Procédures modérées

Un implant crânien posé au cours d'une chirurgie de quatre à six heures, puis une cinquantaine de séances d'enregistrement de trois heures en moyenne, trois à cinq fois par semaine, sur un animal éveillé et maintenu en contention : c'est ce que subissent 60 furets, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Pour les motiver, le porteur les place en contrôle hydrique du dimanche après-midi au vendredi, soit 120 heures par semaine, avec une pause de dix jours tous les deux mois. L'objet déclaré est l'étude de la perception auditive et visuelle active, avec une retombée annoncée sur la conception des prothèses auditives. L'implant est retiré au terme d'une seconde chirurgie de trois heures pour permettre une réhabilitation, sans que le RNT nomme les organismes chargés de les accueillir ni ne précise en quoi consiste la tâche comportementale imposée.

Objectifs

Percevoir dans des situations réalistes est un processus actif qui mobilise les facultés perceptives et cognitives, conférant aux stimuli du sens et de la pertinence. Grâce à l'écoute et à la vision, les humains et les autres animaux naviguent à travers des scènes sensorielles complexes, séparent des sources mélangées, désambiguïsent des messages et évaluent leur pertinence comportementale. Ces prouesses remarquables sont actuellement au-delà de notre compréhension et dépassent de loin les capacités des systèmes d'ingénierie audio et vidéo les plus sophistiqués. L'objectif du projet est d'étudier expérimentalement la perception auditive et visuelle dans une situation active les processus sensoriels adaptatifs et cognitifs interagissent. Notre objectif est d'intégrer la fonction cognitive comme faisant partie intégrante du traitement sensoriel, ce qui se prête à une investigation neurophysiologique. Plus précisément, nous allons explorer le postulat que la perception active est médiée par un processus d'adaptation rapide au niveau du neurone mais aussi des populations de neurones dans leur ensemble ; ce phénomène est ici appelé plasticité rapide.

Bénéfices attendus

Le projet s'appuie sur les travaux du chercheur en charge du protocole réalisés lors de la dernière décennie sur la neurophysiologie du codage des sons dans le cerveau et la modélisation de ces phénomènes. En nous appuyant sur des techniques de pointe (électrophysiologie et neuroimagerie) et plusieurs innovations méthodologiques (reconstruction de stimulus à partir d'enregistrements de neurones à grande échelle chez les animaux réalisant une tâche de comportement, décodage de l'activité corticale), nous visons à une meilleure compréhension du codage de la nature et de la localisation des sons par le cerveau, ainsi que de l’influence de l’attention sur ce codage. Ce projet permettra de caractériser de manière plus fine les mécanismes neuronaux impliqués dans la perception auditive et l'attention. À terme, ces connaissances contribueront à l'amélioration de la conception des prothèses auditives pour les populations malentendantes, en surmontant certaines des limitations conceptuelles actuelles dans le traitement du signal auditif.

Procédures

POSE D’IMPLANT. Tous les animaux sont équipés d'un implant crânien lors d'une première chirurgie qui se fait sous anesthésie et analgésie (durée 4-6h). Cet implant permet ensuite de réaliser des enregistrements neuraux en électrophysiologie ou en neuroimagerie fonctionnelle par ultrasons (procédures répétées autour d'une cinquantaine de fois en moyenne chez animal vigile, entre 3 et 5 fois par semaine, durée moyenne d'enregistrement 3h). A la fin de la période d’enregistrement, l'implant crânien sera retiré lors d'une chirurgie sous anesthésie et analgésie (durée 3h) pour permettre une réhabilitation après un temps de récupération adapté. SUIVI POST-OPÉRATOIRE. Lors du suivi postopératoire, l'animal est en hébergement individuel maximum 48h en infirmerie (cage d’hébergement séparé qui permet de maintenir le contact visuel, olfactif et auditif avec les autres animaux, le personnel et la routine de l’animalerie) afin de s’assurer que d’autres furets ne s’accaparent les aliments mous mis à disposition ainsi que pour pouvoir observer si la prise de nourriture est faite. ENTRAÎNEMENT SOUS CONDITIONNEMENT APPÉTITIF. Les furets en entraînement sont placés en contrôle hydrique à partir de dimanche après-midi après pesée jusqu’au vendredi (120h, soit 5j soit 0.7 semaine). Une pause de 10 jours est ménagée tous les 2 mois.

Impact sur les animaux

L’intervention chirurgicale induit une présence de douleur post-opératoire sur les 2-3 jours post-op. Le suivi postopératoire entraîne un hébergement en isolation sur maximum 48h (cage d’infirmerie individuel qui permet de maintenir le contact visuel, olfactif et auditif avec les autres animaux, le personnel et la routine de l’animalerie) afin de s’assurer que d’autres furets ne s’accaparent les aliments mous mis à disposition ainsi que pour pouvoir observer si la prise de nourriture est faite. Les enregistrements neuraux se font chez l'animal en situation de contention sur une durée

Devenir

Nous retirons l'implant crânien des 60 furets à la fin de l'expérimentation afin qu'ils puissent être réhabilités par des organismes compétents.

Remplacement

Afin de pouvoir comprendre le traitement de l'information sensoriel dans les cortex auditifs, visuels et frontaux, il est nécessaire d'avoir recours à des animaux vivants pour pouvoir enregistrer l'activité neurale, que ce soit de neurones uniques en électrophysiologie ou les flux hémodynamiques en imagerie large-champ. Ce type d'enregistrement n'est pas réalisable chez des êtres humains. Par ailleurs, le furet constitue un animal modèle nécessaire à la compréhension de la perception auditive dans un contexte de prise de décision. En effet, il est capable d'apprendre des tâches complexes et de percevoir des sons dans une gamme auditive similaire à celle de l'être humain. Son cerveau à cortex plissé permet aussi d'étudier le rôle fonctionnel des plis corticaux, ce qui n'est pas possible chez le rongeur ou primate à cortex licencéphale.

Réduction

Le type d'expérimentation que nous réalisons permet de réaliser de nombreux enregistrements sur un nombre réduit d'animaux. Le nombre total d'animaux est de 60 furets pour les 5 axes expérimentaux du projet, avec 12 animaux au maximum pour chacun des 5 axes expérimentaux. Les effets seront quantifiés par des tests statistiques pour une interprétation fiable des résultats.

Raffinement

Les animaux sont hébergés dans des cages enrichies en jouets et tunnels divers et régulièrement mis tous ensemble dans une aire de jeu. Durant les week-ends, les animaux ne doivent pas effectuer de tâche comportementale. Leur état de santé est suivi en permanence, en collaboration avec un vétérinaire. Le comportement est motivé par un contrôle hydrique, raison pour laquelle nous avons établi des points limites et suivons au plus près le poids des animaux ainsi que les marqueurs de bien-être (poids, état global, comportement...). Le protocole de chirurgie inclut l’administration d’anti-inflammatoire et d’anti-douleur en pré- et post-opératoire. Sur le plan expérimental, un effort constant nous pousse vers la pose de systèmes d'enregistrements chroniques chez les animaux pour obtenir des sessions d'enregistrements plus courtes. Enfin nous explantons les animaux à la fin de l'expérimentation, afin de les réhabiliter.

Choix des espèces

Les furets apprennent rapidement une tâche ; ils ont par ailleurs une large gamme auditive, similaire à celle de l'homme. Leur cerveau est assez grand pour utiliser des électrodes avec 200 contacts. De plus leur cortex est convolué ; ces plis corticaux ne sont pas présents chez le rongeur à l’inverse de nombreux primates. Le furet permet d’étudier un putatif rôle fonctionnel de ces plis. Les individus femelles sont préférés en raison de leur petite taille. Les animaux entrent en procédure à partir de 5 mois (jeune adulte, quand le développement du cerveau est terminé).

12 chats de trois ans, six mâles et six femelles, sont utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, puis renvoyés à l'animalerie où ils pourront être inclus dans un autre projet. Chacun subit deux poses de cathéter veineux sous anesthésie générale à trois semaines d'intervalle, six prélèvements sanguins, un régime enrichi à 10 % d'huile et un isolement d'environ un jour et demi autour de chaque cathétérisation. Il s'agit d'évaluer si un extrait de feuille d'olivier limite les altérations métaboliques liées au surpoids, un débouché de médecine vétérinaire préventive que le porteur adosse au chiffre de 63 % de chats en surpoids dans certains pays. Sur le remplacement, il écrit que le recours à ce modèle animal est "pertinent et indispensable" parce que l'étude porte sur les réponses physiologiques propres à cette espèce.

