouvir leur besoin de ronger. Les animaux sont manipulés au minimum de façon hebdomadaire tout au long du projet permettant une habituation à un binôme d’expérimentateurs, qui reste le même tout au long de l’étude.

Choix des espèces

L’espèce animale utilisée est le rat. La lignée de rat a été choisie en raison des données déjà disponibles pour la modélisation de la maladie de Parkinson. De plus, ces rats viennent de croisements entre différentes familles, ce qui réduit la consanguinité (ils ne sont pas tous très proches génétiquement). Cela permet de maintenir une diversité génétique, offrant ainsi un meilleur reflet de la variabilité observée chez l’Homme et permettant d’obtenir des groupes présentant des flexibilités comportementales différentes. Les animaux seront utilisés à l'âge adulte (11 semaines au moment de la chirurgie) puisque nous avons besoin d'avoir des circuits et systèmes neuronaux entièrement développés

4 524 souris vont être utilisées, toutes tuées pour des analyses post-mortem, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Des cellules tumorales leur sont greffées sous la peau du flanc, puis viennent des injections dans l'abdomen quatre jours par semaine pendant trois semaines, et pour un groupe une irradiation de sept minutes trente sur animal vigile suivie d'une greffe de moelle osseuse. Le porteur écrit que les traitements ne provoquent pas d'effets indésirables, et indique par ailleurs que l'irradiation entraîne diarrhée et perte de poids pendant plusieurs semaines et qu'une nécrose peut apparaître sur la tumeur en fin d'expérience. Aucun antalgique n'est prévu pour ces souris porteuses de tumeurs, le porteur s'appuyant sur des recommandations internationales en cancérologie expérimentale pour leur substituer un suivi rapproché et des points limites précoces.

Objectifs

Les cellules dendritiques sont les sentinelles du système immunitaire. Elles patrouillent dans les tissus qu’elles échantillonnent à la recherche de signaux de danger (infection, tumeur), et sonnent l’alerte en activant dans les ganglions lymphatiques les lymphocytes T spécifiques de l’origine du danger. La mise en place d’une réponse des lymphocytes T est essentielle à la lutte contre les tumeurs, Une réponse immunitaire efficace et les stratégies actuelles d’immunothérapies visant à augmenter la réponse T reposent donc sur deux fonctions essentielles des cellules dendritiques : la migration et l’échantillonnage. Nous avons identifié une protéine qui est naturellement activée par les signaux de danger dans les cellules dendritiques au cours d’une réponse immunitaire, et qui augmente leur migration in vitro et in vivo. Cette protéine peut être activée chimiquement par des molécules spécifiques. Nos résultats préliminaires utilisant l’activateur « A1 » de cette protéine ont montré que A1 stimule la migration des cellules dendritiques in vitro sans affecter les fonctions d’échantillonnage, qu’A1 n’est pas toxique in vivo, et que l’utilisation de A1 permet d’augmenter la sensibilité de certaines tumeurs aux traitements par inhibiteur de points de contrôle (thérapies qui stimulent le système immunitaire afin d'éliminer la tumeur). . Ce projet a pour objectif d’évaluer le potentiel thérapeutique de l’activateur A1, sur la réponse immunitaire anti-cancéreuse, seul ou en combinaison avec des inhibiteurs de points de contrôle, et ce dans différents modèles tumoraux.

Bénéfices attendus

Ce projet nous permettra de déterminer si la molécule A1 peut être utilisée pour améliorer la réponse aux traitements d'immunothérapie dans les tumeurs solides qui ne répondent actuellement pas ou peu à ces traitements. Cela permettra aussi de mieux comprendre les mécanismes immunitaires déterminants dans la réponse ou la non-réponse à ce type de traitements, et ouvrira de nouvelles perspectives thérapeutiques.

