Procédures modérées

100 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, tous tués par perfusion intracardiaque à l'issue. Chacun subit une chirurgie stéréotaxique de 45 à 90 minutes pour recevoir des vecteurs viraux dans le cerveau, et 90 d'entre eux portent ensuite un plot d'enregistrement de 5 à 10 grammes fixé sur le crâne, ce qui impose un hébergement individuel pendant environ six mois. Ils sont maintenus en restriction alimentaire pour qu'ils cherchent leur nourriture dans une arène, deux sessions par jour, pendant des mois selon la qualité du signal électrophysiologique. L'équipe compte utiliser les mêmes rats comme leurs propres témoins, avec et sans stimulation laser, une réduction du nombre d'animaux qui selon elle "n'augmente que marginalement les désagréments".

Objectifs

L’objectif principal est de comprendre comment l’activité des cellules dites ‘directionnelles’ est générée à partir des informations vestibulaires périphériques . Les cellules directionnelles sont des neurones présents dans le thalamus antérieur mais également dans d’autres structures corticales, qui s’activent lorsque la tête du rat pointe vers une direction précise. Ces cellules permettent à l’animal de s’orienter dans son environnement. Leur activité, particulièrement dans le thalamus, est sous le contrôle des informations provenant du système vestibulaire périphérique dans l'oreille interne. Ces informations vestibulaires sont vehiculées aux cellules directionnelles par deux structures du tronc cérébral: le noyaux supragénual et le noyau tegmental dorsal. Ces noyaux représentent le circuit responsable de la genèse des signaux directionnels thalamiques puisque la lésion de chacun de ces noyaux provoque une disparition de la modulation directionnelle des cellules directionnelles. Toutefois, leur rôle spécifique n’est pas connu. En parallèle de ces noyaux, la subdivision vestibulaire du cervelet (communément appelé vestibulo-cervelet) pourrait contribuer également à l'activité directionnelle puisque son activité pourrait générer un signal de vitesse de rotation de la tête centré sur le référentiel externe gravitationnel. L’objectif de notre projet est d’étudier le rôle exact des différentes composantes de ce circuit sur le contrôle des cellules directionnelles thalamiques. Pour cela nous allons réaliser des enregistrements électrophysiologiques de ces cellules chez des rats en comportement. Puis nous allons effectuer des perturbations de l'activité des structures cérébrales précitées, nous permettant de tester le rôle nécessaire et/ou suffisant de leur fonctionnement pour l’expression à la fois du comportement et de l’activité des cellules directionnelles. Ces trois approches (comportement, enregistrements et perturbations) forment une triade permettant de proposer des schémas interprétatifs solides sur la genèse des signaux directionnels, pouvant potentiellement aboutir à une vision d’ensemble de la contribution des signaux vestibulaires à la capacité de s'orientater dans l'espace.

Bénéfices attendus

Ce projet vise à expliquer comment les signaux vestibulaires sont véhiculés aux structures cérébrales dont l'activité est nécessaire pour s'orienter correctement dans l'espace. Ceci permettra de mieux comprendre la nature et l'origine des déficits d'orientation spatiale et de mémoire qui sont générallement observés chez des patients ayant des atteintes du système vestibulaire.

Procédures

Les animaux seront soumis à deux interventions principales: une procédure chirurgicale et une procédure comportementale couplée à l'enregistrement neuronal. La procédure chirurgicale a une durée comprise entre 45 et 90 minutes environ, en fonction de la présence ou absence de l'étape d'implantation du plot d'enregistrement. Pour la procédure comportementale, les animaux sont d'abord maintenus doucement par l'experimentateur pour permettre le brachement du cable d'enregistrement sur le plot. Cette étape a une durée de 30-60 secondes. Afin de minimiser le stress des animaux, ils sont habitués à cette legère contention avant et après la chirurgie, au cours des séances quotidiennes de manipulation. Puis ils sont introduit dans le dispositif comportemental. Chaque session comportementale a une dure de 20-30 minutes, durant lequel le rat doit explorer une arène ou une plateforme circulaire à la recherche de nourriture, à raison de 2 sessions par jour. Cette procédure peut perdurer pendant des mois, en fonction de la qualité du signal électrophysiologique.

Impact sur les animaux

Nuisance attendues : - la chirurgie stéréotaxique, sous anesthésie générale profonde, d'une durée comprise entre 45 et 90 minutes, entraîne une lésion et du stress. Cette chirurgie permet d’injecter les vecteurs viraux dans les structures cibles (N=100, tous les rats) et d’implanter les électrodes dans le thalamus antérieur (N=90 rats). 90 rats seront soumis à l’enregistrement de l’activité neuronale au cours de deux tests comportementaux (chacun ayant une durée de 30 minutes maximum) qui seront effectués 1 fois par jour (avec un délai de 2 heures environs entre les deux tests). - le plot d'enregistrement implanté en chronique entraîne une gêne modérée de par son encombrement et son poids (5-10 g), et impose un hébergement individuel pour préserver sa fonctionnalité. Il y a donc une restriction des interactions sociales durant environ 6 mois. De plus, Il y a donc un isolement social, et un protocole de contrôle alimentaire ayant pour but de motiver les animaux à l'obtention de récompenses alimentaires, et qui entraîne une faim modérée, qui est satisfaite lors des séances comportementales. - la manipulation pour le branchement du câble d'enregistrement nécessite une légère contention de l'animal pendant quelques secondes uniquement. - en fin d'expérimentation, les animaux sont mis à mort par perfusion intracardiaque, sous anesthésie et analgésie adaptée.

Devenir

A la fin des expériences tous les animaux seront mis à mort. Cette décision découle des objectifs de l'expérimentation, à savoir la réalisation des contrôles histologiques pour vérifier la bonne expression des opsines dans les strcutures cérébrales cible et la correcte implantation des électrodes. Elle est donc prise par les responsables du projet en accord avec la Structure du Bien Etre Animale (SBEA) de l'institut de recherche.

Remplacement

La nature même des expériences ne permet pas d'envisager de remplacement. En effet, elles reposent sur l'étude du comportement des rats, ce qui ne peut pas être realisé à partir de modèles in vitro ou des modèles artificiels (basés sur des simulations sur ordinateur). Du fait du caractère invasif des procédures (injections intra-cérébrales virales, implantation d'électrodes) elles ne peuvent pas non plus être conduites chez l'humain.