Objectifs

Le surpoids chez le chat est un problème fréquent en médecine vétérinaire, touchant jusqu'à 63% des chats dans certains pays. Outre ses implications économiques pour les propriétaires, le surpoids a des conséquences graves sur la santé des chats et favorise les affections telles que le diabète de type 2, pour lequel il n'existe actuellement aucun traitement efficace. Il est donc impératif de mettre en place des mesures préventives pour ralentir l’apparition du surpoids et des comorbidités associées. Récemment, l’utilisation de composés naturels à base de plantes, notamment l’extrait de feuille d’olivier, a émergé comme une approche prometteuse pour la prévention du surpoids. Chaque composé pris indépendamment possèdent des propriétés bénéfiques pour la santé et limite la croissance du tissu adipeux. Cependant, malgré des études approfondies, les avantages spécifiques de cet extrait n’ont pas encore été étudiés chez le chat. Ainsi, notre étude vise à évaluer la capacité de l’extrait d’olivier à limiter les altérations biologiques liées à une surcharge lipidique, mimant les dysfonctions associées au surpoids chez le chat, en se focalisant sur l’inflammation et les dysfonctions des vaisseaux sanguins.

Bénéfices attendus

A ce jour, de nombreux traitements et modifications du mode de vie des chats sont utilisés pour lutter contre le surpoids et les altérations métaboliques associées. Malheureusement, la plupart d'entre eux s'avèrent coûteux, peu efficaces sur le long terme et peuvent induire des effets secondaires graves. Par ailleurs, bien que des résultats prometteurs aient été obtenus quant aux effets préventifs des extraits d’olivier sur le surpoids chez l'homme, le domaine de la prévention chez le chat est très peu étudié. Ainsi, tous les résultats obtenus au cours de cette procédure contribueront à une meilleure compréhension des mécanismes physiologiques sous-jacents au surpoids chez le chat, ainsi qu'à une meilleure compréhension de l’impact d’une supplémentation en un extrait de feuille d’olivier chez le chat soumis à un régime hyperlipidique, reproduisant ainsi les altérations biologiques liées au surpoids. À terme, l'objectif final serait de proposer une stratégie de prévention primaire reposant sur l'extrait d'olivier, suffisamment efficace pour réduire l'inflammation systémique et les altérations de la fonction endothéliale associées au surpoids chez les chats. Cette approche pourrait potentiellement prévenir la progression des altérations métaboliques, telles que le diabète, et réduire l'incidence des cas de surpoids chez les chats.

Procédures

Les chats subiront deux poses de cathéter veineux à 3 semaines d’intervalle sous anesthésie générale. Le cathéter sera retiré le lendemain de sa pose. Par l'intermédiaire de ce cathéter, chaque chat aura un total de 6 prélèvements sanguins : 3 prélèvements espacés de 2h, puis 3 semaines après, 3 prélèvements espacés de 2h. Un prélèvement sanguin dure environ 5 minutes mais le stress global dure environ 15 minutes car 3 chats seront prélevés sur la même période.

Impact sur les animaux

Au cours de cette procédure, plusieurs effets indésirables sur les chats peuvent être notés. Deux poses de cathéters veineux espacées de 3 semaines sont effectuées, chacune suivie de prélèvements sanguins via le cathéter. La pose du cathéter engendre un stress lié à la contention de l'animal, à l’anesthésie et la pose du cathéter, d'une durée d'environ 30 minutes, à une intensité de gravité modérée. De plus, un stress de gravité légère est induit par la contention nécessaire pour prélever le sang via le cathéter en place (5 minutes / chat). Enfin un stress léger pourrait également exister lors du retrait du cathéter veineux à l’issue des prélèvements, stress de durée de 5 minutes. Par ailleurs, un stress de gravité léger peut également être généré par la modification de l'appétence du régime alimentaire « standard » au moment de l'expérience, par l’ajout de 0.1% d’extrait d’Olivier (pendant 3 semaines) ou des 10% d’huile pour le régime « hyperlipidique » (pendant 1 jour) durant les 5 semaines de la procédure. Cela peut perturber les habitudes alimentaires des chats et entraîner une réticence éphémère (3 jours maximum) à consommer leur nourriture habituelle. Enfin, les animaux seront isolés à la fois lors de la distribution des repas quotidien durant une quinzaine de minutes et aussi lors de la pose du cathéter jusqu’à son retrait, soit une durée d’environ 1 jour et demi. Cet isolement peut également être une source de stress, par limitation de leurs interactions sociales et de leur environnement.

Devenir

Les chats retourneront à l'animalerie et pourront être inclus dans un autre projet.

Remplacement

Notre projet vise à prévenir le surpoids et les altérations métaboliques associées spécifiquement chez les chats. L’utilisation de ce modèle animal est donc pertinent et indispensable, et permet de cibler précisément les besoins et les réponses physiologiques propres à cette espèce.

Réduction

En amont de ce projet, nous réalisons des tests de toxicité in vitro, à la fois sur les molécules isolées et sur l'extrait total d’olivier, en utilisant des lignées cellulaires de chat : les cellules intestinales et les macrophages. Nous examinons également le potentiel effet anti-inflammatoire et anti-oxydant de cet extrait. Cette approche nous permet de prédire les effets toxiques en fonction des doses testées, et de déterminer la dose la plus efficace à tester chez le chat, réduisant ainsi le nombre de chats nécessaires à inclure dans notre procédure. Nous minimiserons le nombre de chats utilisés par des méthodes expérimentales validées et reproductibles réalisées par un personnel expérimenté et en ayant recours à des analyses statistiques appropriées. Ainsi, nous avons trouvé que 6 animaux par groupe seront nécessaires à notre étude. Notre projet inclut donc 12 chats (6 mâles et 6 femelles).

Raffinement

Pendant la procédure, nous mettrons en place plusieurs mesures visant à assurer le bien-être des animaux et à minimiser toute forme de stress. Tout d’abord, une feuille de suivi des soins, comprenant une évaluation quotidienne du comportement des chats ainsi que des examens cliniques réguliers, permettra d’évaluer tout signe de détresse ou de problème de santé au cours de la procédure. Pour limiter le stress lié à la pose du cathéter, la cathétérisation sera réalisée sous anesthésie générale, dans un lieu calme. Pour stopper la sédation et accélérer le réveil du chat, nous utiliserons un antidote 30 à 60 min après l'anesthésie. Le réveil des animaux sera surveillé attentivement. Chaque semaine, nous suivrons le poids de chaque animal. Cela nous permettra de détecter rapidement tout changement dans les habitudes alimentaires ou dans le poids des animaux, et d'ajuster en conséquence le régime alimentaire ou les doses d'extrait d'olivier si nécessaire. Enfin, en dehors des jours de prélèvements sanguins où les chats seront isolés, les chats seront logés en 2 groupes de 6 chats (n=6) au sein de la chatterie d’ONIRIS, où des étagères et des cachettes murales sont installées.

Choix des espèces

Notre projet vise spécifiquement à prévenir le surpoids et les altérations métaboliques associées chez les chats. L'utilisation de ce modèle animal est donc essentielle pour cibler précisément les besoins et les réponses physiologiques propres à cette espèce. Cela permet la transposabilité directe des résultats à la pratique clinique vétérinaire. Par ailleurs, nous travaillerons sur des animaux sains, ce qui permet d'étudier les mécanismes physiopathologiques de la maladie à un stade précoce (prévention). Au cours de cette procédure, 12 chats de 3 ans seront inclus. Il a été montré que l’augmentation de l’âge pouvait avoir un impact sur le métabolisme lié au surpoids et à la gestion de l’inflammation. Afin de minimiser l'impact de l'âge sur nos résultats et d'assurer la comparabilité des données, notre projet inclut des jeunes chats de même âge : 3 ans.