Procédures

Dans un premier lot, des cellules tumorales seront injectées aux animaux anesthésiés (1 fois – durée anesthésie inf 5 min). Les animaux seront ensuite traités par des injections dans l’abdomen à raison d’une injection/jour, 4 fois/semaine pendant 3 semaines au maximum. Dans un second lot, des souris vigiles seront irradiées pendant 7min30. Les souris seront anesthésiées pour recevoir une injection de cellules de moelle osseuse (1 fois – durée anesthésie inf 5 min). Des cellules tumorales seront injectées aux animaux anesthésiés (1 fois au– durée anesthésie inf 5 min) Puis les animaux seront traités par des injections dans l’abdomen à raison d’une injection/jour, 4 fois/semaine pendant 2 semaines. Dans un 3ème lot, des cellules tumorales seront injectées aux animaux anesthésié (1 fois– durée anesthésie inf 5 min). Les animaux seront traités par des injections dans l’abdomen à raison d’une injection/jour pendant 2 jours. Un prélèvement de sang par la sera effectué juste avant la mise à mort des souris. Dans un 4ème lot, des cellules tumorales seront injectées aux animaux anesthésié (1 fois– durée anesthésie inf 5 min). Des cellules fluorescentes seront injectés aux animaux anesthésiés (1 fois – durée anesthésie inf 5 min). Les animaux seront ensuite traités par une injection dans l’abdomen. Dans un 5ème lot, des cellules tumorales seront injectées aux animaux anesthésié (1 fois– durée anesthésie inf 5 min). Des cellules seront injectées aux animaux anesthésiés (1 fois– durée anesthésie inf 5 min). Les animaux seront ensuite traités par une injection dans l’abdomen. Dans un 6ème lot, des cellules tumorales seront injectées aux animaux anesthésié (1 fois– durée anesthésie inf 5 min). Des cellules seront injectées aux animaux anesthésiés (1 fois– durée anesthésie

Impact sur les animaux

Les effets indésirables observés sont ceux liés au développement de tumeurs en sous-cutanée sur le flanc des animaux. Etant donné que nos observations se font à des temps précoces de la croissance tumorale, la taille de la tumeur reste modérée et ne gêne pas les déplacements de l’animal. Une nécrose peut apparaitre sur la tumeur en fin d’expérience. L'irradiation peut provoquer une diarrhée et une perte de poids chez les souris pendant quelques semaines. Les différents traitements sont non toxiques et ne provoquent pas d'effets indésirables chez les souris. Leur administration entrainera une légère douleur de courte durée liée à la piqûre elle-même.

Devenir

Dans toues les procédures, les animaux sont mis à mort pour des analyses post-mortem.

Remplacement

Nos résultats in vitro ont démontré le potentiel du composé A1 pour stimuler la migration des cellules dendritiques, et nous ont permis de comprendre les mécanismes moléculaires associés. Pour analyser les effets sur la réponse immunitaire anti-tumorale de ce composé, rien ne peut remplacer un modèle animal où les cellules sont confrontées à leur environnement physiologique. Aussi, malgré le développement de méthodes alternatives auxquelles le laboratoire a eu recours, l’utilisation du modèle Souris reste indispensable pour le présent projet. Pour évaluer la migration dans un tissu, entre deux tissus (par exemple la tumeur et les ganglions), et les effets sur la croissance tumorale et sur la réponse immunitaire, il est à ce stade du projet indispensable de réaliser des expériences in vivo chez la souris.

Réduction

Chaque tumeur sera coupée en 2 échantillons afin de réaliser plusieurs analyses (imagerie et cytométrie) sur la même tumeur pour permettre de réduire le nombre d’animaux utilisés. Notre projet est basé sur une suite d’étapes expérimentales dont les résultats conditionnent le passage à l’étape suivante. Nous ne procéderons à l'étude de la manière dont la réponse immunitaire est précisément affectée par le traitement que dans le groupe de souris traitées pour lesquelles nous observons un effet positif du traitement sur la croissance de la tumeur. Les résultats seront analysés par des approches statistiques.