Réduction

Le calcul du nombre d’animaux utilisés reflète la recherche d’un juste équilibre entre la nécessité de répliquer les observations pour obtenir des résultats statistiquement valables (les phénomènes étudiés pouvant présenter une variabilité interindividuelle importante, notamment dans l’étude du comportement) et celle de réduire la taille des effectifs. Pour cela nous allons utiliser une stratégie qui consiste en l’utilisation des mêmes animaux pour analyser les effets à la fois comportementaux et neuronaux des inhibitions optogénétiques. Les rats seront ainsi leur propre témoin en comparant les résultats obtenus durant les périodes avec et sans stimulation laser. Cette stratégie présente un réel bénéfice en terme de réduction du nombre d’animaux et en terme de pertinence scientifique et statistique tout en n’augmentant que marginalement les désagréments pour les animaux. Le nombre d’animaux ici présenté a été estimé sur la base de nos expériences antérieures à la fois sur le comportement et l'enregistrement de l'activité neuronale, et sur un test de puissance statistique permettant de reduire au maximum le nombre d'animaux tout en ayant suffisamment de données pour une inférence statistique valide.

Raffinement

Les animaux sont habitués à la manipulation et à la salle d’expérimentation pendant 10 jours avant le début du protocole expérimental afin de diminuer leur stress. La chirurgie stéréotaxique pour effectuer les injections intra-cérébrales couplées aux implantations d’électrodes est optimisée pour réduire la durée de l’opération (environ 45-90 min). La souffrance est modérée car la chirurgie est réalisée sous anesthésie profonde. Les principaux paramètres vitaux (température, fréquence respiratoire) sont contrôlés tout au long de la chirurgie. Afin de diminuer la douleur, un analgésique morphinique puissant à action prolongée est administré en préopératoire. En complément, un analgésique anti-inflammatoire est administré en début d'opération pour anticiper l’apparition d’éventuelles douleurs et hydrater l’animal. Les animaux ne présentent pas de signes de souffrance ni de stress après réveil de l’anesthésie gazeuse. Le personnel animalier et expérimentateurs s’assurent d’une bonne récupération postopératoire des animaux. Une grille d’évaluation clinique adaptée est mise en place pour déterminer les points limites adaptés et mettre en place des actions

Choix des espèces

La majorité des études portant sur la caractérisation des cellules directionnelles ont été réalisés chez le rat. De plus, notre travail s’inscrit dans la continuité d’études antérieures (publiées et en cours d’analyse) réalisées chez la même espèce. On pourra ainsi se baser sur des connaissances bien établies pour poursuivre ce projet et ainsi éviter de multiplier les expériences et l'utilisation d'un grand nombre d'animaux. Les animaux seront testés à l'âge adulte. A cette âge les réseaux neuronaux sont suffisament matures et l'activité des cellules directionnelles bien stable. Peu d'études se sont intéressés à la caractérisation des propriétés des cellules directionnelles au cours du développement, alors que la grande majorité des travaux publiés ont été effectués chez des rats adultes. Ceci nous permet de se réferer à un grand nombre de données connues, reduisant ainsi le nombre d'animaux nécessaire pour réaliser notre projet.

Pour étendre à trois autres types de dengue un candidat vaccin à ARN messager, 1 000 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. Elles reçoivent deux à trois injections dans la peau du dos ou dans le muscle, à trois ou quatre semaines d'intervalle, avec trois prélèvements sanguins à la lancette. Le porteur indique que les gonflements aux points d'injection peuvent provoquer une boiterie, et prévoit une alimentation gélifiée pour faciliter la mastication après chaque prise de sang. Son calcul de réduction aboutit à 20 souris traitées et 20 témoins par expérience, répétée trois fois, soit 120 animaux, un chiffre que rien dans le résumé ne relie au millier demandé.

Objectifs

Il existe deux vaccins vivants atténués contre la dengue. Dengvaxia® est recommandé pour les 9-45 ans en zones endémiques ayant déjà été infectés, mais augmente le risque de dengue sévère chez les non-infectés, rendant son usage inadapté pour les voyageurs. Qdenga®, un est recommandé dès 4 ans, indépendamment d'une exposition antérieure, sans risque accru de cas sévères. Il a été montré chez des personnes asymptomatiques ou peu symptomatiques infectées par le virus de la dengue une activation de la réponse immunitaire adaptative (lymphocytes T notamment) corrélée à des taux d’anticorps anti-dengue circulant plus faibles que chez les patients symptomatiques. Cette activation des lymphocytes T permet chez les patients asymptomatiques de combattre l’infection virale sans activation forte et incontrôlée du système immunitaire. Un vaccin à ARN messager un type de dengue a été développé. Notre projet vise à étendre cette approche aux 3 autres types, via un vaccin ARN. Les cellules musculaires produiront alors des protéines virales, déclenchant une réponse immunitaire. Ce vaccin pourrait être utilisé seul ou avec d'autres, notamment chez les non-exposés à la dengue, les enfants de moins de 9 ans, et les voyageurs. Nous voulons grâce à cette étude : 1.Identifier et caractériser les lymphocytes T des souris vaccinées et évaluer la quantité ainsi que la qualité de leurs réponses, validant ainsi l'immunogénicité (la capacité de protéger) de notre nouvelle formulation. 2.Utiliser notre formulation seule ou en association avec des vaccins préexistants et comparer les protections ainsi induites. 3.Mesurer la production éventuelle d’anticorps si activation des lymphocytes B. 4.Mesurer la protection induite par notre nouvelle formulation contre les quatre différents sérotypes.

Bénéfices attendus

Un vaccin qui induit des réponses des cellules T contre la dengue peut offrir plusieurs avantages importants : Bénéfices du projet à court terme : Améliorer la formulation actuelle de notre candidat vaccin en élargissant la protection que nous avons vu contre un type du virus de la dengue aux 3 autres types. Combiner notre approche ciblant une activation de la réponse cellulaire uniquement avec des vaccins plus classiques activant réponses anticorps et cellulaire pourrait nous permettre d’étudier finement les bénéfices et/ou les inconvénients de chacune des approches et d’améliorer nos connaissances en immunologie fondamentale. Bénéfices du projet à long terme : On estime à 390 millions le nombre d’infections par le virus de la dengue chaque année, dont 96 millions se manifestent cliniquement. La moitié de la population humaine vit dans des régions menacées par ce virus. Deux vaccins sont aujourd’hui sur le marché mais présentent encore des limitations dans leur recommandation, ce qui permet d’envisager le développement d’autres types de vaccins, notamment grâce à la technologie à ARN messagers qui a largement prouvée son innocuité et sa rapidité de déploiement dans la lutte contre la pandémie de SARS-CoV-2. Un vaccin efficace contre le virus de la dengue pourrait réduire l'incidence de la maladie et des complications qui lui sont associées. Largement utilisé dans les zones endémiques, il permettrait de diminuer la transmission du virus et de protéger non seulement les sujets vaccinés mais aussi les sujets non vaccinés. .