Injectées à une ou deux reprises alors qu'elles sont éveillées, puis piquées cinq à six fois pour des prélèvements sanguins, 5 274 souris sont utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le protocole prévoit un dernier prélèvement sous anesthésie, et les injections d'anticorps peuvent faire chuter leur température centrale de deux à trois degrés pendant une demi-heure. L'objectif déclaré porte sur l'optimisation d'anticorps thérapeutiques et sur la "bioproduction" de différents formats, la seule répétition des prélèvements suffisant à faire classer l'ensemble en souffrance modérée. Toutes sont tuées à la fin de chaque procédure, le porteur indiquant qu'elles ne peuvent être ni réutilisées ni adoptées parce que leur système immunitaire a été modifié de manière pérenne.

Objectifs

Nous cherchons à améliorer et à optimiser les anticorps thérapeutiques pour le traitement de diverses pathologies. Nous cherchons à améliorer la sélection d'anticorps innovants et d'optimiser la bioproduction de différents formats d'anticorps en comparant les choix possibles pour leur activité in vivo. Ceci sera étudié dans des souris humanisées pour des molécules affectants le rôle des anticorps pour une meilleure translation des résultats à l’homme.

Bénéfices attendus

Notre projet vise à améliorer notre compréhension de la fonction effectrice d'anticorps à visée thérapeutique pour améliorer le traitement de diverses maladies humaines. La comparaison d’anticorps produits sous différents formats avec différentes modalités servira à mieux maîtriser leur développabilité dès les premières phases de développement et d'optimiser la bioproduction de formats d'anticorps.

Procédures

- Injections sous-cutanées, intradermique, intraveineuse, intramusculaire, intrapéritonéale et intranasale sur animaux vigiles : quelques secondes. 1-2 injections par animal. - Prélèvement sanguin sur souris vigiles : quelques secondes. 5-6 prélèvements par animal. - Prélèvement sanguin sur souris anesthésiés : quelques minutes. 1 prélèvement par animal.

Impact sur les animaux

Au cours de ces expériences, il n’est pas théoriquement envisagé de douleur ou effet indésirable majeur du fait de la nature des produits injectés (anticorps ou protéine). Les prélèvement répétés de sang représentent la nuisance principale dans ce projet. Il est également possible que les animaux présentent une légère irritation au niveau des sites d'injection, qui sera contrôlée chez la souris. En outre, les souris peuvent souffrir d’une légère hypothermie transitoire (2 à 3°C de perte de température centrale pendant 20-30 min) après les injections d'antigènes et d'anticorps. La température des souris sera surveillée pour détecter toute perte de température anormale et des critères d'évaluation appropriés ont été fixés. Aucun effet à long terme n'est attendu pour cette procédure. Les injections et les prélèvements sanguins de petit volume ne requièrent qu'une contention suivi de l’introduction d’une aiguille. Pour ce geste les animaux sont susceptibles d’éprouver une douleur légère de courte durée. La sévérité globale des procédures est considéré comme modérée uniquement du fait de la répétition des prélèvements sanguins au cours des protocoles.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure car ils ne peuvent être ni réutilisés, ni replacés, ni adoptés car leur système immunitaire aura été modifié de manière pérenne durant les procédures, impactant leur capacité de réponse à d’autres stimuli.

Remplacement

Le recours à l’utilisation d’animaux est justifié par le fait que les mécanismes moléculaires du système immunitaire sont difficiles, voire impossible à étudier in vitro, en raison de l'implication de plusieurs organes et de l'absence d'un système circulatoire intact. Les thérapies objets d’investigations, ne peuvent pas être remplacées par des modèles in vitro: nos procédures expérimentales ont un caractère de stricte nécessité et ne peuvent pas être remplacées par d'autres méthodes expérimentales n'impliquant pas l'utilisation d'animaux vivants et susceptibles d'apporter le même niveau d'information biologiquement pertinente.

Réduction

Le recours à des lignées consanguines de souris permet entre autres de réduire le nombre d’animaux par groupe expérimental, et de ne pas prolonger les explorations dès lors que sont initiées et mesurables les conséquences biologiques des interactions entre les anticorps et leurs récepteurs. Les nombres d’animaux utilisés lors des expériences sont minimisés, avec la contrainte d’obtenir des données statistiquement significatives. Une analyse de variances sera réalisée entre les groupes.

Raffinement

Mesures prises pour minimiser les atteintes au bien-être des animaux. Il n’est pas attendu d’effet secondaire délétère pour la santé des animaux. L'état général des animaux et le point d'injection seront surveillés quotidiennement. La procédure sera interrompue si des signes généraux sont observés. Une légère irritation peut survenir au niveau des sites d'injection, qui sera contrôlée chez la souris. En outre, les souris peuvent souffrir d’une légère hypothermie transitoire (2 à 3°C de perte de température centrale pendant 20-30 min) après les injections d'antigènes et d'anticorps. La température des souris sera surveillée pour détecter toute perte de température anormale et des critères d'évaluation appropriés ont été fixés. Aucun effet à long terme n'est attendu pour cette procédure. Si l’animal présente une posture prostrée, un poil hérissé ou une perte de poids de plus de 10-15% le raffinenement sera renforcé avec du gel hydrique ou une réhydratation sous cutanée pour prévenir/traiter les signes cliniques. Si l’animal présente une hypothermie prolongée de plus de 30 min suite à une injection ou un prélèvement, les cages pourront être chauffées avec des chaufrettes. Les soins adéquats à apporter à l'animal seront déterminés par le vétérinaire. L’animal sera mis à mort si aggravation des signes clinique malgré le traitement.

Choix des espèces

L’espèce utilisée est la souris de laboratoire. Le recours à des lignées consanguines de souris permet de réduire le nombre d’animaux par groupe expérimental. Les souris de laboratoire restent des modèles dont la pertinence biologique et biomédicale est établie. De plus, l’utilisation de lignées de souris génétiquement modifiées permettra d’évaluer plus précisément les mécanismes moléculaires et cellulaires de la pathologie humaine. Nos procédures expérimentales ont un caractère de stricte nécessité et ne peuvent pas être remplacées par d'autres méthodes expérimentales n'impliquant pas l'utilisation d'animaux vivants et susceptibles d'apporter le même niveau d'information biologiquement pertinente. L’ensemble des animaux expérimentaux seront utilisés au stade « jeune adulte à adulte » : entre 6 et 15 semaines au début de l’expérience, âge à partir duquel le système immunitaire est mature et ne subit plus de changements majeurs. Les animaux ne sont pas utilisés à un âge plus avancé (au-delà de 15 semaines), afin que leur masse ne soit pas trop importante et ne nécessite l’injection de doses d’anticorps plus importantes.

Pour mettre au point une prothèse mammaire biologique destinée à des femmes ayant subi une mastectomie, 10 cochons miniatures, tous des femelles, vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune subit une lipoaspiration d'une heure, puis l'implantation sous la peau de quatre bioprothèses sous anesthésie générale, avant quinze jours d'hébergement en box individuel et jusqu'à douze pansements sur trois mois. Le porteur retient le cochon pour la ressemblance de sa peau avec la peau humaine, et des animaux de 15 à 30 kilos pour qu'ils aient assez de graisse à aspirer sans écraser les implants en position couchée. Les dix sont tués pour retirer les prothèses de leur corps.

Objectifs

L’objectif de notre projet est de développer une prothèse mammaire biologique permettant une reconstruction définitive, plus sur et de meilleure qualité aux femmes touchées par un cancer du sein (cela concerne plus de 20000 femmes par an subissant une mastectomie). On éspère ainsi reconstituer un sein natif à l'image des bioorganes en cours de developpement (decellularisation-recellularisation de cœur, foie, poumons etc). Cette nouvelle méthode permettrait ainsi d’allier les bénéfices d’une reconstruction par prothèses (simplicité, pas de morbidité du site donneur, une seule cicatrice) aux bénéfices d’une reconstruction à partir des propres tissus de la patiente (définitifs et resultats plus naturels).

