Procédures modérées

Des cellules cancéreuses sont injectées dans la veine de la queue ou sous la peau de souris sans poils, l'expansion tumorale gagnant les membres inférieurs et le bassin jusqu'à gêner progressivement les déplacements. 576 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, avec 10 à 12 prélèvements sanguins hebdomadaires sur animal éveillé et jusqu'à huit séances d'imagerie sous anesthésie. Toutes sont tuées entre la douzième et la quatorzième semaine, quand la greffe est jugée assez développée pour l'analyse. Le porteur ne retient des gestes pratiqués qu'une douleur "légère et de courte durée", et lit les mouvements d'étirement des pattes comme le signe d'une greffe réussie qui évolue.

Objectifs

Le projet vise à démontrer, chez l’animal, comment deux gènes mutés dans la même cellule contribuent au développement de la mastocytose, une maladie qui affecte plusieurs organes ou uniquement la peau. Nous pourrons ainsi valider les observations réalisées in vitro sur l'implication de nouveaux gènes dans la maladie et qui soulignent la nécessité de développer des traitements personnalisés ciblant les effets de ces gènes sur les patients. Avant de tester de nouveaux médicaments, il est crucial de comprendre comment ces gènes influencent la maladie.

Bénéfices attendus

Les résultats de ce projet confirmeront la nécessité de développer des thérapies personnalisées ciblant les dérégulations qui ont lieu chez les patients. La réalisation de ce projet est indispensable avant de prévoir l’étude préclinique qui consistera à tester l’efficacité de nouvelles drogues. Cette stratégie a démontré son efficacité dans notre précédente étude.

Procédures

Une seule injection de cellules cancéreuses sera réalisée chez les souris, soit par voie intraveineuse (dans la veine) soit par voie sous-cutanée (sous la peau). L’injection, effectuée sous anesthésie générale (pour les injections sous la peau) ou sans anesthésie (pour l'injection dans la veine de la queue), dure seulement quelques secondes. Un petit échantillon de sang sera prélevé chaque semaine sur les souris, avec un total de 10 à 12 prélèvements ; chaque prélèvement dure moins de 5 secondes (animal éveillé). Ces animaux seront également examinés par imagerie 3 à 5 fois au total. Les deux méthodes d’analyse sont complémentaires pour le suivi précis de la cinétique de multiplication des cellules. Pour les souris ayant reçu une injection sous-cutanée, un seul prélèvement de sang sera réalisé à la 10ème semaine, pour vérification, car les cellules ne devraient pas migrer dans le sang. Le suivi de la greffe cutanée est fait par imagerie (8 au total). L’imagerie est réalisée sous anesthésie générale et dure maximum dix minutes.

Impact sur les animaux

L’anesthésie générale provoque une baisse de la température corporelle, un assèchement des yeux et un stress dû à la manipulation. L’injection des cellules pourrait provoquer une douleur légère et de courte durée après le réveil. L’imagerie peut entrainer du stress et une gêne de courte durée liée à l’anesthésie. Les prélèvements de sang, bien que brefs, peuvent provoquer du stress et une douleur légère durant les minutes qui suivent le réveil. L’expansion des cellules au niveau cutané peut provoquer des démangeaisons. L'expansion des cellules préférentiellement au niveau des membres inférieurs et du bassin, peuvent entrainer une difficulté progressive de se mouvoir. Des mouvements d’étirements des pattes indiquent une greffe réussie qui évolue, à surveiller de près.

Devenir

Les animaux utilisés sont euthanasiés entre la 12 et la 14 semaine suivant l’injection des cellules, ce délai correspondant au stade où la greffe est suffisamment développée pour permettre l'analyse des souris.

Remplacement

Au cours des trois dernières années, nos recherches en laboratoire ont cherché à comprendre comment certains gènes interagissent dans la mastocytose, un type de cancer qui peut se manifester soit dans plusieurs organes, soit uniquement sur la peau. Cependant, ces études en laboratoire ont leurs limites, car elles ne reproduisent pas entièrement les conditions réelles, où l'environnement autour des cellules joue un rôle crucial dans le développement du cancer, sa propagation et la résistance aux traitements. Les souris sont essentielles pour recréer, même partiellement, les conditions pathologiques chez les humains et pour explorer comment les gènes interagissent afin de tester de futurs traitements. Par exemple, pour mieux étudier la forme cutanée de la maladie, nous utilisons des souris sans poils. Ce modèle nous aide à suivre de près comment les cellules cancéreuses envahissent la peau, de manière similaire à ce qui se passe chez les patients.

Réduction

Nous avons choisi deux types de souris pour notre étude en raison de leur pertinence pour notre travail et de leur utilisation fréquente en recherche. Le premier type nous aide à étudier le cancer quand il touche différents tissus dans le corps, tandis que le second est utilisé pour observer la forme du cancer qui se manifeste uniquement dans la peau. Grâce à notre expérience et aux informations recueillies de précédentes études, nous savons combien de cellules injecter, comment les tumeurs se développent avec le temps, à quelle fréquence nous devons prélever du sang, quand et comment réaliser l’imagerie et quand il est nécessaire de mettre fin à l’étude.

Raffinement

Dans le cadre de notre projet, nous mettrons en place des méthodes de raffinement qui visent à garantir que les modèles animaux sont traités de manière éthique et que leur bien-être est pris en compte. 1.Anesthésie pour réduire la douleur et l'inconfort des animaux. 2.La surveillance régulière de la santé des animaux permet de détecter rapidement toute anomalie ou signe de détresse, ce qui permet une intervention précoce. 3. Enrichissement de l'environnement avec des éléments tels que des abris, des jouets, ou des matériaux à mâcher pour stimuler les comportements naturels et améliorer le bien-être des souris.

Choix des espèces

Le modèle souris s'avère particulièrement approprié pour notre étude sur la mastocytose, car il répond à notre besoin de comparaison avec la pathologie observée chez les patients et repose sur des recherches préexistantes, éliminant ainsi la nécessité de mises au point supplémentaires. Les souris seront greffées entre 5 et 8 semaines d'âge. Les expériences antérieures montrent que ce stade est optimal pour une bonne prise de greffe dans les deux souches, bien qu'il soit possible de les greffer jusqu'à 12 semaines d'âge.

72 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour la collecte de sang et de tissus, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune subit une chirurgie stéréotaxique de vingt à vingt-cinq minutes pour l'implantation d'une canule dans le bulbe olfactif, puis vit isolée pour que le dispositif ne soit pas abîmé. Suivent un test de tolérance au glucose de deux heures avec prélèvements sanguins répétés à la queue, cinq heures de privation de nourriture, et un test consistant à chronométrer le temps mis pour retrouver un morceau de cookie au chocolat enfoui dans la litière. L'espoir affiché, un traitement contre l'obésité, repose sur l'hypothèse qu'une protéine stimulerait l'appétit en améliorant l'odorat. Le porteur affirme avoir calculé l'effectif au plus juste, sans donner ni méthode ni chiffre.

