Procédures modérées

Les souriceaux visés ont 1 à 3 jours, âge auquel l'os du crâne reste assez souple pour y enfoncer une aiguille sans incision. 972 souris nouveau-nées sont utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées, soit en cours d'étude si les points limites sont franchis, soit à la fin pour prélever leurs tissus. Chacune reçoit une injection intracérébrale de composé candidat sous anesthésie gazeuse, avec pour risques déclarés un retard de croissance, une absence de prise de poids jusqu'au sevrage, un rejet par la mère et une atteinte des mouvements spontanés ou du comportement de recherche de la tétée. Les mères et les souriceaux non traités, qui ne comptent pas dans les 972, sont soit utilisés pour la formation à des gestes techniques, soit basculés vers un autre projet d'évaluation de composés.

Objectifs

En France, le nombre de personnes atteintes de maladies rares (moins d’une personne atteinte sur 2000) est estimé à 3.5 millions. Plus de 7000 maladies rares, dont 800 neurologiques, sont décrites, et de nouvelles sont identifiées chaque semaine. Les maladies rares sont généralement sévères, chroniques et handicapantes. L’atteinte pour certaines d’entre elles peut provoquer des signes cliniques pathologiques dès la naissance ou l’enfance (entre 3 mois et 6 ans), comme les encéphalopathies épileptiques et/ou développementales (Developmental Epileptic Encephalopathies ou DEEs). Les DEEs sont des maladies neurodéveloppementales rares, génétiques et syndromiques, caractérisées par une déficience intellectuelle, des troubles du langage, un développement moteur potentiellement altéré et des crises d'épilepsie d'apparition précoce, souvent accompagnées d'une régression du développement. Les traitements actuels (médicaments antiépileptiques) sont peu efficaces pour les formes rares, et les interventions chirurgicales sont lourdes et risquées chez les jeunes enfants. Il est nécessaire d’explorer de nouvelles approches thérapeutiques pour améliorer la qualité de vie et l’apprentissage des patients. Les composés étudiés, sélectionnés après des tests in silico et in vitro, sont testés chez la souris adulte afin d’évaluer leur tolérabilité et leur efficacité sur une cible d’intérêt. Les meilleurs candidats sont retenus et testés chez la souris nouveau-née (phases de développement cérébral similaire entre un souriceau de 3 jours et un nourrisson humain de 3 mois) afin d’évaluer leur effet dans le cadre du traitement des maladies épileptiques rares, et destinés à être administrés à de jeunes enfants (à partir de 3 mois). Il est essentiel d’évaluer l’effet de nos candidats médicaments pendant les stades de développement du cerveau où les crises épileptiques se manifestent le plus dans le cadre des DEEs. Les traitements pharmacologiques peuvent avoir des effets différents sur un cerveau en développement (nouveau-né) par rapport à un cerveau plus mature (souris sevrée, jeune adulte ou adulte). L’objectif de ce projet est de définir un modèle permettant d’administrer nos candidats médicaments dans des zones spécifiques du cerveau de souris nouveau nées âgées de 1 à 3 jours par voie intracérébrale. En effet, les candidats médicaments ne passant pas la Barrière Hémato-Encéphalique, nous sommes obligés de les administrer par voie intra-cérébrale.

Bénéfices attendus

Ce projet s’inscrit dans le cadre de la stratégie de recherche en neurosciences. Les traitements de la DEE reposent sur la prescription de médicaments antiépileptiques, qui ne sont pas toujours efficaces pour les formes rares d’épilepsie, et sur des interventions chirurgicales curatives (ablation de la zone épileptogène, radiochirurgie cérébrale ou thermocoagulation) qui peuvent être lourdes et risquées notamment chez les jeunes enfants. Les futurs candidats médicaments évalués dans ce projet sont connus pour ne pas passer la Barrière Hématoencéphalique (barrière naturelle qui sépare le cerveau du reste du corps). Ils seront donc administrés directement dans le système nerveux central (SNC) des patients afin de permettre un ciblage direct de celui-ci, augmentant ainsi l’efficacité des traitements, et diminuant les effets secondaires qui pourraient survenir après une administration orale ou intraveineuse, améliorant ainsi grandement la qualité de vie des patients. Les bénéfices attendus de ce projet sont de caractériser les potentiels candidats médicaments et de déterminer leur efficacité sur une cible donnée dans le cadre de maladies rares neurologiques infantiles. Chez la souris, afin de mimer au mieux la voie d’administration humaine, les composés seront administrés par voir intracérébrale.

Procédures

- Administration de composés étudiés par voie intracérébrale sous anesthésie générale gazeuse et couverture analgésique (durée maximale de 15 minutes – 1 seule fois en début d’expérience) - Administration sous-cutanée des médicaments vétérinaires analgésiques (contention d’une durée maximale de 30s) et administration intra-péritonéale des médicaments vétérinaires analgésiques (contention d’une durée maximale de 30s) avant l’euthanasie en fin d’étude.

Impact sur les animaux

Une potentielle source de stress ou douleur peut provenir lors : - Des administrations d’anesthésique Intra péritonéales en amont de la perfusion intra-cardiaque. La contention de 30s et l’administration d’environ 10s peuvent également générer un léger stress. - De la phase d’anesthésie gazeuse (durée maximale de 20min) et du suivi post-anesthésie qui peuvent générer un stress modéré. - De l’administration de composés par voie intra-cérébrale sous anesthésie générale, d’une durée maximale de 30s qui peut générer un stress modéré. Une potentielle source de nuisance peut survenir lors : - D’une non prise de poids des souriceaux jusqu’au sevrage pouvant être induite par l’administration du composé ainsi qu’un retard de croissance (nuisance modérée) - Du rejet de la mère (nuisance modérée) Les composés administrés peuvent également induire des effets cliniques (par exemple atteinte des mouvements spontanés, retard du comportement de recherche de la tétée) et provoquer une nuisance pour l’animal (durée maximale de l’étude : 60 jours).

Devenir

Tous les souriceaux inclus dans les procédures sont soit euthanasiés en cours d’étude si des points limites éthiques sont atteints, soit euthanasiés en fin d’étude afin de réaliser des prélèvements de tissus qui permettront d’effectuer des analyses biochimiques (effet des composés sur l’expression de la protéine d’intérêt par exemple). De plus, les mères ainsi que les souriceaux non-traités, non inclus dans les procédures de cette demande de projet seront soit utilisés pour de la formation à des gestes techniques, soit utilisés dans des études d’évaluation d’efficacité de composé faisant l’objet d’un autre projet autorisé.

Remplacement

La recherche de nouveaux médicaments dans le domaine des maladies neurologiques rares repose sur une première étape d’identification de molécules efficaces sur leur cible au moyen de tests in vitro (cultures de neurones primaires, cellules souches…) et in silico. Toutefois l’efficacité thérapeutique d’une molécule ne peut être démontrée qu’après administration chez l’animal. Il est donc nécessaire que les molécules les plus abouties dans leur développement soient administrées in vivo. Plus spécifiquement pour ce projet, seul l’animal sain possède de façon intégrée un répertoire comportemental et des caractéristiques neurophysiologiques permettant d’évaluer l’activité de candidats médicaments pour le traitement de maladies neurologiques rares.

Réduction

Un premier filtre in vivo est effectué via une autre autorisation de projet afin d’identifier les meilleurs candidats médicaments pharmacologiquement intéressants. En effet, des études préalables permettront d’évaluer la tolérabilité des composés sur des souris adultes ainsi que leur efficacité sur une cible d’intérêt, afin de pouvoir sélectionner les candidats médicament les plus puissants. A l’issue de ce premier filtre, les administrations chez la souris nouveau-née pourront être réalisées sur un nombre restreint d’animaux (6 souris maximum par groupe) et sur des animaux des deux sexes (la détermination sexuelle ne pouvant être sûre qu’à partir de 21 jours) dans le cadre de l’évaluation pharmacologique des composés. Une consultation du service de Biostatistique sera effectuée après la réalisation des premières études afin de réduire au maximum le nombre d’animaux par groupe mais en assurant l’obtention de résultats exploitable et reproductibles. Au cas par cas, en fonction du projet de recherche concerné et des questions posées, une consultation statistique sera programmée pour réajuster le nombre d’animaux nécessaire ainsi que pour travailler sur le design expérimental le plus adapté. Lors des prélèvements effectués à la fin des études après euthanasie des souris, un maximum de tissus seront collectés sur un même animal. Chaque tissu, cérébral ou périphérique, sera séparé en plusieurs échantillons permettant ainsi la multiplication des analyses biochimiques et/histologiques potentiellement réalisables. Ce processus nous permet de limiter au maximum le nombre d’animaux utilisé par projet de recherche.

