Procédures modérées
Effet de la Température sur les capacités de Navigation et l’activité Cérébrale chez la seiche
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
- Système nerveux
Pêchées au casier au moment où elles se rapprochent des côtes pour pondre et entrer en sénescence, 180 seiches communes sont utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré pour 45 d'entre elles et sévère pour les 135 autres. La chirurgie consiste à implanter des électrodes dans le cerveau et à fixer sur le dos, au-dessus de l'os de seiche, un boîtier étanche d'enregistrement, sous anesthésie par balnéation et analgésie locale. Trois groupes de quinze animaux servent à mettre au point la technique, dont quinze maintenus vigiles pendant deux heures d'enregistrement. Soixante seiches équipées et soixante sans dispositif passent ensuite une tâche d'apprentissage en labyrinthe en T à 12, 18 ou 24 degrés, avec des enregistrements de douze heures par jour un jour sur deux. Les seiches porteuses d'électrodes sont tuées pour repérer l'emplacement exact des implants, celles restées sans appareil pouvant réintégrer l'élevage selon le porteur, qui juge le recours à des animaux vivants "indispensable" pour relier activité cérébrale et navigation.
Objectifs
Ce projet vise à évaluer les effets de changements de température de l’eau sur le fonctionnement cérébral et les capacités de navigation de la seiche commune (Sepia officinalis). Des perturbations environnementales, à l’image des changements de température, peuvent modifier le fonctionnement cérébral des animaux marins. Cela peut engendrer une diminution de flexibilité comportementale et in fine du taux de survie des espèces impactées. La seiche commune, comme de nombreux autres mollusques céphalopodes, présente des capacités cognitives complexes et une diversité comportementale importante dont dépendent leur survie. Cependant il n’existe à ce jour aucun moyen d’étudier le fonctionnement cérébral in vivo au cours de diverses tâches comportementales. L’objectif de ce projet est donc d’adapter chez la seiche un système d’enregistrement cérébral ayant déjà été utilisé chez le poulpe (céphalopode également) afin d’évaluer la fluctuation de l’activité cérébrale en fonction de la température de l’eau dans laquelle elles évoluent (successivement 12°C, 18°C et 24°C). Il sera alors possible de mesurer l’activité cérébrale au cours d’une tâche de navigation spatiale à de telles températures chez des seiches équipées de ce système.
Bénéfices attendus
Les seiches sont des animaux d'intérêt économique, écologique et scientifique majeurs. Elles représentent en effet une partie importante des stocks de pêche en France, font partie intégrante des écosystèmes marins et sont au centre de nombreuses études en cognition animale et neurobiologie. Comme de nombreuses autres espèces marines, leur survie est en grande partie dépendante de leur flexibilité comportementale. Celle-ci découle d’un fonctionnement cérébral pouvant être sensible à des changements environnementaux. Notre étude vise d’une partà mieux cerner l’impact que peuvent avoir les changements de températures sur les capacités cognitives des seiches et d’autre part de savoir comment l’activité cérébrale associée peut en être modifiée. Associés, ces objectifs permettraient sur le long terme de faire de la seiche un modèle d’étude émergent contribuant à mesurer les effets des pressions anthropiques sur les espèces marines à plus large échelle. Plus globalement ils pallieraient la difficulté actuelle à tisser des liens directs entre conditions environnementales, modification du fonctionnement cérébral et des comportements, en particulier chez des espèces marines.
Procédures
Une mise au point de la technique d’enregistrement d’ondes cérébrales sera faite chez un premier groupe d’animaux anesthésiés à l’aide d’électrodes cérébrales reliées à un amplificateur. L’installation de ces électrodes est faite chez un premier groupe 15 d’animaux sous anesthésie et l’enregistrement dure 40 minutes chez l’animal maintenu en anesthésie continue. Une seconde étape de mise au point de ce protocole sera réalisée cette fois chez 15 animaux vigiles sur deux heures d’enregistrement. Une fois les ajustements de protocole réalisés, un nouveau groupe de 15 animaux sera équipé d’un système d’enregistrement d'électroencéphalographie (EEG) miniature et sans fil appelé neurologger. Celui-ci est contenu dans un boitier étanche fixé sur le dos de l’animal relié à des électrodes d’enregistrement placées au niveau du cerveau. Ces interventions chirurgicales seront réalisées sous anesthésie en une fois. Les animaux ainsi équipés évolueront librement dans un bac d’eau de mer à 18°C pendant trois jours puis à 12°C, 18°C ou 24°C pendant les trois jours suivants. Les enregistrements dureront 12h par jour, un jour sur deux. Il sera alors possible de comparer les enregistrements EEG à ces différentes températures. Enfin, le dernier objectif consiste à évaluer les compétences de navigation spatiale à différentes températures. Pour cela deux groupes d’animaux seront constitués, l’un composé d’animaux équipés du neurologger (60 seiches), l’autre non équipé (60 seiches). Les deux groupes seront soumis à une tâche d’apprentissage spatial dans un labyrinthe en T à 18°C durant trois jours. Une tâche de rappel sera réalisée à l’issue de cet apprentissage à l’une des trois températures suivantes (20 animaux par température et par groupe) : 12°C, 18°C ou 24°C.
Impact sur les animaux
Des nuisances peuvent être attendues sur les seiches suite à l’implantation des électrodes au niveau du cerveau et du neurologger sur leur dos (coquille interne appelée communément os de seiche). Cette chirurgie sera faite sous anesthésie induite préalablement par balnéation. Cette induction est considérée comme étant effective lorsque les critères comportementaux suivants sont observés : perte de mouvements, pâlissement du manteau, perte de réaction suite à une stimulation mécanique (pincement au niveau de la nageoire), diminution d’adhérence des ventouses. Cette anesthésie induite sera accompagnée d'une analgésie locale. Cette chirurgie pourra néanmoins occasionner une gêne temporaire dans les heures suivant l’implantation liées à la cicatrisation des zones d’implants (au niveau de la peau recouvrant le cartilage protégeant le cerveau et au niveau de la peau recouvrant la coquille). Les dimensions (poids et taille) du neurologger seront adaptées à la taille de l’animal de façon à ne pas gêner ses déplacements. Néanmoins les fils reliant les électrodes d’enregistrement (au niveau de la tête) au boitier étanche contenant le neurologger (au niveau du dos) peuvent occasionner une légère gêne lors de certains mouvements de la tête. Ce point sera particulièrement surveillé lors de la mise au point des techniques d’enregistrement afin de limiter au maximum cette gêne (adaptation de la rigidité et longueur des fils). De plus, le boitier étanche dans lequel se trouvera le neurologger sera amovible. Aussi les températures choisies pour étudier l’effet de leur changement se trouve dans les gammes de températures proches des conditions naturelles donc n’occasionneront pas de stress supplémentaire.
Devenir
Tous les animaux impliqués, à l’exception des animaux ne portant pas de dispositif d’enregistrement EEG, seront mis à mort à la fin des derniers enregistrements de chaque procédure, sans délai. Cela permettra de prélever leur cerveau afin de retracer la localisation précise des électrodes utilisées pour les enregistrements.
Remplacement
Le point central de ce projet est de pouvoir mesurer les effets de l’activité cérébrale chez des seiches libres de leurs mouvements, lors de la réalisation d’une tâche de navigation (enregistrements pendant les phases d’apprentissage et de rappel). Il en est de même pour étudier l’effet de changements de température sur la cognition spatiale. Le recours à des animaux vivants est donc indispensable.
Réduction
La mise au point du système d’enregistrement consistera à adapter un protocole de chirurgie pour l’implantation des électrodes au niveau du cerveau et de l’appareil sur le dos des seiches. Il conviendra donc de réaliser ces ajustements de protocole dans un premier temps sur des seiches mortes (pêchées au chalut et achetées à la criée). Les seiches de deux ans utilisées par la suite seront pêchées au casier, après qu’elles se soient rapprochées des côtes pour pondre et entrer en sénescence. Par conséquent le prélèvement de ces animaux n’induit pas de perturbation au niveau de leur population. Concernant les protocoles, des tâches comportementales non invasives seront réalisées chez des animaux ne portant pas d’appareil d'enregistrement afin de constater au préalable l’effet de la température de l’eau sur le comportement “de base” (locomotion, prédation, phases d’activité et de repos) mais aussi sur les capacités de navigation. Ainsi, le nombre d’animaux utilisés en conditions avec enregistrements (i.e chez qui les étapes d’anesthésie, de chirurgie et de mise à mort seront appliquées) sera réduit et chaque animal ayant fait tests comportementaux pourra réintégrer la structure d’élevage. Les analyses statistiques a posteriori seront faites à l’aide de tests non paramétriques conçus pour des échantillons de faible effectif.
Raffinement
La capture des animaux dans la nature sera faite par du personnel habilité, à l’aide de relevés de casiers en pleine mer. Par ailleurs, les animaux seront hébergés dans des infrastructures adaptées à cette espèce. Les seiches sont des animaux non sociaux et des interactions agonistes peuvent avoir lieu entre les individus évoluant dans le même bac lors de la période de reproduction. Il est donc préférable d’isoler les individus dans des bacs d’élevage pourvus d’enrichissements (plantes artificielles et abri). Les étapes de chirurgie seront toutes précédées d’une phase d’anesthésie adaptée, prolongée jusqu’à la fin des interventions. Une fois l’anesthésie effective, les animaux seront placés sur un support de chirurgie équipé d’un système de circulation d’eau et de solution anesthésiante au niveau de leurs branchies et un film plastique sera placé sur leur dos pour maintenir l’humidité au niveau de leur manteau. La hauteur d’eau sera ajustée pour maintenir la tête et le dos des animaux émergés et permettre les actes chirurgicaux. Une injection de solution analgésiante sera également réalisée localement au niveau des zones d’incision dorsale et de la tête. De manière à n’avoir recours qu’à une seule étape d’anesthésie générale et limiter le nombre de manipulations des animaux, l’implantation des électrodes et du boîtier contenant le neurologger, le cas échéant, se fera au cours de la même procédure. Après la chirurgie, les animaux équipés seront replacés dans leur bac d’élevage et surveillés pendant 48h afin de prévenir toute manifestation de souffrance ou de stress. L’emplacement, les dimensions et le poids du boîtier et du neurologger qu’il contient seront choisis de manière à ne pas limiter les mouvements naturels de l’animal suite à l’implantation.
Choix des espèces
La seiche commune (Sepia officinalis), est une espèce modèle bien étudiée en neuroéthologie. Son anatomie cérébrale, ses capacités cognitives et comportements complexes sont largement démontrés. Il s’agit d’une espèce évoluant dans un milieu fortement soumis aux pressions anthropiques dont font partie les changements de température aquatique. La mise au point d’un système d’enregistrement d’ondes cérébrales au cours d’une tâche comportementale chez cette espèce représente deux intérêts majeurs : mesurer l’impact de changements de conditions environnementales sur des capacités cognitives essentielles à la survie de l’espèce et bénéficier d’un outil permettant plus généralement d’explorer le bon fonctionnement cérébral. De plus, comme chez d’autres espèces de mollusques céphalopodes utilisés dans la recherche, plusieurs critères visuels (patterns liés aux chromatophores, présence ou non de lésions) et comportementaux (comportements de prédation, flottaison, mouvements désordonnés, propulsions, jets d’encre excessifs) sont utilisés chez la seiche commune pour attester de son état physiologique (bien-être, souffrance, stress). Les animaux utilisés seront des seiches adultes âgées de un ou deux ans, de taille assez importante pour faciliter les étapes de chirurgie et dont le développement cognitif (mémoire) est mature. Les individus ayant déjà pondu (en fin de vie) seront privilégiés.