Objectifs

La protéine ACBP se lie aux acides gras et interagit avec d’autres molécules. Chez les humains, elle est présente à des niveaux plus élevés chez les personnes obèses et plus faibles chez celles souffrant d’anorexie. Chez les rongeurs, elle stimule l’appétit : lorsqu’on leur administre de l’ACBP, ils mangent davantage et prennent du poids, ce qui peut mener à l’obésité. La majorité des recherches ont étudié son action sur l’hypothalamus, mais son rôle dans le bulbe olfactif (zone du cerveau liée à l’odorat) reste peu exploré, bien qu’il soit connu qu’ACBP y est bien exprimée avec son récepteur GABAarD, rendant son étude dans cette zone pertinente. Puisque l’odorat influe sur l’alimentation, l’ACBP pourrait, en améliorant l’odorat, stimuler l’appétit. Bloquer cette protéine pourrait donc réduire la consommation de nourriture et offrir une piste de traitement contre l’obésité. Pour tester cela, nous allons injecter ACBP dans le bulbe olfactif de souris ou utiliser des anticorps pour bloquer son action, en comparant avec un groupe témoin. Pour se faire, 2 groupes distincts seront mis en place : un premier pour évaluer les effets immédiats sur l’odorat et la régulation du glucose et un second groupe recevra des injections similaires pour observer leur prise alimentaire, avec ou sans aliments appétents. Ce projet cherche à mieux comprendre l’influence d’ACBP sur l’odorat et l’appétit, avec l’espoir de développer des traitements contre l’obésité.

Bénéfices attendus

Chez les rongeurs, la protéine ACBP influence l’alimentation : quand on leur administre cette protéine, ils mangent plus, prennent de la graisse et deviennent obèses sur le long terme. La plupart des études ont examiné l’effet de l’ACBP sur une région du cerveau appelée l’hypothalamus, mais on sait peu de choses sur son rôle dans le bulbe olfactif, la partie du cerveau responsable de l’odorat. Pourtant, l’odorat joue un rôle clé dans l’alimentation. Si l’ACBP améliore l’odorat, cela pourrait expliquer pourquoi les souris mangent davantage. À l’inverse, bloquer cette protéine pourrait réduire l’appétit. Cela pourrait offrir une nouvelle piste pour traiter des maladies comme l’obésité et ses complications.

Procédures

Dans cette étude, les souris subiront une opération d'environ 20 à 25 minutes pour installer un tube dans leur bulbe olfactif, permettant d’y injecter les protéines nécessaires. Ensuite, pour évaluer comment leur corps utilise le glucose, un test de tolérance au glucose sera effectué : leur taux de glucose dans le sang sera mesuré à plusieurs moments (0, 15, 30, 45, 60, 90 et 120 minutes) en déposant une goutte de sang sur un appareil similaire à ceux pour humains. De petites quantités de sang (environ 20 microlitres) seront également prélevées aux temps 0, 15 et 90 minutes pour mesurer l’insuline, l’hormone qui régule le glucose, ce qui suffira pour suivre son évolution tout en limitant le volume de sang prélevé. Les tests de tolérance au glucose et à l'insuline durent chacun deux heures. De plus, pour évaluer l'impact de la molécule dans le bulbe olfactif sur la recherche et/ou l'envie pour de la nourriture palatable, des tests comportementaux seront réalisés une fois sur chaque animal, en espacant chacun des tests (métabolique et comportemental) de deux semaines. Le "buried-food test", traduit comme le test de la nourriture enfouie, consiste à mesurer le temps que met la souris à retrouver un bout de nourriture, le plus souvent un morceau de cookie au chocolat odorant, caché dans la litière. Il dure quelques dizaines de minutes et permet d'estimer la performance olfactive de l'aimal, accompagnée de la motivation à chercher de la nourriture. La prise alimetaire d'aliment standard ou d'aliment palatable est également évaluée pendant 3h après une courte période privation de nourriture (5h), ce qui permet de voir si l'animal présente une modulation de son appétit selon la catégorie d'aliment.

Impact sur les animaux

Les animaux subiront une chirugie stérotaxique, avec inhalation d'anésthesiant et injection d'analgésiant, cependant une douleur modérée est susceptible d'être ressentie au réveil. Concernant les tests de tolérance au glucose et à l'insuline, des nuisances légères peuvent survenir avec les prélèvements de sang à la queue de l'animal (légère douleur) , et avec un faible risque d'hypoglycémie suite à l'administration d'insuline. Les tests comportementaux (capacité olfactive pour retrouver un aliment enfouï, et prise alimentaire) ne présentent pas d'effets indésirables hormis la privation de nourriture préalable au test. Après la chirurgie, les animaux sont isolés afin d'éviter que les cannules de perfusion ne soient endommagées, ce qui représente un stress dû à l'isolement susceptible d'être ressenti par les animaux.

Devenir

Tous les animaux sont mis à mort à la fin de l'étude, afin de collecter du sang et des tissus pour analyses ultérieures. Au cours des procédures, si l'animal ne se remet pas correctement de la chirurgie ou qu'un problème survient malgré le suivi post opératoire, perte de poids ou autres problèmes de santé ou de bien-être (problème de locomotion, prostration et qualité du poil, etc.)), l'animal sera mis à mort.

Remplacement

Le contrôle du métabolisme fait intervenir de nombreux organes (foie, intestin, cerveau, muscles, tissus adipeux) qui communiquent entre eux en permanence pour informer l'organisme des besoins énergétiques et contrôlent les flux d'énergie en fonction des besoins. Il est impossible de mimer in vitro toutes ces interactions et c'est pour cela que l'utilisation des modèles animaux est encore nécessaire.

Réduction

Le nombre d'animaux utilisé a été calculé pour que les tests statistiques puissent être fiables et robustes, évitant ainsi de réitérer les expériences, tout en utilisant le nombre d'animaux le plus faible possible.

Raffinement

Nous avons prévu les prélèvements de sang en calculant au plus près les volumes nécessaires aux mesures de l'insuline donc les volumes sont minimes, afin de peu impacter le bien-être animal. Concernant la chirurgie stéréotaxique permettant d’installer les canules d'injection dans le bulbe olfactif, intervenant dans les 2 procédures (et donc toute l’étude), nous avons mis en place une anesthésie et analgésie adaptée avant, pendant et après la chirurgie. Les animaux seront maintenus isolés après chirurgie dans des cages standards avec des milieux enrichis (nids végétaux, tubes) ce qui permettra d'améliorer leur bien-être. Ils seront également observés quotidiennement afin d'identifier les animaux en souffrance et éventuellement d'euthanasier les animaux dont les points-limites auraient été atteints. Une légère perte de poids peut-être observée après les premiers jours suivants l’opération, et un complément alimentaire de type gel enrichi en calorie pourra être proposé aux animaux pour leur permettre une meilleure récupération. Cependant, après une semaine, les animaux qui sont en perte constante de poids (supérieure à 15% de leur poids initial) seront mis à mort. A tout moment, si un point limite est atteint l'animal sera mis à mort pour éviter toute souffrance.

