Procédures modérées

Le ventre de souris gestantes est ouvert sous anesthésie pour injecter un gène humain dans le cerveau de leurs fœtus, suivi d'une électroporation de moins de quinze minutes. 910 souris vont être utilisées, mères, fœtus et nouveau-nés confondus, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées par une chirurgie terminale destinée à prélever le cerveau. L'objet est de savoir si treize gènes propres à l'espèce humaine modifient la forme et les connexions des neurones du cervelet, un protocole d'organoïdes cérébelleux humains existant depuis cette année mais restant, selon le porteur, à optimiser. Chez les mères, il décrit des douleurs après l'opération, une infection possible de la plaie et une rupture des points de suture qui constituerait un point limite, chez les fœtus une rare interruption de gestation, et chez les souriceaux une simple "gêne légère et momentanée".

Objectifs

L’espèce humaine présente des caractéristiques cognitives supérieures qui ont été en partie liées à l’évolution du cortex cérébral. Mais l’implication des autres régions du cerveau, comme le cervelet, reste largement inexplorée malgré son association avec les fonctions cognitives supérieures (comme le langage) et les troubles cognitifs (comme l’autisme et la dyslexie). De plus, le cervelet humain présente des caractéristiques divergentes par rapport à d’autres espèces, aux niveaux anatomique, fonctionnel et comportemental, dont les mécanismes moléculaires et cellulaires sous-jacents sont inconnus. Les mécanismes moléculaires qui participent à l’évolution des neurones et circuits neuronaux reposent en partie sur des gènes dupliqués spécifiquement humains (absents des génomes d’autres espèces) ou des gènes spécifiquement exprimés chez l’humain (expression absente chez les autres espèces). Le rôle de cette étude est d’étudier l’effet de ces innovations moléculaires sur le développement des neurones et circuits du cervelet. Nous avons une liste de 13 gènes candidats basés sur des données publiques d'expression de gènes au cours du développement dans le cervelet humain et non chez la souris et l’opossum. Pour étudier un effet fonctionnel de ces gènes, nous devons faire des expériences de gain-de-fonction dans un cervelet de Mammifère, c'est-à-dire exprimer artificiellement un gène humain pour mimer son action . Le cervelet a une structure conservée entre les Mammifères, c’est pourquoi nous choisissons la souris comme modèle, comme Mammifère le plus éloigné de nous phylogénétiquement (=dans l'arbre des espèces animales). De plus il s’agit d’une espèce pour laquelle le cervelet est très caractérisé d’un point de vue cellulaire, développemental, anatomique, et fonctionnel. Les objectifs de cette études sont : 1) d’étudier, parmi les gènes d’intérêts, lesquels sont suffisants chez la souris pour altérer la morphologie des neurones du cervelet, leur connectivité neuronale ainsi que sur la vitesse de maturation des neurones, 2) d’étudier les mécanismes cellulaires et moléculaires sous-jacents pour les 3 gènes candidats dont l’effet sera le plus flagrant.

Bénéfices attendus

A court terme, les résultats de ce projet augmenteront nos connaissances sur les effets de gènes spécifiquement humains dans le développement du cervelet de Mammifère. Cela permettra d’ouvrir un nouveau champ de l’évolution du système nerveux humain, en dehors du cortex cérébral. A plus long terme, les résultats pourraient mettre en évidence une sensibilité propre à notre espèce à certains troubles cognitifs (spectre autistique), moteurs (ataxie cérébelleuse) ou encore la dyslexie. Ils pourraient aussi ouvrir de nouvelles possibilités thérapeutiques pour ces troubles.

Procédures

Procédure 1: laparotomie sous anesthésie générale de la mère suivie d'injection ventriculaire cérébrale sur foetus suivie d'une électroporation (

Impact sur les animaux

Les effets indésirables sur les animaux sont : - chez la mère : de rares problèmes post-opératoires comme des douleurs (associées à une perte de poids ou un état de prostration), l’infection de la plaie, ou une rupture des points de suture, qui constituraient un point limite. - chez le fœtus : une rare interruption de la gestation. - chez le souriceau : une gène légère et momentanée au point d'injection.

Devenir

Tous les animaux seront utilisés pour les procédures décrites.

Remplacement

Une première alternative à l’approche expérimentale décrite dans ce projet serait l’utilisation d’une autre espèce de Vertébré tel que le poisson zèbre, qui possède également un cervelet. Cependant l’organisation et le développement du cervelet chez les Vertébrés non-Mammifères sont trop divergentes comparé aux Mammifères pour pouvoir interpréter nos expériences de gain de fonction. Une autre option alternative à l’approche expérimentale décrite dans ce projet serait la culture in vitro de cellules souches de souris ou humaines, suivie d’une différentiation en organoïde cérébelleux. C’est une approche qui va être établie en parallèle dans notre laboratoire, pour laquelle un protocole existe depuis cette année pour les cellules humaines mais qui reste à être optimisé. En effet, ce type de culture ne permet pas à ce jour de récapituler l’ensemble des aspects anatomiques observés dans un cervelet in vivo (connectivité neuronale). De plus, ces approches ne permettent pas d’étudier des réseaux neuronaux dans un cervelet qui est intégré à un organisme in vivo, avec des stimulations sensorielles et un contrôle moteur, qui sont clefs dans la maturation neuronale cérébelleuse. De plus, ces approches in vitro manquent d'une composante critique que sont les fibres grimpantes qui proviennent d’une autre région du tronc cérébral, l’olive inférieure.