Raffinement

En accord avec les recommandations internationales dans le domaine de la cancérologie, les animaux sont suivis attentivement tous les deux jours (poids, aspect et comportement). En effet, conformément aux guides de la Commission Européenne et aux recommandations internationales en cancérologie expérimentale, le raffinement de ces modèles ne fait pas appel à des antalgiques mais à un suivi rapproché pour déterminer des points d’arrêt les plus précoces possibles. Une grille de score permettra d’évaluer de manière objective l’état des animaux et de mettre en place des points-limite adaptés. L’atteinte d’un point-limite conduira à la mise en place de soins de support voire à la mise à mort de l’animal si la souffrance ne peut être soulagée. Du gel nutritif et hydratant sera donné en complément de l’alimentation habituelle afin de faciliter la prise alimentaire, et limiter la perte de poids et la déshydratation qui peuvent être causés lors de l’irradiation. Un apport de fluide injectable sera également assuré pour en cas de déshydratation. Les gestes nécessitant une immobilisation de l’animal seront effectués sous anesthésie générale.

Choix des espèces

La souris est le modèle de choix pour les études en immunologie anti-cancéreuse, de par la proximité de son système immunitaire avec le système immunitaire humain. C’est également dans ce modèle murin que nous avons à notre disposition les modèles génétiques indispensables à ce projet (souris déficientes pour la protéine d’intérêt, cible de A1). Stade adulte entre 8 et 24 semaines Nous souhaitons travailler sur un système immunitaire adulte.

Une ligature de l'artère pulmonaire gauche de quarante minutes, puis une embolisation des artères du lobe pulmonaire droit chaque semaine pendant six semaines, sous anesthésie générale à chaque fois. 40 cochons vont subir ces opérations dans des procédures classées à un niveau de souffrance modéré, jusqu'à un cathétérisme cardiaque final. Tous seront tués pour analyser leur cœur et leurs poumons au microscope. Le porteur écrit que les animaux seront entretenus dans des conditions contrôlées "pour s'assurer qu'ils ne subissent aucun stress", et décrit par ailleurs une insuffisance cardiaque droite qui s'installera chez tous les opérés, avec essoufflement à l'effort et fatigue.

Objectifs

L'insuffisance cardiaque droite est la principale cause décès de patients atteints d'hypertension pulmonaire (représentant 1 % de la population globale). Cependant, aucun traitement n'existe pour réduire l'apparition de l'insuffisance cardiaque droite. Nos résultats récents suggèrent qu'une protéine (Orai1) serait impliquée dans le développement de la dysfonction ventriculaire droite chez le rat et le porc (résultats en cours de publication). L'objectif de cette étude est donc de déterminer si l’inhibition de cette protéine in vivo est bénéfique pour réduire le développement de l’insuffisance ventriculaire droite. La réalisation de ce projet permettra de valider l'intérêt de notre cible thérapeutique pour réduire le développement de l’insuffisance ventriculaire droite. Les patients atteints de cette pathologie n'ayant actuellement aucun traitement spécifique, ce projet présente une utilité majeure dans la prise en charge de ces malades.

Bénéfices attendus

La réalisation de ce projet permettra de valider l'intérêt de notre cible thérapeutique pour réduire le développement de l’insuffisance ventriculaire droite. Les patients atteints de cette pathologie n'ayant actuellement aucun traitement spécifique, ce projet présente une utilité majeure dans la prise en charge de ces malades.

Procédures

Pour tous les animaux du projet : Sous anesthésie générale les porcs subiront une ligature de l'artère pulmonaire gauche sous anesthésie générale (durée de la chirurgie 40 min), puis une embolisation hebdomadaire des artères pulmonaire du lobe inférieur droit sous anésthésie générale (durée de l'embolisation 20-40min) durant 6 semaines. Des prélèvements de sang (durée du prélevement 5min) seront réalisés au moment de ces procédures par les cathéters mis en place. Lors de l'évaluation hémodynamique finale un cathétérisme cardiaque droit sera réalisé sous anesthésie générale (30 min).

Impact sur les animaux

Les procédures chirurgicales conduiront au développement d'une hypertension pulmonaire et d'une insuffisance cardiaque droites chez tous les animaux opérés. Les effets secondaires et les atteintes cardiaques (essouflement à l'effort, fatigue) sont les conséquences de la mise en place de l'insuffisance cardiaque droite.