Choix des espèces

Nos modèles murins, les souris C57BL6 adultes sont très bien caractérisées au niveau métabolique depuis plusieurs dizaines d'années dans plusieurs laboratoires, dont le nôtre et représentent une souche murine adéquate comme modèle d'étude des maladies humaines. De plus, nous avons l'expertise du suivi du bien-être de l'animal après injection, du phénotypage métabolique des souris.

Seize heures sans nourriture avant le test de l'aliment caché, une nuit de test de préférence au sucre, deux tests d'anxiété, un conditionnement de peur sur deux jours : 504 souris enchaînent neuf épreuves comportementales après sept jours d'instillations nasales d'antibiotiques sous anesthésie. Elles reçoivent ensuite par le nez des bactéries ou du microbiote de patients parkinsoniens, ce qui peut déclencher deux mois plus tard une maladie de Parkinson expérimentale, avec malnutrition, troubles de la motricité et faiblesse musculaire. Le niveau de souffrance déclaré est modéré, et toutes sont tuées pour l'analyse de leurs tissus nasaux, nerveux, sanguins et intestinaux. Le porteur présente le recours à la souris comme un moyen d'éviter d'utiliser des primates non humains.

Objectifs

La maladie de Parkinson (MP) est la deuxième maladie neurodégénérative la plus fréquente en France, après la maladie d'Alzheimer. C’est une maladie complexe, d’étiologie encore inconnue, caractérisée par une destruction d’une population spécifique de neurones, entraînant un déficit au niveau de l’initiation et du contrôle des mouvements. Sur le plan moléculaire, des lésions sont retrouvées et correspondent à des amas pathogènes formés par une protéine : l’α-synucléine. Les troubles olfactifs sont fréquents dans la MP et sont souvent présents plusieurs années ou décades avant l'apparition des symptômes moteurs. Les troubles précoces de l’odorat dans la MP pourraient être la conséquence d’un déséquilibre du microbiote nasal. Dans cette étude, nous émettons l’hypothèse qu’il existe un lien entre le microbiote nasal et les déficits olfactifs de la MP. Ce modèle expliquerait tout d’abord les lésions inflammatoires de la muqueuse olfactive constatées chez les patients MP, ainsi que l'accumulation de la protéine neurotoxique dans les structures olfactives. Nous proposons d’élucider le rôle du microbiote nasal et de ses métabolites dans la perte de l’odorat observée au décours de la maladie de Parkinson (MP). Nos trois principaux objectifs sont de clarifier (1) le rôle exact de profils spécifiques de microbiotes nasaux avec les performances olfactives, (2) l’impact de l’environnement sur le microbiote nasal et (3) tester le lien entre microbiote nasal et MP. L’opportunité d’étudier deux populations ayant une exposition environnementale très différente, en France métropolitaine et aux Antilles, devrait permettre d’identifier des anomalies du microbiote spécifiques à la maladie de Parkinson. Les souris constituent un modèle pertinent pour ce projet car (1) elles peuvent facilement être colonisées par des microbiotes d’origine humaine et (2) elles peuvent développer des maladies proches de la MP très rapidement après gavage avec des échantillons provenant de selle de patients MP.

Bénéfices attendus

Nous proposons d’élucider le rôle du microbiote nasal et de ses métabolites dans la perte de l’odorat observée au décours de la maladie de Parkinson (MP). Nous couplerons notre analyse moléculaire du microbiome avec l’analyse métabolique de la muqueuse nasale et du sérum de patients MP et de souris transplantées avec du microbiote humain de patients MP. Ce projet nous permettra d’identifier les mécanismes moléculaires impliqués dans le déséquilibre du microbiote nasal et de proposer des biomarqueurs et des nouvelles cibles thérapeutiques. Les résultats de ce projet pourraient améliorer la prise en charge médicale des patients.

Procédures

Chaque animal sera soumis à : - une instillation intranasale d’antibiotiques (30 secondes) tous les jours pendant 7 jours sous anesthésie légère (5 minutes) - une seule instillation intranasale de bactéries (30 secondes) trois jours après la dernière instillation d’antibiotiques, sous anesthésie légère (5 minutes) - une restriction alimentaire de 16 heures avant de passer le test de la nourriture cachée (durée : 15 minutes). - Un test d’anxiété (20 minutes) - Un test de reconnaissance de nouveaux objets (20 minutes) - Un test de préférence au sucrose (une nuit) : mesurant leur préférence à boire une solution sucrée plutôt que de l’eau plate (test effectué sur une nuit, biberons additionnés de sucre et biberon normal). - Un second test d’anxiété (10 minutes): - Un test mesurant la perception aux odeurs des souris (15 minutes) - Un test des capacités morices (5 minutes) - Un test d’évitement des prédateurs (10 minutes). - Un test de test de conditionnement de peur (10 minutes pendant 2 jours)

Impact sur les animaux

Chaque animal sera soumis à : - une instillation intranasale d’antibiotiques (30 secondes) tous les jours pendant 7 jours sous anesthésie légère (5 minutes) L’anesthesie gazeuse provoque un inconfort de courte durée. La piqure d'aiguille pour l’injection d’anesthésique entraîne une douleur légère de courte durée. L’instillation intranasale d’antibiotiques provoque un inconfort de courte durée. - une seule instillation intranasale de bactéries ou de microbiote humain (30 secondes) trois jours après la dernière instillation d’antibiotiques, sous anesthésie légère (5 minutes) L’anesthesie gazeuse provoque un inconfort de courte durée. La piqure d'aiguille pour l’injection d’anesthésique entraîne une douleur légère de courte durée. - L’instillation intranasale de microbiote humain ou de bactéries comme des Staphylocoques provoque un inconfort de courte durée et peut induire deux mois après l’instillation une maladie de Parkinson expérimentale chez la souris qui présentera alors des signes de malnutrition, des problèmes de motricité et une faiblesse musculaire. - Une restriction alimentaire de 16 heures avant de passer le test de la nourriture cachée (durée : 15 minutes). La restriction alimentaire induit habituellement un stress physique modéré et de la détresse modérée pendant une durée de 16 heures avant la réalimentation.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure car il est nécessaire que tous leurs tissus nasaux, nerveux, sanguins et intestinaux soient analysés en détail pour identifier les mécanismes sous-tendant le développement de la maladie de Parkinson.