Raffinement

Les souriceaux seront stabulés avec leur mère jusqu’au sevrage (21 jours) puis maintenus en groupes sociaux une fois retirés de leur mère, dans un environnement adapté limitant au maximum les facteurs de stress (bruits, manipulations fréquentes …) et en séparant les mâles des femelles pour les études de plus de 21 jours. Phase d’administration (20 min max de l’induction de l’anesthésie au réveil de l’animal) sous anesthésie générale gazeuse sur couverture chauffante. Aucune incision ne sera nécessaire pour insérer l’aiguille d’injection dans les ventricules – l’os du crâne étant encore souple chez un souriceau de 1-3 jours. Observation des souriceaux effectuée durant la phase de réveil et lors du replacement dans la cage avec la mère après un réveil complet. Une grille de score spécifique réalisée par une analyse comportementale (1h, 3h, 6h et 24h après administration) établira un score de tolérabilité des candidats médicaments. Tout animal ayant atteint un ou plusieurs points limites définis par la grille de score, sera euthanasié. Suivi de l’état général des animaux réalisé quotidiennement (durée max de 60 jours). Le suivi du poids sera réalisé 1 à 2 fois par semaine pendant les 10 premiers jours post-administration afin de limiter au maximum le rejet de la mère. Une estimation visuelle de la bonne croissance des souriceaux administrés sera effectuée en regard d’un animal contrôle non-administré. Pour diminuer les risques de rejet: - Mise en contact de la femelle gestante, dès son arrivée et jusqu’au début des études, avec les odeurs qu’elle rencontrera sur les nouveau-nés (solutions désinfectantes, gants…) - La cage d’une femelle qui vient de mettre bas ne devra pas être nettoyée pendant 2 semaines. Si un nettoyage ou un changement de litière est nécessaire au cours des premiers jours, le nid entier sera transféré dans la nouvelle cage. - Les administrations seront faites sur une première moitié de la portée puis sur la seconde afin que la mère ait toujours des nouveau-nés avec elle - Avant la réintroduction des souriceaux dans la cage de la mère après administration, ils seront frottés avec le nid souillé afin d’en être réimprégnés de l’odeur. L’hébergement sera enrichi : bâtonnet de coton et sizzle pad pour le nid en plus d’un tube en plexiglass et d’un bâtonnet en bois La phase de prélèvement se déroulera sous analgésie (buprénorphine 0.1ml/10g ou méthadone 10mg/kg en SC) et anesthésie profonde (kétamine 120mg/ml et de xylazine 12mg/ml en IP).

Choix des espèces

La souris saine présente une forte homologie génétique, physiologique et comportementale avec l’homme et apporte ainsi une forte valeur translationnelle. 90% des gènes humains ont un équivalent chez la souris saine, permettant d’évaluer l’efficacité des composés sur les cibles génétiques sans avoir systématiquement recours à des souris génétiquement modifiées. Afin d’évaluer l’effet de nos composés dans le cadre des DEEs, il est important de développer des modèles vivo adaptés au stade de développement cérébral et physiologique des patients atteints. Ainsi, il s’avère nécessaire de réaliser les études sur des souris nouveau nées. Les procédures d’évaluations décrites dans ce projet s’appuient sur une littérature scientifique et une expertise interne robustes. Les administrations seront réalisées sur des souriceaux âgés de 1 à 3 jours. Afin d’évaluer l’effet de nos composés dans le cadre des épilepsies rares infantiles, il est important de développer des modèles vivo adaptés au stade de développement cérébral et physiologique des patients atteints. Ainsi, il s’avère nécessaire de réaliser les études sur des souris nouveau-nées.

216 souris reçoivent une ou deux injections intrapéritonéales de psychédéliques agissant sur le récepteur 5-HT2A, puis sont tuées une heure plus tard. Ces procédures impliquent un niveau de souffrance modéré, et l'ensemble des animaux est mis à mort pour analyser la neurochimie de trente régions cérébrales. Le porteur écrit qu'aucun effet indésirable n'est attendu et qu'aucun point limite n'est rapporté pour ces composés, tout en prévoyant le cas d'une respiration altérée, d'une prostration, d'une immobilité en posture anormale ou de convulsions. Il précise alors que l'animal sera retiré du dispositif puis tué dans une chambre à dioxyde de carbone, rapidement s'il ne récupère pas, ou en fin de journée si les signes persistent.

Objectifs

L'objectif de ce projet est d'évaluer l’effet d’agents pharmacologiques psychédéliques agissant sur le récepteur à la sérotonine 5-HT2A (psychédéliques classiques). Les agonistes de ce récepteur sont considérés comme des antidépresseurs et anxiolytiques potentiels, mais ils sont aussi des composés hallucinogènes. Compte tenu de l’expression diffuse de l’expression du récepteur 5-HT2A dans le cerveau, nous postulons que les effets de ces composés altèrent l’activité de nombreux systèmes de neurotransmissions et de réseaux neurobiologiques. Cette information n’existe pas. C’est la raison pour laquelle nous avons lancé ce projet de recherche en neuropharmacologie et qui s’insère dans le champ de la neurobiologie intégrative. Par ailleurs, ce projet vise aussi à inclure dans la question posée le rôle de l’environnement dans le mécanisme d’action de ces composés. Une analyse de la littérature montre en effet que ces composés ne sont pas évalués dans des protocoles d’exploration forcée, en d’autres termes, des protocoles qui mettent en jeu le comportement exploratoire de l’animal.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de mieux comprendre les mécanismes d'action des agents pharmacologiques psychédéliques sur l’activité des systèmes de neurotransmissions classiques dans le cerveau. Ces systèmes de neurotransmission jouent un rôle essentiel dans le traitement de l’information et les comportements. La réalisation de banque de données neurochimiques sur 30 régions cérébrales permettra de concevoir pour une première fois l’organisation fonctionnelle des systèmes de neurotransmission seuls ou en interaction sur plusieurs réseaux neurobiologiques dans le cadre du mécanisme d’action de ces composés. Cette permettra aussi de définir le rôle du récepteur cible des psychédéliques dans les effets neurochimiques de ces composés hallucinogènes, associés à des effets comportementaux (principalement le comportement exploratoire).

Procédures

Il y aura une voire 2 injections intrapéritonéales chez les souris qui seront réalisées par des expérimentateurs aguerris. La durée totale nécessaire à la préhension de la souris et à l'injection est estimée à moins d'une minute.

Impact sur les animaux

Il n'y a à priori aucun effet indésirable attendu en dehors des effets de la préhension de l'animal et de l'injection sur les animaux qui sont euthanasiés 1 h après l'unique injection intrapéritonéale. Néanmoins, les effets des substances sont ambivalents nécessitant des études en dose réponse. Ils induisent des effets non toxiques sur la physiologie générale et ont des propriétés plutôt analgésiques. Il n’y a pas de points limites reportés pour ces composés dans la gamme des doses que nous avons déterminée. L’antagoniste MDL100907 a été caractérisé comme un antipsychotique de seconde génération, et est parfois administré chez l’homme. Il n’a pas d’effets secondaires connus. Les solvants contiennent parfois des composés potentiellement agressifs (Tween, DMSO), mais pas aux concentrations utilisées. L’utilisation de ces composés (Tween, DMSO) est nécessaire pour dissoudre les composés. Il n’y a pas de points limites mais il faut être vigilant. Dans le cas où une injection serait associée à des effets néfastes inattendus (respiration altérée, prostration, immobilité associée à une posture anormale, convulsions), l’animal sera retiré de la cage en plexiglas, et placé dans une cage d’hébergement classique contenant de la litière. L’animal sera euthanasié dans une chambre à dioxyde de carbone ultérieurement, c’est-à-dire rapidement si l’animal ne recouvre pas de la souffrance apparente, ou en fin de journée si les points limites ne disparaissent pas rapidement.

Devenir

Les animaux sont euthanasiés à la fin de la procédure en vue d'une analyse neurochimique de différentes structures cérébrales.

Remplacement

Ce projet ne peut être réalisé que chez l'animal, le modèle murin étant un des plus classiquement utilisé pour ce type d'étude. En effet il s'agit d'évaluer des effets pharmacologiques sur des paramètres comportementaux et neurochimiques dans plusieurs régions cérébrales.

Réduction

Les groupes expérimentaux sont conçus avec le minimum d’individu pour pouvoir réaliser des études statistiques valables. Ces analyses tiennent compte de comparaison de moyennes ou d’analyses plus complexes (analyses en corrélations, analyse multivariées).

Raffinement

Pour limiter au maximum le stress des animaux, ceux-ci sont habitués à l'expérimentateur (le même pendant toute la durée de l'expérience) dès leur arrivée dans l’animalerie agrée du laboratoire. Le temps d’acclimatation des animaux aux lieux sera d’au moins 10 jours. Les animaux seront hébergés dans des cages par 4 en présence de litière favorisant l’absorption des liquides vers le bas. Ces cages sont transparentes afin de favoriser le contact visuel. Ils auront également à leur disposition des formes d’enrichissement afin de réduire l’ennui et le stress comme des carrés de coton, un cylindre rigide en carton, jusqu’au jour de l’expérience. Les animaux sont observés quotidiennement afin de déceler d'éventuelles souffrances entrainant des comportements particuliers: respiration anormale, agressivité vis à vis des congénères, auto-mutilation, diminution d'activité ainsi qu'un suivi de poids, une perte de poids anormale étant un indice de souffrance. Si un animal présentait des signes de souffrance, il sera isolé de ses congénères, la procédure sera arrêtée et il sera surveillé sur tous les paramètres précédemment cités. S’il ne récupère pas des paramètres normaux, le vétérinaire sera contacté pour évaluation de son état. En cas de lésions, un traitement analgésique local à la lidocaine pourra être envisagé.

Choix des espèces

La majorité des études sur le sujet sont réalisées sur des rongeurs de laboratoire, particulièrement chez la souris. L'utilisation de souris C57/ Bl6 permettra d'analyser nos résultats en se basant sur les données de la littérature de façon plus pertinente. Souris adultes de 3 à 6 mois

756 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, chacune passant entre 5 et 74 séances d'imagerie sous anesthésie, d'une durée pouvant atteindre 1 h 30, sur une période allant jusqu'à 18 mois. Un nerf ciliaire leur est coupé pour léser l'innervation de la cornée, opération de 10 à 15 minutes, et un filament de nylon est posé sur leur œil une fois par mois pour déclencher le réflexe de clignement. Toutes sont tuées à la fin de la période de maintien, les yeux prélevés et les cornées disséquées, pour une étude qui cherche à comprendre comment les nerfs de la cornée se régénèrent, sans traitement candidat à ce stade. Le porteur justifie le choix de la souris en affirmant que "plus de 98 pourcent de son génome est identique à celui de l'Homme".