Devenir

A la fin de l'étude, tous les animaux seront euthanasiés afin de réaliser des études histologiques sur les tissus cardiaques et pulmonaires.

Remplacement

Le recours à des animaux est indispensable et se justifie par la nécessité d’étudier la fonction cardiovasculaire dans un contexte physiologique et physiopathologique. Il se justifie par l'impossibilité de simuler ex vivo la mise en place de l'hypertension pulmonaire et de l'insuffisance cardiaque droite qui est un processus multifactoriel complexe.

Réduction

Les fonctions cardiovasculaires seront étudiées par des méthodes non invasives (échocardiographie) permettant de limiter le nombre d'animaux utilisés. A la fin de la procédure, des prélèvement d’organes seront réalisés afin de réaliser de nombreuses expériences de biochimie et de biologie moléculaire à partir des différents tissus collectés seront effectuées afin de minimiser encore le nombre d'animaux utilisés. Afin de déterminer le plus précisement possible le nombre nécessaire et suffisant d'animaux, nous avons utilisé un test statistique adéquat.

Raffinement

Les animaux seront surveillés quotidiennement (évaluation quotidienne et des points limites précoces sont prévus) et leur entretien sera effectué dans des conditions soigneusement contrôlées pour s'assurer que les animaux ne subissent aucun stress. Les procédures chirurgicales seont réalisées sous anesthésie générale balancée combinant hypnotique et analgésique. Avant la chirurgie les animaux seront préparés chirurgicalement (lavage chirurgical, rasage de la zone d'intérêt et pesage afin d'ajuster les médications, champs stérile...). La procédure conduira à une insuffisance cardiaque droite, les animaliers surveilleront quotidiennement l'apparition de points limites précoces, notamment l'essoufflement lors des déplacements ou la perte de poids afin d'adapter les dépacements et le nourissage des animaux. L'eau ainsi que la nourriture sera à disposition libre pour les animaux.

Choix des espèces

L'analyse physiopathologique de l’insuffisance ventriculaire droite nécessite une analyse précise de la fonction et de l’histologie ventriculaire droite, une analyse de la fonction des cardiomyocytes ventriculaires droits ainsi que l’histologie pulmonaire dans nos différentes conditions expérimentales. Pour ces raisons, l'utilisation de tissus humains n'est pas envisageable. Le coeur du porc est très similaire à celui de l’homme, ce qui rendra nos résultats plus pertinents vis à vis de la pathologie humaine. Nous utliserons de jeunes porcs adultes. A ce stade de développement (pleine phase de croissance) l’induction de l’insuffisance vetriculaire droite est plus rapide.

Pour calculer des marges de sécurité avant la première administration de médicaments à des êtres humains, 720 souris, 840 rats et 800 lapins vont être utilisés dans 65 études, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils reçoivent les composés par voie orale, intramusculaire, sous-cutanée ou intraveineuse, sur des durées allant d'un jour à six mois, avec prélèvements de sang, de tissus, de fèces, d'urine, de salive et de larmes. Des mises à mort intermédiaires sont prévues pour prélever les tissus aux différents temps de l'étude. Le porteur écrit à deux reprises que ce projet est "indispensable" à la première administration chez l'humain, sans que la nature des composés testés soit précisée.

Objectifs

L'objectif de ce projet est de déterminer les propriétés pharmacocinétiques et pharmacodynamiques d'un ou plusieurs composés pharmaceutiques après administration unique ou répétée chez des rongeurs ou des lagomorphes. La réalisation de ce projet est indispensable à la réalisation de la première administration chez l'Homme, conformément aux lignes directrices ICH S3 M2 et ICH S3 (TK).

Bénéfices attendus

L'ensemble des études du projet vise à identifier un profil métabolique, pharmacocinétique, pharmacodynamique de biodistribution permettant le calcul de marge de sécurité chez l'Homme en gardant à l'esprit en permanence le ratio bénéfice/risque du produit concerné pour la santé humaine. La réalisation de ce projet est indispensable à la réalisation de la première administration chez l'Homme.