Mise au point de procédures d’évaluation de la personnalité chez la perdrix rouge
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
Gardées en vie à l'issue du projet parce qu'elles n'ont subi aucun traitement invasif, les 40 perdrix rouges sont destinées à d'autres expérimentations. Elles sont utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, quatre tests individuels de moins de trente minutes un jour sur deux, avec une capture par l'expérimentateur qui déclenche des réponses de peur, fuite et envol. L'isolement social pendant ces tests constitue une source de stress pour ces oiseaux grégaires, ce que le porteur reconnaît en invoquant la brièveté des séances. L'objectif déclaré est d'identifier les personnalités les plus aptes à survivre après un lâcher, la perdrix rouge étant une espèce en fort déclin dont des populations captives sont relâchées chaque année en France.
Objectifs
Face à la diminution importante de la biodiversité, de nombreux programmes de conservation proposent de renforcer les populations naturelles par la mise en nature d’individus nés et élevés en captivité. Cependant, il apparait, que pour beaucoup d’entre eux, le taux de survie des individus relâchés est faible, rendant inefficaces les efforts de conservation. Ce faible taux de survie peut être expliqué notamment par une altération des comportements adaptatifs (comportements anti-prédateurs, d’exploration des ressources alimentaires, reproducteurs) chez les animaux nés en captivité. Cependant, au sein d’une même population captive, il existe une très forte variabilité comportementale entre les individus, variabilité qui permet d’identifier des personnalités animales différentes. Certains travaux montrent aujourd’hui un rôle important de ces personnalités animales dans la dynamique naturelle des populations, certaines personnalités étant impliquées dans les processus de dispersion et de colonisation de nouveaux milieux, tandis que d’autres dans le maintien sur une même aire de répartition (sédentarité). Dans ce contexte, le choix de personnalités particulières dans les programmes de repeuplement pourrait être un levier pertinent permettant d’améliorer leur réussite. Aussi, l’objectif de ce projet est de caractériser les différentes personnalités chez la perdrix rouge, espèce dont des populations captives existent et sont mises en nature chaque année en France pour des objectifs de conservation.
Bénéfices attendus
La caractérisation des différentes personnalités chez la perdrix rouge pourrait permettre d'identifier des personnalités plus favorables à la remise en nature et ainsi améliorer la réussite des programmes de repeuplement de cette espèce
Procédures
Les animaux seront uniquement soumis à des tests éthologiques de caractérisation du comportement. Les tests individuels sont au nombre de 4 et restent d'une durée inférieure à 30 minutes chaque jour. Le comportement reproducteur est observé en volière extérieur sans intervention sur l'animal.
Impact sur les animaux
Les oiseaux peuvent subir des nuisances lors de la capture puisqu’ils peuvent émettre des réponses de peur à l’approche de l’expérimentateur (fuite et envol). Cependant, le temps de capture est inférieur à 2 minutes, ceci permettant de limiter les risques de blessure de l’animal lors de ces comportements de fuite. L’isolement social lors des tests peut également être une source de stress pour ces oiseaux sociaux. Cependant, cet isolement sera d’une courte durée (moins de 30 minutes par jour et ce un jour sur deux).
Devenir
Les oiseaux n'ayant pas subi de traitements invasifs, ils seront gardés en vie d'autres expérimentations.
Remplacement
Nous travaillons sur la caractérisation des personnalités animales, nous donc devons expérimenter directement sur l’animal vivant, ce qui exclut tout type de remplacement.
Réduction
Le nombre d’animaux choisi (20 mâles et 20 femelles) permet d’avoir un effectif suffisant pour les comportementales tout en tenant compte d’un possible effet sexe.
Raffinement
Les oiseaux seront hébergés en groupes sociaux mixtes de 5 individus en volières intérieures munies de fenêtres extérieures permettant un éclairage naturel. Chaque volière intérieure sera munie d’une mangeoire et d’un abreuvoir (nourriture et eau à volonté), de litière au sol (copeaux de bois) leur permettant de faire des bains de poussière et de deux abris leur permettant de se soustraire aux perturbations environnementales. Lors de la phase de reproduction, les oiseaux seront placés en volière extérieure de 25m2 (4 couples par volière) comprenant un couvert végétal naturel, de l'alimentation et de l'eau, ainsi que des cachettes pour s'abriter des conditions climatiques. Lors des phases de tests, les oiseaux seront déplacés et manipulés par des personnes compétences et expérimentées. Les phases de tests seront limitées à 30 minutes par jour pour limiter les contraintes pour l’animal. Les oiseaux seront soignés et observés tous les jours par un personnel expérimenté (grille annexe 1). La détection de tout changement de comportement ou de blessure induira un isolement de l'individu pour l’administration de traitement .
Choix des espèces
Les perdrix rouges sont des gallinacés emblématiques des milieux ouverts du bassin méditerranéen. Leurs populations sont en fort déclin actuellement et un certain nombre de programmes de conservation vise à utiliser les populations captives pour des repeuplements. Cependant, la réussite de ces programmes reste mitigée et il convient donc de trouver de nouveaux outils pour améliorer leur efficacité. Les perdrix utilisées seront des adultes âgés de 6 mois. A cet âge le profil comportemental est stable et nous pourrons donc observer des différences interindividuelles robustes, ainsi que de potentielles différences liées au sexe.
Modélisation des maladies inflammatoires de l’intestin au TNBS chez les rongeurs et évaluation prophylactique et thérapeutique de molécules thérapeutiques.
- Recherche appliquée
- Troubles gastrointestinaux
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
Cinquante études sur cinq ans, commandées par des laboratoires académiques, des biotechs et des industriels du médicament : 1 500 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue, pour faire tourner un modèle de maladie inflammatoire de l'intestin. L'inflammation est déclenchée par une administration intra-rectale de TNBS dilué dans l'éthanol sous anesthésie, suivie de gavages, de prélèvements de sang et d'endoscopies par sonde caméra. Une partie des souris est immunodéficiente et porte un système immunitaire humanisé. Le porteur classe l'ensemble en souffrance modérée tout en décrivant une diarrhée pouvant être sévère, une déshydratation, une anémie, une prostration et une perforation de l'intestin.
Objectifs
La maladie inflammatoire chronique des intestins (MICI) est une pathologie caractérisée par une inflammation de la paroi du tube digestif entrainant une dégradation significative de la qualité de vie des patients. Les MICI les plus courantes sont la colite ulcéreuse (ou rectocolite hémorragique) et la maladie de Crohn. A l’heure actuelle, les mécanismes d’apparition de cette pathologie sont peu connus et aucun traitement curatif n’est disponible sur le marché. L’objectif de ce projet est de développer un modèle d’étude fiable des MICI pour permettre d’en accroitre la compréhension et d’évaluer les propriétés immunitaires, thérapeutiques et toxicologiques de molécules issues de laboratoires académiques, biotechnologiques et pharmaceutiques.
Bénéfices attendus
Les MICI sont des maladies inflammatoires. En basant notre modèle sur des souris ayant un système immunitaire humanisé, nous mettons à disposition des chercheurs un modèle permettant d'étudier les MICI et des potentiels traitements avec davantage de spécificité pour l’espèce cible de ces recherches : l’Homme.
Procédures
Administration intra-rectale sous anesthésie générale, durée de l'intervention 4 à 5 minutes. Administration des composés à visées thérapeutiques par voie enterale (gavage ou incorporation dans l'eau de boisson) ou parentérale (intraveineuse, intrapéritonéale, intramusculaire ou sous-cutanée). Leur nombre est à déterminer, leurs durées seront de 10 à 15 secondes chacune. Prélèvements sanguins pour le suivi de la pathologie et des effets des traitements selon un schéma établis par le vétérinaire et le comité de bien-être. Chaque prélèvement aura une durée de 15 à 30 secondes, environ. Insertion de sonde caméra intrarectale sous anesthésie pour analyse des intestins, 3 à 4 minutes par analyse.
Impact sur les animaux
Les MICI se caractérisent par une diarrhée pouvant être sévère et entrainer une perte de poids, une déshydratation, des coliques ou une une anémie. Des nuisances peuvent également être induites par l'injection intra-rectale de TNBS solubilisé dans l'éthanol ainsi que par les prélèvements sanguins, l'administration des composés de recherche et les effets potentiellement toxiques de ces composés à visées thérapeutiques dans un contexte préclinique ainsi que par l'endoscopie. Ces nuisances et effets indésirables peuvent se manifester, entres autres, par une perte de poids, une hypo- ou une hyperactivité, une prostration ou des difficultés à se déplacer, une perforation de l'intestin.
Devenir
Les animaux seront mis à mort en fin de procédure.
Remplacement
Il n’est à l’heure actuelle pas possible de recréer in vitro un modèle étudiant les interactions complexes qui peuvent exister entre le système immunitaire et un système digestif fonctionnel qui permettrait de reproduire les MICI tout en objectivant les effets thérapeutiques et toxicologiques de composés médicamenteux destinés à leurs traitements. Les modèles murins constituent donc une approche scientifiquement valide, robuste et indispensable au développement et à la mise à disposition de thérapies innovantes pour les patients.
Réduction
Un total de 1500 animaux est demandé pour la réalisation de ce projet sur une durée de 5 ans, permettant de réaliser 50 études afin de mettre en place le modèle et de réaliser les premières études précliniques. Chaque étude comprendra un minimum de 4 groupes (contrôle négatif, contrôlé positif, plusieurs doses ou traitements à comparer) avec 5 à 10 animaux par groupe afin d’obtenir des résultats fiables malgré la variabilité intrinsèque liée au modèle. Le nombre d’animaux utilisés dans chaque étude sera réduit au maximum en se basant sur des tests statistiques adaptés aux effets attendus de la série et sur base des données historiques collectées.
Raffinement
En début d'étude et tout en respectant la réglementation en vigueur, les souris seront hébergées préférentiellement par groupes sociaux stables composés de 5 individus. La nourriture et l’eau de boisson seront fournies ad libitum sauf si le protocole d’étude nécessite un jeûne de nourriture. La durée de ce jeûne ne pourra dépasser 6 heures par semaine. L’eau ne sera jamais retirée des cages. Des compléments alimentaires pourront être administrés suivant l’état de santé des animaux. La cage contiendra à minima une couche de litière permettant aux souris de creuser, de se cacher et de réaliser un nid, élément essentiel à leur bien-être. En outre, des enrichissements de qualité seront fournis dans chacune des cages : morceaux de bois, tunnel en carton, kraft et/ou boules de cotons. Les souris seront hébergées dans une atmosphère contrôlés en permanence. À leur entrée dans l’animalerie, les souris bénéficieront d’une période d’acclimatation de minimum 4 jours. Lors d’un changement de zone au sein de l’animalerie, les souris bénéficieront d’une période d’acclimatation d’une nuit au minimum. Pour gérer la douleur, la souffrance et l’angoisse, nous évaluerons l’état de santé par une échelle de scores appliquée dès le premier geste invasif. Le vétérinaire aura pleine autorité pour euthanasier un animal pour raison éthique ou mettre en œuvre un traitement anti-douleur s’il/elle le juge nécessaire. Concernant les prélèvements sanguins, le volume maximal est de 200µL pour un prélèvement unique, au-delà il s’agira d’un prélèvement terminal sous anesthésie. Les fréquences sont limitées et une réhydratation est prévue pour tout prélèvement unique à partir de 8mL/kg. Les animaux n’attendront pas dans la salle d’euthanasie. Une salle d’attente est prévue à cet effet. Lorsqu’un animal rentre en salle d’euthanasie, il doit être immédiatement euthanasié. Les points limites conduisant à une euthanasie seront fonction des scores cliniques et de la perte de poids. Les administrations intra-rectales seront réalisées sous anesthésie générale à l'isoflurane et le volume d'injection ne pourra dépasser 200 μL. L’endoscopie sera réalisée sous anesthésie.
