Procédures modérées
Evaluation de l’efficacité de traitements par radiothérapie interne vectorisée chez la souris porteuse de tumeur EU 2/2
- Recherche appliquée
- Cancers
Jusqu'à six séances d'imagerie sous anesthésie de cinquante-cinq minutes, une irradiation du corps entier et deux injections intraveineuses par semaine sur trois semaines : 5 490 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. Une partie reçoit une greffe de cellules ou de fragments tumoraux sous la peau ou dans la graisse mammaire, avec des nécroses et une perte de poids possibles, et les femelles des modèles hormonodépendants peuvent être mises sous estradiol au risque de calculs rénaux. L'objet est d'évaluer l'efficacité antitumorale de traitements par radiothérapie interne vectorisée et de mesurer les doses de radioactivité reçues par la tumeur comme par les organes sains, pour les extrapoler ensuite à l'être humain. Le porteur retient la souris parce que son génome est connu, que la prise tumorale est homogène sur un fond génétique stable et qu'elle est compatible avec les appareils d'imagerie du laboratoire, proches de ceux de la clinique.
Objectifs
Le cancer est désormais la première cause de mortalité dans les pays développés, devant les pathologies cardiovasculaires. Dans ce contexte, l’objectif de nos projets est le développement de nouvelles thérapies utilisant la radiothérapie interne vectorisée (RIV). Cette dernière repose sur le principe suivant : « attacher » une molécule radioactive à une molécule biologique qui joue le rôle de transporteur et va reconnaitre spécifiquement les cellules tumorales. Pour la thérapie, on utilise de la radioactivité Beta- ou Alpha qui est très vite arrêtée par la matière mais possède une grande énergie. Elle va ainsi détruire les cellules à proximité immédiate de l’endroit où elle est transportée. Pour que le traitement par RIV soit efficace, il faut d’abord s’assurer qu’il se lie bien aux cellules tumorales, c’est pourquoi le développement de ces nouveaux traitements est souvent associé au développement d’un examen diagnostique (qui fait l’objet d’une autre DAP). Il est également nécessaire de bien valider que le traitement ne va pas se fixer et endommager les organes sains et qu’il exerce une action antitumorale. Nos objectifs sont donc doubles : * Evaluer l’efficacité antitumorale de traitements RIV visant la même cible. * Evaluer précisément les doses de radioactivité reçues à la tumeur mais également aux autres organes pour les extrapoler à l’homme lors de travaux nommés études dosimétriques afin de s’assurer que le traitement sera efficace sur la tumeur et sans danger sur les organes sains. Ce projet est un projet multisite entre deux Etablissements Utilisateurs différents.
Bénéfices attendus
Notre projet permettra de caractériser précisément des nouveaux composés de RIV pour proposer un traitement parfaitement personnalisé aux patients en utilisant la radiothérapie interne vectorisée, modalité thérapeutique actuellement en plein essor.
Procédures
*Induction tumorale : Sous anesthésie
Impact sur les animaux
- Certaines souris seront immunodéficientes et pourraient développer des pathologies du fait de leur manque de défenses immunitaires si elles n’étaient pas hébergées dans des conditions sanitaires protégées. - L’irradiation corps entier chez certains animaux va éliminer les défenses immunitaires et fragiliser l’animal qui pourrait développer des infections s’il n’était pas maintenu sous des conditions sanitaires protégées. - L’implantation sous cutanée ou dans la graisse mammaire de cellules tumorales ou des fragments de tumeurs va mener à une masse sous cutanée qui pourrait si elle est menée trop loin, gêner l’animal dans ses mouvements et impacter son état général. De plus, des nécroses peuvent apparaitre. Il est aussi possible, que la progression tumorale entraîne une cachexie constatée par une perte de poids. - Pour les études sur modèles hormonodépendants, les animaux pourront être mis sous estradiol qui peut induire des calculs rénaux. - Afin d’observer des effets de composé sur l’évolution de la tumeur, les animaux recevront des traitements de composés dans différents schémas d’administration qui pourront induire un stress léger. - La contention des souris pour manipulation lors de la mesure de la taille des tumeurs et de la mise sous anesthésie pourrait provoquer un léger stress. - A la randomisation, les animaux seront potentiellement mis avec de nouveaux congénères. Cette nouvelle organisation sociale pourra engendrer un stress de 1 à 2 jours. - L’injection intraveineuse pourrait également provoquer un léger inconfort et des lésions locales. - Les produits administrés pour la thérapie peuvent provoquer une perte de poids transitoire.
Devenir
Différentes mesures de radioactivité et analyses complémentaires réalisées sur les organes prélevés post-mortem sont nécessaires pour atteindre les objectifs scientifiques de nos études. La totalité des animaux seront donc euthanasiés en fin d’étude.
Remplacement
Pour étudier le devenir d’une molécule dans l’organisme et évaluer l’efficacité d’un traitement anticancéreux, il n’est pas possible de se passer d’un organisme entier avec ses fonctions physiologiques intactes et donc d’études sur animaux. Des études préliminaires réalisées in vitro nous permettrons néanmoins de valider que la molécule étudiée atteint bien sa cible et que le traitement envisagé est bien efficace sur la lignée étudiée.
Réduction
Une sélection des composés avec la meilleure activité sera réalisée in vitro en amont de toute utilisation in vivo et permettra de réduire le nombre d’animaux nécessaire à son strict minimum. L’effectif d’animaux dans les groupes expérimentaux a été adapté pour chaque type d’étude afin de mener à des résultats scientifiquement pertinents tout en réduisant l’effectif à son maximum. Par expérience, les groupes de n=10 souris sont suffisamment robustes pour les études d’efficacité pour prendre en compte les variabilités de réponse au traitement et de pousse tumorale sur le long terme. Enfin, les 1ères données obtenues sur les études dosimétriques permettent d’optimiser les groupes avec n=7 souris pour s’assurer l’obtention de résultats interprétables. Enfin, la bonne connaissance de la pousse tumorale pour chaque modèle, permet d’optimiser le nombre d’animaux pour chaque étude et d’implanter uniquement le nombre d’animaux nécessaires pour obtenir des groupes porteurs de tumeurs de tailles homogènes.
Raffinement
La majorité des procédures (injection intraveineuse, intratumorale, et imagerie) est réalisée sous anesthésie sur lit / plaque chauffant(e) réduisant l’inconfort potentiel à son minimum et permettant ainsi le raffinement de l’étude. La fréquence de mesure des volumes tumoraux sera adaptée à la vitesse de croissance du modèle. La fréquence de pesée des animaux sera adaptée à leur état général. Les animaux sont observés quotidiennement. Les expérimentateurs sont formés pour reconnaître tout signe de souffrance. La SBEA (Structure chargée du Bien Être des Animaux) de l’établissement a mis en place une grille détaillée de suivi des animaux et identification des signes de douleur / souffrance permettant d’identifier au plus tôt les signes et de les prendre en charge. Les animaux seront hébergés par groupes de 2 à 10 individus en fonction de la taille des cages et du nombre d’animaux par groupes. L’eau et la nourriture seront données ad libitum. Au minimum une sorte d’enrichissement sera placé dans chaque cage (sizzle-dry ou tubes en polycarbonate ou bâton de bois). La greffe de tumeur est réalisée sous anesthésie générale gazeuse. Lorsque l’implantation nécessite l’incision de la peau (cas de l’implantation des fragments de tumeurs ou dans la graisse mammaire), la chirurgie est réalisée de façon aseptique et les animaux reçoivent une injection de buprénorphine, des soins opératoires (maintien de la température), surveillance post opératoire et soins post opératoires adaptés si nécessaires. Le transport vers la plateforme d’irradiation sera réalisé par un transporteur agréé, et le trajet ne dépassera pas 2h. Les animaux seront irradiés directement dans leur cage et leur environnement (cage, litière, enrichissement et nourriture) ne sera pas modifié. Les biberons seront remplacés par de l’eau gélifiée déposée dans leur cage. A leur retour dans l’animalerie, les animaux seront changés de cages. Les animaux seront transportés par un transporteur agréé de l’EU1 vers l’EU2 (environ 1km de trajet) dans des cages avec litière, enrichissement et nourriture. Les biberons seront remplacés par de l’eau gélifiée déposée dans leur cage. A leur arrivée dans l’animalerie de l’EU2, les animaux seront changés de cages.
Choix des espèces
Les souris constituent un modèle de choix en pharmacologie car leurs génomes sont connus et leurs grandes fonctions physiologiques sont comparables à l’Homme (fonction rénale, hépatique). Enfin, elles sont compatibles avec nos systèmes d’imagerie utilisés pour la caractérisation préalable des traceurs eux-mêmes très proches des appareillages d'imagerie, facilitant par là même le transfert à la clinique (recherche translationnelle). Du point de vue scientifique, la souris reste le modèle de choix dans les études d’oncologie. La prise tumorale dans des souris avec un fond génétique stable est homogène permettant une assez bonne reproductibilité. Les animaux seront utilisés à l’âge adulte (7-8 semaines lors de leur première manipulation). Toutefois, ils pourraient être reçus à partir de 5 semaines mais ne seront pas manipulés avant 7 semaines minimum. Les molécules étudiées ont pour but d’aider le diagnostic ou le traitement de cancers retrouvés chez les patients adultes. Il est donc justifié de travailler sur des animaux adultes possédant des fonctions physiologiques proches de la future cible humaine
Mise en place d’une décompensation spontanée de la cirrhose et d’un modèle d’ACLF suite à une induction de la cirrhose par un agent hépatotoxique et d’un désordre métabolique.
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
Jusqu'à 44 administrations d'un produit toxique pour le foie, deux fois par semaine pendant 22 semaines, par gavage ou par injection dans l'abdomen : c'est ce que subissent des rats arrivés au laboratoire à quatre semaines, pour reproduire une cirrhose puis sa décompensation aiguë. 8 140 rats sont concernés, dont 4 200 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, et tous sont tués à l'issue. Le porteur annonce des animaux en état de choc et en détresse cardio-respiratoire dans les heures qui suivent l'induction, écarte l'analgésie au motif qu'elle introduirait un biais, et écrit viser une gravité "jugée sévère mais qui permette de maintenir des animaux dans un état acceptable du point de vue éthique". Dans les études de survie, le délai jusqu'à la mort compte comme donnée, et c'est l'atteinte du point d'arrêt anticipé qui vaut déclaration de la mort de l'animal.
Objectifs
Ce projet s’inscrit dans le cadre d’un programme de recherche destiné à identifier de nouvelles molécules permettant de traiter la cirrhose à stade très avancé ou une ACLF (acronyme d’Acute on Chronique liver Failure ou décompensation aiguë de la cirrhose) La cirrhose se définit par l'accumulation excessive de fibrose conduisant à la dégénérescence du foie.