Remplacement

Malheureusement, à l’heure actuelle, il n’existe pas de méthode alternative à l’expérimentation animale pour tester la perception, la mémoire et la coordination motrice.

Réduction

Notre stratégie expérimentale est conçue de manière à réduire le plus possible le nombre d’animaux. Le nombre d’animaux estimé pour ce projet a été calculé par un biostaticien de manière à ce que, pour chaque expérience, les groupes utilisés soient constitués de 12 souris, le nombre minimal requis pour que l’analyse statistique ultérieure permette une évaluation pertinente des résultats. Nous avons calculé qu’un nombre de 12 souris minimum par groupe est nécessaire.

Raffinement

Notre stratégie expérimentale est conçue de manière à réduire tout stress et inconfort de l’animal. Après l’instillation intranasale de bactéries ou de microbiote humain, chaque animal fera l’objet d’une évaluation quotidienne pendant 2 jours puis tous les 7 jours pour s’assurer de sa bonne santé (mesure du poids, analyse de l’allure du pelage, de l’état de vigilance, de la posture, du comportement moteur général et du comportement exploratoire dans la cage). Nous allons particulièrement surveiller l’apparition de signes chroniques parkinsoniens comme un trouble de la motricité (allure de la marche, activité locomotrice, comportement exploratoire dans la cage, coordination motrice et équilibre) et une faiblesse musculaire (incapacité à bien se mouvoir sur la grille de la cage). Ces signes cliniques sont habituels dans les modèles expérimentaux de maladie de Parkinson chez la souris. Si l’animal présente des signes parkinsoniens, il fera l’objet d’un suivi plus poussé : Il sera pesé tous les jours et du gel hydrique sera disposé sur la litière pour améliorer la prise alimentaire. Si cet animal en plus des signes parkinsoniens se met à présenter une perte de poids ≥20% du poids basal, est déshydraté ou reste prostré, il sera mis à mort immédiatement.

Choix des espèces

Le système nerveux des souris est proche de celui de l’humain et sensible au développement de pathologies expérimentales parkinsoniennes comme par exemple après l’administration de microbiote intestinal humain provenant de patient parkinsonien. Nous disposons d’un nombre important d’outils et de données avec ce modèle qui devraient nous permettre de tester les liens entre déséquilibre du microbiote nasal et neuropathologie parkinsonienne et d’établir des schémas thérapeutiques, voire préventifs pour les humains, en évitant donc de recourir à des primates non humains. Nous utiliserons des souris surexprimant un gène humain qui nous permettront d’appréhender le facteur génétique de l’hôte dans la pathologie. Adulte, à partir de 6 semaines après la naissance, car la maladie touche les adultes.

Les souris ne faisant pas d'accident vasculaire cérébral spontanément, une chirurgie d'une heure sous anesthésie leur en provoque un, avec les déficits moteurs et cognitifs qui suivent. 350 souris vont être utilisées, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour le prélèvement de leurs tissus. Une partie est génétiquement déficiente pour le facteur XII de la coagulation, et l'ensemble reçoit des injections de nano-gouttes fluorescentes puis des séances d'imagerie d'une heure sous anesthésie. Le porteur annonce des procédures ayant "un caractère de stricte nécessité" et une batterie de cinq tests comportementaux, sans préciser lesquels.

Objectifs

L’accident vasculaire cérébral (AVC) est une pathologie neurologique survenant après l’occlusion d’une artère irriguant le cerveau. Cette pathologie est la 3ème cause de mortalité et la première cause de handicap acquis chez l’adulte dans le monde. En France, cent trente mille nouveaux cas sont répertoriés par an. L’AVC pose donc un problème majeur tant dans le domaine de la santé publique que sur le plan humain. Actuellement, la prise en charge des patients à la phase aigüe de l’infarctus cérébral est réalisée par l’injection intraveineuse de l’activateur tissulaire du plasminogène (tPA) associée ou non à la thrombectomie pour lesquels seul 20% des patients seront éligibles. De ce fait, il existe de nombreux travaux de recherche qui ambitionnent de développer de nouvelles stratégies thérapeutiques permettant de traiter un maximum de patients. Pour cela, il est nécessaire de mieux comprendre les processus physiopathologiques des AVC. La thrombectomie, ne conduit malheureusement pas toujours à une reperfusion efficace de la région cérébrale ischémique. L'une des raisons potentielles de ce phénomène pourrait être liée à la formation de microthromboses, dont il a été constaté qu'ils perturbent localement la barrière hémato-encéphalique (BHE). Par conséquent, l'objectif du projet est de caractériser les mécanismes spatio-temporels et fonctionnels de la microthrombose post-recanalisation, également connue sous le nom de phénomène de "no-reflow",puis d’en comprendre les mécanismes sous-jacents afin de déterminer son impact sur l’AVC, en utilisant différents modèles animaux représentatifs de la physiopathologie humaine.

Bénéfices attendus

Ce projet à pour but d’étudier les interactions entre les cellules des microthomboses et les différents composant de la BHE (Cellules endothéliales, péricites, astrocytes) et comment cela va influencer la physiopathologie de l’AVC. Ces travaux devraient permettre d’identifier des mécanismes cellulaires qui pourraient être de nouvelles voies de développement d’outils thérapeutiques pour le traitement des AVC.

Procédures

Les animaux subiront des chirurgies pour induire des AVC puisque les souris n'en développent pas spontanément. Ainsi, il sera réalisé des chirurgies sous anesthésie générale d'une durée de 1 heure maximum, permettant de générer des déficits moteurs et cognitifs. Des injection de nano-gouttes fluorescentes en intraveineux seront également faites sous anesthésie générale soit pendant l'anesthésie associée à la chirurgie soit au moment des acquistions en imagerie. Il n'y aura donc pas d'aneshtésie spécifique à ce geste expérimental. Le suivi en imagerie microscopique ou imagerie médicale (IRM) sera réalisé également sur animal aneshtésie (durée : 1 heure maximum) afin d'assurer l'immobilité des souris. Une batterie de tests comportementaux (5 au total) seront effectués sur les animaux afin d'évaluer les déficits moteurs et cognitifs. La durée de chaque test ne devrait pas dépasser 15 minutes.

Impact sur les animaux

Suite à la chirurgie d’induction de l’AVC, les animaux se trouveront désorientés, avec des déficits neurologiques vecteur de stress. Pour cela une surveillance accrue des animaux sera réalisée sur toute la période post AVC. Il est également attendu des douleurs post-opératoires qui seront prises en charge par une couverture analgésique adaptée.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort afin de prélever les tissus et faire des analyses.