Bénéfices attendus

Notre projet prévoit la création d'une bioprothèse mammaire. Cette bioprothèse agirait comme un néo-sein (néo-organe) : la matrice porcine decellularisée servirait d'echaffaudage aux cellules graisseuses de la patiente pour repeupler et recellulariser ce néo- sein. On éspère ainsi reconstituer un sein natif à l'image des bioorganes en cours de developpement (decellularisation-recellularisation de cœur, foie, poumons etc).Cette nouvelle méthode permettrait ainsi d’allier les bénéfices d’une reconstruction par prothèses(simplicité, pas de morbidité du site donneur, une seule cicatrice) aux bénéfices d’une reconstruction autologue (autologues, définitifs et resultats plus naturels).

Procédures

-Lipoaspiration (1h) -Implantation de bioprothèses biologiques en sous cutané (4 par animal sous anesthésie générale en 1h) - Prelevements sanguins si besoin (une fois / semaine pendant toute l'expérience soit 3 mois) si signes d'infections/rejets/inflammation des implants -Hebergements en boxe individuel 15 jours - Pansements (après evaluation par equipe veterinaire, fréquence maximale de 3 par semaine soit 12 au total) -Explantation des implants

Impact sur les animaux

L’implantation des implants biologiques sous cutanés chez le porc pourrait entrainer des douleurs d’intensité faible à modérée ainsi qu’une limitation possible de l’activité. L’infection de site opératoire est un évènement possible. Des douleurs d'intensités faibles à modérée sont possible au site de prelevements de la graisse et d'implantation des prothèses

Devenir

Mise à mort pour explantation des implants

Remplacement

Aucune alternative non animale n’est possible à ce stade du projet. Les expériences in-vitro ont déjà été réalisés et ont permis: 1) d’évaluer les échanges gazeux à travers la membrane de derme porcins décellularisés (passage de l’oxygène selon un gradient donné); 2) de démontrer que la matrice est imperméable à la molécule de transport de l’oxygène (moléule de grande taille); 3)démontrer in-vitro une amélioration de la survie des cellules adipeuses lorsqu’elles sont en contact avec la molécule de transport de l’oxygène comparativement à des cellules seules. Notre matrice est donc perméable à l’oxygène et imperméable à la molécule de transport de l'oxygéne permettant de créer un gradient en oxygène favorable à la survie des adipocytes. Les résultats in-vitro étant en faveur de l’efficacité de notre bioprothèse, nous en sommes donc au stade pré clinique de l’expérimentation.

Réduction

Deux groupes composés de 5 animaux chacun permettront de comparer l'efficacité de la solution Adipolife dans les échanges gazeux à l'intérieur de la bioprothèse et ainsi la survie des cellules graisseuses. Le mise en place de 4 implants par animal est une stratégie de réduction du nombre d’animal. . Ces deux groupes incluent le risque d'échec (2 echecs par groupes) par infection du site opératoire, ainsi en l'absence d'échecs moins d'animaux seront utlisés (6 seulement). 3 animaux par groupes étant indispensable pour obtenir une significativité statistique.

Raffinement

Toutes les conditions nécessaires à une antalgie efficace en per et post opératoire seront mises en place. Ainsi une surveillance accrue de la douleur en post opératoire sera réalisée, ainsi qu’un contrôle quotidien des sites opératoires pour s’assurer de l’absence de réaction inflammatoire ou infectieuse post opératoire. En cas de constatation de modification comportementale des animaux, l'équipe veterinaire sera alertée et consultée afin de determiner l'attitude therapeutique à adopter. Hébergement en boxe individuel – La méthodologie utilisée nous permettra d’assurer l’absence de souffrance inutile et le bien-être des animaux. Les conditions d’hébergement sont conformes à la réglementation et adaptées en accord avec le personnel de l’animalerie (les animaux disposent de nourriture et d’eau ad libitum; le milieu est enrichi). Les animaux sont mis en boxe commun dès que les conditions optimums nous le permettent

Choix des espèces

En matière de recherche en chirurgie plastique et reconstructrice, l’utilisation du porc se justifie par la proximité de la peau porcine avec la peau humaine. Ainsi l’anatomie de la peau du porc est semblable à celle des humains composés de trois couches, l’épiderme, le derme et l’hypoderme. Le prelevement de tissu graisseux par lipoaspiration dans le modèle porcin est une méthode decrite, reproductible et peu douloureuse chez cet animal. Des animaux femelles mini pig Yucatan pesant environ 15 à 30 kg seront utilisés dans cette expérience, nous avons besoin d'animaux présentant un important pannicule adipeux pour réaliser la lipoaspiration mais d'un poids modéré pour ne pas altérer les implants lorsqu'ils sont en position couchées.

Les souris de ce projet ont un système immunitaire partiellement déficient, ce qui permet de leur greffer des cellules cancéreuses humaines sans rejet et les rend plus vulnérables aux infections. 600 d'entre elles vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue pour analyse des tumeurs et des organes. La tumeur est implantée sous la peau du dos ou dans la glande mammaire, puis chaque souris reçoit trois traitements par semaine, par injection ou par gavage, pendant quatre à six semaines, avec une ponction sanguine hebdomadaire à la veine de la joue sans anesthésie. La croissance de la tumeur peut s'accompagner de prostration, de poil hérissé et d'ulcération, et c'est l'atteinte d'un score limite sur la grille d'évaluation qui déclenche la mise à mort.

Objectifs

Malgré les avancées thérapeutiques majeures de ces 10 dernières années, avec notamment la génération d'anticorps permettant de cibler la tumeur ou de restaurer les fonctions immunitaires anti-tumorales, le pronostic de certains cancers reste sombre voire incertain. C'est le cas pour certains cancers de la peau et du sein. Ce mauvais pronostic résulte essentiellement de la survenue de résistances ou de rechute en cours de traitement ou après traitement, ce qui rend nécessaire la génération de nouveaux agents thérapeutiques ou l'amélioration des thérapies existantes. Dans cette optique, nous avons identifié de nouvelles molécules soit exprimées spécifiquement à la surface des cellules tumorales soit sécrétées par la tumeur et capables d’inhiber le système immunitaire. Les anticorps reconnaissant ces molécules sont d'ores et déjà disponibles au laboratoire et ont montré une efficacité anti-tumorale dans des modèles cellulaires au laboratoire (in vitro). Le projet vise à valider dans un organisme vivant (in vivo) l’efficacité anti-tumorale de ces anticorps, utilisés seuls ou en combinaison avec des thérapies existantes, dans des modèles murins de cancers cutanés ou mammaires bien établis et largement utilisés par la communauté scientifique. La réalisation de ce projet devrait permettre de déterminer si un gain thérapeutique pourrait découler de l’utilisation des anticorps testés en combinaison avec des thérapies ciblées ou des immunothérapies actuellement utilisées pour le traitement des patients.

Bénéfices attendus

La réalisation de ce projet doit permettre de valider les résultats obtenus sur des modèles cellulaires in vitro, à savoir la génération d'une réponse immunitaire anti-tumorale efficace en présence des anticorps testés. Les expériences envisagées établiront si l'utilisation d'anticorps thérapeutiques dirigés contre des marqueurs spécifiques des cellules cancéreuses que nous avons identifiés est en mesure de promouvoir une élimination tumorale et/ou de renforcer l'action d'agents thérapeutiques utilisés en clinique (thérapies ciblées et immunothérapies). La validation du mode d'action de ces anticorps dans un modèle murin devrait conduire au développement d'anticorps injectables chez l'Homme et à la conduite d'essais cliniques pour évaluation de leur efficacité anti-tumorale en conditions pathologiques réelles. En cas de résultats probants, ces anticorps représenteraient une nouvelle alternative (ou un complément) thérapeutique pour le traitement des cancers cutanés et mammaires étudiés, cancers pour lesquels les traitements actuels restent peu ou partiellement efficaces

Procédures

Afin de mettre en place le modèle expérimental, les souris seront soumises à une greffe des cellules tumorales en sous-cutanée (sous la peau du dos, sous anesthésie; durée 3 minutes) ou au niveau de la glande mammaire (sous anesthésie; durée: 3 min). Les essais thérapeutiques seront administrés aux animaux non anesthésiés par injection et/ou gavage (3 fois par semaine pendant 4 à 6 semaines; durée du geste: 1 min). Le suivi de l'effet thérapeutique sera évalué par des mesures de la taille des tumeurs et un prélèvement sanguin au niveau de la veine de la joue (sans anesthésie; 1 fois par semaine pendant 4 à 8 semaines; durée 30 secondes).