Bénéfices attendus
Le pronostic des patients cirrhotiques est variable en fonction de la cause et de son contrôle et de la présence de décompensations. L’ascite réfractaire survient chez 5-10 % des patients cirrhotiques, avec un taux de mortalité de plus de 50 % à 2 ans. Souvent, elle s’associe à d’autres complications comme l’infection spontanée du liquide d’ascite. Lors de la phase terminale de cette décompensation et suivant la qualité de vie du patient, l’espérance de survie en dehors d’une transplantation hépatique n’est que de quelques mois. Dans le cadre de l’ACLF, il est nécessaire de prendre en charge les patients pour des défaillances multiples et de préserver le capitale hépatocitaire des patients. La perte de fonctionnalité du foie durant cette période conduit à un décès du patient de façon précoce. Les traitements actuels sont purement symptomatiques et ne visent qu’à limiter les risques liés à l’hypertension portale, les surinfections, les risques d’hémorragie ou au contraire de thrombose et sont proposés au cas par cas, ce de manière à préserver les chances d’éligibilité à la transplantation. Les solutions thérapeutiques que nous espérons développer visent à agir sur les différents mécanismes conduisant à une réfractarité de l’ascite, la perméabilité de la paroi intestinale et les productions d’ammoniaque à l’origine de l’encéphalopathie pour la décompensation traditionnelle. Elles visent à agir sur les différentes voies à l’origine de la défaillance multiple (inflammation, immunitaire, métabolique et vasculaire) dans le cadre de l’ACLF.
Procédures
Période d’induction : Décompensation spontanée selon les procédures : Jusqu’à 44 administrations par gavage ou par administration intrapéritonéale de composé chimique hépatotoxique, à raison de 2 fois par semaines pendant 22 semaines (15 secondes) ou jusqu’à 44 administrations par administration intrapéritonéale de composé chimique hépatotoxique à raison de 2 fois par semaines pendant 22 semaines (15 secondes). Sur les procédures de caractérisation de chacun des agents inducteurs (procédure 1 et 2), les animaux pourront subir jusqu’à 6 prélèvements de sang à la veine sublinguale intermédiaire (1 minute) sous anesthésie (3minutes). En dehors de ces deux procédures, les animaux subiront un prélèvement de sang intermédiaire à la veine sublinguale intermédiaire (1 minute) sous anesthésie (3minutes). Pour les études de type ACLF, les animaux subiront une administration intrapéritonéale, par voie intraveineuse ou par gavage des agents inducteurs (15 secondes). Pour les études avec test de composés, en dehors de la phase d’induction de la cirrhose et de l’ACLF, les animaux pourront subir jusqu’à 10 administrations par gavage, voie intrapéritonéale ou intraveineuse (15 secondes). Dans certains cas, les 4 administrations avec un volume plus important en intrapéritonéale se fera sous anesthésie (durée 1 minute), avec 4 drainages du dialysat à raison d’une fois par jour (15 minutes) sous anesthésie générale. L’administration intraveineuse pourra être faite par infusion lente à l'aide d'un perfuseur (durée 120 minutes).
Impact sur les animaux
L’induction de la fibrose n’induit pas de douleur mais un inconfort et un stress passager lié à la contention nécessaire pour le gavage ou l’administration intrapéritonéale des agents, l’habituation au geste estompe rapidement ce stress. La gêne est présente mais pas accompagnée d’une analgésie chez l’humain. Les animaux présentant de l’ascite semblent présenter des signes de gêne de posture lorsque celle-ci est abondante sans pour autant présenter des signes de douleurs (grimace scale). L’administration massive d’alcool produisent les effets d’une ivresse importante (perte d’équilibre, ataxie). L’ACLF est un épisode grave chez le patient dont le pronostic vital est engagé. Le modèle animal présente, par voie de conséquence, lors de l’induction de l’ACLF des signes d’inconfort manifestes. L’administration unique ou répétée des agents inflammatoires ont des effets notoires sur les animaux dans les heures qui suivent les inductions. On s’attend à observer des animaux en état de choc et de détresse cardio-respiratoire, avec des épisodes de troubles de la régulation de la température corporelle. Les effets cités sont observés de manière plus ou moins prononcée, ces signes constituent les critères d’atteinte des points limites. Certains animaux présenteront ces symptômes à des stades qui nécessiteront un point d’arrêt anticipé. Dans les situations d’études de survie où le délai jusqu’à la mort est une donnée clé de la procédure, le recours au point d’arrêt anticipé sera appliqué et c’est à ce moment précis que sera déclarée la mort de l’animal. Pour évaluer les effets de nos composés, nous nous fixons comme objectif de reproduire une gravité qui sera jugée sévère mais qui permette de maintenir des animaux dans un état acceptable du point de vue éthique et conservant toute pertinence scientifique.
Devenir
L'intégralité des animaux sera mis à mort à l'issue des procédure afin de pouvoir étudier les biomarqueurs circulant, histologique ou transcriptionnelle permettant de caractériser la pathologie et l'efficacité d'une molécule.
Remplacement
La possibilité de disposer d’un modèle animal qui permet d’évaluer les effets des nouveaux composés sur tous les aspects d'une pathologie présente chez l’homme constitue une étape clé dans la lutte contre ces maladies et font de nos modèles des outils translationnels très pertinents. Bien qu'une première phase de sélection des meilleurs composés soit effectuée sur des modèles acellulaires ou cellulaires, contribuant ainsi à l’utilisation de méthodes alternatives visant à remplacer partiellement l’utilisation des animaux comme nous le rappelle la règle des 3R’s, l’évaluation finale du potentiel thérapeutique des produits dans des modèles animaux reste cependant nécessaire. Les pathologies étudiées étant multi-organes, le recours à l'emploi d’un animal vivant permet d’évaluer la réelle efficacité des composés dans un système biologique complexe et « global », capable de métaboliser les principes actifs donc de déceler les effets secondaires, capable d'activer toutes les voies de signalisation qui participent à la caractérisation de ce modèle. Son remplacement à ce stade du projet scientifique (phase pré clinique) n'est pas envisageable dans un système biologique isolé ou cellulaire qui quel que soit sa nature ne pourra apporter tous les enseignements issus de l'expérimentation in vivo.
Réduction
La stratégie de réduction consiste à ne réaliser que les essais avec les composés les plus prometteurs ayant satisfait aux étapes de sélection préliminaires in vitro. La réduction du nombre d'animaux est motivée par la longueur/lourdeur des procédures expérimentales, cela nous a conduit lors d'essais pilotes ou préliminaires de cibler le juste nombre d'individus nécessaires à l'obtention de résultats pertinents. Les paramètres que nous étudions in vivo (bio marqueurs, induction/répression de gènes, effets histologiques etc) doivent être relevant. Ces études pilotes nous permettront de caractériser et d’écarter les paramètres dont la pertinence serait trop faible pour être statistiquement décelable qu'avec des effectifs trop importants. Nous disposons de données expérimentales ou publiées dans la littérature sur les paramètres biologiques ou biomarqueurs les plus pertinents et "robustes". La connaissance de la variance de ces biomarqueurs permet de définir un effectif théorique à l'aide d’un test statistique qui associe variance et probabilité d'atteinte d'un seuil de significativité. Cette approche statistique permet d'affiner les effectifs et de réduire donc les nombres d'animaux qui seraient surévalués et non nécessaires à l'obtention d'un résultat biologique relevant. Une priorité sur le développement sera accès par rapport à la prépondérance observée chez l’homme : infection (LPS), consommation excessive d’alcool et/ou intoxication médicamenteuse (APAP), le développement des autres agents précipitants sera envisagé qu'au cas où ceux-ci ne donneraient pas les résultats escomptés. Dans le cas d’administrations de composés par voie veineuse en aigue ou en répétés, peuvent se présenter des difficultés techniques et nous oblige parfois à augmenter les effectifs de façon à combler les pertes.
Raffinement
Les rats sont hébergés par paire, l’enrichissement du milieu est systématisé par l’apport de dispositifs permettant aux animaux de rongeur (blocs ou billes des bois), un apport de coton compressé permet de maintenir l’instinct de création du nid, des tunnels en polycarbonate transparent teintés en rouge sont placés dans les cages pour apporter un espace simulant la dissimulation et favorisant le maintien de l’instinct grégaire des rats. Nous avons opté pour la pose de cathéters qui offrent un accès à l’aide d’un bouton métallique bouché par un obturateur aimanté qui présente l’avantage de pouvoir faire cohabiter les animaux dans une même cage sans crainte d’arrachage du cathéter par les congénères, cela constitue une amélioration significative du bien-être des animaux. L'établissement de points limites dans ce modèle expérimental de défaillance hépatique nous permet d'écarter tout individu susceptible de subir un inconfort trop important ou de la douleur. Bien conscient que nous développons dans ce projet des modèles sévères, nous nous efforçons d'avoir recours à des moyens analgésiques adaptés et non confondants. La pathologie et les mécanismes qui la déclenchent sont en partie connus, l'emballement inflammatoire en est une composante, le recours à des moyens de lutte contre la douleur peut introduire un biais expérimental ; une étape de validation s’impose pour chaque situation.
Choix des espèces
Sur la base de la littérature scientifique, aucun modèle invertébré ne permet à ce jour dans le cadre de la cirrhose du foie de valider l’efficacité d’une nouvelle molécule dans le traitement de cette pathologie ou celles qui lui sont associées. Le génome des rongeurs et celui de l'homme ont 90% d’homologie, cela en fait un modèle de choix dans les études pharmacologiques. Le choix de l'espèce rat a été fait en se basant sur la littérature scientifique et sur nos connaissances des caractéristiques des molécules à tester. Pour les études menées sur les rats avec une présensibilisation au phénobarbital et induction au composé hépatotoxique, nous utiliserons des animaux de 4 semaines à l'arrivée (75-100 gr) âge préconisé dans la littérature, c’est en effet lorsque les rats ont atteint un poids de 100gr environ que l'effet du phénobarbital est le plus efficace. L'ensemble des autres études (sans présensibilisation au phénobarbital) sera réalisé sur de jeunes adultes, à savoir 6 à 7 semaines (250 à 300 g) à l'arrivée. Les traitements induits aux animaux affectent essentiellement la fonction hépatique et produisent des modifications métaboliques. Il est nécessaire de les appliquer sur un organisme développé, qui puisse mettre en place des mécanismes de réparation et de défense. L’animal au stade de jeune adulte qui a un système immunitaire compétent (microbiote bien établi) et des mécanismes de réponse à des stress inflammatoires correspond au stade de vie requis pour développer notre modèle expérimental.
Utilisation du poisson zèbre pour l’étude des métastases EU 2/2
- Recherche fondamentale
- Oncologie
Une partie des poissons zèbres utilisés ici portent un vieillissement accéléré qui les amaigrit et les fait mourir prématurément, d'autres développent des mélanomes. 1 040 individus sont concernés, dont 60 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, et tous sont tués à l'issue. Les embryons reçoivent une injection de cellules tumorales 48 heures après la fécondation, puis passent jusqu'à deux heures par jour sous anesthésie pour être imagés pendant quinze jours, les adultes du troisième groupe étant intubés quatre heures toutes les deux semaines sur une période pouvant atteindre 52 semaines. Le porteur décrit chez les malades des œdèmes, des abcès, une nage dégradée et un éloignement des congénères, et justifie la mise à mort par la nécessité d'éviter que les tumeurs continuent de croître.
Objectifs
Ce projet a pour objectif d'étudier les interactions entre les cellules tumorales circulantes et l'endothélium dans le réseau vasculaire, la sortie des vaisseaux de ces cellules et leur croissance métastatique. Il s'attache notamment à définir la contribution des facteurs sécrétés par les tumeurs et le rôle des cellules non cancéreuses (endothéliales, fibroblastiques et immunitaires) dans ces processus . L'embryon de poisson zèbre permet de visualiser les étapes précoces de la formation des métastases: sortie des vaisseaux sanguins (extravasation), invasion, prolifération dans l'animal vivant. Nous allons comparer le comportement de lignées de cellules tumorales de différentes origines et ayant différentes propriétés biomécaniques et déterminer leurs interactions avec différents composants de la circulation et de la niche métastatique (vaisseaux sanguins, plaquettes, globules rouges, macrophages, neutrophiles etc..). De plus, nous comptons évaluer le rôle de facteurs secrétés par les cellules tumorales, en particulier les vésicules extracellulaires, dans ces processus. Finalement nous allons déterminer si ces processus se déroulent de la même manière chez des poissons jeunes et chez des poissons ayant un vieillissement accéléré. Le projet se déroule dans deux établissements utilisateurs.