Réduction

Ce projet nécessitera au maximum 910 souris. Les procédures visent à limiter l’utilisation d'animaux tout en obtenant suffisamment de données. Dans nos différentes approches, nous voulons connaître l'effets de gènes humains sur le développement des neurones. Nous commencerons pour chaque gène candidat par 2 portées. Pour les gènes montrant des résultats flagrant, nous reproduirons nos résultats pour les confirmer et les consolider statistiquement. Cette approche permet de ne pas utiliser le nombre maximal de portées pour les gènes sans effet sur le développement neuronal (résultat négatif). Pour diminuer le nombre d'animaux, nous epxrimerons à chaque fois le gène di'intérêt dans la moitié des animaux de la portée, et une condition contrôle dans l'autre moitié. Ainsi, le nombre d’animaux a été estimé au plus juste de façon à répondre aux exigences pratiques et statistiques. Enfin, le contrôle des paramètres environnementaux mais également du statut sanitaire des animaux permettra de limiter la variabilité des résultats expérimentaux obtenus, et ainsi de réduire le nombre d’animaux nécessaire à l’obtention de résultats statistiquement valables.

Raffinement

Les souris utilisées dans ce projet seront élevées en groupes sociaux, avec un nombre maximal de 5 individus par cage, dans un environnement enrichi. Les élevages sont effectués au sein de notre établissement agréé et 5 personnes sont dédiées à l’organisation et l’entretien des élevages quotidien. Soins spécifiques apportés à la mère gestante pendant la chirurgie : stéréllisation du champ opératoire, analgésie sous-cutanée et anesthésie locale avant l’opération suivies par une anesthésie par inhalation. Des analgésiques sont administrés en sous-cutané les jours qui suivent l'opération et la mère gestante est hébergée seule dans une cage enrichie jusqu'à la mise bas. La température des animaux est gardée constante grâce à un tapis chauffant jusqu’au réveil. La mère gestante ne retourne sur son portoir qu’une fois réveillé. Un suivi post-opératoire rapproché est effectué pendant les premières heures suivant l'opération puis le lendemain. Soins spécifiques apportés aux souriceaux pendant leur injection : le souriceau est anesthésié. puis est réchauffé avant de retrouver sa mère. Précautions pour l'injection intraventriculaire du foetus ou souriceau : une micropipette ultra mince est utilisée pour l’injection. Chaque procédure se termine par une chirurgie terminale sous anesthésie en vue du prélèvement du cerveau.

Choix des espèces

Le cervelet a une structure conservée entre les Mammifères, c’est pourquoi nous choisissons la souris comme modèle, comme Mammifère le plus éloigné de nous phylogénétiquement. De plus il s’agit d’une espèce pour laquelle le cervelet est très caractérisé d’un point de vue cellulaire, développemental, anatomique, et fonctionnel. Les animaux seront utilisés au stade embryonnaire et aux stades postnatals, aux étapes critiques du développement des neurones et des circuits.

Des cellules tumorales sont implantées chirurgicalement dans le pancréas, le sein, les ovaires, le poumon, le colon ou le foie de 4 200 souris, dont les tumeurs sont ensuite suivies deux fois par semaine par imagerie sous anesthésie gazeuse. Toutes subissent des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, avec une injection intraveineuse par semaine pendant quarante-neuf jours et un prélèvement de sang hebdomadaire alors qu'elles sont éveillées. Le porteur annonce un acte chirurgical de cinq à dix minutes maximum par souris, puis décrit une "anesthésie longue" génératrice de douleurs après l'opération, et affirme que des tumeurs en trois dimensions et des organoïdes ont limité la phase animale "au stricte nécessaire", pour un candidat médicament testé par an. Toutes sont tuées pour que leurs organes soient analysés, ou plus tôt dès qu'un point limite est atteint.

Objectifs

Durant ces dernières décennies, la recherche médicale a réalisé d’importants progrès en matière de prévention et de traitements des cancers, associés à la diminution de la mortalité. Néanmoins, l’incidence des cancers et leur létalité restent élevées. Le développement de traitements anti-cancéreux reste donc primordial. L’objectif principal de ce projet est de tester les candidats médicaments (à raison de un candidat/ an) dans plusieurs modèles de cancers touchant différents organes. Cette implantation de lignées de cellules tumorales est réalisée directement dans l’organe cible permettant ainsi d’avoir une efficacité optimale grâce à un microenvironnement tumoral plus pertinent. Des administrations, des suivis tumoraux et des prélèvements divers sont réalisés sur les animaux tout au long des procédures expérimentales. Cette caractérisation préclinique orthotopique est primordiale afin d’identifier les meilleurs schémas de traitement et de préparer au mieux les futurs essais cliniques avec ces nouveaux candidats médicaments anticancer. Les études se porteront sur les cancers suivants : les cancers du pancréas, du sein, des ovaires, du poumon, du colon et du foie.

Bénéfices attendus

Ces études représentent une phase essentielle dans l’estimation du bénéfice/ risque des nouveaux candidats médicaments développés pour le traitement du cancer. En cas de succès, ce projet envisagera d'essayer chez l'homme de nouvelles thérapies pour guerir le cancer.