Impact sur les animaux

Les tumeurs seront obtenues par une greffe sous-cutanée ou intra-mammaire de cellules tumorales. Du fait de la croissance de la tumeur, une perte de poids, , , une altération des fonctions physiologiques normales de l’animal ou de son activité (mobilité, nourrissage, toilettage) ou des signes de douleur (prostration, poil hérissé) pourraient apparaître. Les agents thérapeutiques seront administrés par injection et/ou gavage Elles sont par conséquent susceptibles d'induire stress et/ou agitation pendant la durée de manipulation et d''immobilisation de l'animal. Une ulcération/infection à l'emplacement de la tumeur ou du site d'injection pourrait survenir mais n'est que rarement observée. Enfin, du fait de leur système immunitaire partiellement déficient, les souris utilisées présentent une susceptibilité plus grande aux agents pathogènes.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés en fin de protocole. Les tumeurs et les organes pourront être prélevés afin de faire des analyses post-mortem.

Remplacement

Il n’existe pas de méthode alternative non animale car le but de ce projet est de tester l’activité anti-tumorale d'anticorps dont le mode d'action repose sur la présence de cellules immunitaires fonctionnelles en périphérie d’une tumeur en croissance. Il est par conséquent nécessaire d'utiliser un modèle animal permettant le suivi de la croissance tumorale mais aussi la mobilisation et l'activation des cellules immunes en présence d'anticorps. De plus, un aspect de notre étude requiert de reproduire le microenvironnement créé par la tumeur et impactant l'activité des cellules immunitaires (sécrétion de molécules immunosuppressives) afin de se rapprocher le plus possible du contexte pathologique rencontré chez les patients. Le modèle murin est le seul permettant de reproduire ces caractéristiques spatio-temporelles associées à la présence d’une tumeur solide et à son influence sur la réponse immunitaire.

Réduction

Le nombre d'animaux utilisé par groupe correspond au minimum nécessaire et suffisant pour valider la significativité des résultats sur le plan statistique pour un modèle tumoral. Il prend en compte la variabilité de la prise de greffe et de l'intensité de la réponse immunitaire entre individus au sein d'un même groupe. De plus seuls des anticorps ayant préalablement montré une efficacité dans des tests vitrosur des lignées cellulaires, au laboratoire, seront utilisés afin de limiter les risques de non réponse aux traitements. Un maximum de conditions sera réalisé au sein d’une même expérience afin de réduire au minimum le nombre d’animaux utilisés. De même, les expériences visant à tester les combinaisons anticorps/thérapie ciblée ou immunothérapie ne seront entreprises que si des résultats probants auront été obtenus lors de l'utilisation de l'anticorps seul.

Raffinement

Du fait de leur immunodéficience partielle, les animaux seront hébergés dans un environnement adapté et en portoir ventilé afin de limiter les contaminations avec des organismes pathogènes. Elles auront à disposition des outils de nidification ou d’occupation ainsi qu’eau et aliments à volonté. Dès la greffe tumorale et tout au long du traitement,, les souris seront suivies 3 fois par semaine par l’expérimentateur (mesure de la tumeur, pesée, observation du comportement des animaux et absence de signes douloureux). L'administration des traitements aura lieu 3 fois par semaine et sera précédée par une évaluation de l’état physique et du comportement de chaque animal selon une grille d’évaluation préétablie. Chaque animal se verra ainsi attribuer un score reflétant des dégradations, son inconfort ou tout signe de douleur. L’atteinte d’un score limite conduira à l'euthanasie de l’animal. En marge de la surveillance réalisée par l'expérimentateur, une surveillance quotidienne sera assurée par les animaliers. L’expérimentateur pourra intervenir dans la journée en cas de modification ou d'aggravation de l’état général de l’animal. En cas d'apparition de signe de douleur sans atteinte d'un score limite, la surveillance de l’animal sera augmentée à 2 fois par jour avec une mise à disposition de croquettes humidifiées dans la cage et l'injection d'un analgésique une fois par jour afin de soulager la douleur.

Choix des espèces

La souris est le modèle de choix pour les études de recherche sur le cancer et la réalisation d’expériences thérapeutiques. En effet, c’est un mammifère dont les mécanismes associés à la réponse anti-tumorale sont bien connus et décrits. Le modèle murin est aussi le modèle le plus adéquat pour l’étude du microenvironnement tumoral. Il permet d’avoir recours à des animaux partiellement immunodéficients pouvant développer des tumeurs humaines sans risque de rejet, et une réponse immunitaire médiée par des anticorps. De plus, le système immunitaire de la souris étant proche de celui de l’Homme, l’utilisation de ce modèle permet d’avoir une première preuve de concept pour l’utilisation de nouveaux agents thérapeutiques impactant positivement la réponse anti-tumorale en vue de leur développement clinique pour les patients. Enfin, la souris est un petit mammifère dont le comportement est bien connu ce qui permet une évaluation simple et efficace des modifications physiques et/ou comportementales symptomatiques de souffrance ou de mal-être pouvant être engendrées par la présence de la tumeur ou l’administration des traitements. Des souris adultes âgées de 5 à 6 semaines seront utilisées (âge standard pour l’établissement de modèles murins en oncologie).

Isolées en cage individuelle pendant sept semaines avec un accès intermittent à un biberon d'alcool, 200 souris subissent ensuite deux prélèvements sanguins sous anesthésie et un examen IRM de deux heures, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Toutes sont tuées à l'issue pour prélèvement d'organes. Le projet cherche à cartographier les modifications de connectivité cérébrale associées à la consommation massive et rapide d'alcool. Le porteur qualifie cette consommation de "volontaire et non forcée", tout en décrivant un isolement de sept semaines imposé par le protocole, une déshydratation possible et un état d'anxiété ou de dépression à l'arrêt de l'alcool.

Objectifs

Selon les estimations de l’OMS, la consommation excessive d’alcool entraîne environ 3 millions de morts par an (5% de la mortalité dans le monde). D’après le manuel de diagnostic et de statistique des troubles mentaux, le trouble d’usage de l’alcool est défini comme un « schéma problématique de consommation d’alcool entraînant une détresse importante au point de vu clinique ». Il a été montré que les troubles liés à la consommation excessive d’alcool sont de nature hétérogène. De plus, il existe différents types de troubles d’usage de l’alcool avec des bases neurobiologiques spécifiques. Parmi les différents types de troubles de l’usage de l’alcool, nous nous intéresserons à la consommation massive et rapide d’alcool, encore appelée binge drinking. Le binge drinking est défini comme un mode de consommation d’alcool suffisant pour générer une quantité d’alcool dans le sang de plus de 80 mg en une période de temps de 2 heures. Ce type de consommation d’alcool est particulièrement répandu chez les adolescents, et sa prévalence augmente chez les femmes. De plus, il est clairement démontré que l’alcoolisme sévère touche différemment les femmes et les hommes. De ce fait, il est important de caractériser la connectivité et l’impact neurobiologique de ce type de consommation d’alcool (binge drinking) pour comprendre les conséquences de ce mode de consommation d’alcool au niveau cérébral. Ce projet a pour objectif d’identifier les altérations de la connectivité cérébrale liées au trouble de l’usage de l’alcool, dans le cas d’une consommation de type binge drinking. L’identification des changements de connectivité cérébrale et la mise en évidence de l’implication de zones spécifiques au niveau du cerveau pourraient aider la recherche préclinique et clinique, et accélérer les stratégies thérapeutiques et de prévention.

Bénéfices attendus

Les résultats de cette étude devraient aider à mieux comprendre les altérations de la connectivité cérébrale qui tendent le développement d’un profil de consommation excessif et rapide d’alcool. L’identification des changements de connectivité cérébrale et la mise en évidence de l’implication de zones spécifiques au niveau du cerveau pourraient aider la recherche préclinique et clinique, et accélérer les stratégies thérapeutiques et de prévention.

Procédures

Les animaux seront soumis à: 1) un protocole d'accès volontaire et intermittant à un biberon d'alcool pendant 7 semaines 2) deux prélèvements sanguins séparés de plusieurs semaines et réalisés sous anesthésie 3) un examen IRM sous anesthésie incluant: une séquence d'IRM fonctionnelle de 16 min, une séquence d'IRM anatomique de 10 min, et une séquence d'IRM de diffusion de 60 min (TOTAL=2 heures) 4) un test comportemental pendant 5 min. Les souris seront également hébergées individuellement durant toute la durée du protocole, soit 7 semaines.