Choix des espèces
Le séquençage complet du génome de la souris a démontré la proximité phylogénétique des souris et des hommes : 90 % des gènes humains ont un équivalent chez la souris, permettant d’élaborer des approches génétiques et fonctionnelles valides. Lorsque les gènes orthologues produisent des effets différents entre souris et homme, le remplacement dans le génome du gène de la souris par son équivalent humain permet la création de lignées humanisées. Ainsi, les souris SCID (Severe Combined ImmunoDeficiency), leurs dérivées et leurs analogues, toutes immunodéficientes, ont permis le développement des modèles humanisés. Pour les souris non humanisées, les animaux seront inclus aux études à partir de l’âge minimum de 6 semaines, animaux matures au niveau de leur système immunitaire. Pour les souris humanisées, les animaux seront inclus aux études à partir de l’âge minimum de 8 semaines, première apparition des cellules immunitaires humaines dans le sang.
Impact des rythmes de croissance sur l’activité des cellules souches musculaires chez la truite arc en ciel
- Recherche appliquée
- Alimentation animale
- Recherche fondamentale
- Système musculosquelettique
Privées de nourriture pendant sept jours d'affilée pour cent d'entre elles, nourries deux jours par semaine seulement pour deux cents autres, les truites arc-en-ciel de ce projet sont d'abord marquées par une puce magnétique. Elles sont 400 au total, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le porteur ramène cette privation à une "sensation modérée de faim" pendant cinq à sept jours par semaine, et annonce qu'aucune nuisance n'est attendue pour les poissons nourris à satiété. Toutes sont tuées par une dose létale pour prélever leur muscle, l'enjeu déclaré étant de mesurer l'effet des rythmes de croissance sur les cellules souches musculaires et d'en tirer des recommandations pour les pisciculteurs.
Objectifs
En fonction de la température et de la disponibilité en eau, les pisciculteurs adaptent leurs pratiques en réduisant fortement le nourrissage pour assurer la survie des animaux et maîtriser l’impact environnemental de leur production. Ces pratiques ont pour conséquences d’altérer le rythme de croissance des animaux.
Bénéfices attendus
Dans le cadre de ce projet, nous pourrons déterminer si les rythmes de croissance au cours de la phase exponentielle de croissance affectent l'activité des cellules myogéniques et le nombre de fibres musculaires qui sont déterminantes pour le potentiel de croissance ultérieure. Par ailleurs, cette connaissance permettra de faire des recommandations aux pisciculteurs quant à la gestion des rythmes de croissance dans leur élevage.
Procédures
Après avoir été marqués à l'aide d'une puce magnétique (procédure 3, modérée), les animaux seront soumis à une restriction alimentaire (procédure 1) ou à un jeûne d'une semaine (procédure 2) afin de ralentir leur croissance. Nous utiliserons 200 poissons dans la première procédure et 100 poissons dans la deuxième (1 semaine de jeûne). Les prélèvements qui seront réalisés seront faits après euthanasie à dose létale.
Impact sur les animaux
Certains animaux vont être soit nourris 2 jours par semaine (lundi et jeudi) soit privés de nourriture pendant 7 jours maximum ce qui va engendrer une sensation modérée de faim pendant au maximum 5-7 jours par semaine. Pour les animaux nourris à 80% de la satiété et à satiété aucune nuisance n'est attendue.
Devenir
A l'issue de chaque procédure, pour réaliser des prélèvements de muscle, les animaux seront euthanasiés à dose létale par une personne compétente désignée par les responsables de projet. Les responsables du bien-être des animaux sont bien sûr informés.
Remplacement
L'objectif du projet étant de déterminer l'impact des rythmes de croissance sur la plasticité des cellules souches, cela implique nécessairement de réaliser des tests sur animaux vivants.
Réduction
Pour réduire le nombre d'animaux utilisés, nous allons utiliser des bacs avec un volume modulable pour maintenir une densité optimale (entre 5 et 20kg/m3) et un effectif de 100 poissons/bac pour éviter les comportements agressifs. Avec cette quantité, nous pouvons prélever 15 poissons à chaque prélèvement ce qui est suffisant pour atteindre les objectifs scientifiques de l'étude et détecter des différences de plasticité des cellules souches musculaires.
Raffinement
Les animaux seront élevés dans un environnement optimal pour l’espèce (photopériode, qualité d’eau, densité, enrichissement). Les paramètres physico-chimiques de l’eau (température, O2, NH4+) seront également régulièrement contrôlés. Les manipulations sont réalisées par du personnel compétent le plus rapidement possible pour limiter le stress.
Choix des espèces
La truite arc-en-ciel (Oncorhynchus mykiss) est une espèce robuste dont l’élevage, la croissance et la reproduction sont bien maîtrisés en pisciculture. Il s’agit d’une espèce d’intérêt agronomique puisqu’elle représente 95% de la production française piscicole en eau douce. Elle est par ailleurs un modèle biologique largement diffusé dans la communauté scientifique (environ 50 000 références). C’est une espèce avec une très grande plasticité de croissance. Cette espèce n'est pas incluse dans la liste des espèces identifiées comme devant provenir d’élevage ou de fournisseurs agréés. Nous allons utiliser des poissons de 5g à 250g car c'est durant cette période que la croissance est exponentielle et avec la plus grande plasticité. Par ailleurs, pour évaluer l’effet sur la qualité du produit (texture), il faut des poissons d'un poids minimal de 250g, qui correspond à la taille commerciale « portion ».
Développement par imagerie d’une méthode d’expression de protéines bioluminescentes via l’injection de vecteur ADN dans les cellules musculaires de la souris
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
Les souris utilisées sont immunodéficientes, dépourvues de défenses efficaces au point qu'une contamination bactérienne ou virale les tuerait, ce que le porteur qualifie de phénotype dommageable. Elles sont 180, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour prélèvements post-mortem. Chacune subit jusqu'à cinq injections, dix anesthésies à l'isoflurane, quatre séances d'imagerie de bioluminescence et jusqu'à cinq prises de sang à la mandibule sur animal vigile, l'injection intramusculaire étant couplée à des décharges électriques pour faire entrer un plasmide dans le muscle. L'objectif est de transformer ce muscle en ce que le porteur appelle une "usine de production" d'anticorps, preuve de concept dont il annonce les débouchés chez les espèces domestiques, contre l'arthrite ou le psoriasis.
Objectifs
Le présent projet vise à développer, grâce à l’imagerie, une méthode permettant de faire exprimer par un muscle un anticorps ou fragment d’anticorps à partir d’un plasmide contenant leur gène. Le plasmide est injecté dans les cellules musculaires de souris afin d’induire une sécrétion à une dose supérieure ou égale à la dose minimale efficace de l’anticorps. L'objectif est donc double : 1/ mettre en place une méthode d’expression d‘anticorps par les cellules musculaires 2/ induire une expression qui soit suffisante pour être détectée dans le sang des animaux et agir sur des cibles présentes à distance des muscles sécréteurs. Ce projet fait suite à de nombreux tests cellulaires de vérification de la fonctionnalité des plasmides ADN utilisés. Sa réussite ouvrira la voie à des études plus approfondies et à visée thérapeutique chez des espèces domestiques. En bref, nous aurons une preuve de concept de l’utilisation de vecteurs ADN injectés dans les muscles des animaux, qui fonctionneront alors comme des « usines de production » d’anticorps dirigés contre des cibles. La niche d’utilisation de cette stratégie clinique concerne les maladies chroniques, dans notre cas, les maladies chroniques inflammatoires articulaires (ex : arthrite) et cutanées (ex : psoriasis ou pelade).
Bénéfices attendus
Une fois abouti, le présent projet a pour vocation de mettre en place une méthode de production de biomédicament par les cellules musculaires de souris via l’injection d’un vecteur ADN. Celle-ci ouvrira de nombreuses perspectives thérapeutiques et vétérinaires.
Procédures
Les souris de ce projet subiront au maximum : - 5 injections d’une durée total de 12 min (1 IM couplée ou non à l’électroporation, soit 10min ; 4 IP pour l’imagerie, soit 2 min) - 10 anesthésies à l’isoflurane pour une durée totale de 70 minutes (5 rasages, soit 10min ; 1 IM couplée ou non à l’électroporation, soit 10 min ; 4 imageries de bioluminescence, soit 50 minutes) - 2 à 5 prélèvements de sang sur souris vigile, soit 2 à 5min au total.
Impact sur les animaux
Les injections intramusculaires et l’application de courants électriques pour l’électroporation peuvent potentiellement induire des douleurs. Ils seront réalisés sous anesthésie générale. Une prise de sang au niveau submandibulaire sera également réalisée sur animaux vigiles dans les deux premières procédures. Les souris seront suivies grâce à nos grilles de scoring pour surveiller l’apparition de signes de souffrance tel que la perte de poids, la modification de la physiologie ou du comportement (dont la locomotion suite à l’injection intramusculaire avec ou sans électroporation). Nous utiliserons des souris immunodéficientes qui sont à phénotype dommageable car elles présentent une absence de défenses immunitaires efficaces. Si elles sont contaminées par des bactéries et/ou virus, cela entrainerait leur décès. Elles seront donc hébergées en portoir ventilé où il y a une très haute protection contre ces agents pathogènes empêchant ainsi l’expression de ce phénotype. Ce statut est également garanti durant les différentes séances d’imageries durant lesquelles des procédures strictes sont respectées (désinfection du matériel, entretien des locaux, ordre de passage des souris dans l’imageur…).
Devenir
Mise à mort de tous les animaux à la fin de chaque procédure pour prélèvements post-mortem.
Remplacement
Une première sélection des meilleurs plasmides d’expression a été réalisée en amont par nos collaborateurs par des études in vitro. L’étude de la production d’un anticorps ou d’une protéine recombinante par un tissu musculaire et sa sécrétion dans la circulation sanguine générale n’a pas de méthode alternative que l’utilisation d’animaux vivants à l’heure actuelle.
Réduction
Nos protocoles expérimentaux ont été mis en place de sorte à réduire au maximum le nombre d’animaux utilisés en injectant des vecteurs exprimant des protéines bioluminescentes, qu’il est possible de suivre par imagerie de bioluminescence et par luminométrie. Le suivi par bioluminescence in vivo permettra de suivre l’expression de la luciférase au cours du temps sur un seul et même animal et d’éviter de multiplier les groupes. C’est donc un double bénéfice au niveau scientifique et au niveau de l’utilisation d’animaux. Le nombre d’animaux utilisés dans ce projet est réduit au minimum sans toutefois compromettre les objectifs. Sur 5 ans, nous prévoyons l’utilisation au maximum de 180 souris qui seront réparties ainsi : - Mise en place des protocoles de transfert de vecteur ADN au sein de notre laboratoire : 40 souris - Étude du contrôle du système immunitaire : 40 souris - Étude des méthodes de transfert du vecteur ADN dans les cellules musculaires en utilisant soit différents polymères, soit différents produits de transfection : 100 souris.
Raffinement
La modalité d'imagerie mise en œuvre est non invasive et est réalisée sous anesthésie gazeuse. Les injections intramusculaires sont également effectuées sous anesthésie gazeuse. Le matériel stérile à usage unique adapté aux rongeurs, ce qui limite le risque d’infection et la douleur infligés au cours de l'expérimentation. Enfin, les souris auront 1 semaine minimum d’acclimatation avant le début de l’expérimentation. Elles seront 2 à 6 souris maximum par cage de 530 cm² selon leur poids. Ces cages seront en portoir ventilé, ce qui empêchera l’expression du phénotype dommageable des souris immunodéficientes. Ce statut est également garanti durant les différentes séances d’imageries durant lesquelles des procédures strictes sont respectées (désinfection du matériel, entretien des locaux, ordre de passage des souris dans l’imageur…). Les souris immunocompétentes seront également hébergées en portoir ventilé. Les cages sont enrichies avec du matériel pour la fabrication d’un nid et des granulés pour ronger et jouer avec ses congénères. Elles auront un accès à l’eau et la nourriture ad libitum et un cycle jour/nuit 12h/12h pendant toute la durée de l’expérimentation. Des grilles de scoring avec des points limites prédictifs seront mis en place et le personnel assurera l’observation des animaux quotidiennement afin d'anticiper leur souffrance. Néanmoins, en cas de douleur observée en post injection du plasmide, une injection sous-cutanée d’un analgésique) sera effectuée. Une injection intramusculaire peut provoquer une douleur liée à un hématome. Pour les prises de sang, un crayon hémostatique sera appliqué à la fin du prélèvement afin d’arrêter le saignement.