Objectifs

Les maladies de la cornée sont la deuxième cause de cécité dans le monde après la cataracte. Leur origine peut être génétique, dégénérative (vieillissement, diabète) et/ou environnementale. Il est donc essentiel de mieux comprendre la physiologie de la cornée pour proposer de nouvelles options thérapeutiques aux patients souffrant de défauts de la cornée. L'atteinte de l'innervation cornéenne se traduit par des symptômes allant d'une diminution de la sensibilité oculaire sans lésion cornéenne au syndrome de l'oeil sec. Actuellement, il n'existe aucun traitement disponible en routine pour la gestion de l'innervation cornéenne. Dans ce projet, nous souhaitons étudier la régénération de l’innervation cornéenne en temps réel dans des modèles murin de lésion de l'innervation de la cornée. Nous avons ainsi pour objectifs d’étudier différents mécanismes lors de la régénération axonale (interactions entre les nerfs et les cellules immunitaires ; interactions entre les nerfs et les cellules gliales ; mécanismes de dégénérescence nerveuse ; implication des molécules de guidage axonale). Afin de comprendre l’ensemble de ces mécanismes ainsi que leur modulation en fonction de l’âge des animaux, nous souhaitons réaliser cette étude sur populations d’âges différents (comparaison groupe jeune et groupe agé. ).

Bénéfices attendus

Aucun traitement n’est actuellement disponible en routine malgré le nombre important de patients atteints (estimé à 1 personne sur 2000). Les causes du développement de la maladie sont diverses : d'origine virale ou bactérienne, mais également des affections secondaires dues à d'autres pathologies telles que le diabète ou encore à des atteintes traumatiques ou chirurgicales. Cette étude permettra de mieux comprendre l'innervation de la cornée et les mécanismes sous-jacents impliqués dans sa plasticité, son remodelage et sa régénération à la suite de lésions; et ainsi d’identifier de nouvelles voies thérapeutiques pour le traitement de la kératite neurotrophique.

Procédures

Un partie des animaux recevra un traitement par gavage (réalisé une seule fois, sur animal vigile, l'acte dure moins de 1 min par animal). Les animaux subiront une chirurgie (lésion d'un nerf ciliaire) ; cet acte dure environ 10-15 min par animal et il est réalisé sur animal anesthésié et analgésié. Une fois par mois (soit 18 fois maximum selon les groupes), nous réaliserons un test de sensibilité de la cornée (réalisé sur animal vigile, l'acte dure environ 3 min par animal). Ce test est rapide et consiste à poser un filament de nylon sur l'oeil pour provoquer un reflexe de clignement de la paupière. Chaque animal sera imagé 1x par semaine pour une durée allant de 1 mois jusqu'à 18 mois selon les objectifs du projet (soit entre 5 et 74 sessions d'imagerie, selon la procédure, réalisées sous anesthésie d'une durée maximale de 1h30 chacune).

Impact sur les animaux

Une partie des animaux recevront un traitement par gavage (une seule fois). La contention au moment de sa réalisation peut être source de stress chez les animaux. L'introduction de la canule peut quelques fois provoquer des microlésions. Les animaux recevront deux injections par voie sous-cutané. Au moment de la réaliser, la contention et l'introduction de l'aiguille peut être source de stress pour les animaux. Une légère douleur au moment de l’insertion de l’aiguille peut aussi être ressentie. Pour réaliser ce projet, nous allons induire une lésion de l’innervation cornéenne par ablation d’un nerf ciliaire. La contention de l'animal pour la réalisation du test de sensibilité de la cornée peut également être source de stress. Ce test est rapide et consiste à poser un filament de nylon sur l'oeil pour provoquer un reflexe de clignement de la paupière. La répétition des sessions d'imagerie peut également être source de stress pour les animaux. L'anesthésie peut dans de rare cas amener un stress thermique ou une potentielle détresse respiratoire chez les animaux.

Devenir

A la fin de la période de maintien prévue, les animaux seront euthanasiés afin de réaliser des analyses histologiques complémentaires (les yeux seront prélevés et l'ensemble des cornées des animaux sera disséqué).

Remplacement

Du fait de la complexité de l'oeil, de l’innervation cornéenne et des interactions entre les nerfs et les cellules, il n'est pas possible de modéliser les mécanismes de la pathologie que nous étudions par des modèles in vitro. L'utilisation de l'animal nous est donc indispensable pour étudier de façon complète les mécanismes du développement de la pathologie que nous étudions ainsi que les processus de régénération de l'innervation de la cornée.

Réduction

Ce projet impliquera au maximum 756 souris. Le nombre d’animaux utilisés dans ce projet est le minimum requis pour obtenir des résultats statistiquement interprétables (nous utiliserons dans notre étude un test statistique adapté pour l'analyse de nos études) et atteindre les objectifs scientifiques de ce projet. Le nombre d'animaux requis pour ce projet a été déterminé à l'aide d'un logiciel.

Raffinement

Les animaux seront hébergés dans des cages de stabulation standard avec enrichissement (bâtons en bois, coton), avec un cycle jour-nuit de 12h. La température et l’hygrométrie sont régulés. Les animaux sont examinés quotidiennement par le personnel qualifié de l’animalerie et/ou les expérimentateurs. Des points limites ont été définis (tels que la surveillance du poids des animaux, l'absence de locomotion, l'état du pelage, la prostration). Pour les étapes chirurgicales et les analyses par imagerie, les rongeurs bénéficieront d'une analgésie ainsi que d'anesthésie générale complémenté par une anesthésie locale de la cornée.

Choix des espèces

La souris présente l’avantage d’être très similaire à l’homme que ce soit anatomiquement, physiologiquement et génétiquement. En effet plus de 98 pourcent de son génome est identique à celui de l’Homme. Par ailleurs, ce modèle permet la transgénèse et donc de pouvoir étudier in vivo les conséquences de la délétion d’un gène. La souris est un modèle utilisé depuis de très nombreuses années pour l’étude du système nerveux et de l’innervation cornéenne. De ce fait de nombreuses données sont déjà disponibles sur lesquelles notre étude peut se reposer. Nous réaliserons les expérimentations sur 2 groupes d’âges différents. Un premier groupe nommé jeune (animaux âgés d’environ 3 mois) et un groupe agé (animaux âgés d’environ 15 mois). Cela nous permettra de comparer les processus et capacités de régénération en fonction de l’âge.

105 chats et 100 chiens sont utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, aucun n'étant tué : tous sont gardés vivants et réutilisés. Chacun subit un prélèvement sanguin sous contention manuelle, un séjour pouvant aller jusqu'à 24 heures seul en cage à métabolisme pour recueillir urine et fèces, ou un prélèvement de peau et de muscle sous anesthésie. Ces prélèvements ne répondent à aucune question scientifique propre : ils fournissent de la matrice témoin, une référence sans molécule active, pour valider les méthodes de dosage d'études réglementaires menées par ailleurs. L'avenant fait passer le nombre de chats de 35 à 105 sans approche statistique déclarée, le porteur écrivant six fois qu'il est "indispensable" de recourir à "l'animal dans son ensemble".

Objectifs

Avenant: suite au renouvellement et à l'accroissement de notre colonie, le nombre de chat est augmenté de 70. L'objectif de ce projet est de fournir des échantillons témoins c'est à dire ne contenant pas le produit test qui sera analysé ( par exemple du sang, du serum, du plasma, des excretas, des biopsies cutanées et musculaires et des liquides céphalo-rachidien) afin de permettre le dosage des échantillons. Il est indispensable d'avoir à disposition de la matrice témoin ou exempte de molécule active pour pouvoir valider la méthode de dosage et valider les dosages.

Bénéfices attendus

Il est indispensable d'avoir de la matrice témoin. Il s'agit d'échantillons témoins c'est à dire ne contenant pas le produit test qui sera analysé pour pouvoir valider la méthode de dosage et valider les dosages. Cela est indispensable pour valider les résultats d'une étude.

Procédures

Les animaux seront soumis à un seul prélèvement de sang. La durée du prélèvement sera de l'ordre de la minute. Ce prélèvement sanguin servira à fournir de la matrice témoin en plasma ou en sang. Pour générer de la matrice d'urine ou de féces, les animaux seront placés en cage à métabolisme de façon individuelle pour une durée maximale de 24h. Les animaux auront un contact visuel et auditif entre eux. Les échantillons d'urine ou de féces seront juste collectés sans aucune manipulation particulière de l'animal. Pour générer des matrices tissulaires , les animaux seront préalablement anesthésiés. Ces gestes seront réalisés par un personnel formé selon les bonnes pratiques vétérinaires et la règlementation en vigueur. La durée de l'anesthésie est de l'ordre de la minute et la durée de l'euthanasie est de l'ordre de quelques minutes (estimation entre 1 à 2 minutes)

Impact sur les animaux

Pour pouvoir générer de la matrice témoin il est indispensable de recourir à l'animal dans son ensemble. L'animal subira une contention manuelle pour pouvoir réaliser un prélèvement sanguin. Le temps d'immobilisation même de courte durée pourra induire un stress chez l'animal. Dans le cas de recueil d'excrétas, l'animal devra la plupart du temps être hébergé en cage à métabolisme (pour une durée maximale de 24h) pour pouvoir collecter des échantillons d'urine ou de fèces témoins. Ce type d'hébergement entraînant un isolement de l'animal qui peut également engendrer un stress.

Devenir

Les animaux seront gardés en vie: dans le cas de prélèvement sanguin classique (volume inférieur à 20 % du volume circulant de l'animal) et dans le cas de collecte d'excrétas (urine, féces) ou dans le cas de prélèvement tissulaire sous anesthésie générale.