Impact sur les animaux

La procédure expérimentale est basée sur une consommation volontaire et non forcée de l’alcool sur une courte période. Les souris peuvent cependant présenter un état de déshydratation suite à la consommation excessive d’alcool. Ce protocole exige par ailleurs que les souris soient isolées ce qui peut induire un stress chez les animaux, les souris peuvent également être dans un état d’anxiété et/ou de dépression dû à l’arrêt de consommation d’alcool. Le prélèvement sanguin peut entraîner : une perte de poids corporel, des hémorragies sous-cutanées et un œdème. Le test comportemental peut générer du stress en raison de l'isolement des souris pour la réalisation du test.

Devenir

A la fin de la procédure, les animaux seront mis à mort afin d'effectuer des prélèvements d'organes d'intérêt.

Remplacement

Le modèle animal est pour le moment le seul modèle qui permet d’étudier dans son ensemble les phénomènes complexes mis en œuvre dans l'addiction à l'alcool au niveau cérébral à l'échelle du connectome. En effet ces atteintes sont multifactorielles, nécessitant un grand nombre d’acteurs, et toutes les conditions ne sont pas reproductibles fidèlement dans un modèle de culture cellulaire. L'alcoolisme est une pathologie hétérogène qui implique une grande variabilité des profils symptomatiques. L'étude chez l'animal permet un suivi au cours du temps et un contrôle de l'historique de consommation incluant différents paramètres. Il n'est pas non plus possible de réaliser des prélèvements tissulaires chez l'humain.

Réduction

Le nombre de souris est réduit au minimum d’animaux nécessaire afin d'assurer l'efficacité des tests statistiques et donner des résultats statistiquement fiables en fonction des expériences réalisées. Ainsi, le nombre d'animaux a été déterminé par une analyse de puissance statistique et sur la base de nos études antérieures sur l'addiction à l'alcool. En raison de la forte variabilité des phénotypes de consommation d’alcool, 50 souris seront nécessaires par groupe pour effectuer nos analyses conduisant à un total de 200 animaux.

Raffinement

Le stress potentiellement engendré par la pratique expérimentale sera limité au maximum. A leur arrivée à l’animalerie, les souris bénéficieront d’une phase d’acclimatation à leur nouvel environnement de 2 semaines. Dans chaque cage d'hébergement, l'environnement sera enrichi par : 1- des lanières de papier permettant l’édification du nid afin de stimuler l’activité naturelle et diminuer le stress. 2- deux cylindres de coton pour l’édification du nid. 3- un morceau de bois pour que les souris usent leurs dents. 4- un tube pour fournir un abri. Durant l'examen IRM, le raffinement sera respecté par l'usage d’une anesthésie afin de réduire au maximum le stress de l'animal. Les yeux des animaux seront protégés du dessèchement grâce à l’application d’un gel de protection. Un tapis chauffant permettra le maintient des animaux à une température physiologique. La température et la respiration seront en permanence surveillées par un système de monitorage. En cas de chute de la température et/ou d’une respiration altérée, l'acquisition en cours sera immédiatement interrompue et l'animal sorti de l'IRM et pris en charge. Il sera alors placé dans une cage mis sous une lumière chauffante jusqu'à son réveil, sous surveillance. Les animaux seront habitués aux procédures comportementales préalablement à la réalisation des expériences. Des points limites ont été établis afin de soustraire les animaux à la douleur.

Choix des espèces

Nous utiliserons des souris de fond génétique C57BL/6. Cette souche est la plus utilisée dans l'étude du comportement lié à l'alcool et c'est également celle que nous avons utilisée dans nos études précédentes. Des informations standardisées sur sa génétique et son comportement sont connues. Des modèles de souris génétiquement modifiées présentant une sensibilité accrue à l’alcool que nous pourrions utiliser à l’avenir sont également disponibles, qui n'existent pas chez d'autres espèces. Nous utiliserons des animaux agés de 8 semaines. Le binge drinking chez les adultes entraine des effets chroniques, des coûts pour la santé et la société. Il s'agit ici d'étudier des effets de la consommation excessive sur un cerveau pleinement développé.

192 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles portent une mutation qui provoque l'agrégation de la protéine tau et un déclin cognitif dès cinq mois, et reçoivent une injection intrapéritonéale par jour pendant 28 jours, en alternant les flancs pour limiter l'inflammation aux points de piqûre. S'y ajoutent un passage de dix minutes dans un labyrinthe en croix et jusqu'à trois passages quotidiens de dix minutes en champ ouvert pendant cinq jours consécutifs, avant le prélèvement des cerveaux. Le porteur rappelle que la plupart des composés testés jusqu'ici ont échoué en essai clinique faute d'effet sur le déclin cognitif des patients, et qualifie néanmoins sa molécule de "très prometteuse" si l'effet se confirmait chez la souris.

Objectifs

La maladie d’Alzheimer est la première cause mondiale de démence et est un problème de santé publique majeur. En 2019, 30 millions de personnes étaient atteinte de cette pathologie dans le monde. Elle se caractérise par un déclin cognitif progressif se traduisant par des pertes de mémoire et finalement l’installation d’une démence après plusieurs années. Au niveau cellulaire, l’un des marqueurs principaux de la maladie est l’agrégation anormale d'une protéine (la protéine tau) sur laquelle nous nous focalisons dans le cadre de ce projet. Cette agrégation, autrement appelée tauopathie se solde par la mort des neurones, cause du déclin cognitif chez les patients. Des résultats préliminaires obtenus au laboratoire chez la souris adulte montrent que la molécule 1) est distribuée au sein du cerveau, 2) restaure les troubles cognitifs associés au vieillissement, 3) prévient les troubles de la formation de nouveaux neurones, 4) améliore la connectivité entre les neurones. Nous avons montré que cette molécule a également un effet bénéfique au niveau de la vascularisation cérébrale. L’ensemble de ces résultats prometteurs nous a conduits à émettre l’hypothèse que cette molécule pourrait atténuer la tauopathie dans un contexte de maladie d’Alzheimer. Ce projet a pour but d’évaluer l’efficacité d'un composés dans un modèle de souris transgénique par l’étude de ces propriétés sur la tauopathie et de son effet pro-cognitif. Si nous établissions la preuve de son efficacité, cette molécule pourrait devenir un potentiel médicament dans le contexte de la maladie d’Alzheimer pour laquelle aucun traitement n’existe jusqu’alors.

Bénéfices attendus

Ce projet, qui a pour objectif d’évaluer un candidat médicament, pourrait apporter de nouvelles perspectives thérapeutiques si l’effet de la molécule testée était confirmé sur la tauopathie et se traduisait par une amélioration cognitive chez les souris transgéniques. Si la molécule testée permettait d’envisager un arrêt de l’évolution ou une amélioration du déclin cognitif, cette molécule serait très prometteuse car bon nombre de composés testés jusqu’alors ont échoués en essai clinique ces dernières années par manque d’effet significatif sur le déclin cognitif chez les patients.

Procédures

Les animaux seront injectés quotidiennement avec la molécule développée, en intra-péritonéal. Pour limiter l'apparition d'une inflammation au point d’injection, les injections se feront alternativement dans le flanc droit et dans le flanc gauche de l’animal. Enfin, les animaux participeront à des tests cognitifs pour lesquels ils seront préparés par une acclimatation préalable afin de réduire leur stress potentiel. Pour les tests comportementaux, les souris seront placées 1 fois dans un labyrinthe en forme de croix pendant 10 minutes. Pour d’autres tests comportementaux, les souris seront placées, individuellement dans une boite (openfield) pendant 10 minutes, 1 à 3 fois par jour pendant 5 jours consécutifs.

Impact sur les animaux

Dans ce projet, les souris seront injectées quotidiennement avec la molécule pendant 28 jours. Ces injections qui nécessitent de manipuler l'animal ce qui peut induire un stress ponctuel de quelques minutes et une douleur légère au point d'injection. Enfin, une perte de poids pourrait être associée au traitement. La répétition des injections quotidiennes pendant 28 jours pourrait également conduire à des nuisances additionnelles pour les souris (perte de poids / répétition d'un stress potentiel). C'est pourquoi le dégré de gravité de cette procédure est modérée. A l'âge de 5 mois, les signes cognitifs observés n'altèrent pas gravement l'état général des animaux.