Remplacement

Les procédures expérimentales pour réaliser ce projet ont un caractère de stricte nécessité. L’étude de la formation de microthromboses et de leur impact nécessite la réalisation d’expériences sur l’animal, aucune méthode alternative ne peut remplacer l’utilisation d’animaux vivants et susceptibles d'apporter le même niveau d'information

Réduction

Avant de procéder à une telle étude, nous nous sommes assurés d’utiliser le nombre minimal d’animaux adéquat pour atteindre le résultat souhaité grâce à une analyse de puissance statistique. Ainsi, le nombre d’animaux utilisé a été réduit au maximum. De plus, lorsque cela est possible il est prévu d’utiliser des approches non invasives afin de faire un suivi comportemental et en imagerie.

Raffinement

Afin de souscrire au principe de raffinement, les animaux seront anesthésiés durant chaque procédure chirurgicale et/ou douloureuse. Les expériences seront réalisées par du personnel qualifié en respectant les règles de bonnes pratiques de laboratoire pour le respect des animaux. Le bien-être des animaux sera suivi bi-quotidiennement par du personnel qualifié 7j/7 et quotidiennement pendant les weekends et jours fériés et cela pendant toute la durée du projet. Ce suivi fera l'objet dun scoring afin d'évaluer les points limites. Les animaux seront hébergés dans des cages par groupe de 5 avec de l’enrichissement (domehome, ouate de cellulose) et un accès à l’eau et à la nourriture ad libitum. Tout sera mis en œuvre pour réduire l’angoisse, la souffrance et la douleur de chaque animal, pouvant être occasionnées pendant le projet. Les souris seront pesées et acclimatées pendant une heure dans la pièce expérimentale. Un suivi strict et rapproché des animaux, une évaluation de la douleur, une couverture analgésique suffisante en période pré et post opératoire, un accès facilité à la nourriture seront mis en place. Pour la chirurgie et le suivi en imagerie, les animaux seront anesthésiés et sous couverture analgésique.

Choix des espèces

La souris est l'espèce animale la plus étudiée dans le domaine des AVC et les techniques employées sont bien décrites et maitrisée. L'anatomie du système nerveux murin, de la barrière hémato-encéphalique et la physiologie de la souris sont également bien connues et proches de celles de l'homme, ce qui fait des modèles utilisés dans ce projet des approches expérimentales fiables. Toutes les connaissances et l'expérience que nous avons dans le laboratoire et dans la littérature rendent cette espèce particulièrement intéressante pour cette étude. Les expériences nécessitent l'utilisation d'animaux transgéniques, des souris déficientes pour le facteur XII de la coagulation. Ce modèle transgénique ne peut être produit que chez la souris. De plus, il n'existe pas de modèle fiable utilisant des vertébrés ou des invertébrés moins sensibles, étant donné que leur anatomie et leur physiologie sont très différentes de celles de l'homme. Concernant l’ensemble des procédures, seuls des animaux adultes âgés de 6 à 8 semaines correspondant à un stade jeune adulte seront nécessaires. Ce stade est classiquement utilisé dans la littérature pour l'étude de pathologies (AVC) et notamment en conditions inflammatoires (inflammation centrale).

358 rats mâles vont être utilisés, tous tués à l'issue pour le prélèvement du cerveau et des poumons, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacun passe soixante minutes immobilisé dans un tube de contention pour inhaler un aérosol de particules de tungstène, après six séances d'habituation à ce tube réparties sur deux semaines. Une partie reçoit en plus une irradiation gamma du corps entier, puis viennent quatre échographies de trente minutes et cinq prélèvements sanguins échelonnés sur trois mois. Le rat a été retenu parce que la plateforme d'inhalation du laboratoire est dimensionnée pour lui : les animaux doivent peser 350 grammes à quinze grammes près pour tenir dans les tubes sans trop y bouger.

Objectifs

Le concept d’exposome prend en compte le fait que, tout au long de sa vie, un individu va être exposé à un ensemble de polluants environnementaux et professionnels qui vont avoir une répercussion sur sa santé. Ces expositions multiples peuvent produire des effets plus prononcés que lorsque l’on considère un polluant séparément. Notre projet porte sur les effets biologiques d’une coexposition à un stresseur chimique et à un stresseur radiologique sur le cerveau. Ce nouveau projet, fort de la base de résultats acquis au cours des projets précédents, viendrait compléter les connaissances en se concentrant sur la vascularisation du cerveau. Les stresseurs sélectionnés : particules de tungstène métal - valence chimique de notre co-exposition - et irradiation gamma – valence radiologique - sont pertinents au regard de ceux auxquels les travailleurs du nucléaire pourraient être exposés de façon accidentelle lors de taches spécifiques qu’ils auraient à effectuer. L’objectif de notre étude est d’identifier les mécanismes impliqués dans la réponse de la vascularisation cérébrale à une exposition aigüe à des doses faibles de rayonnements ionisants, associée ou non à l’inhalation d’un aérosol particulaire de tungstène chez le rat in vivo. Les analyses réalisées permettront d’étudier si l’exposition à ces deux stresseurs ensemble induit des effets potentiellement plus prononcés que lorsque les expositions se font séparément. Pour cela, l’évaluation de potentielles conséquences sera réalisée à différents niveaux d’analyse : de l’expression de gènes, à la cellule jusqu’au fonctionnement et à l’intégrité des vaisseaux. Cette approche permettra d’identifier les principaux processus biologiques qui sont affectés selon les différents types d’exposition.

Bénéfices attendus

En associant les résultats de ce projet avec les précédentes études, nous pourrons mieux comprendre le rôle de la vascularisation cérébrale dans les effets observés en lien avec notre schéma de coexposition. Ces résultats permettront de prendre en compte l’ensemble des effets avec les autres composantes du cerveau, notamment les différents types cellulaires : les neurones, les cellules gliales. A plus long terme, cette étude alimentera les réflexions sur l'évolution du système de radioprotection dans la gamme des faibles doses de rayonnement ionisants. Cette étude permettrait une meilleure identification des risques réels pour une optimisation des normes d’un point de vue sanitaire et la connaissance des effets biologiques après exposition à des doses faibles combinées à un autre stresseur sur le cerveau.

Procédures

Un nombre réduit d’animaux participeront à la mise au point de certaines étapes : prélèvements sanguins répétés sur animal anesthésié (max 5 prélèvements par animal) et réalisation d’échographie avec produit (1 injection i.v. par animal sur animal anesthésie suivie d’une échographie). Les animaux seront exposés en une seule fois à un aérosol de particules de tungstène (durée 60 min en tube à contention). Pour l’habituation à cette contention, ils auront eu 6 séances d’habituation d’une durée allant de 10 à 60 min réparties sur deux semaines à raison de 3 séances par semaine. Certains lots recevront une dose unique d’irradiation sous la forme de rayonnement gamma en corps entier à une faible dose de 50 mGy. Pour cette irradiation, ils seront placés dans une boite d’irradiation. Ils seront en vigile pour cette irradiation. La durée de l’irradiation est d’une minute. La durée totale de la mise en boite, transport dans le bâtiment, irradiation et remise en cage n’excède pas 30 minutes. Certains lots seront exposés aux deux types de stresseurs dans la même journée en dose unique également. Pour tous les animaux, les échographies et les prélèvements de sang sont non invasifs et effectués sous anesthésie. Les animaux auront 4 séances d’échographies de 30 minutes chacune : une avant l’exposition, puis à 24 heures, 28 jours et 3 mois. Le nombre de prélèvements sanguins est de 5 reparti entre 15 minutes et 3 mois post-exposition, et le volume n’excèdera pas 500 microlitres à chaque prélèvement.