Bénéfices attendus
L'objectif principal de ce projet est d'accroitre les connaissances fondamentales sur les étapes précoces de la formation des métastases.
Procédures
Groupe 1: Une injection au stade embryonnaire (48 heures après fécondation). Durée 10 secondes (EU1). Imagerie non invasive au maximum une fois par jour (EU1). Durée 1 à 2h, sous anésthésie. pendant 15 jours. Groupe 2: Deux injections au stade embryonnaire (48 heures après fécondation) (EU1). Durée 10 secondes chacune. Imagerie non invasive au maximum une fois par jour (EU1). Durée 1 à 2h, sous anésthésie. pendant 15 jours. Groupe 3 Une injection au stade embryonnaire (au stade une cellule) (EU1). Durée 10 secondes. Photographie une fois par semaine au maximum (EU1), sous anésthésie. Imagerie par microscopie sous intubation avec anésthésie et analgésie, jusqu'à une fois toutes les deux semaines (EU2). Durée 4 heures. De 8 à 52 semaines maximum. Groupes 4 et 5: prélèvements d'un petit morceau de nageoire sur animaux anésthésiés pour génotypage (EU1).
Impact sur les animaux
Chez l'embryon ou la larves, on peut observer un retard de développement suite à l'injection, mais cela reste très rare. Les larves de moins de 15 jours peuvent souffrir de l'isolement. Chez l'adulte, la formation de mélanomes peut entrainer des changements de comportement généralement associés au stress ou à une maladie. Ceux-ci comprennent : une diminution de la qualité de la nage (moins droite et régulière, moins rapide), la formation d'abcès ou d'oedèmes, des difficultés de respiration (visibles par un rythme anormal de dilatation des branchies) ou de prise de nourriture. Les animaux malades peuvent également s'éloigner de leurs congénères. Le vieillissement accéléré conduit à un amincissement des individus et une mort prématurée.
Devenir
Les animaux seront mis à mort en fin de procédure afin d'effectuer des prélèvements et pour éviter que les tumeurs ne continuent à croître et entrainent plus de nuisances.
Remplacement
Le modèle animal est indispensable à la réalisation de ce projet car il n'existe pas de modèle permettant de reproduire in vitro toute la complexité du microenvironnement entre le moment où la cellule tumorale quitte la circulation envahit un nouveau tissu et le colonise. Néanmoins, certaines étapes ou certaines interactions sont étudiées in vitro. Nous avons par exemple développé un système de microfluidique permettant de reproduire les interactions entre cellules tumorales soumises à un flux et cellules endothéliales. Nous utilisons également un modèle d'invasion en matrice de collagène in vitro, ainsi que des systèmes de co-culture cellules tumorales-cellules immunitaires. Nous utilisons des lignées de cellules tumorales dérivées de mélanome ou de carcinome mammaire.
Réduction
Nous utilisons des systèmes d'imagerie qui permettent un suivi longitudinal d’un même animal et donc une réduction du nombre total d’animaux nécessaires. Une étude exhaustive des données récentes de la littérature n'a pas permis d'identifier une équipe réalisant des expériences similaires ailleurs dans le monde. Nous avons établi le nombre d'animaux pour obtenir des résultats statistiquement fiables et robustes.
Raffinement
Des points limites ont été établis pour éviter toute souffrance animale. Un traitement analgésique et anesthésique est prévu avant imagerie des adultes. Les larves en procédure seront hébergés individuellement pour permettre leur suivi longitudinal. Les adultes en procédure seront hébergées en groupe de 10 à 20 pour conserver les interactions sociales essentielles à leur bien être. Les aquariums, en particulier lorsque les larves sont isolées, sont enrichis avec des fonds imprimés représentant des cailloux de rivières. Certains adultes sont isolés pendant 12h pour vérifier qu'ils récupèrent bien des séances d'imagerie. Dans ce cas, ils sont hébergés par 2, mais séparés par une vitre pour leur permettre de maintenir un contact visuel et réduire leur stress. Lors de leur transport, les animaux sont conservés dans leur eau d'origine et une fois arrivés sur place un temps de récupération est prévu.De plus larves et adultes seront nourris quotidiennement avec de la nourriture vivante, ce qui induit des comportements de chasse et augmente le bien être. Cet enrichissement est particulièrement important pour limiter le stress dans les rares cas où les animaux doivent être isolés (plaie ou blessure apparente). Tous les animaux utilisés sont obtenus par croisements sur place et sont donc habitués à notre animalerie.
Choix des espèces
Depuis quelques années, il apparait que la progression tumorale chez le poisson zèbre présente d'importantes similarités avec l'homme, d'un point de vue génétique et histologique. Par ailleurs, le poisson zèbre présente l'avantage, notamment par rapport à la souris, de permettre l'observation des tumeurs par imagerie non-invasive dans l'animal vivant. Nous avons récemment montré que des cellules de mélanomes de poisson zèbre sécrètent des vésicules extracellulaires très semblables à celles sécrétées par des lignées de mélanomes humaines (en morphologie et en contenu protéique). Nous avons également montré que nous pouvions suivre ces vésicules extracellulaires marquées par fluorescence dans l'embryon vivant. Nos expériences portent majoritairement sur les stades embryonnaires et larvaires, mais aussi sur les adultes pour certaines investigations.
Excitabilité des neurones épineux striataux chez des animaux compulsifs pour l’alcool
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Isolés en cage individuelle, 272 rats sont conditionnés à boire de l'alcool au cours de quelque 80 sessions de trente minutes étalées sur une vingtaine de semaines. Six de ces sessions s'accompagnent de stimuli aversifs, destinés à séparer ceux qui continuent de boire malgré le signal négatif de ceux qui s'arrêtent, et le porteur classe l'isolement combiné au modèle de consommation comme un impact sévère, qui concerne 200 animaux sur 272. Vient ensuite une chirurgie d'une quarantaine de minutes, avec des injections dans deux à quatre sites du cerveau, avant trois semaines d'attente puis la mise à mort et le prélèvement des cerveaux. Les 40 rats qui ne boivent pas assez pour rester dans l'étude sont proposés pour des formations à l'expérimentation animale.
Objectifs
Démontrer qu’en modulant spécifiquement l’activité de certaines populations de neurones sensibles à la dopamine (une substance active du cerveau) dans le cerveau - par des approches génétiques chez le rat - on peut moduler une prise compulsive d’alcool (une consommation irrépressible d’alcool en dépit des conséquences négatives que ces prises d’alcool peuvent avoir sur l’individu).
Bénéfices attendus
Comprendre une partie des mécanismes liés à la prise compulsive d’alcool en lien avec le rôle de la dopamine dans le cerveau. La prise compulsive d’alcool est à la base de nombreux troubles psychiatriques et comprendre son fonctionnement est un préalable indispensable au développement de stratégies thérapeutiques ciblées et efficaces.
Procédures
La production des animaux transgéniques nécessitera une biopsie de tissus. La recherche envisagée s’étale sur une durée d’environ 20 semaines. Des rats adultes seront conditionnés à consommer de l’alcool de façon compulsive au cours d’un total cumulé de près de 80 sessions de 30 minutes chacune. Après habituation à consommer de l’alcool (environ 60 sessions), 6 sessions seront associées à stimuli aversifs pour associer la recherche d’alcool à un signal négatif et ainsi distinguer les rats compulsifs ne pouvant pas stopper leur consommation d’alcool malgré ce signal, de ceux non compulsifs. Les animaux utilisés dans ce projet auront ensuite des injections dans le cerveau (chirurgie sous analgésie et anesthésie générale d’injections en deux à quatre sites, pour une durée d’opération n’excédant pas 40 minutes) qui permettront au bout de trois semaines d’étudier les mécanismes de régulation de la prise compulsive d’alcool.
Impact sur les animaux
La production des animaux transgéniques nécessitant un génotypage par biopsie d’oreille peut induire une douleur légère de courte durée. L’effet du modèle de consommation d’alcool que nous allons utiliser et l’isolement des animaux pour cette expérimentation sont à considérer comme ayant un impact d’ordre sévère sur l’animal, augmentant son niveau d’anxiété mais n’induisant pas par exemple de symptômes physiques de manque. Des nuisances modérées sont attendues liées à la procédure de chirurgie d’injection et à la procédure des stimuli aversifs. Des nuisances légères sont attendues pour ce qui est des injections dans l’abdomen et/ou sous-cutanées des traitements antalgiques et anesthésiques.
Devenir
Les animaux ayant suivi l'ensemble des expériences auxquels ils sont destinés seront tous mis à mort afin de prélever les cerveaux pour analyses histologiques. Cependant, dans notre projet, nous estimons à vingt pour cent au maximum les animaux ne satisfaisant pas au critère comportemental (appétence pour l'alcool) nécessaire à la poursuite des expériences. Ceux-ci seront proposés pour être réutilisés dans le cadre de formations à l’expérimentation animale ou autre formation d’enseignement. La décision sera prise en concertation avec le vétérinaire réfèrent et/ou un membre de la Structure chargée du Bien Être des Animaux.
Remplacement
Il n’existe pas de méthodes alternatives n’impliquant pas d’animaux vivants qui permettront l’évaluation d’un comportement compulsif de prise d'alcool (comportement pour lequel on observe une continuation de la prise en dépit des conséquences négatives, un des critères diagnostic des addictions).
Réduction
Chez les animaux dont nous étudierons le comportement compulsif à la prise d’alcool différents scores d’activité́ comportementale seront relevés et les analyses des cerveaux de ces mêmes animaux prélevés en fin d’expérimentation permettront de déterminer également les pourcentages de neurones préférentiellement activés en fonction de nos conditions expérimentales. Le nombre d’animaux sera limité au nombre minimum nécessaire par groupe estimé sur la base de procédures similaires. Pour une question d’organisation et de gestion des expérimentations, l’ensemble des animaux dont nous étudierons le comportement compulsif à la prise d’alcool sera traité au cours de sessions distinctes et successives pour n’avoir à suivre simultanément qu’un nombre restreint d’animaux à la fois.
Raffinement
Les animaux sont hébergés dans les conditions répondant aux critères légaux relatifs aux soins et à l’hébergement des animaux, limitant ainsi les angoisses qui pourraient être induites par l’environnement. Nous serons cependant obligés de les isoler par rapport à la procédure expérimentale, mais en cages ouvertes, ce qui limitera toutes nuisance associée à un isolement plus strict. Ils seront hébergés pendant une semaine à leur arrivée pendant laquelle ils sont manipulés quotidiennement, avant le début des expérimentations (pendant une semaine) afin d’atténuer le stress pouvant être lié aux contentions et aux manipulations. Les chirurgies du cerveau seront réalisées sous anesthésie générale, après analgésie préalable des sites d’incision. Les yeux seront protégés de la dessication par application d’un gel ophtalmique. La température de l’animal sera maintenue constante par une couverture chauffante. En post-opératoire les animaux seront placés sous une lampe chauffante jusqu’à leur réveil avec contrôle de la température. Des injections d’eau glucosée seront réalisées pour faciliter le processus de récupération post-chirurgical. Les douleurs post-opératoires seront prévenues par un antalgique. L’intégrité du processus cicatriciel en post-opératoire sera renforcé par application d’une solution iodée après suture de la peau. A leur réveil les animaux seront retournés dans leur cage. En cas de signe d’alerte, l’alimentation sera supplémentée par une nourriture hypercalorique et hydratée fournie par l’animalerie. Le suivi quotidien et les pesées bihebdomadaires des animaux permettront de veiller à ce qu’ils ne souffrent pas et de mettre en place des stratégies de soins et des points limites adaptés.