Procédures

Immunisation : Les animaux seront vaccinés 2 à 3 fois par voie intradermique au niveau du dos ou par voie intramusculaire à des intervalles de 3 à 4 semaines. Prélèvement des échantillons sanguines : Au jour 0 et 7 jours après chaque immunisation, des échantillons de sang sont prélevés. Au total seront 3 prélèvements de quelques secondes par prélèvements seront réalisés sur chaque animal au cours des expériences.

Impact sur les animaux

Les vaccins à ARN messager ont été soumis à des essais cliniques rigoureux, montrant un bon profil de sécurité et une efficacité élevée. En outre, les réactions indésirables graves sont extrêmement rares, et la technologie a fait ses preuves en termes de sécurité et d'efficacité dans plusieurs vaccins approuvés. Mais, comme tous les vaccins les principaux effets secondaires attendus sur les souris peuvent être des gonflements locaux aux sites d’injections qui peuvent induire une boiterie, mais ils disparaissent en général rapidement et les souris retrouvent leur mobilité. Les prélèvements sanguins de faible volume nécessitent uniquement une contention simple et une ponction à l'aide d'une lancette au niveau de la veine, conformément aux bonnes pratiques vétérinaires. Cette procédure peut entraîner une douleur de courte durée.

Devenir

En fin d’expérience, tous les animaux immunisés et le contrôle seront mis à mort car il est nécessaire afin de récupérer des organes pour poursuivre leur étude ex vivo.

Remplacement

Pour développer ce candidat vaccin, nous avons sélectionné des séquences de peptides immunogènes en se basant sur notre expérience, sur la littérature et sur des outils informatiques. Pour explorer notre hypothèse et valider l’immunogénicité de nos constructions, nous souhaitons utiliser un modèle animal de souris car c’est le modèle de référence pour les études vaccinales précliniques. Pour se développer, la réponse immunitaire a besoin de multiples partenaires (types cellulaires différents) interagissant au sein de tissus différents (ganglions, rate, circulation sanguine), en suivant une chronologie très précise. La réponse immunitaire se mesure dans des temps relativement longs (jusqu’à deux-trois mois dans notre étude). Pour le moment aucun modèle alternatif n’arrive à reproduire la complexité du système immunitaire c’est pourquoi nous avons besoin d’utiliser des souris pour étudier notre candidat vaccin.

Réduction

Nous avons déterminé le nombre moyen d'animaux utilisés pour les essais comparatifs d'un traitement ou d'un vaccin pour ce projet en examinant la littérature et en exécutant des tests statistiques. Par conséquent, nos groupes expérimentaux seront constitués de groupes de 20 souris (5 souris par sous groupe fois 4 conditions) tests et 20 souris témoins par expérience et chaque expérience sera répétée trois fois. Ces animaux ne peuvent pas être réutilisées car nous avons besoin de leurs organes lymphoïdes pour mener des expériences ex vivo.

Raffinement

Notre expérience précèdente a montré que l’administration de différents types de vaccins d’intérêts avec anesthésie n'entraîne pas de pathologie spécifique ni n'altèrent leur état de santé. Les immunisations seront effectuées sous anesthésie. Après l'injection, les animaux seront placés dans des boîtes préchauffées pour maintenir leur température et surveillés jusqu'à leur réveil complet. Si une boiterie est observée et persiste au-delà de 24 heures, des analgésiques seront administrés. L'alimentation sera adaptée à une texture gélifiée pour faciliter la mastication et la litière sera remplacée par un matériau plus doux. Après chaque prise de sang, l'alimentation des animaux sera adaptée pour faciliter leur mastication (à base de gel). Les animaux seront également réhydratés par une injection de solution saline physiologique afin de compenser le volume sanguin prélevé.

Choix des espèces

La souris est le modèle de référence pour les études vaccinales précliniques. Pour se développer, la réponse immunitaire a besoin de multiples partenaires (types cellulaires différents) interagissant au sein de tissus différents (ganglions, rate, circulation sanguine), en suivant une chronologie très précise. La réponse immunitaire se mesure dans des temps relativement longs (jusqu’à deux-trois mois dans notre étude). Pour le moment aucun modèle alternatif n’arrive à reproduire la complexité du système immunitaire c’est pourquoi nous avons besoin d’utiliser des souris pour étudier notre candidat vaccin. La réponse immunitaire de la souris est suffisamment proche de la réponse immunitaire chez l’homme pour que les résultats soient transférables à l’humain. La taille réduite des souris permettrait d’immuniser des groupes statistiquement pertinents des deux genres (mâles et femelles). Les souris âgées de 6 à 16 semaines seront utilisées. Cet âge garantit que leur système immunitaire soit mature pour développer des réponses contre une immunisation.

Les souris utilisées sont dépourvues de système immunitaire fonctionnel, irradiées puis greffées avec des cellules humaines pour porter une immunité qui n'est pas la leur. 320 d'entre elles vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue pour prélèvement d'organes. Elles reçoivent l'anticorps testé en intraveineuse, puis des prélèvements sanguins sous anesthésie gazeuse toutes les deux à trois semaines, puis tous les sept jours jusqu'à disparition de l'effet du produit. Le porteur présente ce modèle comme "une alternative solide à l'utilisation de primates en recherche préclinique", l'anticorps ne reconnaissant ni les cellules de rongeurs ni celles de primates.

Objectifs

L’objectif du projet est l’évaluation de l’effet pharmacologique d'un anticorps monoclonal sur les réponses immunes humaines dans un modèle murin de souris immunodéficiente humanisée. Ce modèle murin consiste à injecter les traitements chez la souris immunodéficiente préalablement reconstituée avec des précurseurs humains. D’une façon très intéressante, ce modèle nous permettra de répondre à deux questions qui sont : combien de temps et où va l'anticorps dans le corps une fois injecté, et comment agit-il sur la cible ?

Bénéfices attendus

Les résultats obtenus à l’issue de cette étude, permettront de : - Déterminer le potentiel thérapeutique de l’anticorps testé, - Suivre la cinétique de l'effet thérapeutique dans le temps, - Déterminer la dose efficace - Evaluer les caractéristiques pharmacocinétiques et pharmacodynamiques de traitement.

Procédures

- Irradiation des souris vigiles dans une boîte spéciale (3min) ; - Injection des cellules humaines et traitement en intraveineuse sur animal vigile (5min/animal, une seule fois) ; - Sous anesthésie gazeuse, des prélèvements sanguins seront réalisés sur toutes les souris (10min/souris, toutes les 2-3 semaines avant injection des traitements, puis tous les 7 jours aprés injection des traitements jusqu'a la disparition de l'effet de l'anticorps) ; - Euthanasie sous anesthésie gazeuse (6min/animal).