Procédures

Différents protocoles expérimentaux sont réalisés faisant intervenir des gestes chirurgicaux. Ces derniers nécessitent une anesthésie générale, durée de l'acte chirurgical entre 5 et 10 minutes maximum par souris. Les injections des candidats médicaments sont administrées par voie intraveineuse (1 fois par semaine et ce pendant 49 jours) sur souris non anesthésiées (5 à 10 secondes par injection). Des prélèvements sanguins, 1 prélèvement par souris et par semaine (10 secondes par acte) sont effectués sur souris non anesthésiées. Les injections des différents traitements (les anesthésiques, les traitements de référence) se font respectivement en sous-cutanée et en intrapéritonéale (10 secondes par manipulation). L’imagerie par bioluminescence sera réalisée afin de suivre le développement tumoral, deux fois par semaine, souris sous anesthésie gazeuse, un maximum de 15 minutes d'acquisition. Le substrat de suivi de la luminescence est réalisé par voie intrapéritonéale (10 secondes par acte).

Impact sur les animaux

Les animaux subissent une anesthésie longue et une procédure chirurgicale, ce qui peut induire un inconfort voire des douleurs post-opératoires. Lors du suivi de croissance tumorale par bioluminescence, les animaux seront anesthésiés 2 fois par semaine (entre le lundi et le vendredi) ce qui pourrait engendrer du stress chez les animaux et un inconfort lié à la manipulation. La présence de tumeurs au niveau des organes cibles peut induire un inconfort, une douleur chez les animaux. Les manipulations des souris, les prises de sang effectuées ainsi que les injections de traitements répétés (IP ou gavage) peuvent induire un inconfort, une angoisse et des douleurs chez celles-ci.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort pour analyses des organes principaux.

Remplacement

Différentes études in vitro sur des modèles de cellules tumorales et des modèles plus « sophistiqués » comme des « avatars » de tumeurs (structures 3D et organoïdes) ont été mises en place pour permettre de bien caractériser les candidats médicaments sur des modèles pertinent et limiter ainsi la nécessité de recours à plusieurs expérimentations sur des modèles animaux in vivo. Ceci a permis de limiter cette phase in vivo au stricte nécessaire. Toutefois, l’évaluation du rapport entre la dose toxique et la dose efficace sur des tumeurs nécessite le recours à des organismes modèles de l’Homme. En effet, l’efficacité antitumorale est liée à la disponibilité de la molécule dans la tumeur.

Réduction

Les effectifs ont été calculés à partir d'un dimensionnement statistique adapté, que les différents groupes contrôles permettent de conclure sur les effets potentiels du traitement et que les aléas liés au modèle sont pris en compte. Le nombre de souris correspond au nombre minimal requis pour avoir une différence significative de réponse biologique entre les différents groupes.

Raffinement

Le bien-être des animaux est analysé et est pris en compte tout au long des protocoles expérimentaux. Les critères concernant l'apparence, la mobilité et le comportement des animaux sont détaillés. Une phase d’observation post chirurgie et un suivi quotidien post traitement des animaux sont réalisés afin d’évaluer de leur état général. Utilisation d'anesthésiques et d'analgésiques couvrant une longue période d’action (72h) ; mise en place d’une grille unique de score, description détaillée dans tous les protocoles. Suivi des animaux via une grille d’évaluation de la souffrance prenant en compte le poids, la croissance tumorale, le comportement et l’aspect de l’animal. Les animaux sont hébergés dans des cages enrichies. La détermination des points limites et l’utilisation d’une grille de score permettent de réduire, supprimer ou soulager au maximum l'inconfort, la douleur et l'angoisse subies par les animaux. Dès l’atteinte d’un point limite, les animaux sont mis à mort selon les méthodes réglementaires.

Choix des espèces

Les effectifs ont été calculés à partir d'un dimensionnement statistique adapté, les différents groupes contrôles permettent de conclure sur les effets potentiels du traitement. Les aléas liés au modèle tumoral greffé sont pris en compte. Animaux à maturité sexuelle, entre 7 et 12 semaines. Les animaux plus âgés ne sont pas souhaités dans la mesure où la présence de graisse peut entrainer une modification de la biodisponibilité de la molécule. Ces souris jeunes adultes peuvent finir leur croissance ; les animaux à cet âge supportent mieux le transport de l’élevage jusqu’à l’animalerie ainsi que l’anesthésie.

Une lésion musculaire est provoquée chez 240 rats porteurs d'une dystrophie, par injection intramusculaire ou rétro-orbitaire sous sédation puis anesthésie gazeuse. Ils reçoivent ensuite un antidouleur deux fois par jour pendant au moins deux jours, certains des injections intrapéritonéales deux fois par jour pendant trois à six jours, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, et tous sont tués entre six et huit mois pour que leurs muscles soient prélevés. L'objet est de comparer les cellules souches des muscles qui bougent les yeux, épargnés par la maladie, et celles des muscles des membres, qui se détériorent. Le porteur affirme que jusqu'à six mois aucune entrave majeure à une qualité de vie autonome n'a été constatée, après avoir décrit une douleur inflammatoire modérée qui exige un morphinique.