Remplacement

Aucune méthode alternative ne permettant actuellement de générer de la matrice témoin, il est indispensable de recourir à l’animal dans son ensemble . En effet la non utilisation de matrice témoin entraine un bias dans la méthode. Si l'échantillon qui permet la quantification est différent de celui à quantifier, la méthode n'est pas exacte.

Réduction

100 chiens et 105 chats sont prévus dans ce projet. C'est le nombre d'animaux minimal pour générer de la matrice témoin sur une durée de 5 ans. Aucune approche statistique faite pour ce projet. Les mesures prises pour réduire le nombre d'animaux sont l'utilisation d'une méthode avec un seuil de quantification faible , l'appareillage utilisé devra avoir un seuil de détection faible afin de réduire au maximum la quantité d'échantillon utilisé pour la quantification. Le nombre d'échantillon nécessaire pour la quantification sera réduit afin d'assurer l'exactitude de la méthode. Avenant: suite au renouvellement et à l'accroissement de notre colonie, le nombre de chat est augmenté de 70.

Raffinement

Les animaux seront hébergés en groupe, à même le sol. De l'enrichissement sera présent autant que possible. Pour l'espèce chien , des balles, des cordes, des tablettes seront présentes. Pour l'espèce chat, des griffoirs, coussins, cordage seront présents autant que possible dans les hébergements. Les animaux seront manipulés par un personnel formé et tout geste sera fait selon les bonnes pratiques vétérinaires et conformément à la réglementation en vigueur. En ce qui concerne les prélèvements de sang pour les matrices témoins sang / plasma, 7.5% du volume de sang circulant prélevé en 24h donne lieu à une récupération d'une durée d'une semaine pour l'animal. 10 % du volume de sang circulant prélevé en 24h donne lieu à une récupération d'une durée deux semaines pour l'animal. 15 % du volume de sang circulant prélevé en 24h donne lieu à une récupération d'une durée de quatre semaines pour l'animal.. Pour la collecte d'excretas ( matrice d'urine ou de fèces), l'animal sera placé en cage à métabolisme pour une durée maximale de 24h et sera réduite autant que possible. Les animaux auront un contact visuel et auditif entre eux. Dans ce projet les points limites sont : - Problèmes hématologique ou biochimique, dans ce cas l'animal ne sera pas inclus dans ce projet - Douleur observée au niveau du site de prélèvement avant la réalisation du prélèvement lui même, l'animal pourra être prélevé au niveau d'un autre site ou il n'y aura pas de prélèvement du tout. - Animal ayant un comportement inhabituel (prostré, poils ébouriffé, signes d'agressivités). Dans ce cas, l'animal sera observé plusieurs fois par jour pour suivre les signes comportementaux et sera exclu du projet. Cette décision sera prise en accord avec le vétérinaire désigné. - Animal présentant une perte de poids supérieur à 20 % par rapport à son poids basal. L'animal sera exclu de ce projet - Animal présentant des fèces liquides, diarrhéiques. En fonction de la fréquence et de la durée cela pourra éventuellement conduire à une exclusion du projet en accord avec la décision du vétérinaire responsable

Choix des espèces

Dans les études précliniques, il est très souvent nécessaire d'avoir de la matrice témoin (sang, serum, plasma, tissus, excretas). Ceci est indispensable pour pouvoir valider la méthode de dosage et valider les dosages. Les espèces chiens et chats sont largement utilisés dans ce type d'étude en tant qu'espèces non rongeurs Cela dépendra des matrices témoins. S'il s'agit de prélèvement sanguin un animal de stade jeune adulte conviendra le mieux. S'il s'agit d'un prélèvement de tissus, un animal adulte vieillissant pourra plutôt être sélectionné. Cela dépendra des objectifs de l'étude pour laquelle la ou les matrices témoins seront collectées.

La récompense qui fait tenir la tâche repose sur une restriction d'eau de moitié, laquelle fait perdre aux souris jusqu'à 10 % de leur poids, et leur tête reste immobilisée jusqu'à 45 minutes par séance. 480 souris sont utilisées dans ce premier volet, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, après 49 jours d'introduction de congénères inconnus dans leur cage pour installer un état anxieux. Le porteur qualifie pourtant la tâche de "non aversive et non douloureuse" et classe la restriction hydrique parmi les effets indésirables "mineurs". Toutes sont tuées à l'issue, leur cerveau prélevé pour des analyses post-hoc.

Objectifs

La phobie sociale, ou trouble de l'anxiété sociale (TAS), est une forme de trouble anxieux définie récemment, actuellement classée parmi les troubles psychiatriques les plus fréquents. Ce trouble se caractérise par une peur intense et persistante d'une évaluation négative potentielle par les autres lors d'interactions sociales, ce qui conduit souvent à l'évitement social et au repli sur soi. L'une des principales altérations du TAS, souvent considérée comme une cause sous-jacente, est une perturbation du traitement de l'information sociale. En effet, les individus socialement anxieux présentent des réponses exagérées et ont du mal à contrôler leur attention face aux stimuli socialement menaçants. Le toucher est une forme essentielle d'interaction sociale, et il a été observé que la perception tactile est altérée chez les personnes socialement anxieuses, qui semblent ne pas tirer profit de ses bienfaits et manifestent une aversion pour le toucher social. Cependant, les réponses neuronales et les processus attentionnels nécessaires pour filtrer les informations tactiles, lorsqu'elles deviennent non pertinentes, n'ont pas encore été étudiés. Dans cette étude, nous visons à caractériser la perception des stimuli tactiles, qu'ils soient sociaux ou non-sociaux, ainsi que le contrôle attentionnel dans le contexte du TAS. Nous proposons de développer et d'utiliser une nouvelle tâche de prise de décision perceptive, combinée à des mesures physiologiques de l'activité neuronale dans un modèle murin du TAS. Le projet est un multisite, et se déroulera dans deux EU differents. Nos résultats permettront d'approfondir la compréhension de la perception tactile et du contrôle de l’attention face aux stimuli tactiles dans le TAS, tout en révélant les mécanismes neuronaux sous-jacents. En utilisant une tâche adaptable pour des études humaines mesurant les réponses tactiles chez les individus socialement anxieux, nous espérons obtenir des résultats susceptibles d'améliorer la qualité de vie des personnes souffrant de TAS.

Bénéfices attendus

Le trouble d'anxiété sociale (TAS) est un trouble psychiatrique chronique qui peut constituer un véritable handicap au quotidien. La prévalence estimée du TAS au cours de la vie est d'environ 4 %. Dans le trouble d'anxiété sociale (TAS), les personnes réagissent souvent de manière exagérée aux situations sociales perçues comme négatives et éprouvent des difficultés à contrôler leur attention face aux stimuli sociaux. Ces caractéristiques sont bien connues et pourraient être une des causes de ce trouble. Egalement, les individus socialement anxieux semblent ne pas tirer profit des bienfaits de l’interaction sociale. Comprendre les altérations neuronales à l'origine de ces difficultés sociales pourrait fournir des informations cruciales sur les modifications du fonctionnement cérébral dans le TAS. Ces recherches pourraient révéler de nouvelles cibles pour le développement de traitements pharmacologiques visant à améliorer les symptômes du TAS, ou encore identifier des biomarqueurs permettant d'évaluer l'efficacité de traitements expérimentaux dans un cadre préclinique. Ces types d'études nécessitent cependant des approches invasives et des manipulations qui ne peuvent être réalisées dans un cadre clinique. Nous pensons que notre étude contribuera à une meilleure compréhension des types de cellules et des circuits impliqués dans l'altération de la perception sociale dans le TAS. Il s'agit de la première étude à caractériser ces altérations neuronales en utilisant une tâche adaptable aux études humaines, et elle a le potentiel de fournir des informations qui, à terme, amélioreront la qualité de vie des personnes diagnostiquées avec un trouble d'anxiété sociale.

Procédures

Pour étudier le trouble de l’anxiété sociale, les animaux soumis à un protocole d'instabilité sociale pendant 49 jours au cours de l'adolescence et de l'âge adulte, similaire à celle des personnes qui se déplacent fréquemment (EU 1). Leur anxiété, réponses sensorielles et interactions sociales seront évaluées par les taches comportementales (EU 1). Tous les animaux seront soumis à deux interventions chirurgicales sous anesthésie et analgésie : la première durera environ 45 à 90 minutes, et la deuxième durera de 90 à 120 minutes (EU 1). Pour comprendre les mécanismes neurobiologiques du control de l’attention, les animaux apprendront à effectuer une tâche comportementale non aversive et non douloureuse, basé sur les récompenses, pendant 45 minutes par jour (EU 2). En même temps, nous effectuons des mesures physiologiques afin d'enregistrer l'activité des neurones du cerveau (EU 2). Afin de permettre cet enregistrement, les animaux sont entraînés à accepter une contention partielle (immobilisation de la tête) (EU 2). Pour s'assurer que les animaux ne ressentent ni stress ni anxiété, ils seront progressivement habitués à l'installation et à l’immobilisation de la tête d’une minute à 45 minutes, pendant 5 jours. Cela permet aux animaux apprendre que cette immobilisation est réversible et pas douloureuse. Lorsqu'ils seront à l'aise dans le dispositif (pas de signes de détresse, capables de manger et boire), l'entraînement à la tâche comportementale commencera (EU 2).