Choix des espèces
Le présent projet vise à développer, grâce à l’imagerie, une méthode permettant de faire exprimer par un muscle un anticorps ou fragment d’anticorps à partir d’un plasmide contenant leur gène. La souris est une espèce animale très largement employée dans la littérature pour ce genre d’étude de par la relative faible durée des expérimentations (quelques semaines), ainsi que par la possibilité d'utiliser des techniques d'imagerie in vivo. C'est ainsi le modèle animal de choix. La méthode mise en place dans ce projet a pour vocation de faire produire notre anticorps d’intérêt dans un système complètement fonctionnel et développé. Les animaux employés seront donc adultes, entre 7 et 10 semaines au moment de l'arrivée des animaux et leur entrée dans le protocole.
Production de sérum de lapin entrant dans la fabrication d’un médicament humain
- Production de routine
- Recherche appliquée
- Autres troubles humains
- Troubles immunitaires
- Tests réglementaires
Le protocole s'achève par un prélèvement de sang poursuivi jusqu'à la mort de l'animal, dix à douze minutes sous anesthésie. Il concerne 120 790 lapins, tous tués, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque lapin reçoit d'abord deux injections d'une suspension cellulaire à quatorze jours d'intervalle, puis subit deux saignées de cinq à huit minutes à l'artère médiane de l'oreille, maintenu vigile dans une boîte de contention et refermé à la colle chirurgicale, avec une anémie de deux à six jours que le porteur reconnaît. Le sérum obtenu entre dans la fabrication d'un immunosuppresseur commercialisé dans plus de quatre-vingts pays, et le porteur décrit au titre de la réduction une sélection génétique menée sur les reproducteurs de l'élevage pour augmenter la quantité de sérum tirée de chaque lapin.
Objectifs
Le projet a pour objectif la production de sérum de lapin entrant dans la fabrication d'un médicament à usage humain, immunosuppresseur visant à lutter contre le risque de rejet de greffe chez l'Homme et également utilisé dans le traitement de l'aplasie médullaire.
Bénéfices attendus
Le bénéfice attendu du projet est la production d'un médicament humain, commercialisé dans plus de 80 pays à travers le monde et considéré comme un "life saving drug", c'est-à-dire un médicament vital pour de nombreux patients. Il est utilisé en milieu hospitalier. Ce médicament est un immunosuppresseur sélectif utilisé pour lutter contre les rejets de greffe chez l'Homme en période pré et post-opératoire. Le médicament est également utilisé dans le cadre de la prévention de la réaction du greffon contre l'hôte aiguë et chronique en cas de transplantation de cellules souches hématopoïétiques ainsi que pour le traitement de la réaction du greffon contre l'hôte aiguë corticorésistante. Enfin, le médicament sert au traitement de l'aplasie médullaire. Il est inclus sur la liste des médicaments critiques de l’Union Européenne (Union list of critical medicines), pour lesquels un stock minimal de 4 mois est requis afin d’éviter toute rupture d’approvisionnement des pays.
Procédures
Les animaux sont changés de cage au moment de la mise en place en salle de protocole et pesés individuellement. Puis le protocole comprend différentes étapes pouvant impacter les animaux : - une phase d'immunisation : l’injection d'une suspension sur animal vigile simplement contenu (durée : 1 minute) et l’injection d'une suspension sur animal vigile simplement contenu 14 jours plus tard (durée : 1 à 2 minutes) - un premier prélèvement de sang à l'artère médiane de l'oreille sur animal vigile mis dans une boite de contention (durée : environ 5 à 8 minutes), puis l’application de colle chirurgicale au point de prélèvement pour éviter tout saignement. - un second prélèvement de sang à l'artère médiane de l'oreille controlatérale sur animal vigile mis dans une boite de contention (durée : environ 5 à 8 minutes), puis l’application de colle chirurgicale au point de prélèvement pour éviter tout saignement. - l’anesthésie de l’animal par injection intraveineuse d’un mélange d’anesthésiques sur animal vigile mis dans une boite de contention (durée : 1 minute), puis un prélèvement de sang terminal, jusqu'à la mort de l’animal (durée : environ 10 à 12 minutes).
Impact sur les animaux
Le protocole comprend différentes étapes sur les animaux inclus dans le projet : - une phase d'immunisation avec deux injections d'une suspension cellulaire sur animal vigile réalisées à 14 jours d’intervalle entrainant une douleur légère de courte durée ; - une phase de prélèvements avec deux prélèvements successifs à l'artère médiane de l'oreille sur animal vigile entrainant une douleur légère de courte durée ; - un prélèvement terminal sous anesthésie générale, entrainant une douleur légère de courte durée lors de l’anesthésie. Les prélèvements peuvent entrainer une anémie de courte durée (entre 2 et 6 jours) et celle-ci reste légère à modérée (selon une étude interne réalisée en 2023 sur le suivi de l’anémie des animaux par le biais de la mesure du taux d’hématocrite).
Devenir
Tous les animaux entrant dans la procédure sont mis à mort, puisque le protocole prend fin à la mort des animaux lors du prélèvement de sang sous anesthésie générale.
Remplacement
A l'heure actuelle des connaissances scientifiques, il n'existe pas de modèle alternatif au lapin pour la production d'anticorps polyclonaux tels qu'inclus dans la composition du médicament final. La diversité et la quantité d'anticorps produits par l'animal permettent une compatibilité sans équivalent avec un nombre très élevé de patients receveurs de greffes dans les différents pays du monde. Cette diversité n’est pas reproductible via la production d’anticorps in vitro. En effet, plus de 80 épitopes différents de cellules de l’immunité sont ciblés par le médicament, ce qui provoque chez le patient une immunosuppression majeure et durable.
Réduction
La procédure expérimentale appliquée a été définie afin d'obtenir la plus grande quantité possible de sérum par animal utilisé (sérum contenant la concentration requise en anticorps polyclonaux). De plus, un travail de sélection génétique mené sur les animaux reproducteurs de l'élevage a permis d'optimiser la quantité de sérum prélevée sur chaque lapin lors du prélèvement terminal, et d'améliorer la concentration en immunoglobulines du sérum produit. De plus, la répétition des prélèvements de sang, réalisée sous surveillance du bien-être des animaux, augmente la quantité moyenne de sérum prélevée par animal. Il est donc possible de fabriquer une plus grande quantité de médicament avec un nombre équivalent d'animaux utilisés. Enfin, les lapins mâles et femelles sont utilisés dans le cadre du protocole, ce qui permet d'inclure dans la procédure tous les lapins élevés au sein de l'établissement.
Raffinement
Les lapins sont hébergés dans des cages conformes aux exigences de la règlementation et de respect du Bien-Etre Animal, ils disposent d'un enrichissement adapté (diffusion de radio, mise à disposition de bûchettes de bois à ronger, de tunnels pour se cacher). Les animaux élevés ensemble depuis leur naissance sont de préférence hébergés dans la même cage, afin de limiter le risque d’agression entre lapins. Le suivi quotidien des animaux est assuré par des personnes expérimentées et formées régulièrement ; des fiches de suivi permettent d’enregistrer les soins adaptés prodigués aux animaux et de suivre l’évolution de l’état de santé des animaux. Un suivi renforcé est effectué sur les animaux durant les phases de prélèvements du protocole expérimental. Une évaluation de la souffrance animale en référence à une grille établie est réalisée chaque jour. La grille permet également de fixer les points limites et de cesser immédiatement l'expérimentation sur tout lapin présentant des signes de souffrance excessive. Une prise en charge spécifique de la douleur par l'application d'un protocole d'anesthésie générale validé est appliquée lors du dernier prélèvement de sang. Enfin, l'utilisation de colle chirurgicale lors de chaque injection intraveineuse ou prélèvement de sang assure un meilleur confort à l'animal.
Choix des espèces
A l'heure actuelle des connaissances scientifiques, il n'existe aucune méthode alternative permettant de produire le sérum entrant dans la composition du médicament humain in vitro. De plus, le médicament est sous autorisation de mise sur le marché avec utilisation exclusive du lapin, espèce qui fait référence dans la production d'anticorps polyclonaux pour l'usage pharmaceutique. L’AMM du médicament fixe également l’âge et le poids requis pour utiliser les animaux dans le cadre du protocole expérimental. Les lapins ne sont inclus dans la procédure d'expérimentation animale qu'à partir de l'âge de 14 semaines et pour un poids minimum de 2,8 Kg. C'est en effet à partir de cet âge que leur système immunitaire est capable de produire les anticorps nécessaires à la fabrication du médicament humain, en quantité et concentration suffisantes. Les animaux sont également aptes à supporter les différentes phases de la procédure (prélèvements de sang répétés notamment).
Caractérisation de l’effet d’un pesticide sur les cellules d’origine d’un cancer pédiatrique musculaire dans un modèle murin
- Recherche fondamentale
- Oncologie
Pour vérifier si des cellules neuronales embryonnaires transformées donnent des tumeurs du muscle, et si un pesticide favorise ce basculement, 250 souris de six semaines reçoivent une greffe dans la patte. Elles sont utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré et toutes tuées à l'issue, sans possibilité d'être réutilisées. L'épaisseur de la patte greffée est mesurée deux fois par semaine sur animal vigile, jusqu'à seize fois, et le porteur indique que la croissance de la tumeur peut provoquer une douleur modérée. La mise à mort est déclenchée par l'atteinte de points limites décrits comme précoces et prédictifs d'un mal-être, et le porteur annonce l'ajout de nourriture humidifiée au fond de la cage au cas où les souris auraient des difficultés à se déplacer.
Objectifs
Les cancers touchent chaque année plus de 2500 enfants en France. On estime qu’un enfant sur 440 sera atteint par un cancer avant l’âge de 15 ans. Malgré des essais cliniques internationaux, leur taux de survie ne s’améliore plus depuis 20 ans. Il est donc indispensable de mieux comprendre leurs origines et leurs particularités moléculaires pour développer des traitements plus efficaces et moins toxiques. Ce projet a pour objectif de déterminer si des cancers du muscle observés chez les enfants et les adolescents peuvent dériver non seulement de la transformation de cellules du muscle mais aussi d’une autre population de cellules neuronales, sous l’effet de facteurs environnementaux et/ou génétiques. Cette question est importante, car la réponse aux chimiothérapies peut varier en fonction de la cellule à l’origine des tumeurs. Il a été montré que lorsqu’on exprime des gènes mutés chez les patients atteints par ces cancers du muscle dans les cellules neuronales, celles-ci prolifèrent et expriment des marqueurs de ces cancers. Par ailleurs, l’exposition de ces cellules aux pesticides favorise leur potentiel tumoral. Il faut maintenant vérifier que les cellules neuronales transformées donnent des tumeurs dans les muscles. Ce projet permettra de fournir de nouvelles pistes pour comprendre l’origine de ces cancers.
Bénéfices attendus
Ce projet va permettre de déterminer si un type de cellules embryonnaires peut être l’origine de certains cancers pédiatriques.
Procédures
Injection anti-douleur / analgésie avant la greffe (Nombre : 1 fois maxi - Durée : 30 s). Anesthésie lors de la greffe (Nombre : 1 fois au moment de la greffe tumorale - Durée : 5 min) Pesée en début de procédure puis 1 fois par semaine (Nombre : 8 fois maxi - Durée : 30 s). Mesure de l’épaisseur de la patte greffée et de la patte controlatérale avant la greffe puis 2 fois par semaine (Nombre : 16 fois maxi - Durée : 1 min).