Objectifs

Les dystrophies musculaires sont des myopathies génétiques rares qui touchent principalement les muscles et le cœur. Certaines dystrophies sont causées par des changements dans le gène codant pour la dystrophine (porté par le chromosome X), générant la dystrophie musculaire de Duchenne (DMD), que touche surtout les garçons. Chez les patients, la production anormalement faible ou absente de dystrophine induit une détérioration progressive des muscles, provoquant une faiblesse musculaire. La forme la plus sévère (absence de dystrophine) apparaît dès l'enfance et entraîne un déclin progressif de la mobilité et du fonctionnement cardiaque, fatale de façon prématurée. Pour autant, les muscles qui contrôlent le mouvement des yeux conservent leur capacité de régénération, contrairement aux muscles des membres. Ce projet vise ainsi à comparer le comportement des cellules souches musculaires, responsables de la réparation du muscle, entre ces deux types de muscles. L’objectif est d’identifier les facteurs clés permettant le maintien de la capacité régénérative des cellules souches épargnées par le vieillissement précoce, ce qui permettrait d'ouvrir une nouvelle piste de traitement pour traiter l'ensemble des myopathies dystrophiques.

Bénéfices attendus

Nous comptons identifier les mécanismes protecteurs du vieillissement précoce des cellules souches. Avec ce projet, nous comptons in fine identifier de nouvelles molécules pour moduler les mécanismes identifiés en vue d'empêcher ou de retarder le vieillissement précoce des cellules souches musculaires dans certaines maladies et ainsi, favoriser la réparation musculaire par le maintien des capacités régénératives des cellules souches.

Procédures

Dans ce projet, tous les animaux seront sédatés une fois par injection sous-cutanée puis anesthésiés par inhalation de gaz. Une injection sera réalisée par voie intramusculaire ou rétro-orbitaire. Les animaux seront injectés 2 fois par jour avec un traitement anti-douleur par voie sous-cutanée pendant un minimum de 2 jours. Certains recevront des injections intrapéritonéales 2 fois par jour pendant 3 ou 6 jours.

Impact sur les animaux

L'expérience de réparation musculaire induite qui constitue la base de ce projet cause une douleur modérée d’origine inflammatoire que l'on peut efficacement contrer avec une un antalgique puissant ou un morphinique qui sera systématiquement administrée aux animaux. Les animaux seront mis à mort entre l’âge de 6 à 8 mois. Jusqu’à 6 mois, aucune entrave majeure à une qualité de vie autonome en animalerie confinée n’a été constatée.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort pour récupérer les prélèvements nécessaires aux analyses histologiques et moléculaires.

Remplacement

Nous avons déjà réalisé tous les essais approfondis sur les cellules souches musculaires en culture. Ces expériences in vitro ne peuvent pas reproduire toutes les interactions et réponses cellulaires observées de façon chronologique dans un organisme vivant. Ainsi, la validation chez l'animal est maintenant indispensable pour évaluer de manière complète et précise les mécanismes de coopération entre les cellules dans la réparation musculaire et dans un contexte physiologique qui respecte la complexité des contributions nerveuses et endocrines.

Réduction

De nombreuses données ont été cumulées sur les modèles animaux utilisés dans ce projet. Nous avons optimisé la correction des données avant analyse statistique et le calcul de puissance statistique nous recommande d'utiliser 8 animaux par groupe. Ce nombre a été validé avec d’autres projets similaires terminés pour lesquels nous avons pu conclure qu'il était suffisant et approprié pour conclure de façon non ambiguë.

Raffinement

Les animaux sont hébergés dans des pièces avec contrôle continu de la température et de l'humidité de l'air ambiant. Le cycle d'éclairage des pièces respecte une alternance jour/nuit fondée sur les besoins naturels des animaux. Nous avons choisi de les élever dans les plus grandes cages disponibles sur le marché, leur permettant de marcher et de se dresser sur leurs pattes arrière. Cet exercice spontané quotidien est adapté à l'évaluation de leur capacité locomotrice. Dans les cages, les animaux ont un accès libre à la nourriture et à l'eau fournies à volonté. Nos animaux sont sociaux. Aussi, nous les hébergeons avec des congénères dans la même cage. Leur environnement est par ailleurs enrichi avec des lanières de papier Kraft, des bâtons en bois à ronger, des balles, des tunnels et des carrés de coton compacté. Pour éviter toute réponse de stress, les animaux sont habitués dès leur arrivée à être manipulés régulièrement, de la manière la plus douce possible. Le suivi des animaux est assuré par un personnel capable de reconnaître, quantifier, atténuer ou supprimer les signes de douleur chez les animaux. Nous avons établi une grille d'évaluation de la douleur, avec des points limites définis et affichés dans les pièces d'hébergement. Les animaux sont constamment évalués en observant chaque individu, 7 jours sur 7. En cas d'anomalie, des mesures correctives sont prises. En cas d'absence de bénéfice suite au traitement prescrit, nous pratiquons une mise à mort compassionnelle. Elle permet d'éviter toute souffrance à l'animal. La survenue d'une éventuelle douleur modérée chez l'animal est anticipée et prévenue par l'administration préalable de molécules anti-douleur très efficaces sur ce type de procédures. Les molécules utilisées dans ce projet sont toutes des médicaments pour lesquels les risques de toxicité sont faibles, connus et anticipables.

Choix des espèces

Nos animaux appartiennent à une espèce de mammifère évolutivement proche de l'humain, ce qui en fait un modèle apprécié pour la recherche. Grâce aux récents outils de modification du génome, cette espèce est devenue un choix privilégié pour l'étude des troubles musculosquelettiques. Nos modèles reproduisent fidèlement les myopathies humaines et sont appréciés en recherche médicale. Les animaux seront âgés de 6 à 8 mois, ce qui correspond au stade où la maladie progresse le plus et les muscles sont de plus en plus impactés, fonctionnellement et morphologiquement.