Impact sur les animaux

Les protocoles d’exposition impliquent des périodes de contention dont le stress est réduit par des procédures prévues. Les expositions par inhalation et/ou d’irradiation ne sont pas susceptibles d’induire de douleurs nécessitant l’administration de produits antalgiques, ni avant, ni après la procédure. Les prélèvements sanguins et les administrations i.v. nécessitent une piqure qui va entrainer une douleur légère et de courte durée. Ces actes seront réalisés sur des animaux anesthésiés dans le respect des bonnes pratiques. Il n’est pas attendu d’effet secondaire des produits administrés. Les animaux seront surveillés après chaque manipulation.

Devenir

A la fin de la procédure, tous les rats seront euthanasiés pour prélever les organes (cerveau, poumons, notamment) pour permettre de réaliser les analyses biologiques (biologie moléculaire, histologie) complétant les analyses fonctionnelles réalisées sur tous les animaux de ce projet.

Remplacement

Pour mimer l’exposition corps entier à une irradiation externe et à une inhalation sous la forme d’un polluant particulaire qui mime nos situations d’exposition professionnelles, il est nécessaire d’avoir recours à une exposition sur un modèle intégré (système nerveux central, voies aériennes supérieures, poumons, reins). Pour répondre à nos objectifs scientifiques, les études in vitro présentent des limites pour l’évaluation des mécanismes au niveau cellulaire après une exposition à des doses faibles de rayonnement ionisant et à l’inhalation de particules. Elles ne permettent pas d’identifier des processus physiologique et/ou physiopathologique. Cet argument est également valable pour les modèles d’organoïdes de cerveau car ils n’intègrent pas les cellules responsables de la réponse neuroinflammatoire. Il est également très difficile de maintenir des cultures cellulaires au-delà de 3 semaines dû au vieillissement cellulaire et aux cycles limités des cellules. Dans ce projet l’idée est d’évaluer la vascularisation organique cérébrale, et la niche neurovasculaire qui regroupe différents types cellulaires qui ne peuvent pas être tous cultivés en même temps. De plus, il n’est pas possible d’évaluer l’irrigation fonctionnelle du cerveau dans des modèles in-vitro.

Réduction

Au total, 358 animaux seront utilisés dans ce projet. Le nombre d’animaux par groupe a été établi avec l’utilisation d’outils statistiques. Des analyses statistiques ont permis d’optimiser le nombre d’animaux par groupe selon les effets attendus. Le nombre d’animaux par groupe a été déterminé sur la base de la littérature existante sur des schémas d’exposition similaires et sur le retour d’expérience des projets précédents.

Raffinement

Les rats font l’objet d’un suivi quotidien. Ils sont pesés à l’arrivée pour vérifier la conformité avec le poids demandé au fournisseur. Ils sont également pesés au cours de la procédure d’habituation aux tubes à contention, témoin de leur état de santé et de l’adéquation de leur prise de poids avec la taille des tubes. Tout signe de prostration de l’animal, de blessures importantes dues à des bagarres par exemple entrainera l’euthanasie anticipée. Si le comportement d’un animal est altéré, il sera pesé avec un point limite à 20% de perte de poids. Lors des différentes procédures, un arrêt cardiaque durant l’anesthésie sera traité par massage cardiaque. Les infections ou blessures éventuelles seront traitées localement. Le transfert des animaux de l’animalerie à la plateforme d’irradiation située dans le même bâtiment se fera en boite de transport opaque et possédant un filtre. Le stress potentiel lié à ce transport est nettement réduit pas la procédure d’habituation à la contention. Les prises de sang et les injections par la veine caudale sont réalisées sous anesthésie.

Choix des espèces

Le rat est le modèle de référence pour les études en toxicologie de l’inhalation en mode nose-only. La plateforme d’inhalation que nous possédons au laboratoire est également adaptée au rat : vitesse des flux d’air au sein de la chambre d’inhalation, taille des tubes de contention, taille des emplacements dans la chambre d’inhalation. Cette espèce est le modèle utilisé dans les protocoles d'inhalation précédents réalisés au laboratoire. Le rat est également un modèle de référence pour les systèmes physiologiques étudiés dans ce projet : système nerveux, voies olfactives : épithélium nasal, nerfs olfactifs et bulbes olfactifs, voie pulmonaire. Ainsi, nos résultats pourront être comparés aux précédentes études que ce soit celles du laboratoire et celles issues de la littérature pour les modes d’exposition par inhalation, mais également par irradiation. Les rats sont utilisés au stade adulte de 12 semaines afin de pouvoir comparer les résultats obtenus avec les expériences précédentes au laboratoire et avec la littérature portant sur les effets d’exposition par inhalation à des particules métalliques et par irradiation externe. Le stade adulte correspond au stade auquel l’homme est le plus exposé par ces modes d’exposition combinés pour la population cible que nous visons, c’est-à-dire les travailleurs. Tel qu’évoqué précédemment, le rat mâle de 12 semaines sera utilisé et le poids à l’arrivée doit être situé aux alentours de 350 ± 15 grammes pour tous les animaux afin d’être dans la gamme de taille et de poids adéquate pour pouvoir rentrer dans les tubes à contention au bout des deux semaines d’habituation. Il faut qu’ils puissent être capables de rentrer dans les tubes tout en étant suffisamment contenu à l’intérieur afin de limiter les mouvements dans les tubes pendant les expositions à l’aérosol et qu’ils ne s’agitent pas trop.

Issus d'autres études quand c'est possible, 3 500 rongeurs et lapins vont être utilisés pour entraîner des expérimentateurs aux gestes techniques : 1 500 souris, 1 500 rats, 300 cobayes, 100 lapins, 50 hamsters dorés et 50 gerbilles. Les procédures relèvent d'un niveau de souffrance modéré, 360 individus seront réutilisés dans un autre projet et les autres seront tués, notamment lorsque le volume prélevé ne permet pas leur survie. Ils subissent des administrations par six voies différentes, dont l'intrathécale, jusqu'à trois prélèvements sanguins par semaine dans la limite de 7,5 % du volume sanguin total, une pose de cathéter de quarante-cinq minutes et une ponction de liquide céphalorachidien. Le porteur indique que certains gestes s'apprennent sur peaux et animaux artificiels, mais que l'évaluation des critères de réussite "impose que l'animal soit vivant".