Procédures

Les animaux sont traités par différentes voies (principalement orale mais aussi intramusculaire, sous- cutanée ou intraveineuse…) de façon journalière (voire plusieurs fois/j) hebdomadaire, ou de manière plus espacée (ex: toutes les 2 semaines, mensuel), avec le(s) produit(s) d’intérêt. La durée de l’administration est généralement rapide (quelques secondes à quelques minutes) et peut atteindre 1 heure dans le cas de perfusion intraveineuse. La durée des études peut être courte (1j) ou longue [1 semaine, 2 semaines, 1, 3, ou 6 mois]. Des prélèvements sanguins, tissulaires, de fèces, urinaires ou/et de fluides corporels (salive, larmes) seront réalisés au cours du temps et analysés afin de déterminer les niveaux du ou des composés administrés, de leurs métabolites ou d’autres marqueurs pharmacologiques pour permettre l’analyse pharmacocinétique, pharmacodynamique et de biodistribution. D’autres prélèvements sanguins ou urinaires sont également possibles pour bilan urinaire, hémato-biochimique ou hormonal par exemple. L’ensemble de ces prélèvements sont réalisés à une fréquence et aux volumes conformes aux recommandations éthiques en vigueur. Tout prélèvement dépassant ces recommandations devra être justifié et fera l'objet d'une réévaluation par le comité d'éthique (balance bénéfice/contrainte pour l'animal). Les animaux seront examinés quotidiennement afin de déceler tout signe clinique. Les consommations alimentaire et/ou hydrique pourront être suivies. Des examens ophtalmologiques, échographiques, radiologiques, comportementaux peuvent être réalisés. Le poids corporel sera mesuré à différents temps au cours du projet. Les animaux seront euthanasiés à la fin du projet et un examen microscopique sera réalisé sur les tissus collectés si nécessaire. La manipulation des animaux durant les interventions est généralement inférieure à 1h/animal/jour (en considérant par ex. 1 journée avec 1 administration + 6 prélèvements sanguins soit environ 30 min). Jusqu’à une vingtaine d’interventions peuvent être réalisées par animal et par semaine (en considérant par exemple 1 administration quotidienne et 12 prélèvements sanguins dans la semaine). Une mise en diurèse n’excédant pas 16h est aussi possible. Une mise à jeun temporaire (en présence d’eau) peut être nécessaire (maximum 16h) pour les rongeurs. Dans certaines situations, les animaux peuvent être soumis à un hébergement individuel dans leur cage (en cas d’agressivité ou de soins individuels par exemple).

Impact sur les animaux

Les effets indésirables attendus correspondent aux effets pharmacologiques du produit administré (ex : action au niveau du système nerveux central), à l’inconfort, au stress et/ou à la douleur transitoires liés aux procédures [prélèvements, administration répétée, contention, mise à jeun éventuelle (uniquement pour les rongeurs)] et/ou aux effets systémiques (exemples : pertes de poids, baisse de consommation alimentaire) qui peuvent être observés. Un hébergement en individuel (rare), avec contacts olfactifs, visuels et sonores préservés et enrichissements additionnels, peut être requis (ex. pour suivre la consommation alimentaire individuelle ou pour des études par voie dermale).

Devenir

En parallèle des prélèvements sanguins, réalisés au cours de l’étude, l’évaluation de la pharmacocinétique, de la pharmacodynamie et de la biodistribution, peut nécessiter des euthanasies intermédiaires afin d’effectuer des prélèvements tissulaires et/ou une analyse histopathologique selon les différents temps de prélèvements définis dans l’étude. Ceci pour permettre l'évaluation de l'exposition du composé ou des composés dans le tissu cible, et /ou pour évaluer les potentiels effets toxiques sur les organes et tissus, respectivement. A ce titre tous les animaux de ce projet seront euthanasiés en fin d’étude.

Remplacement

L'évaluation pharmacocinétique, pharmacodynamique et de la biodistribution d'un composé ou de plusieurs composés administrés dans un organisme complet ne peut pas être réalisée qu'avec des études in vitro, car il n'existe pas d'alternative complète in vitro pour ce type d'évaluation en raison de la complexité d'un organisme vivant. Seule l’observation sur un organisme vivant dans son ensemble permet d’évaluer les différentes phases d’absorption, de métabolisme, de distribution et d’élimination du/des composé(s), de définir les relations et/ou interactions entre ces différentes phases et de pouvoir déterminer l’exposition du/des composé(s) administré(s) dans l’organisme.