Choix des espèces
Le rat est l’espèce adéquate car il existe un degré́ de similitude important avec le cerveau humain, notamment au niveau des réseaux de neurones sur lesquels portent notre étude, tant du point de vue anatomique que physiologique. Les registres comportementaux explorés sont facilement appréhendables dans cette espèce. Au début de l’étude, les rats seront de jeunes adultes (de 8 à 10 semaines, de 200 à 240 g), ce qui permettra de travailler sur un système cérébral stable, mature, qui n’évoluera pas au cours des procédures expérimentales qui pourront, pour certaines, prendre plusieurs mois.
Effets de dérivés de peptides naturels sur la sensibilité douloureuse cutanée chez la souris
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
9 500 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, et chacune commence par une coupe du bout de la queue à quatre semaines. 6 760 d'entre elles sont ensuite exposées à une douleur thermique ou mécanique sur une patte ou la queue, dont 5 400 toutes les quinze minutes pendant deux heures, tandis que 900 subissent une douleur modérée d'une patte pendant 45 minutes et 3 600 une inflammation d'une patte durant de quatre heures à sept jours. 9 000 reçoivent en plus une à cinq injections d'un composé dérivé de venins d'anémone de mer, de mygale ou de serpent. Aucune ne reçoit d'analgésique, le porteur écrivant qu'il ne peut pas en envisager l'emploi dans des procédures qui ont pour objet l'étude de la douleur.
Objectifs
Notre équipe étudie les mécanismes de la perception douloureuse, et en particulier le rôle de détecteurs joué par des protéines membranaires des neurones sensoriels innervant la peau, les canaux ioniques, en développant leur pharmacologie. A partir d‘une bibliothèque de venins animaux, nous avons déjà identifié plusieurs peptides (d‘anémone de mer, de mygale et de serpents) qui ont donné lieu à des publications de haut niveau scientifique. Dans le cadre d'un projet collaboratif, des dérivés de peptides naturels que nous avons découverts doivent être testés dans la perspective d’un prochain développement clinique.
Bénéfices attendus
Ces études précliniques chez l’animal, qui permettent seule l'étude de la réalité physiologique dans un contexte intégré, sont nécessaires à la poursuite d’études cliniques pour développer de nouveaux composés anti-douleur, ce qui est crucial face à la crise mondiale des opioïdes et à l'augmentation des addictions et morts par overdoses.
Procédures
Toutes les souris (9500) subiront à l'age de 4 semaines le prélèvement du bout de queue pour déterminer leur génotype (30’’) et le stress de contentions répétées pendant les tests comportementaux. A l'age de 7 à 15 semaines dans le cadre des tests comportementaux, 6760 souris seront exposées à une douleur légère thermique ou mécanique sur une patte ou la queue de durée < 2 minutes et de laquelle elles pourront s'échapper (mesure d'un seuil de douleur), dont 5400 de façon répétée toutes les 15 minutes pendant 2h. 900 souris subiront une douleur modérée d'une patte pendant 45 minutes et 3600 souris subiront une inflammation d'une patte ne s’accompagnant d’aucun comportement traduisant une douleur spontanée (de 4h à 7 jours). 9000 souris subiront de 1 à 5 injections d’un agent pharmacologique (30’’), dont 3000 sous anesthésie.
Impact sur les animaux
Nuisance légère pour prélèvement de bout de queue pour génotypage, stress léger de la contention après habituation pour les tests comportementaux et l'anesthésie gazeuse, nuisances légères des injections pharmacologiques, nuisance modérée de l'inflammation induite sur une patte arrière et de la douleur ou de l'hypersensibilité inflammatoire ressentie sur la queue ou une patte arrière.
Devenir
Les souris impliquées dans la production des souris expérimentales (500 souris) seront mises à mort à l'issue de leur période physiologique de reproduction (8 mois pour les femelles, 15 mois pour les mâles). Ils permettront des prélèvements d'organes post-mortem pour des analyses biochimiques. Ce sont de plus des animaux OGM qu’il est interdit de disséminer hors des établissements de recherche. C’est aussi le cas pour les animaux ayant suivi les procédures expérimentales (9000) qui ont de plus subi des injections pharmacologiques, des tests invasifs et certains une hypersensibilité douloureuse chronique qui empêche aussi toute réutilisation. Toutes les souris seront donc mises à mort à l'issu des procédures et permettront des prélèvements post-mortem.
Remplacement
Au préalable, nous avons réalisé le maximum d'expériences in vitro sur les canaux ioniques dans des lignées cellulaires en culture, puis sur des cultures primaires de neurones sensoriels de rongeurs. Mais, pour savoir si ces peptides peuvent avoir un intérêt thérapeutique, des expériences de comportement et de pharmacologie chez la souris sont nécessaires, pour avoir accès à la complexité physiopathologique de l'intégration du message douloureux et de la pharmacologie in vivo. Utiliser la souris comme modèle permet d’utiliser des modèles pathologiques de référence, ainsi que d’étudier des animaux transgéniques chez lesquels un gène d’intérêt, codant pour une protéine cible du composé pharmacologique à tester, a été invalidé (knock-out). Aucune méthode alternative ne permet de satisfaire l‘objectif de Remplacement à notre connaissance, et les études précliniques chez l’animal sont nécessaires à la poursuite d’études cliniques pour développer de nouveaux analgésiques.
Réduction
Le design des méthodes de reproduction a été optimisé pour pouvoir produire sur les 5 ans de la durée du projet les souris expérimentales ainsi que d’inclure un croisement pour maintenir le fond génétique. Le projet s’étalant sur 5 ans, le nombre réel des reproductions et des animaux reproducteurs pourra être réduit en fonction des portées déjà produites et étudiées auparavant. Les animaux reproducteurs pourront être aussi utilisés pour produire des souris dans le cadre d’autres projets du laboratoire, ou pour renouveler les lots de reproducteurs, et seront mis à mort à la fin de leur période de reproduction pour permettre des prélèvements de tissus post-mortem. L‘objectif de Réduction a également été pris en compte en réduisant le nombre d‘animaux prévisionnel au minimum nécessaire pour obtenir des résultats statistiquement significatifs tout en intégrant des aléas expérimentaux. Le nombre d’animaux expérimentaux sera réduit chaque fois que possible, et toute expérience rendue inutile ou redondante par des résultats précédents obtenus par nous ou d’autres groupes (veille bibliographique mondiale permanente) ne sera pas conduite. Les expériences prévues sur les souris transgéniques ainsi certaines procédures testant la capacité motrice ne seront conduites qu’avec les composés et par les voies d’injection induisant un effet analgésique. De plus, la réalisation d’une procédure est conditionnée par le résultat préalable d’une autre. Ainsi, le nombre d’expériences ainsi que le nombre maximal de souris prévues pourra être réduit.
Raffinement
Toute souris qui présenterait des signes d'infection au niveau de la queue dans la semaine qui suit le prélèvement pour génotypage sera traitée par des soins vétérinaires adaptés jusqu'à guérison. Si la plaie persiste au-delà d’une semaine, la souris sera mise à mort. Dans le cadre de l'objectif de Raffinement, la longue expérience de notre groupe dans les études des mécanismes de la douleur chez l'animal nous permet de proposer des tests comportementaux complémentaires mettant en jeu différentes modalités douloureuses ou motrices avec une sévérité légère à modérée. Les animaux sont habitués aux tests de façon à réduire leur stress et obtenir des mesures reproductibles et fiables. Les protocoles prévoient parfois un suivi des effets pharmacologiques sur 5 jours, mais cette durée sera réduite en cas d’absence d’effet ou d’effet transitoire. Les animaux sont mis à mort dès la fin de l’expérience de comportement associée à de la pharmacologie in vivo. Grâce à un suivi quotidien de chaque animal tout au long de chaque procédure, tout animal qui présenterait des signes de comportement anormal ou d‘une pathologie quelconque serait mis à mort. Nous ne pouvons en effet pas envisager l’emploi d’analgésique dans nos procédures qui ont pour objet l’étude de la douleur.
Choix des espèces
Les expériences de comportement et de pharmacologie in vivo sont réalisées chez la souris pour pouvoir utiliser des animaux transgéniques (knock-out) pour déterminer la spécificité de l’effet des composés testés et en utilisant des modèles pathologiques de référence. Au sevrage, à 4 semaines, un prélèvement de tissus (extrémité de la queue) permettra une analyse génétique. Les expériences comportementales seront conduites sur des adultes entre 7 et 15 semaines. Cet âge permettra aussi la comparaison avec des expériences déjà publiées.
Mise en place d’un modèle d’infection urinaire murin et validation de nouveaux traitements.
- Recherche fondamentale
- Système urogénital
Une partie des 680 souris de ce projet vient des portées surnuméraires du laboratoire, animaux que le porteur décrit comme voués à être tués sans avoir été utilisés. Toutes relèvent de procédures impliquant un niveau de souffrance modéré et sont tuées à l'issue, pour dénombrer les bactéries logées dans leur vessie et leurs reins. Sous anesthésie gazeuse, un cathéter pédiatrique introduit des Escherichia coli dans leur urètre, puis un traitement ou un placebo est injecté par la même voie 24 heures plus tard, en une fois ou pendant trois jours, l'infection pouvant durer deux semaines. Le porteur affirme que ses traitements tuent 100 % des bactéries visées in vitro, et qu'il lui faut malgré tout les valider sur "animal entier".
Objectifs
Les infections urinaires sont un motif très fréquent de consultation et de prescription d’antibiotiques en médecine générale. On estime en France leur incidence à 625 000 cas/an. Environ 50% des femmes adultes font un épisode d’infection urinaire au moins une fois dans leur vie et 20% des femmes ayant une infection urinaire auront un nouvel épisode. En mai 2023, Santé publique France publiait les chiffres des infections liées aux soins (infections nosocomiales), et montrait que les infections urinaires arrivaient en tête (28% des cas). En termes de germes impliqués, la bactérie Escherichia coli, est la cause principale des infections urinaires. Selon les données de l’assurance maladie, en ville, E. coli est la cause de 90% des infections urinaires. En ce qui concerne les infections urinaires nosocomiales, E. coli arrive également en tête des germes responsables. Les infections urinaires se traitent par des antibiotiques, notamment des fluoroquinolones. Cependant, les traitements peuvent être mis en échec par des souches résistantes aux antibiotiques. La Haute Autorité de Santé dans un rapport de 2021 montre qu’en ville près de 13% des souches de E. coli sont résistantes aux fluoroquinolones et ce chiffre monte à 19% en Ehpad. Le but de cette demande d’autorisation d’expérimentation animale est de mettre en place un modèle d’infection urinaire et de tester de nouveaux traitements de décolonisation bactérienne ciblant notamment les souches résistantes aux antibiotiques.