Objectifs

Le but du projet est de permettre à une personne en formation (zootechnicien, technicien de laboratoire, directeur d’étude) de se former à la réalisation de gestes techniques. Ce projet résume un certain nombre de gestes techniques que doivent acquérir les expérimentateurs pour pouvoir réaliser des expériences sur l'animal de laboratoire. Il s'inscrit dans le cadre de l'acquisition de la compétence des expérimentateurs (arrêté du 1er février 2013, Bonnes pratiques de laboratoire, AAALAC).

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus sont la maitrise de gestes techniques. La formation initiale des personnes doit être complétée par une formation spécifique en fonction des études qu'elles seront amenées à faire pour maitriser les gestes en toute sécurité.

Procédures

Dans ce projet, les animaux vigiles seront administrés par différentes voies (orale, sous-cutanée, intrapéritonéale, intramusculaire, intraveineuse et intrathécale) avec -2 min par administration. Des administrations sur l'animal transitoirement anesthésié pourront également être faites : intradermique, oro-pharyngée, intraveineuse et intratrachéale - environ 5 minutes par administration. Des prélèvements de sang seront réalisés sur l’animal vigile (2 minutes par prélèvement) ou sur l'animal anesthésié (environ 5 minutes par prélèvement). Ces prélèvements seront en général de 0.05 à 2 mL, avec un maximum de 3 prélèvements par semaine et dans la limite de 7.5% du volume sanguin total en adaptant la période de récupération. Une implantation de cathéter pourra être faite sur l'animal anesthésié environ 45 minutes de chirurgie 1 seule fois. Un prélèvement de liquide céphalo-rachidien (1 seul prélèvement) sera réalisé sur animal anesthésié avec un volume maximal de 0,1 ml prélevé

Impact sur les animaux

Les gestes techniques enseignés ne doivent pas affecter la bonne santé / l'état général des animaux utilisés. En fonction du geste et de ses conséquences sur l’animal, un échange se fera avec les responsables du Bien-Etre Animal pour adapter les outils d'observation des animaux en cas de réalisation imparfaite du geste concerné et d'impact négatif sur l'animal. Les contentions des animaux vigiles pour induire l'anesthésie, administrer le produit et pour les prélèvements peuvent engendrer un stress mineur à l'animal. Les chirurgies peuvent induire des douleurs post-chirurgicales qui seront réduites au maximum grâce à une anesthésie, analgésie et un protocole de soins post-opératoire. Les animaux de ce projet pourront aussi subir un stress lié à une douleur équivalente à la piqûre d'une aiguille lors des administrations intramusculaire, sous-cutanée, intrapéritonéale, intradermique, intraveineuse ou intrathécale ou une contrainte légère liée à l'administration per os lors de l'administration du produit ainsi qu'une douleur équivalente à la piqûre d’une aiguille lors des prélèvements sanguins.

Devenir

euthanasie des animaux pour réaliser des prélèvements d’organe/ fluides corporels à un volume ne permettant pas la survie de l’animal ou réutilisation des animaux dans un autre projet ayant un degré de sévérité sans réveil, léger ou modéré après accord du vétérinaire.

Remplacement

Avant tout début de formation, la formation débute par une partie théorique avec une personne expérimentée et certains gestes pourront être réalisés sans animaux grâce notamment à des méthodes alternatives (peaux artificielles, animaux artificiels). Les gestes à acquérir, par du personnel déjà formé aux techniques de base de l'expérimentation animale, imposent que l’animal soit vivant pour évaluer les critères de réussite.

Réduction

Dans la mesure du possible, les animaux seront issus d'études et seront utilisés, après avis du vétérinaire, pour plusieurs gestes techniques de ce projet. Une supervision étroite garantira une utilisation des animaux en minimisant le risque d'erreur.

Raffinement

Les procédures seront réalisées par du personnel compétent déjà formé aux sciences et techniques des animaux de laboratoire, mais devant acquérir une expertise supplémentaire. Ce personnel de formation sera sous la supervision d'une personne experte. Le raffinement sera obtenu par • La mise au point de procédures rigoureuses, • Un suivi quotidien de l’état de santé des animaux, • Le recours à des procédures les moins invasives possibles, • Le suivi d’éventuel signes cliniques et des points limites, •Des protocoles d'anesthésie et d'analgésie adaptés et maîtrisés, un suivi de l'état de santé des animaux ainsi que des soins adaptés pour permettre une bonne récupération, • La mise en groupe des animaux, • La mise en place de jouets dans les cages. • Le recours aux procédures d’euthanasie dès que nécessaire.

Choix des espèces

Les espèces (rongeurs et lapin) qui seront utilisées dans ce projet correspondent aux espèces cibles autorisées pour l’établissement utilisateur, que les personnes en formation auront à manipuler au cours des expérimentations. Animaux adultes. Ce projet n’a pas pour objectif d’étudier les effets du produit sur l’animal à d’autres stades de développement.

Automutilation, saignement incontrôlable, perte de poids supérieure à 15 % : un seul de ces signes suffit à déclencher la mise à mort. 96 rats mâles vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, tous tués à l'issue pour que leur calvaria soit prélevée et analysée. Chaque animal reçoit deux trous de quatre millimètres percés dans la partie supérieure du crâne, comblés par un matériau expérimental, puis des radiographies hebdomadaires sous anesthésie courte et deux injections de colorants. La perte osseuse visée chez l'humain concerne la mâchoire, mais le crâne a été retenu parce qu'il simplifie l'opération.

Objectifs

L'objectif du projet est de tester de nouveaux matériaux pour combler une perte osseuse importante (plus de 1 cm²) dans la mâchoire humaine. Ces matériaux doivent favoriser la repousse osseuse, permettre une bonne circulation sanguine et lutter contre les bactéries. L'expérience sera menée sur des rats. Au lieu de la mâchoire, nous choisirons la partie supérieure du crâne pour créer le défaut osseux. Cela simplifiera l'opération et améliorera le bien-être des animaux en réduisant les risques de complications. Les matériaux testés forment une structure poreuse composée d'un plastique biodégradable et de particules de verre spéciales, parfois enrichies d'un élément antibactérien. Ils sont conçus pour être suffisamment solides pour être manipulés par les chirurgiens et supporter la repousse osseuse. Nous avons déjà évalué plusieurs propriétés de ces matériaux, notamment leur dégradation dans l'eau, leur toxicité pour les cellules et leur efficacité contre les bactéries. Des essais préliminaires sur des rats n'ont montré aucun effet secondaire négatif.