Impact sur les animaux
Avant l’implantation intra-musculaire (IM), l’injection en sous-cutanée d’un anti-douleur engendre une douleur légère. L’implantation IM sous anesthésie quant à elle entraîne une douleur légère. Le suivi de la prise tumorale va engendrer un stress léger lors de la mesure de l’épaisseur de la patte greffée et de la patte car ces mesures sont réalisées sur animaux vigiles. Le développement de tumeurs peut engendrer une douleur modérée.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort en fin de procédure ou en cas d'atteinte de points limites. Les animaux ne pourront pas être réutilisés pour d'autres expériences.
Remplacement
Le modèle animal est le seul permettant de prendre en compte de nombreux facteurs physiologiques susceptibles d'intervenir dans le potentiel tumorigénique de ces lignées cellulaires embryonnaires. Des études in vitro précédemment réalisées ne permettent pas de répondre aux objectifs.
Réduction
Afin de réduire le nombre d'animaux utilisés, des études précédentes ont permis de sélectionner les mutations d’intérêt. D’après les données de la littérature et notre expérience, le taux de prise de greffe sera de minimum 50%. Ces données ont été prises en compte afin d’utiliser le nombre minimum d’animaux permettant de s’assurer de la reproductibilité et de réaliser une analyse statistique des résultats. De plus, les procédures prévues dans ce projet sont séquentielles, ce qui permettra de réduire au maximum le nombre de souris impliquées dans le projet.
Raffinement
Au cours de ce projet, les précautions seront prises pour stresser au minimum l’animal. Une fiche de scoring sera également mise en place. Dès leur arrivée, les souris seront hébergées par groupe de 5 animaux par cage. Une période d’acclimatation sera respectée avant l’entrée des animaux dans l’une des procédures. L'administration d’antidouleur, d'anesthésique, un suivi adapté des animaux et la définition précise des points limites précoces et prédictifs d'un mal être, permettent de limiter au maximum la souffrance animale. Post greffe, de la nourriture humidifiée sera ajoutée au fond de la cage au cas où les animaux présentent des difficultés à se déplacer.
Choix des espèces
L’utilisation de ce modèle souris est nécessaire pour étudier le potentiel tumoral des cellules embryonnaires modifiées car ces dernières sont issues du même modèle murin, permettant de s’affranchir du risque de rejet de greffe par le système immunitaire. Les cancers musculaires sont des tumeurs pédiatriques rares, pour lesquels autant de jeunes femmes que de jeunes hommes sont touchés. Par conséquent, nous utiliserons des souris mâles et femelles dans cette procédure afin de ne pas introduire de biais liés au sexe. Les greffes seront réalisées sur des souris de 6 semaines, âge optimale pour la prise de greffe d'après la littérature.
Étude du rôle de récepteurs spécifiques dans le traitement de l’information par les cellules cérébrales dans le modèle murin.
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
5 160 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré, chacune pouvant enchaîner jusqu'à vingt séances d'habituation puis trente-deux séances d'enregistrement d'une heure trente, tête immobilisée, et vivre en cage avec une plaque métallique fixée sur le crâne. L'implantation se fait sous anesthésie générale, après une injection dans une zone du cerveau, et le porteur indique que le dispositif peut gêner l'animal par son encombrement et limiter son comportement habituel. Toutes sont tuées, une partie pour les analyses post-mortem et les autres parce que leur modification génétique interdit de les réutiliser. L'objet immédiat est de comprendre comment des récepteurs NMDA participent au traitement de l'information visuelle, alors que les retombées annoncées, de nouvelles pistes contre la schizophrénie, l'autisme, la dépression ou la douleur chronique, sont renvoyées au long terme.
Objectifs
Notre projet de recherche vise à comprendre comment le cerveau traite les informations visuelles. Nous étudions des récepteurs spéciaux dans le cerveau, appelés récepteurs NMDA, qui jouent un rôle crucial dans le traitement de l'information par les cellules cérébrales. Notre hypothèse est que les différences dans le fonctionnement et le nombre de ces récepteurs sur divers types de neurones, en particulier les interneurones, influencent grandement la façon dont notre cerveau traite ce que nous voyons. Nous pensons que ces variations sont essentielles au bon fonctionnement de nos réseaux cérébraux et à notre capacité à percevoir et comprendre le monde visuel qui nous entoure. Cette recherche pourrait nous aider à mieux comprendre certains problèmes de vision et potentiellement ouvrir de nouvelles pistes pour les traiter.
Bénéfices attendus
Les maladies du cerveau ont des répercussions majeures sur la santé des individus, leur autonomie, leur éducation, leur emploi, leur mobilité et leurs relations personnelles, ce qui représente un lourd fardeau social et économique. Il est d'une importance fondamentale de comprendre les propriétés de base qui régissent la force, le dynamisme, l'étendue spatiale, la localisation anatomique et les composants moléculaires des connexions synaptiques entre des types de neurones spécifiques formant un réseau neuronal dans des états normaux et pathologiques. Plus précisément, nous pensons que le dysfonctionnement du néocortex est à l'origine de déficiences cognitives et de troubles tels que la schizophrénie, l'autisme, la dépression, ou encore de symptômes de douleur chronique. Cependant, nous ne comprenons pas encore comment les circuits du cortex fonctionnent normalement ni comment ils se dérèglent dans ces troubles. Nous espérons que ces études nous permettront d'identifier de nouvelles stratégies thérapeutiques pour ces troubles. Grâce à l'utilisation d’animaux génétiquement modifiés, nous serons en mesure de cibler des types de cellules et des réseaux spécifiques afin de fournir un cadre physiopathologique permettant de comprendre les maladies du cerveau et à long terme améliorer nos connaissances dans ce domaine afin d’améliorer également la prise en charge des patients.
Procédures
Un petit prélèvement du bout de la queue sera fait sur une partie des jeunes animaux vigiles (1 fois, moins d’1min). Durant une procédure chirurgicale menée sous anesthésie générale avec une analgésie adaptée, une partie des animaux recevra une injection dans une zone du cerveau (1 fois, durée 45minutes maximum). Une autre partie des animaux aura en plus de l’injection une implantation d’un dispositif sur leur tête lors de la même procédure chirurgicale, toujours sous anesthésie générale et analgésie adaptée (1 fois, durée 1h maximum). Ils seront ensuite habitués au dispositif expérimental pendant 5 jours, avec 1 à 2 sessions quotidiennes en commençant par quelques minutes et en augmentant progressivement jusqu'à 1h30 maximum . L’habituation pourra être prolongée d’1 semaine si nécessaire, soit 20 sessions maximum par animal avec 1h30 maximum par session. Puis pour une partie de ces animaux des enregistrements quotidiens de 1h30 sont effectués, sur animal vigile, pendant 4 jours consécutifs, pendant 3 mois avec 1 semaine de repos entre chaque période d’enregistrements de 2 semaines, soit 32 sessions maximum par animal avec 1h30 maximum par session. Pour l’autre partie, un protocole d'enregistrement similaire sera mis en œuvre mais précédé d’une courte anesthésie générale pour implanter un dispositif d’enregistrement cérébral (60 minutes, une fois). Tous les animaux seront euthanasiés par une méthode réglementaire, avec une partie d’entre eux euthanasiée lors d’une procédure chirurgicale sous anesthésie générale et analgésie adaptée (sans réveil, durée 10 minutes).
Impact sur les animaux
Les animaux pourront ressentir un stress dû aux manipulations et contentions nécessaires au cours du projet. L'implantation d'une plaque métallique sur la tête des animaux pour l'imagerie biphotonique nécessite une procédure chirurgicale qui pourra générer une douleur et un inconfort pendant quelques jours ainsi qu’un risque d’infection. Une telle procédure implique une anesthésie générale qui entrainera une hypothermie, une sécheresse oculaire et un risque de dépression cardio-respiratoire. De plus, après l'implantation de la plaque métallique, l'animal devra vivre dans la cage avec cette plaque métallique sur la tête, ce qui peut provoquer une gêne due à l’encombrement et limiter son comportement habituel. Afin d'imager l'animal sous un éclairage à deux photons et réaliser des enregistrements neurophysiologiques, les animaux seront éveillés mais leur tête sera immobilisée, ce qui limitera les mouvements de la tête et génèrera un stress pour les animaux. Pour connaitre le patrimoine génétique des animaux nous prélèverons un petit fragment de la queue pouvant générer une brève et légère douleur.
Devenir
À la fin des procédures, une partie des animaux sera euthanasiée afin de réaliser des analyses post-mortem et les autres seront euthanasiés car il ne pourront pas être réutilisés en raison de leur modification génétique.
Remplacement
Il n’y a malheureusement pas d’alternatives à l’utilisation d’animaux pour ces expériences, car l'objectif est de découvrir le fonctionnement de zones spécifiques dans le cerveau intact. Il s'agit d'une question empirique qui nécessite l'examen de circuits intacts pour y répondre. Il n'existe aucune lignée cellulaire qui récapitule avec précision la physiologie neuronale des animaux, et comme nos expériences étudient les interconnexions entre les neurones qui se produisent dans le cerveau intact, ces expériences ne seraient pas possibles en culture cellulaire. Il est important de noter que notre projet scientifique global comporte une composante alternative à l’expérimentation animale: l’analyse de modèles in silico (création d’un modèle numérique du circuit neuronal étudié incluant les résultats de notre caractérisation expérimentale). Ce modèle sera diffusé publiquement et constituera une alternative à l’expérimentation animale pour l’étude du rôle fonctionnel de certaines cellules cérébrales spécifiques.
Réduction
Le nombre total d'animaux impliqués dans ce projet (5160) est calculé en tenant compte des mesures de réduction. Le nombre d'animaux utilisés dans les procédures sera réduit en effectuant différentes procédures sur un seul animal : les animaux recevront des injections virales et l’imagerie simultanément afin de maximiser les mesures longitudinales multiples sur le même animal. Nos compétences chirurgicales permettront également de réduire le nombre de complications chez les animaux et de minimiser les dommages durables. En outre, notre expertise dans l'entraînement des animaux à être fixées par la tête dans l'installation d'imagerie réduira également la variabilité et, dans une large mesure, les nombres globaux nécessaires pour obtenir une signification statistique dans les cohortes. Enfin, notre choix de la taille de l'échantillon est basé sur des études précédentes et est cohérent avec ceux généralement employés dans le domaine. La taille de chaque groupe sera déterminée par l'utilisation de tests statistiques appropriés, y compris le calcul de puissance. La taille réelle de l'échantillon dépendra de la variabilité de la lecture biologique. Il sera nécessaire de procéder à des tests statistiques pour une interprétation fiable des résultats. La taille des effectifs a été établie grâce à un calcul de puissance et qu’il sera nécessaire de procéder à des tests statistiques pour une interprétation fiable des résultats. Il est également important de noter que le projet comporte un plan de partage de données. Les données expérimentales seront disponibles en libre accès sur la plateforme ebrains.eu (la plateforme de partage de données neuroscientifiques financées par l’U.E.) ce qui permettra à d’autres équipes de profiter de ces données, leur évitant ainsi de reproduire ces expériences, et réduira donc le nombre d’animaux utilisés à terme.