Administrations par voie intranasale, intratrachéale, intramusculaire, intradermique, intracérébrale, intravésicale ou par minipompe posée chirurgicalement, jeûnes pouvant durer seize heures, phase expérimentale allant jusqu'à douze mois : 25 500 rongeurs vont être utilisés dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. L'effectif se répartit entre 12 500 souris, 12 500 rats, 300 hamsters dorés et 200 gerbilles de Mongolie, pour une prestation de mesure de la biodistribution de composés chimiques ou biologiques, parfois radiomarqués. La plupart seront tués pour récupérer les organes et de grands volumes de sang, 10 400 pouvant être gardés vivants et réutilisés s'ils sont restés moins d'une semaine en procédure après une administration unique. Le porteur écrit qu'un phénotype dommageable "n'affectera pas le bien-être animal", tout en précisant dans la même phrase que les animaux concernés pourraient boire davantage ou devenir obèses.

Objectifs

L’objectif de ce projet est d’évaluer in vivo l’absorption, la distribution, la métabolisation et l’excrétion de composés biologiques ou chimiques après une ou plusieurs administrations chez le rongeur. Les paramètres de distribution et d’excrétion des composés seront si possible déterminés préalablement in vitro, ce qui conditionnera le choix de l’espèce rongeur (souris, rat, hamster, gerbille) et de la souche à utiliser pour évaluer la biodistribution in vivo dans le sang, les urines, et les différents organes. Dans certains cas, il sera possible d’avoir recours à une forme radiomarquée des composés afin de faciliter leur dosage et l’identification de leur distribution. Ce projet permettra d’une part de révéler la pharmacocinétique des composés testés in vivo, par administration unique ou répétée (dans le respect des recommandations vétérinaires concernant les voies, volumes et fréquences) de la molécule froide. Une seconde partie du projet aura recours à la forme radiomarquée de la molécule. Dans certains cas, les administrations nécessiteront une pose chirurgicale d’implant (de diffusion prolongée sous cutanée, intraveineuse ou intrapéritonéale). Ces chirurgies seront réalisées stérilement, sous anesthésie avec analgésie couvrant toute la durée de la chirurgie et dans le respect des recommandations de la SBEA. Des prélèvements divers (sang, urines, fèces, liquide cérébro spinal etc., dans le respect des recommandations vétérinaires) pourront être effectués in vivo afin de doser le composé dans ces fluides, ou des paramètres métaboliques (insulinémie, glycémie) et des prélèvements d’organes pourront avoir lieu, exclusivement post mortem. Dans le cas de l’insulinémie et de la glycémie ou d’autres paramètres métaboliques, une injection de glucose en IP ou SC ou une administration PO pourront être réalisées au préalable des prélèvements sanguins.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra d’évaluer la pharmacocinétique in vivo de composés biologiques ou chimiques après une ou plusieurs administrations chez le rongeur, sur une période allant de 1 jour à 12 mois. Cette évaluation est critique afin de pouvoir ensuite réaliser des études d’efficacité.

Procédures

Des composés chimiques ou biologiques froids ou radiomarqués peuvent être administrés aux animaux par toutes les voies possibles : intranasale et intratrachéale, sous anesthésie générale d’environ une heure; intramusculaire, intradermique et intracérébrale sous anesthésie générale d’environ une heure avec analgésie; orale sur animaux vigiles (acte bref d’une minute environ); sous cutanée et intrapéritonéale sur animal anesthésié ou vigile (acte bref d’une minute sur animal vigile, anesthésie d’environ une heure sinon); injection intraportale ou par minipompe (intraveineuse, sous cutanée ou intrapéritonéale) posée lors d’une chirurgie sous anesthésie générale avec analgésie au préalable (chirurgie d’environ 15 minutes, anesthésie d’environ une heure). Les implants pourront être retirés au plus tôt une semaine plus tard (chirurgie d’environ 15 minutes, anesthésie d’environ une heure). Des administrations intravésicales (par cystocentèse ou cathéter) pourront être réalisées (anesthésie générale de moins d’une heure) après privation d’eau sur maximum 4h et vidange de la vessie par pression légère sur le ventre. Pour les administrations orales et oro-gastriques où l’alimentation pourrait biaiser la pharmacocinétique, les animaux pourront être mis à jeun au maximum 16h. Ils seront pesés avant et après le jeûne. Les volumes administrés et les fréquences d’administration respecteront les recommandations de la SBEA. La phase in vivo pourra durer jusqu’à 12 mois dans le cas de composés froids et 2 mois pour les composés radiomarqués. Des prélèvements de sang ou d’urine pourront être réalisés. Les prélèvements de sang sur animal vigile prendront environ deux minutes. En cas d’anesthésie, celle-ci durera au maximum une heure. Pour les prélèvements individuels d’urine et/ou de fèces, il pourra être nécessaire d’héberger individuellement les animaux en cages, sans enrichissement. En fin de projet, la plupart des animaux seront euthanasiés pour récupération des tissus, organes, et du sang. Avant euthanasie, sous anesthésie générale profonde avec analgésie, une perfusion pourra être réalisée pour rincer les organes. Cela durera moins d’une heure avant euthanasie. Dans le cas particulier d’animaux ayant subi une administration unique de produit non radioactif et ayant été gardés en procédure au maximum une semaine, ils pourront être gardés en vie sur avis du vétérinaire.