Bénéfices attendus
Le but du projet est de valider notre approche thérapeutique dans le cadre des infections urinaires. Nous espérons montrer une forte décolonisation de l'arbre urinaire suite au traitement. Nous testerons notre traitement sur 4 souches cliniques résistantes aux antibiotiques. Nous espérons pouvoir apporter la preuve de concept que nos traitements sont efficaces et ainsi proposer une solution là où les antibiotiques sont inefficaces.
Procédures
(i) Anesthésie gazeuse des animaux + injection des bactéries dans l'uretère à l'aide d'un cathéter pédiatrique. Cette procédure prendra moins de 10 minutes par animal. (ii) 24h après infection, les animaux recevront le traitement ou le placebo. Pour cela, ils seront de nouveau anesthésiés (anesthésie gazeuse) de manière à injecter le traitement dans l’urètre. Cela prendra au maximum 10 minutes. L'administration du traitement sera unique ou répétés pendant 3 jours au total.
Impact sur les animaux
Nous allons induire une infection urinaire par l’administration dans l’urètre de bactéries. L'infection urinaire causera une nuisance légère à l'animal. Cependant, les animaux infectés vont mettre en place une réponse immunitaire visant à contrôler la prolifération bactérienne. La littérature scientifique ne reporte aucun cas de souffrance animale nécessitant le sacrifice ou l'administration de médicaments lors d'infections urinaires. La durée de l'infection urinaire sera au maximum de 2 semaines.
Devenir
A la fin de la procédure, les animaux seront mis à mort. En effet, nous voulons quantifier les bactéries présentes dans la vessie et dans les reins et pour cela, la mise à mort de l'animal est indispensable. Des analyses histologiques seront aussi effectuées pour notamment objectiver le maintien de l'intégrité des tissus grâce à notre traitement.
Remplacement
Le but du projet est de valider de nouveaux traitements dans l'éradication des bactéries responsables d'infections urinaires. Même si des études préalables montrent une très forte capacité à tuer les bactéries ciblées in vitro, il nous faut les valider sur animal entier.
Réduction
Nous avons mené de nombreux travaux in vitro de manière à sélectionner les meilleurs traitements possibles contre des souches d’Escherichia coli responsables d’infections urinaires (leur efficacité est de 100% de bactéries tuées). Nous prévoyons 2 types de traitements (1 dose unique ou 1 dose pendant 3 jours). Nous commencerons par la répétition des administrations car c’est ce traitement qui a le plus de chances de fonctionner. Si nous ne constatons aucun effet du traitement, nous arrêterons les manipulations. Une approche statistique sera effectuée de manière à déterminer si le traitement est réellement efficace. Dans le cadre de la règle des 3R, un maximum de prélèvements sera réalisé sur les animaux (vessie, reins + urine) pour effectuer : par exemple le dosage des protéines impliquées dans l’inflammation, de la microscopie, des dénombrements bactériens... Nous prévoyons d'acheter des souris mais également d'utiliser des animaux surnuméraires issus des reproductions du laboratoire. L'utilisation de ces derniers permettra de limiter le nombre d'animaux achetés et d'utiliser à des fins de recherches des animaux qui auraient été mis à mort sans avoir été utilisés.
Raffinement
Les animaux auront libre accès à la boisson et à la nourriture. Le milieu sera enrichi à l’aide de maisons en plastique. Un suivi quotidien des animaux par des expérimentateurs habitués sera effectué de manière à repérer toute détresse animale. De plus, nous utilisons un système de score dont les paramètres sont : l'apparence, le comportement naturel, l'hydratation, les signes cliniques, et le comportement provoqué.
Choix des espèces
Les souris se sont rapidement imposées comme étant un bon modèle d’infection urinaire dès le début des années 1980. Elles sont considérées comme étant notamment un meilleur modèle que les rats pour plusieurs raisons. Nous pouvons par exemple citer l’absence de reflux vésico-urétéral (la remontée d'urine vésicale vers les uretères et les reins), ce qui est le cas chez l’Homme; ou la présence dans l’arbre urinaire de la souris d’uroplakines (des structures transmembranaires présentent également chez l’Homme) servant de récepteurs aux bactéries E. coli responsables d’infections urinaires. Les animaux seront âgés de 8 à 10 semaines au moment de l'infection. C'est un stade de développement classiquement utilisé dans la littérature.
Etude de l’hématopoïèse normale et leucémique
- Recherche fondamentale
- Oncologie
Automutilation, stéréotypie sévère, prostration, perte de plus de 20 % du poids, diarrhée sanglante : la grille de points limites énumère ce qui déclenche la mise à mort des 1 316 souris de ce projet, dont 1 012 relèvent de procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Toutes sont tuées pour prélèvement d'organes. Elles subissent des ponctions de moelle osseuse sous anesthésie, jusqu'à une par mois pendant toute leur vie, ainsi qu'une irradiation suivie quelques heures plus tard d'une greffe de moelle, les animaux d'élevage recevant en plus une coupe de queue pour génotypage. Le suivi va de un à trente mois d'âge pour comprendre le rôle d'une enzyme dans les leucémies aiguës, le porteur renvoyant à la littérature pour justifier l'effectif sans donner de calcul.
Objectifs
Notre moelle osseuse produit toutes les cellules du sang (globules blancs, globules rouges et plaquettes) à partir de cellules immatures nommées cellules souches hématopoïétiques (CSH). Notre gène d'intérêt code pour une enzyme essentielle dans la régulation de la stabilité d’un large panel de substrats, l’impliquant ainsi dans un grand nombre de processus physiologiques, de manière directe ou indirecte. Comme dans d’autres cancers, les Leucémies sont la conséquence de dérégulation de l’expression de protéines clés contribuant à la transformation leucémique des cellules sanguines. Des études de la littérature complétées de nos travaux les plus récents ont permis de décrire une expression altérée de la protéine d'interêt chez les patients atteints de Leucémies Aiguës. Notre équipe a ainsi développé des modèles animaux permettant de reconstituer et ainsi d’étudier l’histoire naturelle de la maladie. Précisément, l’objectif de notre projet de recherche est donc de comprendre le rôle de la protéine d'interêt dans le développement normal des cellules sanguines et d’identifier son implication lors de la transformation leucémique. Cette étape majeure nous permettra ensuite de développer de nouveaux médicaments candidats pour le traitement des Leucémies Aiguës. Dans l’ensemble, ce projet devrait permettre de mieux comprendre ainsi que de cibler les mécanismes cellulaires et moléculaires qui régissent le développement des Leucémies Aiguës.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de mieux comprendre le rôle de la protéine d'intérêt dans l'hématopoïèse normale et ainsi vérifer si elle pourrait être une bonne cible thérapeutique dans les Leucémies Aiguës.
Procédures
Le prélèvement de moelle osseuse et/ou de sang ainsi que les transplantations de moelle osseuse dans des souris receveuses irradiées au préalable se feront sous anesthésie (animal surveillé jusqu'au réveil). Les prélèvements de moelle osseuse, effectués sous anesthésie générale et locale, durent moins de deux minutes et sont réalisés au maximum une fois par mois au cours de la vie de la souris et sont des procédures de degré de sévérité modérée. Les expériences de transplantation nécessitent une irradiation des souris. Cette procédure de degré de sévérité modérée, réalisée une seule fois au cours de la vie de la souris, dure moins de 2 minutes. Les souris sont transplantées avec de la moelle quelques heures après l'irradiation pour garantir leur survie. Elles sont surveillées attentivement dans les heures qui suivent l'irradiation, et du gel hydratant est ajouté dans la cage durant la première semaine. Les animaux de l'élevage (USP7+/+ et USP7+/-) nécessaires à la préparation des lots expérimentaux, subiront la biopsie de queue pour déterminer leur génotype.
Impact sur les animaux
L'invalidation totale de la protéine d'intérêt est létale donc nous n'utiliserons que les animaux possédant une expression de moitié de la protéine d'intérêt (viables et ayant un développement normal) ainsi que leurs homologues sauvages. Ces souris ne présentent aucun phénotype dommageable. Les animaux de l'élevage (USP7+/+ et USP7+/-) qui ont été nécessaires à la préparation des lots expérimentaux de notre DAP subissent la biopsie de queue pour déterminer leur génotype. Dans ces conditions, le prélèvement pourrait être de douleur légère de courte durée pour les animaux concernées.
Devenir
A l’âge voulu, les souris seront euthanasiées pour prélèvement d'organes.
Remplacement
Nous avons validé au laboratoire, in vitro, que la protéine d'intérêt impacte la prolifération des cellules leucémiques et contribue à la résistance aux traitements. Afin de déterminer l'impact de cette enzyme sur un organisme entier, nous allons utiliser des souris où le gène de cette enzyme est muté. Nous allons également utiliser les cellules de ces souris pour réaliser les tests de différenciation ex vivo. Les modèles murins sont utilisés majoritairement par la communautéscientifique internationale pour étudier les cellules souches hématopoïétiques dans des pathologies hématologiques.
Réduction
Les études sur l'animal sont réalisées après une étude bibliographique détaillée et sur la base d'expériences réalisées in vitro avec des lignées leucémiques afin d'optimiser nos protocoles pour réduire au maximum le nombre d'animaux. Des études de la littérature nous permettent également de déterminer le nombre minimum de souris nécessaires afin que l'expérience ait une valeur scientifique et n'ait pas besoin d'être reproduite.
Raffinement
En plus des considérations éthiques, nous n'employons que des personnes formées à la manipulation des animaux et soucieux du bien-être de l'animal. Les animaux sont hébergés en cages ventilées, selon les normes de la directive 2010/63/EU, avec un enrichissement dans chaque cage (parmi igloo, batônnets de bois, coton, sizzle nest), et un statut sanitaire contrôlé trimestriellement. Des méthodes alternatives à la préhension par la queue sont utilisées, les procédures (de degré de sévérité modérée de cette DAP) sont réalisées sous anesthésie et analgésie quand cela est possible, et l’utilisation de tapis chauffants limite l’hypothermie lors des anesthésies. Les animaux utilisés sont choisis en bonne santé et sans phénotype dommageable. L’encadrement est réalisé par du personnel compétent, et l’état de santé des animaux contrôlé quotidiennement. Toute altération du bien-être (prostration, perte de poids, piloerection, blessures) des animaux réformés les écarte de toute utilisation de training. Les observations des animaux permettent d'appliquer des points limites précis et des critères d'arrêt des souffrances : APPARENCE GENERALE : Pas de toilette, posture recroquevillée. COMPORTEMENT : vocalisations, automutilation, stéréotypie sévère, souris immobile, prostrée. SIGNES CLINIQUES : perte de poids > 20% ou émacié, difficulté respiratoire sévère. ZOOTECHNIE : propreté cage : diarrhée sévère et sang, cage humide après 2 jours; absence de prise de boisson et alimentation.
Choix des espèces
Nous allons mener des études longitudinales tout au long de la vie des animaux, incluant des périodes à un jeune âge (1, 3, 6 et 12 mois) ainsi que pendant le vieillissement (souris âgées de 24 à 30 mois). Ces différents stades représentent l'évolution de l'hématopoïèse, à la fois chez l'Homme et chez la souris (hématopoïèse jeune, adulte et clonale).
Exploration des troubles cognitifs et corrélation avec l’inflammation après un AVC chez la souris adulte.