Raffinement
Les méthodes utilisées et la manière de traiter les animaux pendant les expériences et dans l’animalerie assureront à ces derniers un minimum de contraintes et un maximum de bien-être. Les conditions d'élevage, d'hébergement, de soins et les procédures expérimentales sont les plus appropriées pour minimiser toute douleur, souffrance, anxiété/détresse ou dommage que les animaux pourraient subir. Des mesures telles que la formation du personnel, l'habituation, l'acclimatation et le temps de récupération sont prises pour réduire tout au maximum l’impact physique et psychologique potentiel des procédures expérimentales. Les conditions d'élevage et d'hébergement (enrichissement de l'environnement avec des carrés de coton et maison) sont mises en œuvre afin d'accroître autant que possible le bien-être des animaux. Les animaux auront à manger et à boire à volonté. Ils seront observés quotidiennement. La préférence pour les procédures non invasives par rapport aux procédures invasives est prise en considération et, lorsque des interventions invasives sont nécessaires, les directives appropriées en matière d'anesthésie/analgésie seront suivies, en accord avec la structure chargée du bien-être animal. Le prélèvement pour connaitre le patrimoine génétique des animaux sera le plus petit possible et réalisé sur de jeunes animaux (cicatrisation rapide). Nous vérifierons ensuite la bonne reprise en charge des petits par leur mère. Toutes les interventions chirurgicales seront effectuées sous anesthésie générale et des analgésiques seront administrés avant et après les interventions pour limiter la douleur. Un soutien nutritionnel et hydrique ainsi qu’une surveillance étroite seront mis en place à la suite des chirurgies pour s’assurer de la bonne récupération des animaux. Des points limites sont définis et seront respectés pour éviter toute souffrance animale.
Choix des espèces
Les propriétés de base des microcircuits de cellules du cerveau chez la souris sont similaires à celles des autres mammifères, y compris l'homme, ce qui rend les résultats obtenus avec un tel modèle éventuellement transposables à la médecine humaine. Actuellement, seuls les modèles murins nous permettent de visualiser les types de cellules spécifiques que nous étudions. Les souris peuvent être génétiquement modifiées révélant ainsi la fonction de gènes spécifiques. Le développement du cerveau chez la souris est très bien caractérisé, ce qui facilite les études anatomiques et fonctionnelles. Dans ce projet, nous prévoyons d'étudier les mécanismes cellulaires aux stades précoces et tardifs du développement. C'est pourquoi nous prévoyons d'utiliser des animaux pour certaines procédures dès leur naissance et pour d'autres jusqu'à plusieurs mois. Les animaux reproducteurs seront mis en accouplement à partir de l’âge de 2 mois environ jusqu’à l’âge de 12 mois maximum. Dans le cadre de notre étude, nous prévoyons de déterminer le patrimoine génétique des animaux avec un petit prélèvement de l’extrémité de la queue à l’âge de 7 à 10 jours.
Rôles de protéines associées à la neuroinflammation dans les traumatismes de la moelle épinière [EU 2/2]
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Deux souches de souris génétiquement modifiées pour ne pas exprimer une protéine du système nerveux central fournissent les 192 animaux de ce projet, utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère. La moitié subit une hémisection de la moelle épinière sous anesthésie, opération de trente minutes qui paralyse une patte arrière, altère le contrôle du sphincter urinaire et peut provoquer des escarres. Les tests sont détaillés : activité motrice spontanée pendant huit minutes, marche et coordination pendant dix minutes, force d'agrippement, qualité du nid sur vingt-quatre heures, temps de toilettage et latence à rejoindre la nourriture, répétés jusqu'à six semaines après la lésion. Toutes les souris sont tuées pour prélever les tissus destinés aux analyses histologiques, les animaux utilisés étant les surnuméraires issus des croisements menés pour un autre projet.
Objectifs
Les lésions de la moelle épinière touchent 2.5 millions de patients dans le monde (dont 40 000 en France) et induisent des symptômes allant de troubles neurologiques minimes à la tétraplégie complète souvent associés à des douleurs chroniques. Bien que les lésions de la moelle épinière touchent des personnes relativement jeunes (moyenne d’âge à 40 ans), le nombre de patients plus âgés est en nette croissance dans les pays industrialisés. L’étude de cette pathologie représente un enjeu majeur. Il n'existe aucun traitement curatif efficace pour aucun des symptômes induits par une lésion de la moelle épinière. Il est donc de grand intérêt de mettre en place des stratégies thérapeutiques visant à augmenter la récupération motrice et sensitive suivant une lésion de la moelle épinière. Après une lésion de la moelle épinière une cicatrice se forme et constitue un obstacle à la transmission des informations depuis le cerveau au reste du corps ainsi que du corps vers le cerveau. Les cellules immunitaires du système nerveux central jouent un rôle prépondérant dans les réponses neuroinflammatoires suite à une lésion de la moelle épinière. Nous voulons étudier si l’absence d’expression de protéines spécifiques qui sont modulées après lésion de la moelle épinière et associées à la neuroinflammation favorise une meilleure récupération. Ce projet se déroulera dans 2 établissements utilisateurs.
Bénéfices attendus
Les lésions de la moelle épinière induisent des symptômes allant de la paraplégie partielle à la tétraplégie complète. Il n’y aucun traitement permettant de soigner les patients. Développer des travaux visant à favoriser la récupération après lésion de la moelle épinière représente donc un enjeu majeur tant sur le plan de la santé individuelle que sur le plan économique et social. Nous cherchons à caractériser les conséquences de l’absence d’expression de deux protéines spécifiquement dans un type de cellule du système nerveux au niveau de la moelle épinière dans un contexte pathologique tant sur le plan cellulaire et tissulaire que comportemental. Nous obtiendrons des informations importantes sur le rôle de ces protéines qui restent méconnues à ce jour dans les lésions de la moelle épinière lors de la mise en place et le maintien de l’inflammation. Cette étude permettra de déterminer précisément leur importance après lésion moelle épinière chez les deux sexes et d’envisager des stratégies appropriés pour une approche visant à développer des thérapies adaptées.
Procédures
Les animaux seront soumis à plusieurs interventions. Les animaux recevront des injections quotidiennes (moins d’1 minute) en intra-péritonéal durant 5 jours à l’âge de 5-8 semaines sur le site 1 . Les animaux seront transférés du site 1 vers le site 2 selon la réglementation et avis du vétérinaire. Sur le site 2, les animaux subiront des lésions de la moelle épinière sous anesthésie générale et analgésie (30 min ; n=96). Les animaux seront évalués au niveau comportemental pour déterminer les fonctions motrices et évaluer l’anxiété avant et après lésion de la moelle épinière. L’évaluation comportementale analysera l’activité motrice spontanée durant 8 minutes, la marche et la coordination des animaux durant 10 minutes et la force d’agrippement des animaux (2 minutes par animal par session). Les manipulations peuvent engendrer un stress léger. Les tests seront faits 7 jours et 24 heures avant la lésion, puis à J3, J5, J7, J10 et J14 postopératoire puis 1 fois par semaine jusque 6 semaines post-opératoires. Les comportements de type anxieux seront évalués par des tests qui évaluent la qualité du nid fait par un animal durant 24 heures, le temps de toilettage durant 5 minutes, et le temps que met l’animal à aller au contact de la nourriture durant 5 minutes. Ces tests seront effectués deux fois, au début et à la fin de la procédure. Tous les animaux seront euthanasiés pour prélèvement d’organes post-mortem.
Impact sur les animaux
Une anesthésie peut induire une hypothermie transitoire et un dessèchement de la cornée. Les injections quotidiennes en intra-péritonéal peuvent induire un stress pour l’animal. Le transport et le changement de site peut induire un stress pour l’animal. Nuisances motrices : paralysie de la patte arrière du côté de la lésion de la moelle épinière (hémisection). Une récupération spontanée du support de poids est observée dès le 5ème jour après lésion dans le cas de l’hémisection. Nuisance urinaire : le contrôle du sphincter urinaire est altéré après une hémisection, une récupération spontanée est observée dès le 7ème jour après lésion dans le cas de l’hémisection. Suite à la chirurgie les animaux sont observés quant au développement de signes légers relatifs à la détérioration de l’état de santé de l’animal. 24-48hrs suivant la lésion, les animaux peuvent présenter des signes de douleurs. Suite à la chirurgie, une perte de poids est observée pendant 1 à 2 jours après la lésion. A cause de la paralysie des escarres peuvent se former. Suite à la lésion, des comportements de dominance peuvent être observés. Nous utilisons une évaluation par grille de score adaptée permettant après concertation de déterminer un seuil de souffrance nécessitant l’euthanasie de l’animal concerné.
Devenir
A la fin des expériences, les animaux seront euthanasiés afin collecter les tissus d’intérêt pour faire des analyses post mortem histologiques et cellulaires.
Remplacement
Pour éviter l'expérimentation animale, on encourage l'utilisation de cultures de cellules nerveuses. Cependant, ces cultures ne peuvent pas reproduire entièrement la complexité des organismes vivants. Les modèles animaux de traumatisme de la moelle épinière sont actuellement considérés comme la méthode la plus adaptée pour étudier cette pathologie, car ils reproduisent de manière fidèle les différents aspects pertinents chez l'humain. Ces modèles permettront d'explorer les changements provoqués par l'absence d’expression de 2 protéines du système nerveux de manière spécifique dans un type de cellule et faciliteront l'évaluation de nouvelles approches thérapeutiques. L'utilisation d'animaux est nécessaire à cette étape préclinique et demeure cruciale pour envisager des applications cliniques.
Réduction
Les animaux sont utilisés pour plusieurs analyses, les deux sexes sont utilisés. Pour estimer le nombre d’animaux nécessaire, nous nous sommes basés sur les expériences réalisées précédemment au laboratoire. Nous avons également calculé le nombre d'animaux avec un logiciel de biostatistiques afin de réduire au maximum le nombre d’animaux utilisés, tout en conservant des effectifs pertinents pour répondre à notre hypothèse biologique. Ces animaux sont générés et aussi utilisés dans le cadre d’une autre demande de projet et nous utiliserons les animaux surnuméraires issus des croisements effectués sur le site 1. De plus, cela évitera de développer cette lignée en doublon dans l'animalerie du site 2.
Raffinement
Les animaux seront transportés dans un véhicule climatisé dans des cages de transport agréées sous condition d’autorisation pour le statut sanitaire (distance 2,7km). Puis période d’acclimatation pour les animaux d’une période de 7 jours sur le site d’accueil. Afin de réduire le stress, les expérimentateurs seront toujours les mêmes au cours de l’étude et les animaux seront habitués aux tests. Une attention particulière sera portée à l’enrichissement de l’environnement (hutte, coton). Pour la gestion de la douleur, utilisation d’anesthésiants et d'analgésiques adaptés mais compatible avec les lésions de la moelle épinière et le type de données analysées. Afin de réduire la souffrance : soins quotidiens spécifiques. L'absence de signes anormaux sera vérifié 2 fois par jour après la lésion. Nous utilisons une évaluation par grille de score adaptée permettant après concertation de déterminer un seuil de souffrance nécessitant l’euthanasie de l’animal concerné.
Choix des espèces
Les souris sont les animaux le plus utilisées dans le cadre de la recherche sur les lésions de la moelle épinière, en particulier avec le développement de plusieurs modèles chirurgicaux différents (section, compression, contusion). Ces 2 souches de souris génétiquement modifiées n’expriment pas une protéine du système nerveux central dans un type de cellules associé à la neuroinflammation. Cela en fait donc des modèles de choix pour déterminer les conséquences de l’absence de ces protéine après une lésion médullaire sur l’inflammation. Les animaux sont opérés à 3 mois et observés pendant 6 semaines. Nous utilisons des animaux adultes car les souris plus jeunes présentent des phénomènes de récupération spontanée non seulement plus importants mais surtout non homogènes. Ceci n’est ni compatible avec des analyses statistiques fiables ni avec notre optique de transposition à la clinique.