Impact sur les animaux

Les effets indésirables mineurs pouvant être rencontrés dans cette étude seront liés à : 1. Induction du trouble d'anxiété sociale : Le paradigme du stress d'instabilité sociale (SIS49D) qui consiste à introduire des partenaires inconnus du même sexe dans la cage d'accueil (deux fois par semaine) sera mis en œuvre et provoquera du stress. 2. Immobilisation partielle : Une fixation au niveau de la tête pendant la tâche de prise de décision n'est pas douloureuse mais va entrainer du stress aux animaux pendant les premières séances. 3. Restriction hydrique : La mise en place d’une récompense hydrique implique une restriction d'eau (50 % de la consommation ad libitum) qui va entrainer une perte de poids maximale de 10 %.

Devenir

Toutes les souris seront euthanisiées et leurs cerveaux seront prélevés pour des analyses post-hoc.

Remplacement

Les expériences proposées dans cette étude nécessitent des circuits intacts et des mesures à la fois physiologiques et comportementaux. Un modèle animal est absolument nécessaire pour reproduire la complexité de ces interactions neuronales et ne peut pas être remplacé par les études in vitro ou in silico. Les études cliniques ne sont pas adaptées à notre objectif expérimental car il s’agit d’une population clinique fragile et car les approches invasives sont nécessaires pour répondre à notre question scientifique. Les circuits neuronaux sont bien conservés chez les différentes espèces mammifères et sont donc susceptibles d'être fonctionnellement similaires chez les rongeurs et les humains. Utiliser des modèles plus simples, comme la mouche du vinaigre, n’est pas adaptée à notre projet, car cet organisme n’a ni les structures du cerveau ni les comportements nécessaires pour étudier le contrôle de l’attention.

Réduction

Une conception expérimentale soignée garantira la reproductibilité des résultats et, avec des techniques d'analyse statistique appropriées, l'utilisation d'animaux sera réduite au minimum. Partie des protocoles comportementaux, physiologiques, et pharmacologiques ont déjà mis en place pour une étude précédente sur la perception tactile. Cette première étude nous a permis de déterminer le nombre d'animaux nécessaires pour réaliser ces expériences et avoir des résultats statistiquement valides. Cela nous a permis d'assurer la crédibilité de nos résultats avant de procéder à l'étude principale. Les données comportementales, physiologiques, et pharmacologiques seront recueillies auprès des mêmes animaux. Les neurones pyramidaux et inhibiteurs seront suivis simultanément et distingués par l'expression de rapporteurs spécifiques. Les injections du traitement seront suivies des injections contrôles dans les mêmes animaux. Ces mesures nous permettront de réduire le nombre d'animaux utilisés dans l'étude et de mesurer simultanément plusieurs paramètres.

Raffinement

Tous les résultats scientifiques concernant les facteurs influençant le bien-être des animaux, ainsi que leur capacité à ressentir et à exprimer la douleur, la souffrance, l'angoisse et les dommages durables, seront pris en compte. Les expériences seront conçues et réalisées de la manière la plus éthique possible. Le matériel adéquat sera mis à disposition des personnes autorisées, compétentes et dûment qualifiées, qui respecteront rigoureusement les procédures mises en place. Tous les animaux seront manipulés en utilisant les techniques les moins stressantes possibles, conformément à la littérature : l'utilisation d'un tunnel ou des mains en forme de coupe. L’hébergement en cages collectives garantira des interactions sociales pendant et après l’induction du TAS. Le paradigme pour l’induction du TAS débutera pendant l’adolescence, car il est souvent associé à une plus grande agressivité lorsqu'il est appliqué à des souris adultes. Deux tubes en carton et du matériel de nidification seront placés dans chaque cage afin de garantir la poursuite de tous les comportements normaux des animaux et de réduire les incidents d'agression. La nourriture sera également disposée dans la cage pour diminuer les conflits pendant l’induction du TAS, et les animaux seront surveillés quotidiennement. Les animaux seront transférés entre les deux sites dans leurs cages d'origine, pendant leur phase active, et placés dans l'obscurité à l'intérieur d'un chariot. Ils disposeront d’une semaine pour s'habituer à leur nouvel environnement. Pendant la restriction en eau, les animaux seront pesés chaque jour, et leur alimentation en eau sera ajustée afin de s'assurer qu'ils ne dépassent jamais une perte de poids de 10 %. L'hydrogel, fourni comme source d'eau, est considéré comme un enrichissement, car les animaux peuvent le manipuler avec leurs pattes avant. Avant les tâches comportementales, les animaux seront habitués à la pièce d’expérimentation. Pour la tâche de prise de décision, ils seront progressivement familiarisés avec la fixation de la tête pour garantir un stress minimal. Des stimulations tactiles non douloureuses seront utilisées pendant la tâche perceptuelle. L'anxiolytique sera administré par voie orale, dissous dans la boisson des animaux. Pour euthanasier les animaux, les souris seront d’abord anesthésiées. Des points limites spécifiques et des mesures conservatoires seront définis pour chaque phase de la procédure.

Choix des espèces

La souris a été choisie afin de rester cohérente avec les études antérieures sur le stress chronique induit par les interactions sociales. Les souris soumises au modèle de stress chronique d'instabilité sociale, qui sera utilisé dans cette étude, présentent une augmentation de l'anxiété et des perturbations dans les interactions sociales. Les rongeurs possèdent un système sensoriel très développé et sont considérés comme une espèce modèle pour l'étude du traitement de certains types d'informations sensorielles. De plus, les souris sont capables d'apprendre et d'exécuter des tâches de prise de décision perceptive, indispensables pour mieux comprendre les réponses tactiles. Conformément aux études précédentes, le protocole d’induction du TAS débutera à l’adolescence et se terminera à l’âge adulte. Toutes les autres étapes de l’expérience seront menées chez les souris adultes.

Fournir des anticorps à des équipes de recherche publiques ou privées, à raison d'environ 2 milligrammes par animal : 200 lapins New Zealand White sont utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacun reçoit quatre injections d'une information génétique codant l'antigène visé, par voie intradermique, intramusculaire ou sous-cutanée, puis subit trois prélèvements sanguins de 25 à 40 minutes après administration orale d'un tranquillisant. Le porteur signale de la fièvre, un inconfort modéré et l'apparition de petites boules au point d'injection, et compte deux lapins par protocole. Tous sont tués en fin de protocole parce que chaque immunisation est spécifique d'un antigène, ce qui interdit de les réutiliser ailleurs.

Objectifs

L’objectif du projet est de générer par une approche d’immunisation génique des anticorps de lapin contre des antigènes d’intérêt pour le compte de différentes équipes de recherche publiques ou privées. L’immunisation correspond à un processus d’éducation et d’activation du système immunitaire contre un antigène spécifique. Parmi les différentes approches d’immunisation existantes, l’immunisation génique sera utilisée. Cette approche émergente vise à faire produire transitoirement un antigène en administrant une information génétique codant in situ pour un antigène spécifique, initiant ainsi une réponse immunitaire. Les anticorps obtenus seront utilisés dans des approches allant de la recherche au diagnostic. Le nombre de lapins prévus par protocole permettra d’obtenir une quantité suffisante d’anticorps (environ 2 milligrammes par lapin) pour une utilisation sur plusieurs années.

Bénéfices attendus

Les anticorps polyclonaux seront des auxiliaires et des réactifs employés non seulement dans des procédés relatifs à la biochimie, à la biologie moléculaire et à l’immunohistochimie, mais aussi à des fins diagnostiques voire thérapeutiques. Les anticorps développés dans le cadre de projets de recherche, permettront de localiser, d’identifier ou de purifier des protéines synthétisées au sein des cellules, d’un tissu ou d’un organe.

Procédures

4 injections en intradermique, en intramusculaire ou en sous-cutanée de l’information génétique codant pour l’antigène d’intérêt (8 minutes) 3 prélèvements (durée 25 à 40 minutes par prélèvement).

Impact sur les animaux

Les prélèvements de sang n’entrainent pas de gêne particulière (inconfort mineur), le volume de sang étant adapté au poids de l’animal en accord avec les recommandations relatives aux volumes sanguins maximaux prélevés du guide Gircor. Les prélèvements seront réalisés après administration par voie orale d’un tranquillisant à effet vasodilatateur, permettant de prélever le lapin dans de bonnes conditions pour le lapin et l'expérimentateur. L'injection couplée à un agent de transfection peut provoquer l’apparition de fièvre et d’inconfort modéré, pouvant se traduire par une légère diminution de la mobilité pendant les premières heures suivant l’injection (apparition de petites boules correspondant au dépôt de l’émulsion antigène-agent de transfection). Les manipulations des lapins étant source de stress, une habituation sera mise en œuvre, afin de mettre en place une relation de confiance entre le lapin et les expérimentateurs.

Devenir

Tous les animaux sont concernés par l'euthanasie. Les projets étant spécifiques d’un antigène, nous ne pouvons pas réutiliser les animaux pour d’autres protocoles, les animaux sont donc tous euthanasiés en fin de protocole.

Remplacement

La méthode usuelle pour produire des Anticorps Polyclonaux (AcP) reste l’immunisation de l’animal avec des préparations antigéniques, souvent combinées à un adjuvant qui accroît la réponse immunitaire. Les AcP sont produits chez les animaux vivants, puisqu’il n’existe pas de méthode substitutive aussi efficace pour cette production. L’immunité humorale correspond à un processus complexe impliquant différents acteurs du système immunitaire in vivo. Ce processus se traduit par la production d’un répertoire diversifié d’immunoglobulines répondant à un grand nombre d’antigènes. In vivo, l’adaptation accrue du système immunitaire vis à vis de l’antigène au fur et à mesure des immunisations est indispensable pour obtenir des anticorps notablement plus spécifiques et pertinents que ceux obtenus avec des systèmes de développement in vitro. En effet, les techniques partant de banque naïve ne permettent généralement pas une obtention aisée (en termes de temps, budget et matériels) d’une large gamme d’anticorps de hautes affinités ciblant différents épitopes.