Devenir

A l’issue de chaque procédure, tous les animaux seront mis à mort car les cerveaux des animaux seront prélevés pour valider l’action de la molécule. Ainsi, à la fin de l’étude, l’effet pro-cognitif de la molécule pourra être déterminé dans le cadre de tauopathies.

Remplacement

L’étude de l’effet de la molécule sur la tauopathie pourrait être menée sur des cellules en culture mais cette alternative ne permettrait pas de mettre en evidence l’effet pro-cognitif du composé qui représente un aspect fondamental de cette étude.

Réduction

Pour ce projet, des animaux transgéniques et des animaux controles seront testés à l'aide de tests comportementaux. Pour ce type d'expérimentation, les effectifs nécessaires pour obtenir des statistiques robustes ont été déterminés par un test statistique via un logiciel spécialisé. Ainsi, grâce a ce logiciel, nous nous sommes assurés de pouvoir obtenir des résultats statistiques exploitables en employant un nombre d'animaux minimal. Au cours du projet, des analyses statistiques intermédiaires seront réalisées et si les résultats des expériences sont déjà robustes, cela nous permettrait de réduire encore le nombre de souris déterminé au départ.

Raffinement

Pour réduire au minimum les nuisances sur le bien-être animal, les souris seront manipulées quotidiennement 2 à 3 minutes par les mêmes expérimentateurs pendant 7 jours avant le début des expérimentations. Ces mêmes expérimentateurs feront les injections et les tests comportementaux tout au long du projet. L’application de critères d’arrêt et le suivi quotidien des animaux hébergés permettront de garantir leur bien-être. Une grille d'évaluation permettra de suivre l'état général des animaux. En cas de dégradation de cet état général, les animaux seront euthanasiés afin d'éviter de prolonger une éventuelle souffrance.

Choix des espèces

Le modèle de souris transgéniques a été choisi pour ce projet du fait de sa pertinence scientifique pour l’étude de notre molécule et de l’expertise du laboratoire partenaire sur ce modèle. En effet, depuis plusieurs années, le modèle est implanté dans ce laboratoire et fait l’objet de nombreuses caractérisations de la tauopathie. Le laboratoire dispose d’une banque de réactifs qui permettent de caractériser très précisément l’évolution de la pathologie dans ce modèle. Ainsi, les partenaires sont capables grâce à leurs outils d’évaluer au mieux les effets de la molécule testée. De plus, ce modèle de souris transgéniques fait l’objet de nombreuses publications scientifiques montrant un déclin cognitif dès 5 mois chez les animaux transgéniques ce qui valide le recours à ce modèle pour étudier l’effet pro-cognitif de notre composé.

Une hypothermie maintenue trois à cinq heures pour 84 souris, une chirurgie d'injection directe dans le cerveau pour 360 autres, des injections intraveineuses répétées pour 876 : 1 320 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes mises à mort quatorze ou soixante jours après le traitement. Une partie porte des mutations modèles de la maladie d'Alzheimer, avec déficit moteur, perte de mémoire spatiale, anxiété, anomalies de posture et difficultés à s'alimenter. Le projet teste des fragments d'anticorps censés faire passer des oligonucléotides à travers la barrière qui protège le cerveau. Le porteur annonce des tests comportementaux sans dire lesquels, et se réserve "le droit de ne pas divulguer le nom des gènes ciblés".

Objectifs

La maladie d'Alzheimer (MA) reste la cause la plus fréquente de démence. La thérapie génique basée sur les oligonucléotides a montré un grand potentiel thérapeutique car elle peut réguler potentiellement n'importe quel gène spécifiquement ciblé. Cependant, plus de 98% des médicaments développés pour des applications cérébrales ne parviennent pas à traverser la barrière hématoencéphalique (la barrière qui protège le cerveau des agents toxiques véhiculés par le sang), ce qui entrave leur application en clinique. Notre équipe et son partenaire biotechnologique ont développé des "vecteurs", basés sur des fragments d’anticorps, qui facilitent le transport de produits biologiques à travers la barrière hématoencéphalique. Nous faisons l’hypothèse que notre construction fragment d'anticorps pourrait être utilisée pour transporter efficacement des oligonucléotides dans le tissus cérébral et réguler des facteurs de risque pertinents de la MA. Pour évaluer cette hypothèse, nous avons conçu et testé in vitro plusieurs oligonucléotides ciblant des facteurs de risque génétiques connus, associés à la physiopathologie de la MA. Le premier objectif de notre projet est de tester l'efficacité des oligonucléotides chez la souris de type sauvage après injection directe dans le cerveau. Le second objectif du projet est de sélectionner de nouvelles constructions de fragments d'anticorps, conçues pour améliorer les caractéristiques de franchissement de la barrière hématoencéphalique des fragments d’anticorps. Ces deux premiers objectifs nous aideront à sélectionner les oligonucléotides les plus actifs en termes de régulation génique et le fragment le plus efficace en termes de franchissement de la barrière hématoencéphalique in vivo. Le conjugué fragment d’anticorps - oligonucléotide représentera notre médicament final. Par conséquent, le troisième objectif du projet sera de tester l'efficacité de nos nanomédicaments à réguler efficacement l’expression des gènes cibles, d’abord chez les souris sauvages après administration systémique (injection intraveineuse, IV). Enfin, notre quatrième objectif sera de tester nos nanomédicaments sur des souris modèle de la MA afin de vérifier i) leur efficacité dans la réduction des lésions neurodégénératives et ii) dans l'amélioration des fonctions cognitives, en comparaison avec nos placebo.

Bénéfices attendus

Ce projet devrait permettre de mettre au point une nouvelle famille de médicaments à base d'oligonucléotides présentant des caractéristiques de distribution efficaces dans le cerveau et destinés à la régulation de facteurs de risque génétiques impliqués dans la physiopathologie de la MA. Plus précisément, ce projet validera in vivo nos nanomédicaments dont l'efficacité et l'innocuité ont déjà été testées in vitro. Nous répondrons à trois questions scientifiques principales : 1) nos nouvelles constructions fragment d'anticorps 2.0 peuvent-elles délivrer encore plus efficacement des oligonucléotides dans le cerveau que le fragment 1.0 déjà disponible; 2) nos oligonucléotides peuvent-ils réguler l'expression des facteurs de risque génétiques liés à la MA ; 3) l'inhibition des gènes ciblés améliorera-t-elle les fonctions cognitives dans les modèles de la MA. À ce jour, il n'existe aucune alternative in vitro capable de reproduire la complexité d'un système vivant, c'est pourquoi les études sur des modèles de souris restent une étape cruciale et inévitable dans le développement de thérapies dédiées au cerveau. En outre, les études précliniques sur des modèles murins de la MA restent le principal moyen prédictif pour étudier l'efficacité d'un nouveau médicament contre la MA, avant de passer aux phases cliniques. Par conséquent, les animaux restent les seuls modèles permettant d’évaluer nos hypothèses, de réaliser nos objectifs, de répondre à nos questions et de développer de nouvelles thérapies pour la MA. Dans le cadre de ce projet, nous sélectionnerons les nanomédicaments à base d'oligonucléotides qui ont un effet thérapeutique intéressant. A plus long terme, ces nanomédicaments seront produits à plus grande échelle pour validation dans des études cliniques. Par conséquent, notre projet devrait accélérer le développement de thérapies innovantes pour la MA, sachant qu’il n’existe à ce jour aucun médicament efficace contre la MA. En outre, grâce à la modularité de notre technologie, nos études ouvriront la voie à la recherche d'un plus grand nombre de facteurs génétiques impliqués dans d'autres troubles neurologiques (par exemple, la sclérose latérale amyotrophique, la maladie de Parkinson, la sclérose en plaques, les encéphalopathies, etc), élargissant ainsi encore l'impact scientifique de ce projet.