Réduction

Le nombre d'animaux par groupe est très variable en fonction du design de l’étude et du nombre de doses testées. En effet, des animaux des deux sexes seront utilisés uniquement pour permettre l'évaluation de l'effet du sexe sur les paramètres pharmacocinétiques et pharmacodynamiques et sur la biodistribution. Par ailleurs, il peut y avoir une comparaison avec des composés de référence, un criblage de plusieurs produits, etc. Mais le nombre d’animaux par groupe correspondra au minimum permettant une analyse statistique fiable, conformément aux recommandations des lignes directrices. Ce projet permettra de réaliser 65 études, 35 chez le rat; 10 chez la souris et 20 chez le lapin, avec un nombre d'animaux déterminé à minima afin d'obtenir des résultats robustes et fiables permettant d'atteindre tous les objectifs de l'étude en procédant à toutes les analyses nécessaires.

Raffinement

En général, les doses utilisées sont des doses pharmacologiques, faibles et similaires à celles utilisées chez l'Homme. L'état général des animaux est surveillé quotidiennement. Les paramètres suivants peuvent être contrôlés régulièrement afin d’évaluer l’état de santé des animaux : poids corporel et consommation de nourriture et d’eau, température corporelle, signes cliniques, morbidité/mortalité, etc. Toute anomalie est signalée au Directeur d’étude et/ou au vétérinaire selon la sévérité et le degré d’urgence. Si un ou plusieurs points limites sont atteints (perte de poids continue, signes locaux ou généraux ne pouvant être traités/soulagés par des soins (ex : antibiotique/anti- inflammatoire), que la douleur de l’animal ne peut être soulagée ou que l’inconfort ne peut pas être suffisamment limité à son minimum, la décision d'interrompre le traitement ou d'euthanasier l'animal sera prise. Des prélèvements sanguins seront effectués selon les bonnes pratiques vétérinaires de fréquence et de volume. Certains traitements sont réalisés sous anesthésie locale ou générale pour éviter le stress, le douleur ou l’inconfort, par ex : les administrations intramusculaires et intra-articulaires. Les rongeurs et les lapins sont hébergés en groupe dans la majorité des situations. Cependant, soit en raison d'incompatibilités sociales observées parfois chez le lapin ou les souris mâles, soit dans certaines situations expérimentales rares (rongeur uniquement) un hébergement individuel peut être nécessaire. Il devra être dûment argumenté (ex : voie d’administration dermale, bilans d'élimination en collectant les urines et fèces). Le cas échéant, des enrichissements supplémentaires seront proposés et le contact visuel et olfactif sera maintenu.

Choix des espèces

Les espèces rat, souris et lapin sont des espèces de laboratoire très largement utilisée en recherche biomédicale (littérature et connaissance très larges) et sont couramment utilisées pour l'évaluation pharmacocinétique, pharmacodynamique et de la biodistribution et acceptées par les autorités. Le choix de l’espèce/souche est dicté par différents facteurs : résultats déjà existants (essais préliminaires in vitro et in vivo), voie d'administration choisie, métabolisme vitro et/ou pharmacocinétique/pharmacodynamique. De façon standard, les rats, souris et lapins seront âgés de 6 à 10 semaines, 6 à 8 semaines et 3 à 4 mois, respectivement, correspondant à un niveau « jeune adulte » de croissance et de développement nécessaire et suffisant pour conduire les expérimentations. Toutefois, ce projet pourra être effectué avec des animaux juvéniles ou avec des animaux plus âgés (> 1 an) en fonction de l’objectif de l’évaluation et de manière à ce que l’état physiologique de l’animal permette une réponse non équivoque des systèmes analysés après traitement avec le(s) composé(s) et ainsi permettre une évaluation adéquate des paramètres ciblés. Les animaux ne doivent pas être gravides.