Impact sur les animaux

Plusieurs nuisances qui ne concernent pas que la douleur sont présentes, on note : - Le stress de l’animal à cause des manipulations fréquentes pour l’irradiation et les prélèvements, ce stress peut affecter le comportement des souris. - Risques d’infections après irradiation, au site d’injection et de prélèvement - L'exposition répétée à des procédures expérimentales peut entraîner une diminution de l'activité, un changement dans les comportements sociaux ou alimentaires.

Devenir

À la fin des expériences, les animaux seront autopsiés afin d'effectuer des prélèvements d'organes/tissus, ce qui justifie la mise à mort des souris.

Remplacement

Vu la complexité du système immunitaire, les études préalablement réalisées ne peuvent pas remplacer les études sur les organismes vivants. Il est donc nécessaire de déterminer les caractéristiques pharmacologiques du candidat médicament dans un modèle proche de l’Homme. Une alternative solide à l’utilisation de primates en recherche préclinique est le modèle de souris dites « humanisées ».

Réduction

Les caractéristiques pharmacologiques des candidats médicamenteux dans ce modèle seront analysées par le biais des tests statistiques. Le nombre d'animaux par groupe a été réduit au nombre nécessaire et suffisant pour obtenir des résultats statistiquement significatifs ; et de sorte à avoir les contrôles suffisants pour pouvoir conclure quant aux résultats obtenus.

Raffinement

La saisine a été modifiée comme suit : Au début du protocole, les souris seront réparties par groupe de 5 souris par cage, avec des moyens d’enrichissement standard à l’espèce (frisottis, dôme et tunnel). Une surveillance quotidienne des animaux en protocole sera réalisée pour déceler une éventuelle douleur, une souffrance ou un mal-être. Les animaux souffrants seront séparés des autres pour leur offrir une facilité d’accès à la nourriture et l’eau. Nous prévoyons une administration d’analgésique en sous cutané deux fois par jour pour tout animal souffrant. Ces injections seront débutées quand les souris commencent à manifester les premiers signes de souffrance (voussure de dos, légère inactivité, poils ébouriffés). A noter qu’en cas de manifestation des points limites ou en cas de souffrance non gérable par anti-douleur ; l’animal sera euthanasié. Les animaux atteignant les différents points limites ou tout signe montrant une souffrance physique caractéristique d’un mal-être, seront euthanasiés. La perte de poids sera calculée par rapport au poids initial à jour 0. Les conditions d’hébergement et de soins aux animaux seront les suivantes : les souris seront hébergées par groupe de 5 maximum dans des cages de type 2L disposées sur des portoirs ventilés ; un change de litière régulier (minimum 1 fois par semaine) sera réalisé ; un contrôle de l’alimentation et des boissons sera effectué à chaque passage, soit par l’utilisateur, soit par les animaliers. La salle d’hébergement est soumise aux rythmes jour / nuit et à une isolation efficace afin de limiter les bruits. L’accès à l’animalerie est strictement limité au personnel autorisé. Les personnels habilités à accéder à l’animalerie doivent revêtir une tenue adaptée avec charlotte, masque, sabot et gants

Choix des espèces

Nous avons choisi la souris immuno-déficiente pour deux raisons principales : * Elles présentent une facilité de reproduction, d'hébergement et de manipulation. * L’anticorps ne peut être testé que dans un modèle de souris humanisé avec des cellules humaines car il ne reconnait pas les cellules de rongeurs (absence de cross-réactivité) ou de primates. Ces souris immuno-déficientes permettent l'acceptation d’une greffe de cellules immunes humaines. Un tel protocole chez des souris immunocompétentes ne serait pas possible, les cellules et tissus humains seraient rejetés par le système immunitaire. Pour l’injection des cellules humaines, nous avons choisi d’utiliser des souris âgées de 5 semaines. C’est l’âge idéal décrits dans la littérature et de notre expérience pour injecter les cellules humaines. Pour l’injection des anticorps tests, les souris seront âgées de 18-20 semaines environ ; à cet âge-là, l’humanisation des souris est acceptable pour les pourcentages et les nombres des différentes populations cellulaires humaines répondants aux critères d’inclusion, elles ont également un poids relativement stable ce qui facilite leur manipulation, l’injection des anticorps, les prélèvements et l’évaluation physique (bien être).

Le crâne aminci et une canule posée au contact des méninges, 80 rats reçoivent des agents déclencheurs de migraine puis subissent des tests de sensibilité douloureuse de la face, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. La chirurgie dure 45 minutes, après quoi chaque rat est isolé pour protéger le dispositif implanté, et tous sont tués à l'issue d'enregistrements menés sous anesthésie sans réveil. Le projet vise à obtenir des dépressions corticales spontanées chez le rat vigile, en comparant un groupe au crâne aminci et un groupe au crâne intact. Le porteur range la douleur induite par le modèle parmi les nuisances du projet, tout en présentant le test de sensibilité faciale comme limité puisque le rat est libre de ses mouvements et peut se soustraire à la stimulation.

Objectifs

Jusqu’à présent, l’obtention de la dépression corticale (CSD, activation massive des neurones puis inhibition de ces derniers) en recherche préclinique nécessite l’injection de chlorure de potassium (KCl). Le KCl va déclencher une activation suivie d’une inhibition des neurones similaire à celle qui se produit dans le cerveau lors d'une crise de migraine avec aura (phénomène neurologique où le patient perd une partie de son champ visuel). Cependant, notre objectif serait d’obtenir des CSD spontanées après une sensibilisation du cortex, comme c’est le cas chez les migraineux. Des collègues ont mis en évidence que l’amincissement de l’os crânial provoquait des activations semblables à celles que l’on voit lors des CSD. Dans ce projet, nous voulons mettre au point un modèle d'enregistrement de CSD chez le rat vigile en comparant le modèle où on crée une sensibilisation en amincissant l’os crânial vs un modèle où l’os n’a pas été aminci.

Bénéfices attendus

A moyen terme, ce projet a pour but d’améliorer les outils existants dans la recherche pré-clinique pour étudier la physiopathologie de la migraine avec aura. Si nous arrivons à identifier de nouveaux acteurs ainsi que leurs rôles, cela nous permettra de mieux comprendre cette pathologie. A plus long terme, ces études peuvent aider à développer de nouveaux traitements pour soulager les patients souffrant de migraine avec aura.

Procédures

Les interventions dans ce projet sont prévues sur une durée maximale de 3 semaines. 1/ Injections intrapéritonéales afin d'induire l’anesthésie pour la chirurgie. 2/ Réalisation d'une chirurgie (durée 45min). 3/ injection d'agents migraineux sur les méninges à travers la canule sous anesthésie générale brève à l’isoflurane. 4/ Le test de sensibilité cutanée sur la face du rat.