Réduction

Le nombre d’animaux (2 lapins par protocole) pour l’obtention de réactifs intervenant notamment dans la caractérisation de molécules thérapeutiques, a été adapté au plus juste par rapport au besoin de sérum pour les investigations et les recherches au regard de notre recul sur ce protocole. La quantité d’anticorps générés sera suffisante pour des investigations poussées sans avoir à réimmuniser des animaux.

Raffinement

Les animaux sont prélevés et euthanasiés en dehors de la pièce de stabulation pour éviter toute transmission de stress. La pièce de stabulation est à l'abri de toute nuisance sonore. L'observation quotidienne des animaux par le personnel compétent permet une détection précoce de tout risque d'atteinte d'un point limite et ainsi une intervention adaptée au plus tôt. Des tableaux de points limites ont été mis en place avec notre vétérinaire. L’établissement des points limites mis en œuvre se base sur 3 critères principaux : comportementaux (éveil, posture, comportement exploratoire, locomotion, agressivité, vocalisation…), signes cliniques (apparence générale, aspect du pelage, ouverture des paupières, éventuelles lésions…) et zootechniques (abreuvement, poids, …). L’observation de l’un de ces paramètres, permet de définir un score clinique, avec différents niveaux : normal, observer attentivement avec mise en œuvre potentielle d’antalgies, souffrance sévère : arrêt immédiat du protocole et remise en cause de la procédure expérimentale. Ces mesures en accord avec le principe d’amélioration (raffinement), constitue un outil permettant d’atteindre les objectifs scientifiques tout en minimisant autant que possible la souffrance animale. Les points limites mis en place au sein de notre structure pour ce protocole permettent d’atteindre l’objectif de l’étude avant même l’installation d’une souffrance. Les prélèvements seront réalisés après injection d’une molécule, qui possède un effet tranquillisant, permettant une réalisation du prélèvement moins stressante pour l'animal.

Choix des espèces

L'espèce utilisée est choisie avec soin. Nous prenons en compte les facteurs suivants : 1) la quantité nécessaire d'anticorps ou d'antisérum (choix d’animaux de plus grandes tailles lorsqu'on a besoin de grandes quantités d'anticorps); 2) la relation phylogénétique entre l'espèce d'où provient l'antigène protéique et l'espèce utilisée pour produire l'anticorps; 3) la fonction effectrice des AcP provenant de l'espèce productrice d'anticorps; 4) l'utilisation prévue des anticorps. Dans le cadre de cette procédure expérimentale, les lapins New Zealand White ont été retenus, car ils permettront de fournir une quantité suffisante d'anticorps, via la mise en protocole d'un nombre restreint d'individus, avec un risque d'échec du projet très faible. De plus, ces lapins sont communément utilisés pour la production d'AcP, ils sont faciles à manipuler et produisent des antisérums à titre élevé et à forte affinité. La meilleure production d’anticorps est obtenue chez les jeunes adultes. Les lapins entreront en protocole dès l’âge de 3 mois. Auparavant ils auront subi une période de quarantaine de 21 jours, en absence d’incident durant ce temps, ils seront alors aptes à rentrer en protocole.

Deux chirurgies cérébrales, l'une de 45 à 90 minutes et l'autre de 90 à 120, une tête maintenue fixe jusqu'à 45 minutes par jour, une ration d'eau réduite de moitié : 480 souris subissent ce protocole dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue pour prélever leur cerveau. L'anxiété sociale leur est induite par 49 jours d'introduction répétée de congénères inconnus dans leur cage, de l'adolescence à l'âge adulte. Le projet vise à mesurer comment ces souris filtrent des stimuli tactiles, sociaux ou non, dans une tâche de décision récompensée par de l'eau. Le porteur annonce que l'anxiété, les réponses sensorielles et les interactions sociales seront évaluées par des tâches comportementales, sans dire lesquelles, et range la perte de poids de 10 % liée à la restriction hydrique parmi les effets indésirables "mineurs".

Objectifs

La phobie sociale, ou trouble de l'anxiété sociale (TAS), est une forme de trouble anxieux définie récemment, actuellement classée parmi les troubles psychiatriques les plus fréquents. Ce trouble se caractérise par une peur intense et persistante d'une évaluation négative potentielle par les autres lors d'interactions sociales, ce qui conduit souvent à l'évitement social et au repli sur soi. L'une des principales altérations du TAS, souvent considérée comme une cause sous-jacente, est une perturbation du traitement de l'information sociale. En effet, les individus socialement anxieux présentent des réponses exagérées et ont du mal à contrôler leur attention face aux stimuli socialement menaçants. Le toucher est une forme essentielle d'interaction sociale, et il a été observé que la perception tactile est altérée chez les personnes socialement anxieuses, qui semblent ne pas tirer profit de ses bienfaits et manifestent une aversion pour le toucher social. Cependant, les réponses neuronales et les processus attentionnels nécessaires pour filtrer les informations tactiles, lorsqu'elles deviennent non pertinentes, n'ont pas encore été étudiés. Dans cette étude, nous visons à caractériser la perception des stimuli tactiles, qu'ils soient sociaux ou non-sociaux, ainsi que le contrôle attentionnel dans le contexte du TAS. Nous proposons de développer et d'utiliser une nouvelle tâche de prise de décision perceptive, combinée à des mesures physiologiques de l'activité neuronale dans un modèle murin du TAS. Le projet est un multisite, et se déroulera dans deux EU differents. Nos résultats permettront d'approfondir la compréhension de la perception tactile et du contrôle de l’attention face aux stimuli tactiles dans le TAS, tout en révélant les mécanismes neuronaux sous-jacents. En utilisant une tâche adaptable pour des études humaines mesurant les réponses tactiles chez les individus socialement anxieux, nous espérons obtenir des résultats susceptibles d'améliorer la qualité de vie des personnes souffrant de TAS.

Bénéfices attendus

Le trouble d'anxiété sociale (TAS) est un trouble psychiatrique chronique qui peut constituer un véritable handicap au quotidien. La prévalence estimée du TAS au cours de la vie est d'environ 4 %. Dans le trouble d'anxiété sociale (TAS), les personnes réagissent souvent de manière exagérée aux situations sociales perçues comme négatives et éprouvent des difficultés à contrôler leur attention face aux stimuli sociaux. Ces caractéristiques sont bien connues et pourraient être une des causes de ce trouble. Egalement, les individus socialement anxieux semblent ne pas tirer profit des bienfaits de l’interaction sociale. Comprendre les altérations neuronales à l'origine de ces difficultés sociales pourrait fournir des informations cruciales sur les modifications du fonctionnement cérébral dans le TAS. Ces recherches pourraient révéler de nouvelles cibles pour le développement de traitements pharmacologiques visant à améliorer les symptômes du TAS, ou encore identifier des biomarqueurs permettant d'évaluer l'efficacité de traitements expérimentaux dans un cadre préclinique. Ces types d'études nécessitent cependant des approches invasives et des manipulations qui ne peuvent être réalisées dans un cadre clinique. Nous pensons que notre étude contribuera à une meilleure compréhension des types de cellules et des circuits impliqués dans l'altération de la perception sociale dans le TAS. Il s'agit de la première étude à caractériser ces altérations neuronales en utilisant une tâche adaptable aux études humaines, et elle a le potentiel de fournir des informations qui, à terme, amélioreront la qualité de vie des personnes diagnostiquées avec un trouble d'anxiété sociale.

Procédures

Pour étudier le trouble de l’anxiété sociale, les animaux soumis à un protocole d'instabilité sociale pendant 49 jours au cours de l'adolescence et de l'âge adulte, similaire à celle des personnes qui se déplacent fréquemment (EU 1). Leur anxiété, réponses sensorielles et interactions sociales seront évaluées par les taches comportementales (EU 1). Tous les animaux seront soumis à deux interventions chirurgicales sous anesthésie et analgésie : la première durera environ 45 à 90 minutes, et la deuxième durera de 90 à 120 minutes (EU 1). Pour comprendre les mécanismes neurobiologiques du control de l’attention, les animaux apprendront à effectuer une tâche comportementale non aversive et non douloureuse, basé sur les récompenses, pendant 45 minutes par jour (EU 2). En même temps, nous effectuons des mesures physiologiques afin d'enregistrer l'activité des neurones du cerveau (EU 2). Afin de permettre cet enregistrement, les animaux sont entraînés à accepter une contention partielle (immobilisation de la tête) (EU 2). Pour s'assurer que les animaux ne ressentent ni stress ni anxiété, ils seront progressivement habitués à l'installation et à l’immobilisation de la tête d’une minute à 45 minutes, pendant 5 jours. Cela permet aux animaux apprendre que cette immobilisation est réversible et pas douloureuse. Lorsqu'ils seront à l'aise dans le dispositif (pas de signes de détresse, capables de manger et boire), l'entraînement à la tâche comportementale commencera (EU 2).

Impact sur les animaux

Les effets indésirables mineurs pouvant être rencontrés dans cette étude seront liés à : 1. Induction du trouble d'anxiété sociale : Le paradigme du stress d'instabilité sociale (SIS49D) qui consiste à introduire des partenaires inconnus du même sexe dans la cage d'accueil (deux fois par semaine) sera mis en oeuvre et provoquera du stress. 2. Immobilisation partielle : Une fixation au niveau de la tête pendant la tâche de prise de décision n'est pas douloureuse mais va entrainer du stress aux animaux pendant les premières séances. 3. Restriction hydrique : La mise en place d’une récompense hydrique implique une restriction d'eau (50 % de la consommation ad libitum) qui va entrainer une perte de poids maximale de 10 %.