Traitement du diabète de type 1 par administration intranasale combinée d’antigènes modifiés et d’anticorps chez la souris
- Recherche appliquée
- Troubles immunitaires
Anesthésiées pour recevoir un produit dans le nez une à quatre fois par semaine, les souris de ce projet subissent aussi une injection intraveineuse, un prélèvement de sang et un recueil d'urine hebdomadaire pendant six à vingt-cinq semaines. Elles sont 1 530, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré, toutes tuées à l'issue pour prélèvement d'organes. Le porteur indique que les femelles développent un diabète, perdent du poids et s'affaiblissent jusqu'au décès en trois semaines environ, la mesure du sucre dans les urines servant de seuil pour déclencher la mise à mort. L'objectif déclaré est de prévenir le diabète de type 1 chez de jeunes enfants au stade prédiabète, et l'effectif de 1 530 souris n'est appuyé par aucun calcul, le porteur écrivant seulement qu'il sera "réduit au minimum".
Objectifs
Le diabète de type 1 (DT1) est une maladie auto-immune résultant de la destruction des cellules bêta du pancréas, productrice d’insuline, par le système immunitaire. Son incidence est en constante augmentation et touche des enfants et adolescents de plus en plus jeunes. Actuellement, on ne guérit pas du diabète. Son traitement est uniquement palliatif, et implique des injections pluriquotidiennes d’insuline, impactant gravement la qualité de vie des patients et n’empêchant pas des complications à long terme. De nombreuses thérapies ont été testées dans le diabète de type 1, avec des succès souvent très mitigés, probablement dus à une intervention trop tardive, c’est-à-dire chez des patients déjà diabétiques alors qu’une grande majorité des cellules bêta est détruite. Les efforts se concentrent maintenant sur la possibilité d’arrêter ou du moins freiner le développement de la maladie au stade « prédiabète ». Cette approche préventive, ciblant principalement de jeunes enfants, implique la mise en place de thérapies avec une grande spécificité d’action et l’utilisation d’une voie d’administration non invasive pour faciliter leur application clinique. Dans ce projet, l'effet de nouvelles thérapies et combinaisons thérapeutiques sera testée dans un modèle de souris qui développe un diabète de type 1 de manière très similaire à l’homme. Des molécules produites par la cellule bêta (telles que l’insuline), modifiées pour augmenter leur efficacité, ainsi que des anticorps qui agissent en s'attaquant à la cause immunologique du diabète de type 1, seront administrés par voie intranasale. Ce choix est motivé par un intérêt clinique grandissant pour cette voie d'administration simple pour délivrer des anticorps, combattre l'inflammation et bénéficier des mécanismes de tolérance immunitaire associés aux muqueuses.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra d’apporter la preuve de concept des effets thérapeutiques de nouvelles molécules innovantes administrées seuls ou en combinaison par voie intranasale pour moduler les réponses immunitaires et prévenir la maladie chez les enfants au stade de prédiabète. En cas de succès, ces recherches pourraient permettre d’envisager un premier essai clinique de prévention de la maladie qui touche principalement les enfants et adolescents. Cette stratégie, combinant une grande spécificité d’action et l’utilisation d’une voie d’administration non invasive, remplit les exigences de sécurité sanitaire inhérentes au ciblage de populations pédiatriques.
Procédures
*Administration intranasale sous anesthésie générale pendant 5 minutes, effectuée 1 à 4 fois par semaine (1/jour). *Injection intraveineuse sous anesthésie générale pendant 5 minutes, effectuée seule 1 fois. *Prélèvement de sang sous anesthésie générale pendant 5 minutes, effectué 1 seule fois. *Prélèvement d’une goutte d’urine pour mesure du taux de sucre sur souris vigile, 10 secondes, 1 fois/semaine, pendant 6 à 25 semaines.
Impact sur les animaux
Les souris femelles développent un diabète (taux anormalement élevé de sucre dans le sang). Elles perdent alors du poids et s’affaiblissent jusqu’au décès en environ 3 semaines. Les souris peuvent également subir un léger stress lié à l’anesthésie et ressentir des douleurs modérées liées à l’injection intraveineuse et au prélèvement sanguin.
Devenir
Les souris sont mises à mort pour récupération de différents organes nécessaires pour répondre à la question scientifique.
Remplacement
Des tests cellulaires appropriés seront utilisés pour répondre à des questions mécanistiques précises visant à analyser l’impact des protéines sur les réponses immunitaires. Cependant l’expérimentation animale est indispensable pour évaluer sur modèle vivant l’efficacité thérapeutique de la stratégie proposée pour la prévention du diabète de type 1 et comprendre les mécanismes immunitaires responsables de la pathologie et de l’effet thérapeutique observé.
Réduction
Le nombre de souris utilisé sera réduit au minimum tout en permettant une analyse statistique fiable des résultats. Pour chaque souris traitée, plusieurs organes seront prélevés, incluant le tissue nasal, poumons, rate, ganglions et pancréas pour de multiples analyses afin d’obtenir le maximum d’information biologiques et mécanistiques. Aussi, afin de diminuer le nombre de souris utilisé, le protocole donnant le meilleur effet thérapeutique sera déterminé avant de lancer de nouvelles expériences pour comprendre les mécanismes responsables de cet effet.
Raffinement
Les animaux sont maintenus dans des groupes de plusieurs individus (groupes sociaux) dans un environnement enrichi. Des points limites adaptés ont été établis (notamment la mesure du sucre dans les urines pour diagnostiquer un diabète) permettant de mettre à mort l’animal en cas de signes de souffrance ou de développement d’un diabète.
Choix des espèces
La souris est un modèle de choix dans les études sur le diabète de type 1 étant donné la bibliographie existante sur le sujet et la caractérisation des réponses auto-immunes chez cette espèce, et leur similitude avec les observations chez l'homme. Les expériences seront réalisées chez des souris adultes à partir de 6 semaines d’âge afin que les souris aient un système immunitaire mature mais suffisamment jeune pour impacter le développement du diabète.
Dynamique et plasticité cérébrale lors de l’anesthésie
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
336 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue pour prélèvement histologique. Chacune reçoit un implant posé au cours d'une chirurgie d'une heure, la moitié recevant en plus une injection de virus directement dans le cerveau, avant d'être maintenue la tête fixée pendant trois heures d'anesthésie. Les tests de mémoire durent environ une heure et encadrent l'anesthésie, deux jours avant et jusqu'à trois jours après, l'objectif étant de relier les tracés d'électroencéphalogramme aux activités neuronales profondes du cortex et du thalamus pour mieux piloter l'anesthésie humaine. Le porteur reconnaît que certains aspects de la mémoire spatiale peuvent être altérés, et écrit ignorer ces troubles dont la caractérisation est justement l'objet du projet. Sur le remplacement, il affirme que l'étude des dynamiques cérébrales et de leurs conséquences comportementales ne peut se faire que sur des animaux.
Objectifs
Chez l’humain, l’électroencéphalogramme (EEG) est actuellement le meilleur moyen utilisé pour suivre et piloter l’état de l’anesthésie des patients qui subissent une chirurgie ou une endoscopie en milieu hospitalier et pour lesquels une grande variabilité de réponse à l'anesthésie existe selon l'âge, le sexe et la condition physique. La lecture des marqueurs EEG pour le pilotage peut être ambigüe si une grille de lecture des marqueurs EEG n'est pas associée, pouvant conduire ainsi à un surdosage ou sousdosage. De plus, il est parfois difficile de prévenir sans les identifier certains des marqueurs EEG associés à des troubles cognitifs post-opératoires et de comprendre d'où ces troubles peuvent venir. Pour surmonter ces inconvénients de l'anesthésie clinique et comprendre les changements de plasticité cérébrale à l'origine des troubles cognitifs, ce projet vise à caractériser les activités neuronales sous-jacentes des marqueurs EEG au cours des différentes phases de l’anesthésie générale : induction, maintenance et réveil et mesurer si une plasticité s'opère pendant ces états anesthésiés selon la profondeur de ceux-ci. Cette caractérisation indiquera quelles structures sont impliquées dans les marqueurs EEG et expliquera les transitions entres les états cérébraux de l'anesthésie. Ces transitions pourront ainsi être mieux prédites et maitrisées par le dosage de l'anesthésique en amont de l'avènement des états non souhaitables de l'anesthésie. Le projet s'effectuera chez la souris afin d'enregsitrer les neurones de structures profondes du cortex et du thalamus notamment impliqués dans les marqueurs EEG les plus caractéristiques. En tant que mammifère la souris a essentiellement la même structure cérébrale ainsi que la même architecture temporelle de l'EEG que l'humain en réponse à l'anesthésie. L’enregistrement de l’activité des neurones en même temps que l’EEG visera à mieux comprendre le caractère prédictif de certains états sur le comportement et la plasticité et de prévoir des troubles cognitifs post-anesthésie. L'utilisation d'animaux transgéniques dans ce projet permettra d'induire des stimulations optogénétiques qui sont essentielles pour mesurer les changements de force de la connectivité dans le réseau et donc la plasticité induite par l'anesthésie. L’application médicale du projet est de prévenir de façon personnalisée les causes des troubles cognitifs observés chez certains patients subissant une anesthésie.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de mieux comprendre les mécanismes cérébraux de l’anesthésie et d’altération de la mémoire par celle-ci. Nous nous intéresserons en particulier au réseau thalamo-cortical et à l’hippocampe, des structures qui chez l’homme jouent un rôle clef dans la mémoire des souvenirs personnels (mémoire épisodique) et des faits généraux (mémoire sémantique), et qui est particulièrement impactée lors de troubles post-anesthétiques réalisés en conditions hospitalière. À ce titre, l'amélioration des méthodes du pilotage de l'anesthésie a déjà été entamée dans le cadre de la collaboration (hôpital-entreprise-laboratoire) financée par ce projet. Le projet permettra d'encore mieux prédire les états non désirables de l’anesthésie mais aussi de remédier aux troubles cognitifs induits par celle-ci. Le projet aura des bénéfices pour la recherche médicale, pour les connaissances sur la plasticité cérébrale et des conséquences de l’anesthésie chez les personnes fragiles notamment ayant des dégénérescences cérébrales.
Procédures
Ce projet utilisera 336 souris. Les animaux seront implantés (durée d'intervention : 1h) au préalable de toute tâche comportementale ou enregistrement afin de pouvoir enregistrer leur activité cérébrale (EEG et neuronale) au cours du processus d’anesthésie. La moitié sera aussi préalablement injectée d’un virus de façon intracérébrale, de façon à pouvoir stimuler certaines populations neuronales. Pendant l’anesthésie (durée totale prévue 3h) les souris seront maintenues en tête fixée ce qui est un protocole classique pour l’étude électrophysiologique en conditions vigile et anesthésiée. Des tests comportementaux (durée de test environ 1 heure) où la souris doit explorer son environnement motivée ou non par l'obtention d'une récompense, permettront de mesurer ses capacités de mémoire (à court terme et long terme, un test de chaque type) avant et après la phase anesthésiée. Ces tests durent une heure environ de 2 jours avant l'anesthésie et jusqu'à 3 jours après l'anesthésie.
Impact sur les animaux
Certains animaux, qui subissent une chirurgie longue (pour la pose de l'implant), peuvent souffrir d'effets indésirables comme l'hypothermie, la déshydratation et les douleurs post-opératoires. De plus les anesthésies longues et trop profondes sont le sujet de notre étude pour savoir si l'anesthésie peut avoir un impact sur les performances cognitives à long terme. Il est donc possible que comme indiqué chez l'humain que certains aspects de mémoire spatiale soient altérés. Cependant nous ignorons ces troubles et le but est de les caractériser.
Devenir
À l'issue de l'ensemble des procédures, les animaux seront mis à mort. La validation des enregistrements nécessite un prélèvement histologique.