Procédures

Tous les animaux ayant reçu une injection dans le cerveau, soit 360 souris vont subir : - une chirurgie en vue d'injection des oligonucléotides directement dans le cerveau d'une durée de 30 minutes- des prélèvements de sang intermédiaires répartis sur la durée totale de la cinétique (maximum x3, séparés de 24h à 72h) qui seront réalisés sur animaux vigiles en contention à partir de l'extrémité de la queue, la durée d'un prélèvement n'excédera pas 5 minutes. Tous les animaux seront mis à mort 14 jours après injection dans le cerveau. Lors de l'induction de l'hypothermie, tous les animaux soit 84 souris vont subir une contention dans un dispositif dédié, des injections intraveineuses et l'induction d'une hypothermie. L'état d'hypothermie peut durer de 3 à 5 heures. Tous les animaux seront perfusés et mis à mort 14 jours après injection intraveineuse. Les animaux ayant reçu une injection intraveineuse, soit 876 souris, vont subir une contention dans un dispositif dédié, des injection intraveineuses, des prélèvements de sang intermédiaires répartis sur la durée totale de la cinétique (maximum x3, séparés de 24h à 72h) qui seront réalisés seront sur animaux vigiles en contention à partir de l'extrémité caudale et des tests comportementaux, ces manipulations peuvent durer une dizaine de minutes par animal. Tous les animaux seront perfusés et mis à mort à 60 jours après injection intraveineuse.

Impact sur les animaux

Les nuisances ou effets indésirables susceptibles d'entraîner du stress et/ou de l'angoisse sont les suivants : la chirurgie pour l'injection ICV est susceptible d'entraîner de la douleur, la contention lors des multiples prises de température rectale (prise discontinue sur 5h maximum), des différents prélèvements de sang au niveau de la queue et lors des injections intraveineuses peut générer du stress et /ou de l'angoisse. L'induction de l'hypothermie peut provoquer inconfort jusqu’au retour à la température normale. Les anesthésies (par injection ou par inhalation) et les tests comportementaux sont susceptibles de générer du stress. Les souris modèle de la maladie d’Alzheimer sont censés présenter une perte neuronale et une perte des fonctions cognitives et motrices avec l’âge. Pour tous les modèles les phénotypes typiques sont un déficit moteur, un déficit de la mémoire spatiale, de l'anxiété, des anomalies posturales, des difficultés d'alimentation, et une mauvaise reconnaissance des objets nouveaux. Tous ces phénotypes sont plus graves chez les animaux homozygotes que chez les hétérozygotes, c'est pourquoi nous n'utiliserons que des souris hétérozygotes.

Devenir

Tous les animaux de ce projet seront mis à mort pour procéder à l’évaluation de l’efficacité de l’inhibition génique de nos médicaments, par des tests biochimiques et de biologie moléculaire.

Remplacement

Des études in vitro ont montré que nos nanomédicaments inhibent les gènes sélectionnés et sont adsorbés par les cellules neurales grâce aux fragments d’anticorps. En outre, des études de toxicité in vitro ont prouvé que les médicaments testés sont sûrs et n'induisent pas de réactions indésirables dans les cellules. Ces études in vitro nous ont permis de réduire le nombre de médicaments sélectionnés et d’identifier les meilleurs candidats pour chaque gène ciblé, avec un potentiel d'application clinique. Cependant, les études in vitro ne prennent pas en compte les paramètres physiologiques complexes. Pour faire face à cette limite des études in vitro, nous prévoyons de réaliser nos expériences sur le petit animal de laboratoire, en l'occurrence la souris, qui est le premier modèle animal disponible relativement proche de l'homme et largement utilisé pour l'étude in vivo des mécanismes physiologiques et des nouvelles thérapies développées. À l'heure actuelle, il n'existe pas de système prédictif in vitro, de modèle à base d'organoïdes ou de modèles bioinformatiques capables de fournir toutes les réponses aux enjeux pharmacocinétiques, pharmacodynamiques, toxicité et effets secondaires. En ce qui concerne le développement de nouvelles thérapies pour la maladie d'Alzheimer, les études précliniques sur des modèles de souris transgéniques dédiés restent la principale approche prédictive pour étudier leur efficacité, avant de passer à la phase clinique. Par conséquent, à notre connaissance, les animaux sont le seul modèle qui pourrait nous permettre de tester nos médicaments.

Réduction

Notre étude sera structurée et bénéficiera d’une analyse statistique appropriée pour réduire le nombre d'animaux nécessaires. Plus précisément, la taille de l'échantillon pour chaque objectif a été calculée sur la base d'une analyse de puissance. Le nombre total d’animaux sera réparti sur de petits groupes de n=12 (6 mâles +6 femelles), à raison de maximum 15 groupes par étude. Nos données préliminaires ont montré une distribution homogène des oligonucléotides dans toutes les régions du cerveau lors de l’administration dans le cerveau. Par conséquent, pour réduire le nombre total d'animaux le cerveau sera divisé en deux hémisphères et chacun d'eux sera utilisé pour une évaluation différente. Par exemple, pour la localisation de l'ARN, la moitié du cerveau sera utilisé pour les approches de RNAscope (pour évaluer la distribution des ARNm cibles) et l'autre moitié pour les approches de siRNA scope (pour évaluer la distribution des siRNAs). De même, la moitié du cerveau pourra être utilisé pour la quantification de l'expression génique et l'autre moitié pour les analyses biochimiques. Cela nous permettra de réduire de moitié le nombre d’animaux.

Raffinement

A leur arrivée, les animaux sont hébergés en zone d'élevage de l'animalerie entre 4 à 5 souris par cage enrichies par des dômes en carton. Les souris seront transférées dans la zone expérimentale 7 jours avant toute expérimentation. - La chirurgie se fera sous analgésie suivi d'une anesthésie. Une fois l'animal anesthésié, il est placé sur un tapis chauffant. Les yeux sont protégés par un gel protecteur oculaire. Avant incision de la peau du crâne, une infiltration d’anesthésique local est appliquée. Une analgésie post-opératoire est établie pour réduire au minimum la douleur pendant les heures et les jours qui suivent la chirurgie. Préalablement aux injections intraveineuses, les souris sont habituées au dispositif de contention et lors de l'induction de l'hypothermie, nous veillerons à ce que la température ne descende pas en deçà de 30°C. - Après chaque prélèvement sanguin, une compresse est appliquée sur le bout de la queue pour arrêter le saignement. Préalablement aux tests comportementaux, les animaux sont manipulés régulièrement pour les habituer aux environnements des différents tests et à l'expérimentateur. Tout au long des 3 procédures, les animaux sont quotidiennement surveillés et pesés 3 fois par semaine. Une grille d'évaluation est appliquée. Notre réaction dépendra du score constaté. Quant au phénotype dommageable des souris modèles de la maladie d’Alzheimer, les souris seront mises à mort dès l'apparition des signes évidents de troubles nerveux fonctionnels.

Choix des espèces

À l’heure actuelle, à défaut d’alternatives, le modèle rongeur, ici la souris, reste le modèle le plus accessible de « petit mammifère » dont la physiologie est bien connue et relativement proche de celle de l’homme. Par sa petite taille, la souris est intéressante pour la balance pharmacologie/toxicologie (bénéfices/risques et diminution des posologies). La MA est un trouble neurologique multifactoriel qui implique différents mécanismes à l'origine de la maladie. De plus, les principaux modèles animaux expérimentaux de la MA sont des souris transgéniques. Nous nous réservons le droit de ne pas divulguer le nom des gènes ciblés. Pour les procédures sur les souris sauvages, nous utiliserons des animaux dits « jeunes adultes » ayant en moyenne de 7 à 12 semaines. A cet âge, on limite ainsi les variations interindividuelles qui peuvent avoir un impact sur les mécanismes physiologiques et les modulations de l’expression de certaines protéines. Les procédures sur les souris transgéniques modèles de la maladie d’Alzheimer seront effectuées sur deux 2 tranches d'âge : 1) les jeunes animaux (1 à 3 mois) qui ne présentent qu'un dépôt faible/initial d'espèces toxiques Aβ et Tau (stade précoce) ; 2) les souris âgées (6 à 8 mois) qui se caractérisent par un dépôt élevé et diffus d'espèces toxiques Aβ et Tau dans toutes les régions du cerveau (stade avancé).