Devenir

Toutes les souris seront euthanisiées et leurs cerveaux seront prélevés pour des analyses post-hoc.

Remplacement

Les expériences proposées dans cette étude nécessitent des circuits intacts et des mesures à la fois physiologiques et comportementaux. Un modèle animal est absolument nécessaire pour reproduire la complexité de ces interactions neuronales et ne peut pas être remplacé par les études in vitro ou in silico. Les études cliniques ne sont pas adaptées à notre objectif expérimental car il s’agit d’une population clinique fragile et car les approches invasives sont nécessaires pour répondre à notre question scientifique. Les circuits neuronaux sont bien conservés chez les différentes espèces mammifères et sont donc susceptibles d'être fonctionnellement similaires chez les rongeurs et les humains. Utiliser des modèles plus simples, comme la mouche du vinaigre, n’est pas adaptée à notre projet, car cet organisme n’a ni les structures du cerveau ni les comportements nécessaires pour étudier le contrôle de l’attention.

Réduction

Une conception expérimentale soignée garantira la reproductibilité des résultats et, avec des techniques d'analyse statistique appropriées, l'utilisation d'animaux sera réduite au minimum. Partie des protocoles comportementaux, physiologiques, et pharmacologiques ont déjà mis en place pour une étude précédente sur la perception tactile. Cette première étude nous a permis de déterminer le nombre d'animaux nécessaires pour réaliser ces expériences et avoir des résultats statistiquement valides. Cela nous a permis d'assurer la crédibilité de nos résultats avant de procéder à l'étude principale. Les données comportementales, physiologiques, et pharmacologiques seront recueillies auprès des mêmes animaux. Les neurones pyramidaux et inhibiteurs seront suivis simultanément et distingués par l'expression de rapporteurs spécifiques. Les injections du traitement seront suivies des injections contrôles dans les mêmes animaux. Ces mesures nous permettront de réduire le nombre d'animaux utilisés dans l'étude et de mesurer simultanément plusieurs paramètres.

Raffinement

Tous les résultats scientifiques concernant les facteurs influençant le bien-être des animaux, ainsi que leur capacité à ressentir et à exprimer la douleur, la souffrance, l'angoisse et les dommages durables, seront pris en compte. Les expériences seront conçues et réalisées de la manière la plus éthique possible. Le matériel adéquat sera mis à disposition des personnes autorisées, compétentes et dûment qualifiées, qui respecteront rigoureusement les procédures mises en place. Tous les animaux seront manipulés en utilisant les techniques les moins stressantes possibles, conformément à la littérature : l'utilisation d'un tunnel ou des mains en forme de coupe. L’hébergement en cages collectives garantira des interactions sociales pendant et après l’induction du TAS. Le paradigme pour l’induction du TAS débutera pendant l’adolescence, car il est souvent associé à une plus grande agressivité lorsqu'il est appliqué à des souris adultes. Deux tubes en carton et du matériel de nidification seront placés dans chaque cage afin de garantir la poursuite de tous les comportements normaux des animaux et de réduire les incidents d'agression. La nourriture sera également disposée dans la cage pour diminuer les conflits pendant l’induction du TAS, et les animaux seront surveillés quotidiennement. Les animaux seront transférés entre les deux sites dans leurs cages d'origine, pendant leur phase active, et placés dans l'obscurité à l'intérieur d'un chariot. Ils disposeront d’une semaine pour s'habituer à leur nouvel environnement. Pendant la restriction en eau, les animaux seront pesés chaque jour, et leur alimentation en eau sera ajustée afin de s'assurer qu'ils ne dépassent jamais une perte de poids de 10 %. L'hydrogel, fourni comme source d'eau, est considéré comme un enrichissement, car les animaux peuvent le manipuler avec leurs pattes avant. Avant les tâches comportementales, les animaux seront habitués à la pièce d’expérimentation. Pour la tâche de prise de décision, ils seront progressivement familiarisés avec la fixation de la tête pour garantir un stress minimal. Des stimulations tactiles non douloureuses seront utilisées pendant la tâche perceptuelle. L'anxiolytique sera administré par voie orale, dissous dans la boisson des animaux. Pour euthanasier les animaux, les souris seront d’abord anesthésiées. Des points limites spécifiques et des mesures conservatoires seront définis pour chaque phase de la procédure.

Choix des espèces

La souris a été choisie afin de rester cohérente avec les études antérieures sur le stress chronique induit par les interactions sociales. Les souris soumises au modèle de stress chronique d'instabilité sociale, qui sera utilisé dans cette étude, présentent une augmentation de l'anxiété et des perturbations dans les interactions sociales. Les rongeurs possèdent un système sensoriel très développé et sont considérés comme une espèce modèle pour l'étude du traitement de certains types d'informations sensorielles. De plus, les souris sont capables d'apprendre et d'exécuter des tâches de prise de décision perceptive, indispensables pour mieux comprendre les réponses tactiles. Conformément aux études précédentes, le protocole d’induction du TAS débutera à l’adolescence et se terminera à l’âge adulte. Toutes les autres étapes de l’expérience seront menées chez les souris adultes. Conformément aux études précédentes (Saavedra-Rodríguez et Feig, 2013), le protocole SIS49D commencera pendant l’adolescence (P27) et finira quand les souris sont adultes (P76). Tous les autres étapes de l’expérience seront réalisées chez les souris adultes. Les premières tâches comportementales seront réalisées à P78 et P105. Les chirurgies seront réalisées à P115 et l’entrainement dans la tâche de décision sera réalisé depuis P132. Conformément aux études précédentes (Saavedra-Rodríguez et Feig, 2013), le protocole SIS49D commencera pendant l’adolescence (P27) et finira quand les souris sont adultes (P76). Tous les autres étapes de l’expérience seront réalisées chez les souris adultes. Les premières tâches comportementales seront réalisées à P78 et P105. Les chirurgies seront réalisées à P115 et l’entrainement dans la tâche de décision sera réalisé depuis P132.

Placés un par compartiment dans une cage grillagée, 400 rats respirent pendant six heures un composé organique volatil à concentration contrôlée. Vingt-cinq composés industriels sont testés, seize rats chacun, huit mâles et huit femelles, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le porteur indique que somnolence, troubles de l'équilibre et pertes de coordination sont probables, et que l'exiguïté du compartiment peut provoquer du stress. La moitié des animaux est tuée à la sortie de la chambre d'exposition, l'autre 48 heures plus tard, pour doser la substance dans leur sang et leur cerveau.

Objectifs

Dans l’industrie, de nombreux Composés Organiques Volatils (COV) sont utilisés. Lorsqu’ils se dispersent dans l’air des ateliers, ils peuvent être inhalés par les travailleurs, passer dans le sang pour enfin s’accumuler dans certains organes, notamment le cerveau. Ce projet a deux objectifs principaux : 1) Mesurer la quantité de 25 COV différents dans le sang et le cerveau des rats après 6 heures d’inhalation. 2) Vérifier si ces substances sont complètement éliminées du sang et du cerveau 48 heures après la fin de l’exposition. Ces informations nous aideront à mieux comprendre comment ces substances se comportent dans le corps.

Bénéfices attendus

Les Composés Organiques Volatils (COV) sont des substances couramment utilisées dans l'industrie. Lorsqu’on les inhale, elles passent rapidement dans le sang et atteignent le cerveau. Ces produits peuvent provoquer des effets temporaires sur l’activité du cerveau comme la somnolence, une sensation d'ébriété ou des troubles de la concentration, ce qui peut augmenter les risques d'accidents au travail. Cependant, nous ne savons pas exactement à partir de quelle concentration ces effets apparaissent, car les études existantes se basent souvent sur des doses très élevées et mesurent les effets après l’exposition, pas pendant. Déterminer les seuils d’effet des COV sur l’activité du cerveau est donc notre objectif principal. Ainsi, en comparant les quantités de COV qui influencent l’activité cérébrale avec les limites d’exposition autorisées dans les environnements de travail, cette étude contribuera à mieux protéger les travailleurs en alertant le cas échant sur des dangers insoupçonnés. Cependant, cette étude nécessite une expérience préliminaire qui est le sujet du présent projet. Nous devons en effet vérifier en premier lieu que ces COV pénètrent bien dans le cerveau des rats mâle et femelle, et qu’ils sont complètement éliminés de l’organisme des en 48 heures.

Procédures

Pour chaque COV, 16 rats (8 mâles et 8 femelles) seront exposés pendant 6 heures à une concentration stable et contrôlée de la substance, dans des chambres spécialement conçues à cet effet. Les mâles et les femelles seront placés dans des chambres séparées. Après l’exposition, la moitié des rats (4 mâles et 4 femelles) sera mise à mort pour analyser la quantité de substance présente dans leur sang et leur cerveau. Les 8 autres rats seront observés pendant 48 heures avant d’être également mis à mort, afin de mesurer la quantité de substance encore présente dans ces mêmes tissus à ce moment-là.

Impact sur les animaux

Les substances étudiées ici peuvent affecter l’activité du cerveau. Il est donc probable qu’on observe des effets comme de la somnolence, des troubles de l'équilibre ou des problèmes de coordination. Ces effets, bien que réversibles, seront attentivement surveillés. Lors des expositions, les animaux seront placés dans des cages collectives en plastique grillagé divisée en 8 compartiments, à raison d‘un animal par compartiment. Il est possible que l’espace restreint du compartiment dans lequel les animaux seront placés puisse provoquer du stress chez eux.

Devenir

Tous les animaux utilisés dans ce projet seront mis à mort à la fin des procédures, afin de prélever les tissus nécessaires pour les analyses.