Impact sur les animaux

Les nuisances identifiées pour le bien-être des animaux sont : la chirurgie (implantation des canules, amincissement de l’os) qui provoque une douleur post-opératoire, la sensibilité douloureuse liée au modèle de migraine la séparation des animaux après la chirurgie.

Devenir

Les procédures ne permettent pas de réutiliser les animaux. En effet, elles se terminent par par des enregistrements chez l’animal anesthésié sans réveil : les animaux seront donc mis à mort à la fin de la procédure.

Remplacement

Aucune méthode alternative ne permet de remplacer ce protocole. En effet il est nécessaire de réaliser ces études in vivo, car l’intégration de la douleur implique de nombreuses régions du système nerveux central et périphérique simultanément.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés sera réduit au maximum. Le nombre d'animaux est défini à partir de notre expérience et des tests statistiques donnant le nombre nécessaire pour la discrimination des effets. Ainsi dans chaque lot, nous aurons 10 animaux. Notre expérience nous a appris que nous avions environ 20% de pertes d’animaux à cause de la chirurgie, de la perte des canules ou encore des canules qui pourraient se boucher ou encore la perte du signal de courants corticaux, ou des vis d'enregistrement. A cela s’ajoute l’effet discriminant lors du test de sensibilité de la face et de la réponse électrique des neurones entre les différents groupes. Une fois l’expérience chez l’animal vigile terminée, nous réaliserons des enregistrements chez l’animal anesthésié pour obtenir plus de données et éviter un nouveau groupe d’animaux.

Raffinement

Les nuisances identifiées sur le bien-être des animaux sont : la douleur engendrée par les chirurgies, la douleur engendrée dans le cadre du modèle, et la séparation des animaux après la mise en place de la canule sur les méninges. Afin de réduire la douleur de la chirurgie, un traitement antalgique sera donné pendant 3 jours. La cornée est protégée pendant la chirurgie. Par ailleurs, la chirurgie est effectuée sous anesthésie générale, les animaux sont placés sur une couverture chauffante pendant tout le temps de la chirurgie. Le zone d'incision est désinfectée avec une solution antiseptique et elle sera la plus petite possible. La chirurgie est réalisée par une personne expérimentée pour qu’elle dure le moins de temps possible. Nous veillons à ce qu’il n’y ait aucune hémorragie à la fin de la chirurgie. Les animaux sont gardés dans la pièce de chirurgie en observation jusqu'à leur réveil complet. Concernant la douleur générée par le test de sensibilité de la face, nous en limitons la durée et l’intensité au minimum et l’animal a la possibilité d’échapper à la stimulation puisqu’il est libre de ses mouvements. Les animaux seront ensuite observés tous les jours par l’expérimentateur. Ils seront pesés tous les jours, leur vitalité sera vérifiée (déplacement, alimentation, état général, comportement douloureux). Avant chirurgie, les animaux sont hébergés dans des conditions standard. Pour améliorer le bien-être des animaux, les cages sont enrichies à l'aide de rouleaux permettant aux animaux de se cacher avant la chirurgie. Après l’implantation de la canule, les animaux auront un hébergement individuel afin de protéger les dispositifs expérimentaux. Les rouleaux seront remplacés (protection des dispositifs expérimentaux) par des feuilles de sopalin blanc et des lanières de papier kraft pour permettre aux animaux de faire un nid. Au cours de l'expérimentation, les animaux seront observés tous les jours pour déterminer la présence ou non d’un ou plusieurs points limites adaptés à notre expérimentation. Selon notre arbre décisionnel, nos points limites seront considérés comme les critères d’arrêt des souffrances des animaux et entraineront la mise à mort de l’animal après une sédation.

Choix des espèces

Le rat de souche Sprague-Dawley est couramment utilisée au sein du laboratoire depuis de nombreuses années et dans les études précédentes sur le sujet dans d’autres laboratoires. C’est par ailleurs un des modèles les plus utilisés pour les études comportementales dans le domaine de la douleur. Les animaux seront âgés de 7-12 semaines pour la comparaison avec les autres données de la littérature : les rats sont considérés comme adultes.

5 720 souris vont être utilisées pour une intervention de trente minutes chacune, l'implantation d'un dispositif dans la mâchoire sous anesthésie générale, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles portent une mutation qui altère leur dentition et les expose à des difficultés de mastication et à une perte de poids pendant toute leur vie, indépendamment de la chirurgie. L'objet du projet est de tester des membranes synthétiques censées remplacer les greffes osseuses de la mâchoire chez de jeunes patients atteints d'une maladie génétique rare. Toutes sont tuées, une partie pour génotypage non conforme, les autres pour prélèvement de tissus, et le porteur ramène l'effectif à un calcul de puissance sans donner ni le nombre de groupes ni le nombre d'animaux par groupe.

Objectifs

La pathologie d’intérêt est une maladie génétique rare avec des conséquences variées incluant des troubles dans le développement des dents et des mâchoires, avec des complications osseuses et métaboliques associées. Dans les défauts dentaires, cette pathologie est très fréquente et représente environ 52% des cas, représentant alors un enjeu de santé publique majeur. A l’heure actuelle, les troubles dentaires et osseux de la mâchoire sont traités par réhabilitation orale incluant des implants, greffes osseuses et des prothèses. Il s’agit d’une procédure clinique chirurgicale en deux étapes à savoir une greffe osseuse pour établir un volume osseux suffisant puis une pose d’implant dentaire, avant la phase prothétique. La procédure est lourde et à l’origine de risques de comorbidités et de douleur importants, et ce avec des résultats à long terme non optimaux chez les patients atteints de la mutation ciblée. Nous proposons une stratégie efficiente et novatrice utilisant un implant pour remplacer les greffes osseuses afin de régénérer l’os au niveau de la mâchoire pour une population souffrant de sévères lésions osseuses dans le cadre de la pathologie ciblée, en particulier pour un public de jeunes patients. L’objectif principal est donc de répondre au besoin de stratégies thérapeutiques, notamment pour la reconstruction de la mâchoire, via une procédure légère et peu traumatique pour ces patients que ce soit au niveau psychologique ou physique, avec des complications et une douleur post-opératoire largement diminuée par rapport aux standards actuels. Notre stratégie sera évaluée In Vivo sur des souris portant la même mutation que l’homme. Cette phase permettra d’évaluer le potentiel de régénération osseuse des implants dans un contexte se rapprochant le plus des conditions cliniques existantes (opération chirurgicale, incision, troubles métaboliques sur modèle vivant).