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Un accident vasculaire cérébral provoqué par une chirurgie de 45 minutes, puis jusqu'à quinze jours de test de mémoire quotidien sous restriction alimentaire et en cage individuelle : 340 souris passent par là, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles sont pesées chaque jour pour ajuster leur ration, l'appât alimentaire servant à les faire circuler dans un dispositif dont le RNT ne donne pas le nom. Le porteur écrit pourtant que la méthode retenue ne s'accompagne pas de symptômes majeurs et qu'elle limite la souffrance animale, moins de 3 % des souris ayant montré des signes de souffrance dans ses études précédentes. Toutes sont tuées par perfusion intracardiaque sous anesthésie, pour des analyses post-mortem du cerveau.
Objectifs
Les accidents vasculaires cérébraux (AVC) sont une cause majeure de déficits moteurs à long-terme et de déficits cognitifs. Certains symptômes se manifestent tardivement et ne sont pas forcément liés à la région initialement lésée, suggérant qu’un AVC dans une région spécifique peut aussi causer des modifications dans d’autres régions du cerveau. Des altérations dans des régions directement connectées à la zone lésée ont déjà été corrélées à l’apparition de troubles tardifs. Cependant, les régions associées aux fonctions impactées (les fonctions de mémoire par exemple) ne sont pas toujours directement connectées à la région lésée. Une bonne compréhension des mécanismes qui sous-tendent les troubles de mémoire se manifestant tardivement après l’AVC est donc nécessaire pour le développement de stratégies permettant d’éviter leur survenue. Nous émettons donc l’hypothèse que des modifications pourraient donc ne pas se restreindre aux régions connectées à la zone lésée primaire mais s’étendre spatialement et temporellement dans le cerveau. Dans cette étude, nous voulons induire un AVC limité à une région précise du cerveau d’un modèle de souris afin d’étudier l’impact de la lésion dans d’autres régions cérébrales associées aux toubles de mémoires et pas directement connectées à la zone lésée. Grâce à ce modèle, nous étudierons les déficits de mémoire ainsi que leurs décours temporel. De plus, si notre hypothèse est confirmée, nous pourrons corréler ces éventuels troubles aux mécanismes étudiés dans des zones non-connectées qui pourraient sous-tendre leur apparition.
Bénéfices attendus
Ce projet nous permettra de valider notre modèle animal d’AVC pour l’étude des mécanismes sous-tendant les troubles de mémoire qui se manifestent tardivement après un AVC, même quand la région initialement lésée n’est pas impliquée dans la mémoire. Nous émettons l’hypothèse que l’altération de mécanismes cellulaires associés à la mémoire pourrait être présente dans des régions non directement connectées à la zone lésée. Si notre hypothèse est confirmée, le modèle pourrait être utilisé pour comprendre les mécanismes sous-jacents les troubles de mémoire qui apparaissent tardivement après l’AVC. Cette compréhension pourrait avoir des répercussions positives sur la recherche préclinique, et mettre en lumière, à terme, de nouvelles pistes thérapeutiques pour prévenir certains troubles cognitifs après un AVC.
Procédures
Les animaux seront soumis à une chirurgie peu invasive pour induire l’AVC sous anesthésie générale (environ 45 minutes). Un test comportemental sera ensuite réalisé. Pendant la phase d’habituation (2 jours), le test dure entre 2 et 10 minutes et il est répété jusqu’à 3 fois par jour. Ensuite, la durée moyenne du test est de 20-30 minutes (répété une fois par jour jusqu’à stabilisation de la courbe d’apprentissage, jusqu’à un maximum de 15 jours). Enfin, ils seront soumis à une perfusion intracardiaque sous anesthésie générale (20 minutes). Tous les animaux sont concernés.
Impact sur les animaux
La méthode utilisée induit un infarctus cortical limité et ne s’accompagne typiquement pas des symptômes majeurs, rendant le modèle facilement utilisable tout en limitant la souffrance animale. Cependant, suite à l’induction de l’AVC, une perte de poids pourrait être observée. Un effet de stress pendant le test comportemental et pendant l’hébergement entre les répétitions de tests pourrait survenir.
Devenir
A l’issue de toutes les expériences, les animaux seront mis à mort et des analyses complémentaires post-mortem seront effectuées.
Remplacement
Il n’existe pas encore, à ce jour, de modèle alternatif (cultures cellulaires, organoïde) à l’induction d’AVC chez la souris suffisant pour reproduire les mécanismes complexes présents dans la pathologie humaine, impliquant notamment des structures sophistiquées comme la vascularisation cérébrale. La méthode que nous utilisons est cependant la méthode actuelle connue la moins invasive, permettant l’induction controlée et reproductible d’un AVC limité à une zone d’intérêt. Il n’existe pas non plus actuellement de méthode alternative permettant de remplacer les animaux dans les expériences de comportement, impliquant l’intéraction complexe de différentes structures et systèmes cérébraux
Réduction
Le nombre de souris a été évalué sur la base de travaux précédents, en tenant compte des divers problèmes que nous pourrions rencontrer au cours des différentes phases expérimentales (au cours de la chirurgie, pendant les tests de mémoire). Le déroulement des expériences est organisé afin de limiter au maximum le nombre d’animaux. Le test comportemental choisi peut être répété sans altérer les résultats. Cela permet une étude longitudinale, et donc une réduction des animaux. Deux tailles de lésions d’AVC seront testées en même temps pour réduire le nombre d’animaux contrôles (n’ayant pas subi d’AVC) pour chaque lot d’animaux. Des tests statistiques seront utilisés pour comparer les résultats des expériences.
Raffinement
Des mesures de RAFFINEMENT seront mises en place durant toute la durée du projet. Les animaux sont dans des conditions d’hébergement favorisant leur bien-être et observés quotidiennement. Jusqu’à l’expérience de comportement, ils seront placés dans des cages collectives avec un enrichment renforcé par l’ajout d’un tube en carton, au nombre de 4-5 par cage. L’accès à la nourriture et à l’eau est sans restriction et un changement de litière est effectué chaque semaine. Dans des études précédentes, le nombre d’animaux qui ont montré des signes de souffrance dû à l’induction de l’AVC était très limité (moins de 3%). Le test comportemental nécessite une légère restriction alimentaire afin de motiver les animaux à se diriger vers la récompense alimentaire, qui seront donc hébergés individuellement avant le début du test, afin de stabiliser progressivement leurs poids. Pour cela les animaux sont pesés quotidiennement et la quantité quotidienne de nourriture est adaptée. En cas de perte plus importante, la ration alimentaire est augmentée, et si nécessaire de la nourriture en poudre est ajoutée. Les cages sont collées les unes aux autres pour augmenter les intéractions sociales. Dans les deux protocoles, en cas d’absence d’amélioration de l’état de l’animal, nous ferons intervenir la vétérinaire responsable.
Choix des espèces
Le modèle envisagé a déjà été induit chez la souris. Sa reproductibilité et le fait de pouvoir induire l'AVC dans une zone confinée du cerveau en font le modèle d’AVC le plus adapté à ce jour selon la littérature pour tester notre hypothèse. Des phénomènes de déconnexion de zones avec des connexions directes à la zone de l’AVC ont déjà été établis dans ce modèle, ainsi que des modifications de l’activité neuronale dans des zones éloignées et sans connexions directes. Ce modèle nous permettra de réaliser des tests comportementaux afin de mettre en évidence des troubles de mémoire après l’AVC. L’âge des souris a été choisi pour étudier les conséquences d’un AVC sur une tâche de mémoire chez un animal adulte.
Rôle du récepteur minéralocorticoïde dans la fibrose intestinale chez la Souris
- Recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
- Système gastrointestinal
Tester si un médicament de l'hypertension déjà sur le marché freine la fibrose intestinale suppose ici d'infliger des colites chroniques à 924 souris, dont 374 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, toutes tuées à l'issue. Une semaine d'antibiotiques vide leur microbiote, puis sept jours de gavage quotidien le remplacent par un autre, avant l'administration d'un agent chimique dans l'eau de boisson une semaine sur trois, ou par injection dans le rectum. Les protocoles durent 42 à 59 jours et provoquent, selon le porteur, une hypersensibilité viscérale sévère et une perte de poids, sans qu'aucun analgésique soit administré : il affirme que les quatre molécules disponibles interféreraient toutes avec l'inflammation étudiée. Les souris dont le score dépasse 3 sont mises à mort par surdosage d'anesthésiques.
Objectifs
Les maladies inflammatoires chroniques de l’intestin (MICI) regroupent principalement la maladie de Crohn et la rectocolite hémorragique. Ces maladies se caractérisent par la répétition de poussées inflammatoires, entrecoupées de phases de rémission. Une complication fréquente des MICI est la fibrose intestinale. Celle-ci se caractérise par une paroi intestinale plus épaisse en raison d’une réparation excessive. Cela peut conduire à un rétrécissement de la lumière intestinale. Aujourd’hui, aucun traitement spécifique ne permet de prévenir ou d’inhiber le développement de la fibrose intestinale, ce qui conduit les patients à des interventions chirurgicales, d’où l’importance de trouver de nouvelles cibles thérapeutiques pour prévenir ou inhiber la fibrose intestinale. Nous avons décidé de cibler le récepteur minéralocorticoïde (RM). Ce récepteur est impliqué dans la régulation de la pression artérielle. Or, la suractivation de ce récepteur est impliquée dans le développement de fibroses extra-intestinales. Par exemple, cibler le RM permet de diminuer la fibrose cardiaque induite dans un modèle murin d’hypertension artérielle. Ainsi, nous évaluerons l’effet de l’antagonisme du RM sur le développement de la fibrose intestinale dans des modèles murins de colite. De plus, le RM exprimé au niveau des macrophages joue un rôle dans le mécanisme du développement de fibrose dans différents contextes extra-intestinaux, d’où l’importance d’évaluer spécifiquement l’implication du RM exprimé au niveau myéloïde dans le développement de la fibrose intestinale.
Bénéfices attendus
Même si des progrès thérapeutiques notables ont été réalisés dans le traitement des MICI, il n’existe pas de traitement préventif ou thérapeutique contre le développement de la fibrose intestinale. Comme les antagonistes du RM ne sont pas contre-indiqués chez les patients atteints de MICI, nous pourrions repositionner les antagonistes du RM déjà disponibles sur le marché dans un nouveau champ thérapeutique. De plus, ce projet permettra de mieux comprendre les mécanismes sous-jacents sur l’implication du RM dans le développement de la fibrose intestinale et en particulier le rôle du microbiote intestinal.
Procédures
Transfert de microbiote intestinal et induction de la fibrose intestinale. Les souris seront déplétées de leur microbiote par traitement antibiotique dans l’eau de boisson d’une durée d’une semaine. Puis, le transfert de microbiote intestinal se fera par gavage quotidien pendant 7 jours consécutifs et chaque gavage dure environ 1 min par souris. Les protocoles de colite chronique induite chimiquement se feront respectivement soit par administration de l’agent chimique dans l’eau de boisson, soit par une injection intra-rectale sous anesthésie/analgésie. L’administration de l’agent chimique dans l’eau de boisson dure 1 semaine et est répétée 3 fois au cours du protocole expérimental. L’injection rectale dure environ 1min. Les protocoles d’induction de fibrose sont de 59 jours et 42 jours respectivement. La composition corporelle est mesurée par EchoMRI les premiers et derniers jours de protocole de façon non invasive et la procédure dure environ 1 minute par souris. Dans le cadre de certaines procédures, des inhibiteurs pharmacologiques seront administrés dans l’alimentation des souris pendant toute la durée du protocole expérimental.