Bénéfices attendus

Cette étude nous permettra de valider chez les animaux le potentiel de régénération osseuse et de revascularisation d’un matériau poreux constitué d’un réseau de bioverres (supplémentés ou non avec un ion cationique) et d’un polymère biodégradable. Cette étude pourrait participer à l’élaboration d’un nouveau traitement pour la reconstruction osseuse consécutive à l’ORN (ostéoradionécrose, une complication sévère de la radiothérapie, liée à un défaut de cicatrisation du tissu osseux). Ce matériau a pour objectif d’être pratique à utiliser pour les cliniciens et efficace pour la repousse osseuse, la revascularisation et ayant effet antibactérien (propriété de l’ion cationique).

Procédures

Les animaux seront soumis à l’implantation d’un biomatériau chargé ou non en cation au niveau d’un défaut osseux critique sur la partie supérieure du crâne (calvaria) de rats réalisé au préalable (temps opératoire max : 20 minutes). Cette procédure chirurgicale sera réalisée sous anesthésie générale et une analgésie adaptée sera appliquée. Certains des animaux seront anesthésiés de manière hebdomadaire sur des temps courts pour effectuer des radiographies de suivi de repousse osseuse (temps 10 à 20 secondes). L’ensemble des animaux vigiles seront aussi soumis à deux injections intrapéritonéales de colorants vitaux de quelques secondes, 14 et 2 jours avant leur mise à mort. Aucun prélèvement sur animaux vigiles ne sera réalisé.

Impact sur les animaux

Un des modèles les plus pertinents utilisés pour étudier la régénération osseuse est le défaut critique (4 mm) de calvaria chez le rongeur. Par conséquent, ce modèle d’étude sur le rat consanguin Lewis a été étudié depuis plusieurs années, validé et publié. Les effets indésirables attendus peuvent être une difficulté de récupération de l’animal suite à l’anesthésie, l’apparition de douleurs au site d’implantation, une gêne fonctionnelle due à une réaction inflammatoire ou une mauvaise cicatrisation. De façon générale, différents points limites (changement de poids corporel, apparence physique, comportement non provoqué…) seront attentivement regardés.

Devenir

En fin d’expérimentation, tous les animaux seront mis à mort. Les cadavres des animaux seront évacués exceptés les calvarias qui seront prélevées, fixés et préparées pour réaliser les analyses radiologiques et histologiques au laboratoire qui permettront l’évaluation de la néoformation osseuse et des propriétés angiogéniques des biomatériaux.

Remplacement

Cette étude portant sur le tissu osseux, il n'existe pas de solution de remplacement utilisant des invertébrés L'utilisation de rongeurs reste donc nécessaire afin de vérifier si les nouveaux matériaux sont bien tolérés par l'organisme et s'ils favorisent la croissance osseuse. Dans ce but, des études ont été réalisées en laboratoire sur des cellules, il est maintenant nécessaire de tester nos matériaux sur des petits animaux vivants pour observer les effets réels sur un organisme entier.

Réduction

Dans le but de réduire au maximum le nombre d’animaux utilisés, les biomatériaux utilisés ont été sélectionnés en amont et déjà testés in vitro et in vivo (expérience pilote) pour leur biocompatibilité. Lors de la procédure, les défauts osseux seront réalisés sur chaque os pariétal qui compose la calvaria de rats, soit 2 défauts par animal, réduisant de fait le nombre d’animaux tout en préservant la puissance statistique. De plus, une étude bibliographique nous a permis de déterminer la quantité d’implants nécessaires à l’obtention de résultats significatifs (n=7). Cela nous permet ainsi de constituer des groupes avec un nombre d’animaux nécessaires et suffisants pour l’obtention de résultats statistiquement significatifs, reproductibles et valorisables. Le nombre d’animaux est ainsi réduit au strict minimum.

Raffinement

Afin de raffiner la méthodologie, les procédures de manipulation et de surveillance régulière sont élaborées avec l’objectif d’éliminer toute forme de souffrance animale. Chaque étape de l’étude tiendra compte du bien-être de l’animal, de son arrivée dans l’animalerie spécialisée à sa mise à mort en fin d’étude. Une analgésie chimique est assurée en pré- et post-opératoire. Les rats sont anesthésiés par inhalation d'un gaz durant toute la procédure. La chirurgie, même si celle-ci ne dure pas plus de 20 minutes, sera effectuée sur tapis chauffant afin d’éviter toute hypothermie éventuelle. Les rats seront ensuite transférés dans une couveuse chauffante le temps de récupérer suite à ce réveil. Le reste du temps, les rats seront hébergés en groupe sociaux de 2 individus par cage avec enrichissement physique sous forme de tunnel en carton 12x9cm, un bâton de bois à ronger et recevront une nourriture standard et de l’eau de boisson ad libitum Aucune souffrance (ou très faible) n'est attendue lors des manipulations prévues. Les animaux seront observés tous les jours. Cela étant, nous serons vigilants à ces critères: - Signes cliniques notables (Le point limite est atteint en présence de 3 signes simultanés) Lésion sans effraction cutanée Signes spécifiques: grattage de cicatrice en regard de la reconstruction calvariale Agitation/agressivité Hypomotilité/hyporéactivité Incoordination modérée Stéréotypie Poil piqué Coloration anormale de la peau Flaccidité musculaire généralisée Gonflement abdominal Zone ano génitale souillée Fèces liquides Fèces mucoïdes Perte de poids inférieure à 15% Diminution/absence de prise de nourriture -Signes cliniques sévères (Le point limite est atteint en présence d’un seul signe) Lésion sévère automutilation masse ulcérée Signes spécifiques: infection de la cicatrice, saignement incontrôlable, plaie suintante Akinésie Décubitus Difficulté/impossibilité de mobilisation Incoordination marquée Tremblements généralisés Convulsion Hémiplégie Persistance du pli cutané Coloration jaune ou bleue des muqueuses Voussure du dos/dos cambré Absence de fèces Urines rouges Perte de poids supérieure à 15% Absence de prise de nourriture> à 2/jour En cas d’apparition d’un de ces symptômes malgré le traitement antalgique adapté ou en cas d'atteinte du point limite l’animal sera retiré de l’étude et euthanasié dans les plus brefs délais.

Choix des espèces

L’utilisation du rat est justifiée car il s’agit d’un modèle de référence pour la recherche fondamentale ainsi que pour les études pré-cliniques. De plus, de nombreux outils génétiques et biologiques sont disponibles. Le modèle de défaut osseux critique de calvaria chez le rongeur est couramment utilisé dans la littérature pour l’étude de la régénération osseuse et est parfaitement validé. Les animaux inclus dans cette étude seront des rats mâles âgés de 12 semaines au début de la procédure. Ceci permet d’avoir des animaux matures sans pathologies associées au vieillissement tout en limitant les biais liés à la croissance osseuse physiologique.