Bénéfices attendus

Ce projet a pour but d’évaluer des options thérapeutiques moins invasives que les greffes osseuses tout en étant plus efficace pour ces patients. Notre objectif est donc d’optimiser la régénération osseuse en chirurgie maxillo-faciale ou traumatologique en développant des membranes synthétiques bioactives tout en privilégiant une approche peu invasive avec une diminution la douleur et du temps de cicatrisation. Ce projet permettra donc de mettre au point un protocole thérapeutique apte à répondre à la problématique des déformation osseuses au niveau de la mâchoire liées aux mutations génétiques.

Procédures

Un prélèvement pour génotypage sur animal vigile sera effectué. Une implantation sous anesthésie générale d’une durée de 30 min au niveau de la mâchoire.

Impact sur les animaux

La chirurgie induit une douleur modérée ainsi qu'une perte de poids principalement sur les 2 semaines post-opératoires. Le modèle génétiquement modifié ayant une dentition altérée, ces souris pourraient avoir des difficultés à mastiquer induisant un risque de perte de poids et ce tout au long de leur vie. L'implantation permet toutefois la reconstruction osseuse de la mâchoire.

Devenir

Les animaux seront mis à mort pour génotypage non conforme et prélèvement de tissus pour analyse post-mortem

Remplacement

Après des études in vitro validant la non-toxicité et la biocompatibilité des implants, il est nécessaire de passer à des études in vivo étant donnée la complexité de l'environnement osseux et oral. Les modèles in vitro, possibles grâce à la collecte de cellules sur les modèles de l’étude, seront utilisés pour permettre une première évaluation, mais ils ne permettent pas de reproduire l’ensemble des paramètres lié à la régénération de l’os (inflammation, recrutement cellulaire, vascularisation, minéralisation…). La solution thérapeutique développée implique de plus un acte chirurgical. La faisabilité technique de cet acte n’est pas possible in vitro. De plus, la gestion de la douleur peri- et post-opératoire est une donnée importante à minimiser : cet élément n’est pas reproductible sur d’autres modèles. Ainsi, il n’existe à ce jour pas de modèle alternatif pour ce type d’étude.

Réduction

La réduction des effectifs est liée à une approche statistique adéquate et à l'utilisation de modèles standardisés. L’effectif animal de chaque groupe a fait l’objet d’une évaluation statistique via calcul de puissance. Globalement, la stratégie tendra à diminuer le nombre total d’animaux en priorisant certaines stratégies.

Raffinement

Tous les actes chirurgicaux seront réalisés sous anesthésie générale. De plus, une anesthésie locale et des traitements antidouleurs seront appliqués pour réduire la douleur péri- et post-opératoire. Compte tenu des potentielles douleurs pouvant être générées suite aux actes, un suivi rigoureux après l’intervention et une prise en charge précoce de la douleur seront effectués, en cas de signes de souffrance animale. Les animaux seront hébergés en groupes sociaux dans des conditions optimales. L’environnement des cages est enrichi à l’aide de carrés de cellulose et de frisure pour la construction des nids, de tunnels pour permettre aux animaux de se cacher et ainsi diminuer le niveau de stress. La nourriture sera adaptée pour les rongeurs ayant cette condition et l’eau de boisson seront donnés ad libitum. Des points limites ont été établis pour soustraire l'animal à la souffrance.

Choix des espèces

Le modèle de la souris, un modèle d’étude vivant, a été sélectionné pour vérifier la régénération osseuse induite par un dispositif implantable formulé car malgré les variations inter-espèces, le phénotype dentaire chez la souris de la pathologie étudiée est reproduit. De plus, nous avons à disposition des techniques et des outils micro-chirurgicaux développés à ses fins permettant d’étudier la régénération osseuse de la mâchoire chez la souris. Les souris génétiquement modifiées utilisées pour nos procédures constituent donc un bon modèle pour mieux comprendre la maladie étudiée et la réponse métabolique aux traitements.

Sous une anesthésie de trois heures, des brebis subissent une mastoïdectomie, le fraisage de l'os derrière l'oreille, pour recevoir du gadolinium dans l'oreille interne, par ultrasons d'un côté et par injection de l'autre, avant deux heures d'imagerie. 23 brebis vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, avec une seconde anesthésie pour prélever le liquide de l'oreille interne. Le porteur annonce vouloir vérifier l'absence de retentissement sur l'audition, l'équilibre et la symétrie du visage, et cite comme effets néfastes le stress de la contention et un hématome possible. Toutes les brebis sont tuées à l'issue en raison, écrit-il, d'une "perte de la fonction auditive irréversible", de "vertiges incoercibles" et d'une "paralysie faciale empêchant une alimentation normale". Il annonce 23 brebis, puis juge raisonnable d'en inclure 12, plus 2 en cas de problème.

Objectifs

L'objetif principal de notre projet vise à étudier la diffusion de molécules de gadolinium au sein de l'oreille interne en comparant les injections transtympaniques classiques versus l'utilisation d'ultrasons. Les objectifs secondaires sont de vérifier l'absence de retentissement sur la fonction auditive après la réalisation des séances de ces techniques et à distance (J7 de la délivrance), une conservation de l'quilibre et de la symétrie du visage, et l'absence d'altération de la composition des liquides de l'oreille interne suite à ces procédures.

Bénéfices attendus

Si les résultats du projet sont démontrés, c'est-à-dire une amélioration de la diffusion du gadolinium à l'oreille interne par sonoporation (avec ou sans microbulles chargées) avec absence d'effets indésirables à court et long terme, cela permettra de proposer un nouveau mode de diffusion chez l'Homme. Cette méthode permettrait d'obtenir une meilleure diffusion le long de la cochlée et des concentrations plus élevées d'agents thérapeutiques au sein de la cochlée. Par la suite, il sera nécessaire de développer une sonde spécifique pour l'Homme, de réaliser de nouvelles expérimentation avec d'autres molécules. Cependant, cette étape préliminaire reste indispensable à la poursuite du projet. Cette voie de délivrance par sonoporation à l'oreille interne pourrait par la suite avoir un rôle thérapeutique notamment pour traiter certaines atteintes de l'oreille interne comme la surdité brusque, la maladie de Menière où actuellement les injections transtympaniques sont privilégiées. Il pourrait aussi s'agir d'une voie de délivrance dans le cadre de la thérapie génique pour les surdités d'origine génétique.

Procédures

La majorité des actes auront lieu sous anesthésie générale, il s'agit de la mesure des seuils auditifs, de l'abord chirurgical avec la délivrance de molécule, de l'imagerie et du prélèvement de liquide de l'oreille interne. La durée de la première anesthésie générale sera de 3H (1H de chirurgie et 2 H d'imagerie). La seconde anesthésie générale durera 30 minutes, il sera effecué le prélèvement de liquide de l'oreille interne au cours de cette chirurgie.