Impact sur les animaux
Les modèles de colites peuvent entrainer une hypersensibilité viscérale (modérée pour la colite aigue aux doses testées et sévère pour les modèles de colite chronique induite chimiquement) et une perte de poids corporelle chez la Souris
Devenir
A la fin du protocole, l’ensemble des animaux seront mis à mort afin de pouvoir évaluer différents paramètres physiologiques et marqueurs biologiques et collecter un maximum d’informations à partir de ces séries expérimentales.
Remplacement
Avant d’être testés in vivo, nos hypothèses de travail sont validées dans des modèles cellulaires comme des lignées de fibroblastes intestinaux humains ou des lignées de macrophages en conditions de fibrose. Cependant, ces modèles in vitro ne permettent pas de rendre compte de la complexité physiologique de la réponse fibrotique ou inflammatoire in vivo. Les procédures expérimentales décrites dans ce projet ont un caractère de stricte nécessité et ne peuvent pas être remplacées par d'autres méthodes expérimentales.
Réduction
Ce projet s’efforce de réduire le nombre de souris au strict nécessaire pour que l’étude soit concluante et en collectant le maximum d’observations au cours d’une même expérience : (i) données nutritionnelles (composition corporelle, poids des animaux), (ii) inflammation, (iii) fibrose intestinale, (iv) fonction de barrière intestinale et (v) microbiote intestinal. Le nombre d’animaux nécessaires a été évalué selon la sensibilité et la spécificité des procédures utilisées, en fonction de l’expérience acquise lors de nos précédentes études, d’études pilotes pour valider les doses d’agents chimique et des données de la littérature. Pour diminuer le nombre d’animaux utilisés, plusieurs approches combinées ont été prévues : des modèles de colites intestinales induites chimiquement par deux agents différents à des concentrations faibles mais efficaces d’après la littérature. Nous avons fait le choix d’utiliser une dose faible d’inducteur chimique pour limiter au maximum la mortalité, permettant ainsi d’optimiser le bien-être des animaux et de réduire le nombre d’animaux utilisés. - L’utilisation d’espèces d’animaux utilisés à des fins scientifique, caractérisés par une faible variation génétique permet de limiter la variabilité de la réponse biologique et par conséquent le nombre d’animaux. - L’effectif de chaque groupe a été déterminé par une approche statistique en prenant comme critère principal le score histologique. - Nous avons fait le choix de tester l’antagonisme pharmacologique ou génétique du RM uniquement sur les animaux colitiques et par conséquent de limiter les groupes contrôles au strict minimum. Les données obtenues chez des animaux contrôles seront réutilisées autant que possible. Par exemple, des échantillons de colon sont préservés dans le laboratoire et indiqués dans la base de données communes à notre Unité et peuvent ainsi être réutilisés au cours d’un autre protocole par nous ou une personne de l’Unité.
Raffinement
Les souris seront hébergées dans des cages standards (4-5 souris/cage), avec enrichissement. Une période d’acclimatation d’une semaine après réception des souris sera réalisée avant le début des procédures. - Les conditions de soins et les méthodes utilisées viseront à réduire le plus possible toute douleur, souffrance, angoisse ou dommages durables que pourraient ressentir les animaux. Un suivi des animaux sera réalisé quotidiennement durant toute la durée des procédures, afin de déceler tout éventuel signe de souffrance. Une grille d’évaluation des point limites pour le bien-être animal sera utilisée . Un animal présentant un état de mal être ou de souffrance sera exclu de l'étude et mis à mort en fonction de son score et de la discussion avec les membres de la cellule SBEA. Pour limiter la douleur des animaux avec colite induite chimiquement, l’usage est de ne pas utiliser d’analgésique en raison de leur interaction potentielle avec le processus inflammatoire. Il existe 4 analgésiques potentiels utilisés dans l’inflammation intestinale, qui présentent tous un risque d’interférence avec notre modèle selon la littérature scientifique. Nous ne pourrons donc pas utiliser ces analgésiques dans nos procédures expérimentales. En cas d’atteinte des points limites (score >3), les souris seront mises à mort par surdosage d’anesthésiants.
Choix des espèces
La souris (mus musculus) est le mammifère non primate le plus proche (phylogénétiquement) de l’Homme. La souris est l’animal le plus couramment utilisé pour modéliser la colite expérimentale et les modèles génétiques d’invalidation du récepteur minéralocorticoïde ne sont disponibles que chez la Souris. Cette souche n’est pas résistante à l’induction de colite chronique par le DSS et le TNBS comme d’autres souches de souris et permet ainsi de réduire le nombre d'animaux utilisés. La lignée de souris a été utilisée par notre laboratoire pour la mise en place des techniques de greffe de microbiote intestinal et de déplétion du microbiote endogène des animaux greffés par antibiothérapie.
Étude d’un nouvel agent médicamenteux dans un modèle murin d’athérothrombose induite par rupture de plaque
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
Opérées un quart d'heure pour provoquer la rupture d'une plaque de graisse dans une artère, 141 souris nourries au régime gras jusqu'à leurs 28 semaines sont toutes tuées à l'issue. Soixante-quinze d'entre elles ne se réveillent pas de l'intervention, les autres relèvent de procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, avec jusqu'à deux injections et une administration orale. Le projet vise à confirmer chez la souris qu'un peptide candidat réduit le caillot plaquettaire sans augmenter le risque de saignement, effet que le porteur dit avoir déjà observé dans un autre modèle murin. Il en attend un "réel bénéfice clinique pour des millions de patients", formule qui repose sur cette seule étape supplémentaire chez l'animal.
Objectifs
Dans le monde, les pathologies cardiovasculaires représentent la première cause de mortalité (environ 38 % des décès) devant les cancers. Les complications majeures de la thrombose survenant suite à la rupture d’une plaque graisseuse (plaque d’athérome) dans une artère sont l’infarctus du myocarde et les accidents vasculaires cérébraux. À la vue de ce constat, il est aujourd’hui essentiel de découvrir de nouvelles approches thérapeutiques dirigées contre des cibles moléculaires originales impliquées dans ces processus.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus de notre candidat peptide sont une diminution de la taille voire une absence de caillot plaquettaire (thrombus) suite à la rupture d’une plaque graisseuse (plaque d’athérome). De plus, comme décrit précédemment des traitements limitant la formation de caillots plaquettaires existent actuellement sur le marché. Cependant, ceux-ci sont fortement corrélés à un risque accru de saignement. Le candidat peptide étudié dans notre procédure n’augmente pas le risque de saignement. Ce candidat peptide pourrait donc conduire à un réel bénéfice clinique pour des millions de patients atteints de pathologies cardiovasculaires. La réalisation de ce projet d’expérimentation animale permettra de valider et de renforcer les résultats obtenus précédemment et ainsi de démontrer l’effet bénéfique de notre candidat peptide dans un modèle murin, et ainsi permettre d'avoir des données se rapprochant des cas cliniques observés. En effet les patients les plus à risque de thrombose développent, au cours du vieillissement ou lors de pathologies chroniques, des plaques graisseuses à l’intérieur de la paroi de leurs artères.
Procédures
- Injection d’anesthésique et d’analgésique (1 fois, temps maximale de l’injection : 30 secondes) - Injection (au maximum 2 fois, temps maximale de l’injection : 30 secondes) - Administration orale (au maximum 1 fois, temps maximale d’administration : 1 minute) - Chirurgie (15 minutes)
Impact sur les animaux
Les effets indésirables peuvent être un stress physique ou thermique de courte durée, une douleur de courte durée à l’endroit des injections, et une gêne de courte durée lors de l’administration orale.
Devenir
A l'issue de la procédure les animaux seront euthanasiés sans douleur et encore sous anesthésie. Les actes chirurgicaux induits par la procédure sur les animaux ne permettent pas le réveil des animaux.
Remplacement
Nos résultats très encourageants dans différents modèles avec les plaquettes de souris (modèle murin d’occlusion carotidienne induite chimiquement) nous permettent de penser que ce modèle permet de réconcilier les limites de chaque approche, et dans le futur, de se rapprocher de la clinique.
Réduction
Le nombre de souris par expérience est calculé pour permettre le plus faible nombre d'animaux utilisés tout en obtenant des résultats permettant une interprétation fiable basée sur des analyses statistiques adaptées
Raffinement
Une observation quotidienne des souris sera réalisée afin de garantir leur bien-être et détecter d’éventuels signes de douleur ou de stress. L’utilisation d’anesthésiques, d’analgésiques et d’antalgiques permettra de prévenir et/ou traiter toute douleur éventuelle. Un soin sera apporté aux conditions d’hébergement permettant de limiter le stress (enrichissement du milieu de vie, respect de leur vie en groupe, surveillance quotidienne). Puis, au cours de l’anesthésie, les signes vitaux seront surveillés avec une attention particulière portée à la respiration et au rythme cardiaque avec un maintien de la température corporelle grâce à une plaque thermorégulée et une lampe chauffante. Au cours de la phase d’anesthésie, une attention particulière sera également portée aux indicateurs les plus significatifs d’une détérioration irréversible de l’état de l’animal réalisée à l'aide d'une grille d'évaluation de points limites. L’ensemble des animaux sera euthanasié à la fin du protocole.
Choix des espèces
Le modèle murin utilisé dans ce projet constitue le modèle de référence pour leur capacité à développer des plaques graisseuses dans la paroi des artères. L'utilisation à 28 semaines de ces animaux après un régime riche en graisse permet de se rapprocher des conditions pathologiques retrouvées chez l'homme.
Évaluation du bénéfice thérapeutique anti-tumoral de l’inhibition d’une protéine impliquée dans la régulation du stress nucléolaire chez la souris
- Recherche appliquée
- Cancers
264 souris immunodéprimées vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent sous la peau une greffe de cellules cancéreuses humaines, puis leurs tumeurs sont mesurées trois fois par semaine pendant douze semaines au maximum, pendant qu'elles reçoivent chaque semaine une injection dans l'abdomen doublée d'un traitement contre les nausées. Les souris qui ne développent pas de tumeur sont tuées huit semaines après la greffe, le porteur indiquant qu'elles ne peuvent servir à aucun autre projet. Il décrit le bénéfice attendu comme une réduction des doses de chimiothérapie chez l'humain, et conclut que seul un "organisme entier" permet de tester le médicament candidat après les essais sur cellules.