Remplacement

L’utilisation d’animaux vivants est indispensable car, pour savoir comment les COV s'accumulent et sont éliminés, il faut un organisme avec un métabolisme fonctionnel. Les tests en laboratoire sur des cellules ou des tissus isolés ne permettent pas de répondre à ces questions.

Réduction

Le protocole a été conçu pour utiliser le moins d’animaux possible, tout en incluant à la fois des mâles et des femelles. Pour chaque COV, 8 animaux (4 mâles et 4 femelles) seront utilisés pour mesurer les quantités présentes immédiatement après l’exposition, et 8 autres (4 mâles et 4 femelles) seront utilisés pour mesurer les quantités 48 heures après l’exposition.

Raffinement

Les animaux seront manipulés avec soin par du personnel qualifié. Ils seront surveillés chaque jour pour évaluer leur état de santé et leur comportement. Ils seront hébergés par deux dans un environnement enrichi avec des accessoires comme des tunnels en carton, des blocs à ronger ou des matériaux de nidification. Ils auront un accès illimité à la nourriture et à l’eau, sauf pendant les périodes d’exposition. Avant les tests, pour réduire le stress lié au fait de rester 8 heures dans des cages pendant les expositions, les rats seront progressivement habitués à ces conditions. Les cages seront équipées de grilles permettant aux animaux de voir et de sentir leurs congénères, ce qui les aidera à se sentir moins isolés. Pendant les heures d’exposition ainsi qu’après l’exposition, les rats seront attentivement surveillés, et tous les signes observés seront notés dans des tableaux prévus pour évaluer leur état général. En cas de problème, un barème permettra de décider des actions à prendre, comme l’arrêt de l’exposition ou, en cas de souffrance, la mise à mort des animaux.

Choix des espèces

Nous avons choisi d’utiliser des rats car leur métabolisme des COV est proche de celui des humains. En travaillant avec des mâles et des femelles, nous pourrons également étudier d’éventuelles différences dans la façon dont les substances sont transformées dans le corps en fonction du sexe.

Dix séances d'imagerie sous anesthésie gazeuse par animal, plus un gavage, une injection intramusculaire, une injection intrapéritonéale et un marquage des oreilles à l'entaille : 640 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue pour prélever cavité nasale, ganglions, rate, poumons et intestin. Le projet vise à suivre où se répartissent huit formulations vaccinales administrées par le nez ou par la bouche, puis à n'en retenir que deux. Les retombées annoncées, des vaccins muqueux contre des virus respiratoires ou des pathogènes digestifs, sont renvoyées au long terme. Sur le remplacement, le porteur affirme n'avoir "pas d'autre solution que d'utiliser l'animal dans son entier" et qualifie le recours à la souris d'"incontournable" puis de "nécessaire".

Objectifs

La vaccination représente une approche essentielle dans le domaine de la santé comme l’ont montré les épisodes pandémiques liés au Covid-19. Dans ce domaine, le développement de vaccins non-injectables dans le muscle du bras constitue un axe de recherche crucial. D’une part puisque cela permettrait d’améliorer la protection immunitaire associée au vaccin mais également puisque cela permettrait de s’affranchir de l’utilisation d’aiguille. Cette approche, appelée vaccination par voie muqueuse est au cœur des projets de recherche de notre laboratoire. En effet, notre laboratoire de recherche développe de nouvelles formulations vaccinales qui pourrait être admintrées par voie orale ou par voie nasale. Afin d’améliorer l’efficacité de ces potentiels vaccins, l’imagerie in vivo est une technique clé puisqu’elle permet de mieux comprendre les mécanismes mis en jeu lors de la réponse immunitaire. En effet, l'utilisation de techniques d’imagerie dites non-invasives offre la possibilité de suivre des phénomènes biologiques complexes comme la mise en place d’une réponse immunitaire et de suivre la distribution de formulations vaccinales par des mesures répétitives tout en évitant la mise à mort régulière de grands effectifs d’animaux, en comparaison d’une approche in vivo invasive. L’objectif de ce projet est de développer des formulations vaccinales et d’identifier les meilleures compositions grâce au suivi par imagerie de ces formulations après leur administration par voie orale ou nasale chez le petit animal. Cette approche permettra de mieux comprendre les mécanismes de la réponse immunitaire et d’améliorer l’efficacité des vaccins.

Bénéfices attendus

Les bénéfices de ce projet concernent majoritairement la compréhension des mécanismes de la réponse immunitaire dans le cadre de la vaccination. Le bénéfice majeur du projet à long terme est le développement de formulation vaccinale orale ou nasale qui pourra s’appliquer à différents virus respiratoires ou des pathogènes gastro-intestinaux.

Procédures

- Pour l’identification des souris, le marquage des animaux par des entailles sur les bords des oreilles, sera réalisé sur l'animal anesthésié (1 fois/animal, durée : 1 minute). - Les administrations par voie intramuculaire sont des actes induisant une douleur légère. Nous effectuerons donc ce geste sous anesthésie gazeuse (1 fois/animal, durée : 3 minutes) et un analgésique sera utilisé 30 minutes avant l’administration. Il pourra être renouvelé 6h après la première dose. - Les administration orale par gavage peuvent entrainer un leger inconfort pour l'animal (1 fois/animal, durée : 1 minute). Ce geste pourra être effectué après avoir trempé la canule de gavage dans une solution sucrée - Les injections intrapéritonéales sont des actes induisant une douleur légère et ne nécessitant pas d’anesthésie au préalable (1 fois/animal, durée : 5 minutes). - Les acquisitions d’images doivent se faire sur des animaux immobiles et seront donc réalisées sous anesthésie gazeuse (10 fois/animal, durée : 10 minutes).

Impact sur les animaux

- Marquage aux oreilles : ce geste peut entrainer un bref incorfort. - Administration intramusculaire : ce geste sera réalisé sur l’animal anesthésié et peut induire un inconfort léger après leur réveil). - Acquisition d’images : ces gestes seront réalisés sur l’animal anesthésié et peuvent induire un inconfort léger après leur réveil).

Devenir

A l’issue des deux procédures de ce projet, l’ensemble des animaux seront mis à mort. Cette mise à mort est nécessaire car elle permet de prélever différents organes d’intérêt (cavité nasale, ganglions lymphatiques, rate, poumons, intestin, etc ...) et de pouvoir ensuite les étudier plus en détails par d’autres techniques.

Remplacement

Avant d’utiliser sur l’animal les différentes formulations vaccinales développées dans ce projet, des études de toxicité et de réponse inflammatoire ont été menées à l’aide d’autres techniques (cultures cellulaires épithéliales et immunitaires) afin de vérifier leur non dangerosité sur l’animal. De manière générale, la vaccination repose sur la mise en place d’une réponse immunitaire faisant appel à l’ensemble des organes lymphoïdes, dont les ganglions lymphatiques et la rate, et dans différents organes ciblés. Le recours à l’animal est donc incontournable et le choix du modèle souris est le plus adapté afin d’évaluer l’efficacité de la dissémination de ces formulations vaccinales. Nous n’avons donc pas d’autre solution que d’utiliser l’animal dans son entier. L'étude de la biodistribution des formulations vaccinales nécessite une approche in vivo. Aucune méthode alternative ne peut se substituer à l’utilisation des animaux pour la réalisation de notre projet car il requiert l’analyse dans un organisme entier. De plus, nous souhaitons identifier et prélever les organes ciblés selon la voie d'administration (nasale ou orale). C’est pourquoi le modèle murin, qui est un modèle bien caractérisé et facilement manipulable, est nécessaire. Le nombre de souris nécessaires à nos travaux a été réduit au minimum sans compromettre l’analyse statistique de nos résultats. Une définition précise des points limites et une surveillance adaptée des animaux par un personnel compétent permet de limiter au maximum toute souffrance animale. Nous prévoyons d’utiliser au maximum 640 animaux sur une période de 5 ans.

Réduction

Dans l’ensemble, le nombre d’animaux utilisé a été réduit à son minimum sans compromettre les objectifs du projet tout en permettant d’obtenir des résultats fiables (réalisation d’études statistiques). D’autre part, un choix restreint de groupes expérimentaux (8 formulations) a été fait grâce à des tests réalisés en amont par d’autres techniques d’analyses (criblage in vitro). Enfin, la première étape du projet permet de sélectionner les 2 meilleures formulations (sur les 8 initiales) et donc de réduire drastiquement le nombre de formulations testées dans un deuxième temps.

Raffinement

Différentes mesures seront prises tout au long des expérimentations pour limiter la souffrance et le stress des animaux : - l’environnement des souris sera enrichi (igloo, coton, morceaux de bois). - à la réception des souris, elles seront acclimatées durant une semaine dans l’établissement utilisateur. - Le marquage des souris sera effectué grâce à des entailles au bord de l’oreille, moins sensible et réalisé sous anesthésie. - Les administrations intramusculaires se feront sous anesthésie. - Les acquisitions d’image par tomographie par fluorescence ou par bioluminescence s’effectueront après anesthésie et l’anesthésie sera maintenue tout au long de l’acquisition - Après chaque anesthésie, les souris seront placées dans une cage disposée sur un tapis chauffant et le bon réveil des souris sera vérifié (mouvement de la souris, comportement, prise de boisson ou de nourriture, etc) avant de les replacer dans leur pièce d’hébergement.

Choix des espèces

La recherche préclinique chez l’animal est devenue indispensable avant toute application clinique de nouvelles thérapies. L'utilisation de souris permet d'observer les effets sur un organisme entier et la biodistribution dans sa globalité. De plus, l'outil de visualisation par tomographie est dédié à la souris. A la réception, les souris seront âgées de 6 semaines afin de s’assurer que le système immunitaire est mature.