Impact sur les animaux

Les brebis incluses subiront deux anesthésies générales. Lors de la première, il sera effectué une mastoïdectomie avec délivrance de molécules. Lors de la seconde, il sera effectué un prélèvement de périlymphe. La contention effectuée pour l'induction des 2 anesthésies peut engendrer du stress pour l’animal, et l'injection de produit anesthésiant par voie intraveineuse à la jugulaire peut provoquer un hématome.

Devenir

L'ensemble des brebis seront euthanasiées suites aux procédures compte tenu de la perte de la fonction auditive irréversible, de vertiges incoercibles empêchant une mobilité normale et d'une paralysie faciale empêchant une alimentation normale. Ainsi ces pertes de fonctions auront un retentissement majeur dans la vie quotidienne des brebis.

Remplacement

Des études pré-cliniques chez l'animal sont nécessaires afin de s'assurer de la bonne diffusion des molécules utilisées suite à la sonoporation au sein de l'oreille interne. L'utilisation de modèles animaux autorise aussi la vérification de l'absence d'évènements indésirables, et le prélèvement de liquide de l'oreille interne. Cette étude permettra de s'assurer de la supériorité de la sonoporation pour la diffusion du gadolinium au sein de l'oreille interne et de vérifier l'absence de déficit (auditif, vestibulaire ou de la fonction faciale). Le modèle animal ne peut être substitué par un modèle in-vitro ou in silico à ce jour.

Réduction

Sur la base d'une étude statistique et bibliographique, notre étude nécessite l'inclusion de 23 animaux. Afin de réduire le nombre d'animaux utilisés, chaque brebis sera son propre témoin avec un côté où il sera effectué une délivrance de gadolinium par sonoporation et un autre une délivrance par injection en regard de la fenêtre ronde pour vérifier l'hypothèse d'une meilleure diffusion par sonoporation. L'hypothèse d'une amélioration de la diffusion de 60% +/- 30 % du gadolinium par la sonoporation sera vérifiée par un test statistique approprié, ainsi que l'absence de baisse des seuils auditifs. Le calcul d'effectif indique qu'un groupe de 6 sera suffisant pour confirmer cette hypothèse. En métabolomique (pour l'analyse de la périlymphe), il n'existe pas de recommandation sur le nombre minimum de sujets. Cependant nos précédentes études sur le sujet ont montré que l'inclusion de 6 sujets avait permis de faire ressortir des groupes statistiquement différents en utilisant des analyses statistiques adaptées. Notre expérience, sur le prélèvement de périlymphe, nous a permis de le réaliser systématiquement sur une oreille normale jamais opérée. La principale contrainte était le faible volume prélevé qui a été résolu par validation de la technique d'analyse. Ainsi, nous estimons que 12 brebis incluses au total serait raisonnnable pour ne pas augmentrer le nombre d'animaux tout en ayant des résultats si nos hypothèses se vérifient. 2 animaux supplémentaires seront prévus en cas de problème.

Raffinement

Anesthésie : les animaux arriveront la veille de la 1ère anesthésie, et seront mis à jeun 15h avant l’intervention, avec abreuvement adlibitum. Induction intraveineuse, puis maintien au masque avec inhalation d’un mélange gazeux d’oxygène et de gaz anesthésiant pour obtenir un relachement musculaire suffisant avant intubation. Chirurgie et Per-imagerie - Anesthésie : Les brebis seront maintenues sous O2 à la fin de la première anesthésie pour améliorer la qualité et la rapidité du réveil. Dès que l’animal présentera les premiers signes de déglutition ou de clignement des paupières, il sera extubé. Les animaux sont logés en cases collectives sur paille, et manipulés dans le calme. Le monitoring des constantes sera effectué lors de l'anesthésie générale afin de détecter une douleur peropératoire nécessitant une adaptation de l'analgésie et/ou de la profondeur de l'anesthésie. La réalisation d'une anesthésie locale permettra de minimiser la douleur per opératoire. Ces injections seront renouvelées en cas de douleur de l'animal . Une table chauffante sera utilisée pendant la durée de l'anesthésie générale pour éviter tout épisode d'hypothermie. La douleur post-opératoire sera aussi monitorée avec l'échelle visuelle en pièce jointe et l'analgésie revue en cas de douleur.

Choix des espèces

La brebis est l'animal que nous désirons utiliser pour ces recherches sur l'oreille interne car elle présente un spectre auditif comparable à l'Homme et une anatomie de l'oreille interne semblable à l'Homme en terme d'anatomie et de dimensions. La chirurgie de la brebis est comparable à celle de l'homme pour l'accès à l'oreille interne. Le sexe féminin est à privilégier compte tenu des difficulté d'accès à l'oreille interne chez le bélier. En effet, l'épaisseur de la corticale du bélier rend le fraisage difficile et très long. Enfin, le volume de liquide endocochléaire prélevé chez la brebis est comparable au volume qu'il est possible de prélever chez l'Homme rendant possible les études en métabolomique sur ce liquide. Les animaux utilisés seront âgés de plus d'un an car à cet âge, la maturation du système auditif est atteinte. Afin de constituer un groupe homogène, les brebis seront âgées de 2 à 3 ans.

Inoculées à 14 jours avec un virus de la maladie de Marek modifié pour être suivi par fluorescence, 54 poules subissent ensuite six prélèvements de sang et quatre prélèvements de plumes sur animal éveillé. Ces procédures sont déclarées d'un niveau de souffrance modéré, alors que le porteur décrit une maladie hautement contagieuse et fatale pour la majorité des oiseaux infectés et attend que la plupart des animaux inoculés la développent en 63 jours, avec fièvre, ataxie, difficultés respiratoires et fatigue. Toutes les poules sont tuées en fin d'expérience pour prélever organes et plumes, les plus atteintes étant tuées plus tôt. Le porteur retient le poulet parce que cet herpèsvirus ne provoque des lymphomes que chez les gallinacés, ce qui exclut selon lui tout modèle animal moins sensible.