Objectifs
Le cancer reste un enjeu clinique d’importance en France, cette pathologie présentant une forte incidence (environ 382 000 nouveaux cas diagnostiqués par an) et mortalité (environ 158 000/an). Bien que le cancer soit mieux pris en charge grâce aux dernières avancées dans le domaine, aucune solution thérapeutique n’est connue pour certains cancers, dont la prise en charge repose alors essentiellement sur les chimiothérapies. Or les chimiothérapies sont associées à des effets secondaires importants ou à de la résistance. Il est aujourd’hui nécessaire de remplacer ces chimiothérapies par des alternatives thérapeutiques ou de limiter les doses de chimiothérapies en les combinant à de nouvelles thérapies. La désescalade thérapeutique pour les chimiothérapies repose sur (1) l’identification de nouvelles protéines qui jouent un rôle dans la réponse aux chimiothérapies et (2) l’évaluation du bénéfice à cibler ces protéines en combinaison avec les chimiothérapies. In vitro, à l’aide d’une lignée cellulaire dérivée du foie, il a été montré que la réduction d’expression d’une protéine impliquée dans le stress nucléolaire induit un arrêt de prolifération des cellules en réponse à une chimiothérapie. A l’inverse, la sur-expression de cette protéine conduit à une résistance à la chimiothérapie. Aujourd’hui, il reste à démontrer que l’inhibition de la protéine d’intérêt améliore la réponse aux chimiothérapies in vivo. Objectif 1. L’objectif principal de ce projet de recherche est d’évaluer l’intérêt de cibler une protéine impliquée dans le stress nucléolaire dans les cancers à l’aide du modèle murin. Il sera déterminé si l'inactivation de cette protéine est suffisante pour augmenter la cytotoxicité des chimiothérapies courantes, démontrant le potentiel d'inhibition de la protéine d’intérêt en tant que thérapie combinée. Objectif 2. L’objectif secondaire correspond à de la recherche fondamentale, qui permettra de comprendre le rôle de cette protéine du stress nucléolaire dans la tumorigenèse. Il sera déterminé si l'inactivation de cette protéine réduit et/ou abolit la croissance tumorale, démontrant le potentiel d'inhibition de cette protéine d’intérêt en tant qu'approche thérapeutique à elle seule. Pour cela une approche de greffes chez la souris de cellules génétiquement modifiée pour permettre la réduction d’expression de la protéine d’intérêt sera utilisée.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus du projet sont de contribuer à valider une nouvelle stratégie thérapeutique anti-cancer en santé humaine. Ce projet permettra d’évaluer le bénéfice thérapeutique de la perte de fonction d’une protéine impliquée dans le stress nucléolaire dans le traitement de cancers par chimiothérapies. Cette stratégie thérapeutique innovante permettra de réduire la dose des chimiothérapies utilisées tout en augmentant leur efficacité et ainsi diminuer les effets indésirables associés aux chimiothérapies.
Procédures
Injection sous-cutanée de cellule humaine sur animal vigile (1x, 15 sec). Mesure des tumeurs (3x/sem, 25 sec, pendant 12 semaines au maximum). Administration de composés stériles par injection intrapéritonéale sur animal vigile (1x/sem, 15 sec, pendant 5 sem), administration d’un traitement anti-nausée par injection sous-cutanée (1x/sem, 15 sec, pendant 5 sem)
Impact sur les animaux
Contentions multiples (greffe, traitement, mesure) qui peuvent engendrer un stress. La tumeur pourrait entrainer, dans de très rares cas, une gêne à la locomotion. Douleur ponctuelle lors de la greffe (injection sous-cutanée) et lors des traitements (injection intrapéritonéale).
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort afin de récupérer les tumeurs pour des analyses biochimiques, moléculaires et histologiques. Si des animaux ne développent pas de tumeur, ils seront mis à mort 8 semaines post-greffe. En effet, les animaux ayant subi une injection de cellules tumorales, ne peuvent pas être réutilisés dans un autre projet.
Remplacement
En amont de ces expérimentations in vivo, les chimiothérapies et le médicament-candidat ont été testés sur les cellules in vitro. Les approches in vitro sont nécessaires mais elles restent limitées à des modèles cellulaires ayant une structure en 2D ou en 3D, sans microenvironnement. La deuxième étape de validation du médicament-candidat est in vivo, c’est-à-dire d’étudier son action dans des conditions physiologiques et seul un organisme entier le permet.
Réduction
Une étude préliminaire de validation du modèle est conduite sur un nombre limité de souris (40 souris). Si les résultats de cette étude sont concluants, l’étape 2 sera alors mise en œuvre pour analyser les effets d'un médicaments anti-nausée sur le bien-être animal en lien avec des traitements de chiomiothérapie de référence (30 souris). L’étape 3 déterminera la concentration minimale de chimiothérapie à utiliser pour obtenir un effet. Cette procédure sera également faite sur un nombre limité d’animaux (50) pour 3 chimiothérapies testées (chimiothérapies classiquement administrées chez l’homme). Enfin, à l’issu de cette 3eme étape, la procédure 4 sera conduite en séquentielle (chimiothérapie par chimiothérapie). Le but de cette procédure est d’étudier s’il est possible de réduire les effets indésirables des chimiothérapies en co-administrant un médicament-candidat. Des tests statistiques ont été utilisés pour définir le nombre d'animaux par groupe qui permettent à la fois de réduire le nombre total d'animaux tout en préservant la significativité des résultuts et leur robustesse.
Raffinement
Les animaux sont hébergés en groupe de 5 individus, la boisson et l’aliment sont à volonté. Dans chaque cage, des boules de coton sont à disposition des souris pour la construction de nid. Avant toute expérience, les animaux seront acclimatés pendant 7 jours. Les analyses de croissance des tumeurs sont non invasives. L'effet des composés sur l'état physiologique des souris est suivi par la pesée des animaux, et la mesure du développement tumoral. Si une nausée est révélée lors des traitements de chimiothérapie, cette dernière sera prise en charge par l'adminstration d'un anti-nauséeux. Des points limites adaptés sont définis de manière objective pour chaque procédure, incluant des critères d'arrêt de l'expérience en cas de souffrance.
Choix des espèces
La souris est le modèle de choix pour l’analyse de greffes de lignées cellulaires en oncologie. Les expérimentations sont réalisées sur des souris immunodéprimées pour qu’il n’y ait pas de rejet de la greffe des cellules humaines. La greffe est pratiquée sur les souris de 6–8 semaines, pour des raisons d’efficacité et de reproductibilité.
Caractérisation chémogénétique des astrocytes dans le phénomène de vasomotion en condition inflammatoire chez le rat in vivo
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
48 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, chacun passant trois semaines dans le projet et trois anesthésies générales. La première chirurgie consiste en des injections d'outils de modification génétique directement dans le cerveau, la deuxième en un amincissement du crâne suivi d'une nouvelle série d'injections intracérébrales, la troisième séance étant une heure et demie d'imagerie par ultrasons. Le porteur décrit des douleurs modérées et de légers saignements possibles après les opérations, qu'il qualifie d'évènements rares. L'objet est de confirmer le rôle des astrocytes dans la vasomotion cérébrale, les retombées annoncées pour les maladies du système nerveux restant au conditionnel et sans échéance.
Objectifs
La vasomotion est un phénomène naturel où les vaisseaux sanguins alternent spontanément entre contraction et relaxation, créant une sorte de pulsation lente. Bien que ce mécanisme soit connu, son rôle précis reste encore mal compris. Dans une étude précédente, nous avons identifié pour la première fois un lien direct entre la vasomotion et l’inflammation cérébrale, mettant en évidence que ce phénomène est influencé par certaines cellules du cerveau appelées astrocytes, particulièrement en situation d’inflammation. Nous émettons l’hypothèse que l’inflammation amplifie la vasomotion grâce à l’action de ces astrocytes. L’objectif de ce projet est de confirmer le rôle de ces cellules dans le contrôle de la vasomotion cérébrale, tant en conditions normales que pathologiques. Pour cela, nous utiliserons une méthode d’imagerie fonctionnelle basée sur les ultrasons, permettant de mesurer et cartographier les variations du flux sanguin cérébral. Par ailleurs, nous utiliserons un outil de pointe pour moduler directement l’activité des astrocytes grâce à des récepteurs artificiels activables seulement par une molécule spécifique. Ces technologies nous permettront de mieux comprendre comment ces cellules participent à la régulation de ce phénomène cérébral.
Bénéfices attendus
Les traitements actuels pour les maladies du système nerveux central ne répondent pas pleinement aux besoins des patients (faible efficacité, effets secondaires conséquents), ce qui met en évidence l’importance d’explorer de nouvelles approches thérapeutiques. Parmi ces pistes, cibler des cellules non neuronales, comme les cellules gliales, apparaît comme une stratégie prometteuse. Ces cellules, qui constituent environ la moitié des cellules du cerveau humain, jouent un rôle central dans le fonctionnement du cerveau et représentent des cibles intéressantes pour le développement de nouvelles thérapies. Les résultats espérés de ce projet pourraient ouvrir de nouvelles perspectives pour comprendre et traiter les maladies du système nerveux central, notamment celles liées à l’inflammation ou à la dégénérescence du cerveau.
Procédures
Le temps d’inclusion dans le projet pour chaque animal sera de 3 semaines, durant lequel le rat sera anesthésié 3 fois afin de réaliser 2 interventions chirurgicales et 1 session d’imagerie fonctionnelle comme décrites ci-dessous : • 1 intervention chirurgicale pour des injections intracérébrales d’outils de modification génétique (durée : 1h30), réalisée sous anesthésie générale et analgésie. • 1 intervention chirurgicale pour un amincissement du crâne (durée : 60 minutes) associé à des injections intracérébrales de molécules (durée : 30min), réalisé sous anesthésie générale et analgésie. • 1 examen d’imagerie (durée 1h30), réalisé sous anesthésie générale
Impact sur les animaux
Lors des différentes étapes de ce projet (interventions chirurgicales et session d’imagerie fonctionnelle), les animaux pourront ressentir une légère détresse le temps que l’anesthésie soit opérationnelle. Lors des interventions chirurgicales, les animaux pourront être sujets à une inflammation locale, des douleurs modérées, et/ou de légers saignements, restant toutefois des évènements rares.
Devenir
A la fin de la procédure, les animaux seront euthanasiés afin de réaliser les confirmations et les analyses post-mortem des tissus cérébraux, nécessaires à la validation et l’interprétation des résultats.
Remplacement
L'objectif étant d'identifier et de caractériser le rôle des astrocytes dans ce phénomène de vasomotion (un phénomène biologique complexe impliquant des interactions entre cellules vasculaires, gliales et neuronales), l'utilisation d'un modèle in vitro ou in silico n'est ni pertinente ni cohérente avec les connaissances scientifiques actuelles.
Réduction
Le nombre de groupes de l’étude a été réduit au minimum nécessaire afin de répondre à une hypothèse spécifique. Quand cela est rendu possible, les animaux sont utilisés pour plusieurs acquisitions d’imagerie afin de limiter le nombre total d’animaux. Le nombre d’animaux par groupe a été déterminé, grâce à notre expérience en imagerie fUS, sur la base de calcul de puissance statistique compte tenu de la taille des effets observés, de la variabilité de la mesure hémodynamique, ainsi que de l’efficacité relative des transductions virales qui seront réalisées.
Raffinement
Les animaux seront surveillés régulièrement grâce à une grille de score et des points limites adaptés. La douleur sera réduite au maximum par l’administration d’analgésiques dès l’apparition de signes. En cas de signe de détresse, la procédure serait interrompue et si nécessaire, la mise à mort serait effectuée. L’environnement sera enrichi avec morceaux de bois, boîtes ou cylindres.
Choix des espèces
Le rat est fréquemment recommandé pour les études utilisant des dispositifs d'imagerie, car il représente un modèle animal pour lequel des données précliniques existent déjà, incluant l'administration de LPS et l'emploi des différentes techniques utilisées dans ce projet. Par ailleurs, lors de notre étude précédente, ce modèle a été utilisé afin de démontrer le lien direct entre la vasomotion et la neuroinflammation, constituant une base solide à cette nouvelle étude. Des rats adultes seront utilisés pour étudier les contributions des astrocytes dans le phénomène de vasomotion au sein de réseaux neurogliaux pleinement matures, dans des conditions expérimentales identiques à celles de notre étude précédente, afin d'assurer la robustesse et la comparabilité des résultats.