Remplacement
Certains mécanismes cellulaires et moléculaires de l'anesthésie peuvent être abordés in vitro. Certaines propriétés computationnelles de réseaux de neurones peuvent être testées sous forme de simulation numérique. Mais in fine, l’étude des dynamiques cérébrales au cours de l’anesthésie et ses conséquences comportementales nécessite de faire des liens corrélationnels et causaux précis entre activité neuronale à grande échelle et comportements d’apprentissage et de mémoire. Elle ne peut se faire que sur des animaux au cours même de l’apprentissage, du sommeil et du rappel. Une partie des mécanismes de plasticité sera testé in vitro dans un projet séparé afin d’étudier les mécanismes moléculaires sous-jacents des observations de plasticité observés in vivo.
Réduction
Pour réduire le nombre d'animaux, nous utiliserons des systèmes d'acquisition haute densité, permettant d'enregistrer >100 neurones simultanément ou sur plusieurs sites au travers du cortex, l’hippocampe et le thalamus, ce qui maximisera la quantité d'information apportée par chaque animal. Les études utilisant ce type d’approches permettent de publier avec des résultats statistiquement significatifs une vingtaine d’animaux. Nous utiliserons les mêmes animaux pour tester les performances cognitives (test de mémoire spécifique) et les expériences de mesures de plasticité afin de diminuer le nombre d’animaux.
Raffinement
Après les chirurgies, les souris seront surveillées et les points limites évalués quotidiennement pendant une semaine afin de déceler des signes de douleur sur la base de la grille d'évaluation de la douleur validée pour éviter toute souffrance des animaux. Les soins post-opératoires incluront des traitements antibiotiques, analgésiques, ainsi qu'une surveillance quotidienne des animaux. Les systèmes d’enregistrement sont miniaturisés au maximum pour s’assurer que les animaux implantés aient un comportement tout à fait normal. Nos expériences s'effectueront sur des animaux soit anesthésiés pour les besoins de l’expérience, soit vigiles, en tête fixée afin d’optimiser les conditions d’enregistrement des transitions entre l’état d’éveil et l’état éveillé. Ils peuvent s’alimenter et se nettoyer librement la face avec leurs pattes. L'ajustement des électrodes est indolore et ne nécessite pas d’opération particulière lorsque l’animal est tête fixée. Les animaux peuvent être hébergés par deux afin de favoriser les échanges sociaux.
Choix des espèces
Le rongeur est l’espèce standard pour toutes les études des bases neurophysiologiques de la mémoire. Ce sont les modèles pour lesquels les outils expérimentaux sont les plus développés. De plus les souris sont faciles à habituer dans un système de contention nécessaire pour le protocole expérimental utilisé. Nous utiliserons des adultes (à partir de 3 mois jusqu'à 14 mois) de façon à mesurer si les effets de l’anesthétique sont semblables selon l'age. En effet chez l’humain la sensibilité est plus élevée chez les patiens agés. Sur chaque groupe de 12 animaux, 3 tranches d'âge seront sélectionnés : 3 à 6 mois, 7 à 12 mois et 13 à 15 mois afin de mesurer et corréler l'effet de l'âge avec les effets de l'anesthésie.
ACCES-II : Modèle préclinique de rétablissement de continuité colique par anastomose colorectale écho-endoscopique : résultats à long terme sur la perméabilité des anastomoses
- Recherche appliquée
- Troubles gastrointestinaux
Mis à jeun et purgés aux laxatifs, des cochons nains subissent une première chirurgie qui interrompt leur côlon et crée une stomie, puis, deux semaines plus tard, une intervention endoscopique pour reconnecter le côlon au rectum. 15 cochons vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, avec ensuite une à trois sédations pour retirer la prothèse et contrôler le rectum, et tous sont tués à la fin du projet pour analyser les tissus. L'objectif est de rendre moins invasif le rétablissement de la continuité digestive après une intervention de Hartmann, et le porteur ajoute que des internes en chirurgie s'y formeront pendant la première phase. Le titre annonce des résultats "à long terme", sans que le texte précise combien de temps les cochons vivent entre la dernière intervention et leur mise à mort.
Objectifs
Environ 4000 patients sont opérés annuellement en France d’une intervention de Hartmann, dont 80% par chirurgie ouverte (laparotomie), souvent dans le cadre de l’urgence, pour diverses pathologies entraînant une lésion du côlon . Cette intervention consiste à reséquer la partie du côlon gauche lésée. Le rectum est ensuite refermé (et reste en place dans l’abdomen), et le côlon en partie haute est extériorisée en extracorporel via une stomie permettant l’évacuation des selles. Cette intervention est généralement réalisée dans le cas où les risques de complications sont trop importants pour réaliser dès la première chirurgie la connexion entre le côlon et le rectum (anastomose). La stomie ainsi réalisée est théoriquement temporaire et le rétablissement de la continuité digestive se fait dans un second temps qui va néanmoins nécessiter une nouvelle opération en chirurgie ouverte le plus souvent. Cependant, compte tenu de la fragilité des patients, et des risques propres à une deuxième chirurgie pour le rétablissement de continuité, moins d’un patient sur deux sera à terme candidat à cette nouvelle chirurgie, avec des risques supplémentaires. L'objectif de notre étude est de développer une méthode non invasive de rétablissement de la continuité colorectale à l'aide d'une procédure endoscopique innovante.
Bénéfices attendus
Il s’agit d’une étude pilote in vivo sur modèle expérimental animal portant sur la faisabilité́ d’une nouvelle technique mini-invasive. Les perspectives sont l’établissement d’un protocole standardisé de la réalisation endoscopique d'anastomose colorectale, et l’évaluation du devenir des anastomoses colorectales confectionnées endoscopiquement après retrait de la prothèse d’apposition luminale. Les impacts attendus et les perspectives sont multiples : il s’agit en priorité de pouvoir proposer, après réalisation d’une expérimentation prospective chez l’homme en cas de succès, à des patients contre-indiqués au rétablissement de continuité chirurgicale, une prise en charge moins invasive, et de limiter le risque de réintervention pour sténose ou fistule anastomotique. Une évaluation du devenir des anastomoses après retrait des prothèses d’apposition luminale paraît indispensable, l’objectif à terme étant de proposer un rétablissement mini-invasif à des patients opérés d’une intervention de Hartmann, y compris en dehors de toute situation carcinologique ou palliative. La participation d’internes dans la première phase, permettra également d’améliorer leur formation et leur préparation aux situations réelles.
Procédures
Les animaux auront tous 2 anesthésies générales avec préparation dans les heures qui précèdent (mise à jeun et préparation colique – laxatifs) : une première procédure chirurgicale destinée à interrompre la continuité digestive et à créer la stomie (durée environ 1 heure). La seconde intervention, deux semaines après la première, est le traitement par voie endoscopique, d’une durée de 40 minutes environ. Les animaux auront ensuite de une à 3 interventions supplémentaires non invasives, sous sédation simple, d’une durée inférieure à 30 minutes, pour l’ablation de la prothèse et rectoscopie. La mise à mort sera réalisée en fin de projet, sous anesthésie générales préalable.
Impact sur les animaux
Du stress et de l’angoisse peuvent être présents en amont des deux interventions chirurgicales (J0 et J14), faites sous anesthésie générale : ces deux interventions sont considérées comme des procédures à degré de sévérité modérée car de la douleur peut être ressentie par les animaux à l’issue des procédures. Les procédures de contrôle endoscopique sont considérées comme des procédures à degré de sévérité légère. Une mise à jeun des solides au matin de la procédure est nécessaire pour les deux interventions de J0 et J14. De la faim peut donc être ressentie avant les interventions chirurgicales (J0 et J14) mais la boisson est autorisée ad libitum. La reprise de l’alimentation est autorisée le jour-même en l’absence d’élément évocateur de complication. Aucune mise à jeun n’est nécessaire pour les contrôles endoscopiques sous sédation simple.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort en fin de procédure à des fins d'analyses des tissus traités pour rétablir la continuité digestive.
Remplacement
Il s’agit d’une nouvelle procédure au stade de recherche pré-clinique, n’ayant pas été réalisée chez l’Homme et ne pouvant être envisagée en l’absence d’étude de faisabilité sur modèle animal. Les simulateurs virtuels et mécaniques (Phantômes) ont démontré leur efficacité pour réduire l’utilisation du modèle animal dans l’apprentissage de l’écho-endoscopie diagnostique et de la ponction sous écho-endoscopie. Les modèles ex-vivo ont démontré leur utilité pour l’apprentissage du drainage des collections pancréatiques en suturant sur les faces postérieure et antérieure de l’estomac des morceaux d’intestin de porc remplies de gel d’échographie. Des modèles de simulation (virtuel, mécanique ou sur organe isolé) existent pour apprendre la technique de pose des prothèses utilisées dans ce projet. Néanmois, à l’heure actuelle, aucun modèle existant permet de remplacer le modèle animal vivant anesthésié. Effectivement, aucun modèle ex-vivo ne permet de reproduire le péristaltisme digestif, ni les conditions post opératoires après intervention de Hartmann. S’agissant d’une étude de faisabilité d’anastomoses, du tissu vivant est indispensable pour permettre une cicatrisation et évaluer la survenue de sténoses anastomotiques. L’objectif étant l’étude de la faisabilité de cette procédure, cela nécessite un suivi dans le temps, et ainsi l’utilisation d’un modèle animal est indispensable.
Réduction
Le nombre d’animaux maximum étudié a été fixé à 15 pour notre étude, s’agissant du nombre d’animaux nécessaire pour explorer les différents délais avant retrait des prothèses d’apposition luminale, tout en évitant les biais liés à la variabilité individuelle. Cet effectif est suffisant pour apporter des conclusions et permettre de détecter d’éventuelles complications associées à la réalisation des procédures et au suivi à long terme des effets de la procédure. Ces 15 animaux sont répartis en 3 lots stables, permettant un étalement des procédures et une adaptation progressive en cas de difficultés techniques ou de complications. Il n’existe à ce jour pas d’étude dans la littérature s’intéressant à notre sujet de recherche, ce qui ne permet pas de réaliser un calcul d’effectif ou de nombre de sujets nécessaires. La participation d’internes de chirurgie en fin de cursus sous la surveillance d’un chirurgien sénior, pendant la première phase chirurgicale, permettra la formation chirurgicale aux techniques précédemment évoquées sur un modèle vivant utilisé en formation, et ce, sans utilisation d’animaux supplémentaires. Le projet d’étude présenté prévoit également l’utilisation de dispositifs innovants visant à améliorer l’efficacité de l’intervention par le rapprochement du colon et du rectum. Apporter la preuve de l’efficacité de ces dispositifs lors de cette étude dispenserait également de la réalisation d’une nouvelle étude animale.
Raffinement
Les animaux seront hébergés dans le respect du bien-être animal. Les animaux seront gardés pendant une période d’acclimatation de 5 jours minimum entre leur entrée dans l’animalerie et leur première entrée en procédure. Ils seront suivis quotidiennement et leur état de santé sera évalué tout au long du protocole expérimental. Leur environnement sera enrichi (ballon, jouets divers) pour leur permettre d’exprimer un spectre plus large de comportements normaux. Dans la mesure du possible, les animaux seront hébergés par groupes stables afin de favoriser les interactions. Les protocoles chirurgicaux se feront sous anesthésie générale et analgésie. L’analgésie pourra accompagner l’animal en post-opératoire pour éviter toute souffrance inutile.
Choix des espèces
L’anatomie du tube digestif du porc est connue pour être particulièrement proche de celle de l’anatomie humaine et constitue le modèle de référence pour la formation et la recherche en endoscopie digestive depuis de nombreuses années. La taille de l’animal permet d’utiliser les mêmes dispositifs (endoscopes, prothèses) que ceux disponibles en pratique clinique humaine. Nous projetons d’utiliser des mini-pigs pour limiter l’impact de la croissance post-opératoire, et faciliter le suivi au long cours ainsi que les diverses manipulations (retrait de la prothèse, scanner, contrôle endoscopique) Les animaux doivent être sevrés et peser plus de 15 kg permettant l’utilisation du même matériel que chez l’humain adulte (qui est utilisé chez l’enfant de plus de 15 kg).