Objectifs

Le virus de la maladie de Marek est un herpesvirus aviaire hautement contagieux et entrainant des lymphomes mortels pour les animaux en quelques semaines. Ce virus se transmet entre animaux par l'intermédiaire de poussières d'élevage contaminées. Les virions présents dans l'environnement sont excrétés à partir des follicules plumeux infectés, contaminant durablement l'environnement. En effet, l'infectiosité de ce virus dans l'environnement perdure pendant plusieurs mois, ce qui est tout à fait inhabituelle pour un herpesvirus. L’objectif de ce projet est d’approfondir les connaissances sur l'excrétion de ce virus dans l'environnement en suivant les particules virales par imagerie dans les plumes et dans les poussières et de caractériser la nature du matériel infectieux. Ce virus permettra aussi d'approfondir nos connaissances sur la latence et la réactivation virale dans les tumeurs et la rate aux stades tardifs de la maladie. Dans le cadre de ce projet, nous proposons de générer un nouveau virus avec un système innovant qui permet de suivre le génome viral par fluorescence. Il sera validé en culture de cellule avant d'être testé in vivo chez le poulet. L’approche in vitro a montré ses limites, car elle ne permet pas la formation de tumeurs dans leur environnement naturel ni l'excrétion virale telles que décrites à partir des plumes avec la libération de virions infectieux, à haut titre, indépendamment de cellules vivantes.

Bénéfices attendus

Le suivi du génome viral en fluorescence dans les tumeurs, les rates, les plumes et les poussières d'élevage requiert un volet in vivo. Aucun nouveau virus n'a jamais été décrit pour MDV (virus de la maladie de Marek). Au travers de ce projet, nous espérons (i) visualiser les particules virales matures dans l'épithélium des plumes et dans les poussières de l'environnement; (ii) visualiser les cellules infectées (en latence et/ou en réactivation (centre de réplication)) dans les tumeurs et les rates, voire de les quantifier ; (iii) collecter des poussières infectieuses pouvant servir de matériel pour déterminer la nature des poussières infectieuses (taille) mais aussi l'ultrastructure des particules virales dans les poussières après enrichissement sur la base de la fluorescence. Les poussières d'élevage pourront aussi servir de matériel pour réinfecter des animaux, mais aussi pour développer un test d'infectiosité avec des cellules en culture. Les bénéfices sont donc à répartir sur plusieurs niveaux : - Maladie de Marek : Meilleure caractérisation de la maladie par une détection des cellules infectées directement dans les tissus par imagerie. - Virologie : Méthode pour visualiser les particules virales MDV dans les plumes et les poussières. Description de la nature des particules virales excrétées présentes dans les poussières et des poussières contaminées. Capacité à infecter des cellules directement à partir de poussières infectieuses. - Diagnostic : Méthode pour l'évaluation de l'infectiosité des poussières dans un système en culture. Aucune méthode de ce type n'existe actuellement.

Procédures

une inoculation de virus sur animaux vigiles + 6 prélèvements de sang sur animaux vigiles + 4 prélèvements de plumes sur animaux vigiles. Durée de chaque acte : moins d’une minute

Impact sur les animaux

(i) Hébergement. L’hébergement des animaux en isolateurs est nécessaire dans le cadre des recherches portant sur le virus de la maladie de Marek afin de protéger l'environnement de la contamination par le MDV. L’hébergement en isolateurs peut induire une compétition sur les ressources alimentaires en fonction de la fréquence des nourrissages. (ii) Maladie de Marek. La maladie de Marek est une maladie virale hautement contagieuse et fatale pour la majorité des animaux infectés. Il est attendu que la majorité des animaux inoculés développent la maladie durant le temps de l’étude (63 jours). Parmi les symptômes de la maladie de marek qui conduisent à un mal être de l’animal, sont retrouvés : fièvre, ataxie, difficultés respiratoires, fatigue. (iii) Gestes techniques. Les injections et prélèvements de sang et de plumes entraineront un stress chez les animaux concernés. Ces manipulations entraineront également des douleurs ponctuelles au niveau du site d'injection ou de prélèvement.

Devenir

En fin d’expérience, tous les animaux seront euthanasiés pour réaliser différents prélèvements d'organes et de plumes.

Remplacement

Il est impossible de remplacer le modèle par des approches in vitro ou in silico car les méthodes actuelles n‘offrent qu‘une approche limitée de la maladie. Notamment, il n‘est pas possible d‘étudier in vitro la lymphomagenèse et l'excrétion à partir des plumes sous la forme de poussière. L’utilisation d’un autre modèle animal, moins sensible, est également impossible car cet herpèsvirus n’infecte que les gallinacés.

Réduction

Le nombre d’animaux nécessaire par groupe a été déterminé statistiquement sur la base de résultats d’expériences précédentes avec des constructions de virus mutants. Ce nouveau virus est construit de la même façon.

Raffinement

Les animaux seront maintenus en groupe dans des isolateurs adaptés en nombre et en taille, dans des conditions environnementales contrôlées, avec nourriture et boisson à volonté. Ils bénéficieront d’un enrichissement social. Dans les isolateurs, des objets à picorer seront à disposition. Une visite des animaux sera effectuée 2 fois par jour par le personnel technique qualifié. Les animaux présentant des symptômes graves seront euthanasiés après confirmation du diagnostic de la maladie de Marek. Les animaux présentant des symptômes légers seront surveillés plus attentivement pour détecter l'apparition de nouveaux symptômes. Les euthanasies seront réalisées par injection de pentobarbital. L'ensemble des gestes techniques est assuré par du personnel formé et compétent, ce qui limitera le stress des animaux. La contention sera effectuée en douceur et les prélèvements seront réalisés le plus rapidement possible. Les prélèvements de petites plumes et de sang seront réalisés simultanément pour limiter le stress. Le nombre de prélèvements sera réduit au minimum et espacés au minimum de 7 jours pour limiter la manipulation et la souffrance liées aux prélèvements répétés. Dans le cas des prélèvements de plumes, de petites plumes seront prélevées, ce qui limite la douleur par rapport aux prélèvements de plus grosses plumes. Afin de limiter la douleur lors de l'inoculation du virus, nous utiliserons des seringues à insuline et des aiguilles courtes et fines. Les injections seront réalisées sous PSM (poste sécurité microbiologique) avant l'entrée des animaux dans les isolateurs afin de faciliter la manipulation, notamment la contention des animaux et ainsi rendre l’injection plus simple et moins stressante pour les animaux.

Choix des espèces

Le virus de la maladie de Marek ne provoque des lymphomes que chez les gallinacés. De plus, chaque année, malgré la vaccination, des élevages de poulets présentent des cas de maladie de Marek. Cela peut être dû à une mauvaise vaccination, à des souches hypervirulentes ou à des environnements très contaminés. Pour des raisons techniques, les poulets seront infectés à l’âge de 14 jours. Ils seront euthanasiés à maximum 78 jours d’âge. L’âge d’inoculation de 14 jours a été choisi car il permet de commencer les prélèvements sanguins dès le début de l’expérience, tout en restant suffisamment sensible à la maladie pour obtenir des résultats robustes en un minimum de temps.