Impact sur les animaux

Dans le cas de phénotypes dommageables, celui-ci n’affectera pas le bien-être animal, bien que les animaux pourraient boire plus d’eau et/ou être obèses. Il ne peut toutefois pas être exclu que les composés administrés causent de la toxicité (diarrhée, perte de poids, douleur, signes neurologiques), ce qui sera surveillée. Une douleur transitoire modérée pourrait être générée par les chirurgies. Un stress de courte durée et une douleur légère sera générée par les administrations de produit. Les mises à jeun pourraient générer un stress léger et une déshydratation légère.

Devenir

Les animaux seront la plupart du temps mis à mort afin de pouvoir procéder à la récupération des organes et de grands volumes de sang, nécessaires pour évaluer l’effet des composés testés. Les animaux ayant reçu une administration unique de composé non radioactif et étant restés en procédure moins d’une semaine pourront être gardés en vie pour réutilisation.

Remplacement

Les molécules chimiques ou biologiques dont la pharmacocinétique sera évaluée dans ce projet auront été si possible au préalable sélectionnées dans des tests in vitro (tests sur hépatocytes, microsomes etc) afin de s’assurer de leur efficacité, de leur spécificité et de leur absence de toxicité. Ces données sont souvent insuffisantes pour prédire la biodistribution in vivo des molécules. La pharmacocinétique réelle des meilleures molécules devra donc être vérifiée chez le rongeur en choisissant le modèle animal.

Réduction

Le nombre d’animaux par lot a été déterminé sur la base des expériences passées dans notre centre, pour choisir le nombre minimum permettant d’obtenir une puissance statistique suffisante pour conclure. Dans le cas de prélèvements terminaux à différents points de temps (collecte d’organes/tissus, ex collecte de peau à plusieurs points de temps), un groupe d’animaux devra être inclus pour chaque point de temps. Dans le cas de screening de nouvelles molécules, au maximum 5 animaux par groupes seront inclus. Le nombre sera adapté en fonction de la variabilité attendue de la pharmacocinétique du composé. Dans le cas où la bioanalyse suite aux prélèvements nécessiterait un volume trop important de fluides, le nombre d’animaux devra être augmenté, jusqu’à au maximum 15 animaux. Des analyses statistiques seront réalisées sur les paramètres mesurés.

Raffinement

Les animaux seront pesés au minimum 2 fois par semaine : A partir de 10% de perte du poids, les animaux seront pesés quotidiennement des capsules d’eau gélifiées seront mises à disposition dans les cages. De plus, les animaux seront réhydratés une fois par jour avec avec du Ringer Lactate. Une perte de poids de plus de 15% ou se maintenant plus de 3 jours au-delà de 10% constituera un point limite. En cas de suspicion de toxicité du composé chimique ou biologique administré, un arbre décisionnel validé par la SBEA sera utilisé pour décider de l’arrêt du traitement, de traitements de support et/ou de l’euthanasie de l’animal. Pour évaluer d’une façon sensible l’état de souffrance, les expérimentateurs seront formés pour reconnaître ces signes. Les poses et retraits d’implants seront réalisées sous anesthésie générale avec analgésie pré-, per- et post-opératoire. Il ne sera possible de réaliser qu’une pose et un retrait dans la vie de l’animal. Les voies intracérébrale, intrathécale et intraportale ne pourront être réalisées que maximum une fois dans la vie de l’animal. Les voies chirurgicales et poses et retraits d’implants seront réalisés par du personnel extensivement formé à la technique. Les implants (pose et retrait) ne pourront pas être combinés avec d’autres administrations nécessitant une chirurgie. A la suite de chirurgies, les animaux seront suivis quotidiennement le temps de la cicatrisation de la plaie, des soins locaux seront apportés si nécessaire. La fréquence de changement des litières sera augmentée si nécessaire et de la nourriture sera placée en fond de cage pour faciliter l’alimentation. Le comportement des animaux sera surveillé pour évaluer la nécessité de mettre en place une collerette. Les administrations IM et ID seront réalisées après administration d’un analgésique. Les administrations oro-gastriques via un dispositif de gélules ne pourront être réalisées uniquement sur des rats de plus de 150g et les animaux devront être anesthésiés. Ces administrations pourront être pratiquées à une fréquence maximale d’une fois par jour avec le matériel adapté à la taille de l’animal. De plus, un lubrifiant inerte devra être utilisé afin de faciliter le passage de la canule dans l’œsophage. Les variations de poids seront enregistrées quotidiennement à la suite des administrations oro-gastriques. Les perfusions IV de plus de 15 minutes et de 30 minutes maximum devront être réalisées sur des animaux anesthésiés.

Choix des espèces

Si le profil pharmacocinétique in vitro est adéquat dans cette espèce, la souris sera privilégiée pour évaluer la pharmacocinétique des nouveaux composés in vivo, car c’est l’espèce mammifère la plus décrite dans les modèles d’évaluation de molécules chimiques ou biologiques. La souris sera aussi préférée dans le cas d’une administration d’un composé ou d’un traceur radioactif, si le mécanisme d’action de la molécule le permet, pour des raisons pratiques de gestion de la radioactivité et de ses déchets. Pour certaines études pré-réglementaires comme l’étude de l’élimination d’un composé radiomarqué in vivo, le rat sera l’espèce préférée. Des hamsters et des gerbilles pourront être occasionnellement utilisés si besoin, en cas d’études préalables à la mise en place d’un modèle particulier bien décrit dans ces espèces (exemple : hamster pour une étude préalable à une étude d’infection au SARS-CoV2). Seuls des animaux sevrés seront utilisés (jeunes adultes et adultes, 6 semaines minimum), tel que référencé dans la littérature.

Pour tester la fermeture d'un tympan perforé par des feuillets de cellules cultivées, 24 lapins de deux mois sont utilisés dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, tous tués pour les prélèvements. Chaque animal subit d'abord une perforation totale du tympan sous anesthésie générale, puis un mois d'attente destiné à vérifier que la perforation ne se referme pas d'elle-même, puis une reconstruction chirurgicale d'une heure. Les deux oreilles sont opérées, ce qui porte à 48 le nombre d'oreilles incluses et permet au porteur d'annoncer une réduction du nombre d'animaux. Quatre de ces oreilles sont perforées puis laissées telles quelles, sans aucune tentative de reconstruction.

Objectifs

La tympanoplastie est le terme communément utilisé pour désigner la chirurgie de la perforation tympanique. Les causes sont multiples et la chirurgie vise à fermer cette perforation pour éviter les surinfections, faciliter l’appareillage auditif, améliorer l’audition lorsqu’elle est atteinte et prévenir la migration épidermique dans l’oreille moyenne à partir des berges de la perforation. C’est également le geste technique clé de reconstruction après l’exérèse d’un cholestéatome de l’oreille moyenne, afin d’éviter une récidive secondaire. Ce travail se base sur l’ingénierie tissulaire qui regroupe l’ensemble des techniques permettant la génération de substituts tissulaires ex vivo. Plus précisément, c’est ici la technique des feuillets cellulaires, issue de l’ingénierie tissulaire, qui va être utilisée dans cette étude. Celle-ci combine l’utilisation de cellules progénitrices provenant du périchondre auriculaire et l’induction de la différenciation chondrogénique par des facteurs de croissance présents dans le milieu de culture. Le projet de recherche va donc s’articuler autour de la réalisation d’une tympanoplastie, après perforation tympanique induite chez le lapin, par l’utilisation de feuillets cellulaires en superposition. On cherchera alors à évaluer la qualité de fermeture de la perforation par l’étude de son aspect macroscopique, de son intégration immunohistochimique ainsi que par sa capacité vibratoire. L’objectif principal de l’étude va donc être axé sur la réalisation d’une tympanoplastie chez le modèle animal (ici le lapin) à partir de la superposition de feuillets cellulaires en multicouche (MLCS), après perforation tympanique induite. Le but sera alors d’étudier la qualité de cette fermeture par superposition de feuillets cellulaires comparativement à une tympanoplastie standard utilisant du cartilage auriculaire et de l’aponévrose temporale. Les critères d’évaluation seront alors : la fermeture complète, partielle ou inexistante de la perforation tympanique, l’intégration immunohistochimique de la greffe avec le tympan restant, les capacités vibratoires du tympan avant et après tympanoplastie et la survenue de surinfections après le geste. Les perspectives pourront être une application in vivo chez l’homme, dans le cadre de fermetures tympaniques simples ou de reconstruction après exérèse de cholestéatome. Cette dernière constituant un enjeu important, étant donné le risque élevé de récidive de cette pathologie.

Bénéfices attendus

L’objectif principal de l’étude s’attachera à vérifier la fermeture ou non de cette perforation à l’aide de cette greffe tympanique faite à partir des feuillets cellulaires. Nous pourrons ensuite évaluer la qualité de fermeture de la perforation selon le nombre de feuillets utilisés ou le type de cellule à l’origine du feuillet. Les critères secondaires pourront être : - L’étude immunohistochimique de l’intégration du feuillet sur le tympan du lapin - La mesure de la vibration tympanique. Les perspectives de l’étude seraient une potentielle application chez l’homme pour la fermeture de perforations tympaniques. On peut imaginer qu’il serait intéressant de pouvoir refermer une perforation tympanique sur oreille saine avec une superposition de feuillets cellulaires dont l’épaisseur est la plus fine possible. Ceci visant alors à reproduire une structure la plus proche possible du tympan initial. A contrario, la reconstruction tympanique après exérèse de cholestéatome nécessite une certaine résistance afin d’éviter les récidives et donc une superposition de feuillets cellulaires avec une épaisseur plus importante. La création de ces substituts cartilagineux pourrait trouver notamment un bénéfice non négligeable pour les patients ayant subi de multiples récidives de cholestéatome et dont la réserve cartilagineuse (conque, tragus...) commencerait à s’épuiser. Par ailleurs, le degré de transparence de ces feuillets pourrait faciliter la surveillance clinique des patients opérés d’un cholestéatome. Les perspectives d’application de ces feuillets cellulaires s’étendent évidemment au-delà du domaine de l’otologie. On pourrait alors envisager également une application future en rhinologie pour la greffe cartilagineuse des rhino septoplasties. D’autres études seront alors nécessaires.

Procédures

Le but de l’étude est d’induire une perforation sur des tympans de lapins puis de procéder à une reconstruction tympanique par des feuillets cellulaires. Au total, 24 lapins seront sujet à une perforation tympanique totale (chirurgie rapide pratiquée sous anesthésie générale et durant environ 20 minutes). On attendrait alors un délai minimal de 1 mois avant de réaliser la tympanoplastie, dans le but de vérifier l’absence de cicatrisation spontanée du tympan. L'intervention se déroule également sous anesthésie générale et dure environ 1 heure. Une mesure de la vibration du tympan est effectuée par tympanométrie, qui est un test complètement indolore, durant quelques secondes et ne necessitant pas de contention ou de sédation. Il consiste en l'introduction d'une sonde au niveau du conduit auditif du lapin durant la mesure.

Impact sur les animaux

Les procédures chirurgicales sont pratiquées sous anesthésie générale afin de limiter au maximum le stress et la douleur chez les animaux. Il existe des risques d'infection liés à la chirurgie pouvant mimer une otite. Ceux-ci seront limités par la détersion des zones cibles. Une antibiothérapie locale et générale sera administrée si elle devait survenir.

Devenir

Les lapins seront mis à mort afin de pratiquer les prélèvements.

Remplacement

Les études de développement de nouvelles techniques chirurgicales pour la tympanoplastie exigent l’utilisation de modèles pour leur validation préclinique avant l’utilisation en routine clinique. Le modèle animal qui correspond le mieux avant un potentiel essai clinique dans des études sur le tympan qui soit le plus similaire possible à l’homme est le lapin. Sa taille et positionnement du tympan permet d’étudier la tympanoplastie de façon similaire à celle de l’homme. De plus, le prélèvement des cellules progénitrices provenant du périchondre auriculaire est bien connu du laboratoire et permet d’éviter les rejets cellulaires. La culture cellulaire postérieure est également maitrisée. L’utilisation de feuillets cellulaires pour cette tympanoplastie prévoit de mesurer entre autres la vibration tympanique, un modèle in-vitro est donc inenvisageable dans ce cas.

Réduction

Le nombre d'animaux utilisés dans ce projet est basé sur des données antérieures, sur des données de la littérature et sur l'utilisation de tests de puissance statistique. Les mesures réalisées se font sur les deux oreilles incluant des contrôles, réduisant ainsi le biais possible et le nombre final d'animaux à utiliser. Ainsi nous prévoyons d’utiliser un premier lapin pourvoyeur de cellules progénitrices pour preparer les feuillets en amont et une expérimentation comprenant 24 lapins ( 48 oreilles, cf description plus haut). Ces derniers subiront ou pas une perforation tympanique et une reconstruction selon le schéma suivant, 1 mois plus tard : 10 oreilles (perforation + greffe d’une superposition de 4 feuillets cellulaires), 10 (perforation + greffe de 2 feuillets cellulaires), 10 (perforation et greffe d’un feuillet cellulaire constitué à partir d’un autre type cellulaire), 10 (perforation + greffe cartilagineuse et aponévrose temporale), 4 (perforation sans intervention) et 4 (groupe contrôle, pas de perforation induite. Nous avons considéré que le nombre de 10 oreilles était un minimum pour obtenir des résultas exploitables d’un point de vue statistique.

Raffinement

Le bien-être des animaux est pris en charge dès leur arrivée. Une personne habituée au travail avec les lapins est en charge de leur réception et surveillance quotidienne. Les conditions d'habituation et d'hébergement sont prévues pour assurer un maximum le bien-être des animaux. Les animaux seront hébergés ensemble au cours du projet. Une acclimatation à l'animalerie sera faite à l'arrivée des animaux depuis le site du fournisseur. Hébergement, enrichissement et alimentation seront adaptés pour limiter les comportements anormaux avec un suivi journalier des comportements individuels et alimentaires ainsi que des interactions sociales. Nous prévoyons l'installation des lapins en batteries d'hébergement avec enrichissements mais également la sortie quotidienne en parc afin de garantir une surface plus grande avec un enrichissement supplémentaire et la possibilité de réaliser de l'exercice à souhait. Ce type d'hébergement mixte batterie / sol avec de la paille permet d'avoir les lapins plus détendus. La personne en charge de leur bien-être a une grande habitude des lapins, et s'occupera de les suivre tous les jours. De plus, une période d'habituation est prévue afin de permettre aux lapins de prendre connaissance avec la cage de contention et de s'y rendre plus facilement. Des caresses et récompenses aident à cette habituation qui durera minimum une semaine. Les gestes techniques nécessaires à l'étude sont bien réfléchis et le timing prévu au plus réel afin de ne pas avoir des temps de latence qui imposeraient une contention ni une anesthésie plus longue que le strict minimum. Des récompenses sont également prévues à la fin de chaque expérience. Les manipulations des animaux seront faites par du personnel formé, expérimenté et avec du matériel adapté. L'observation des groupes sera faite et des scores de bien-être sont prévus pour chacune des procédures. Des points limites ont été définis pour chaque procédure.

Choix des espèces

Notre choix s’est porté sur le lapin pour i) c’est l’espèce gold standard utilisée pour la réalisation de tympanoplastie selon les données de la littérature iI) la question de taille du tympan pour pouvoir réaliser les chirurgies aisément, et iii) parce que nous avons l’habitude de ce modèle animal ayant déjà eu une première expérimentation sur l’otopoïèse. Aussi, l’anatomie de son oreille moyenne et la taille de la membrane tympanique et de l’oreille externe chez le lapin seraient adaptées à nos procédures expérimentales. Lapins d’environ 6-8 semaines à l'arrivée au laboratoire, donc environ 2 mois au moment des observations. Ils ont l’oreille déjà développée et sont assez légers et moins grands pour les garder en observation le temps des expériences.