Procédures modérées

Trois heures de chirurgie pour implanter des cathéters permanents, une sonde débitmétrique et une canule dans l'iléon ou l'estomac, puis six journées de prélèvements de sept heures avec dix prises de sang simultanées sur deux cathéters, soit 54 millilitres par journée : 64 mini-porcs vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le projet teste la digestibilité de régimes végétalisés et l'effet d'un probiotique sur l'assimilation des nutriments, en vue de recommandations pour l'alimentation humaine. Chaque animal reste hébergé seul dans une case aux parois transparentes, et le porteur ramène les douleurs abdominales postopératoires à quelques jours suivis d'une gêne qu'il qualifie de mineure. Tous sont tués à la fin des essais, pour récupérer le matériel implanté et prélever des muscles.

Objectifs

Notre unité de recherche aborde la nutrition de manière intégrée, depuis la qualité des aliments et des régimes alimentaires jusqu’à leurs effets sur la santé dans le cadre d’une transition vers une alimentation plus durable. Le projet s’inscrit totalement dans cette thématique puisqu’il a pour objectif de tester la qualité nutritionnelle de régimes alimentaires végétalisés en évaluant la digestibilité des macro et micro-nutriments qu’ils contiennent. Une optimisation de cette digestibilité permettra ainsi d’améliorer la qualité de l’alimentation et ses effets sur la santé. Nos pistes pour élaborer une stratégie nutritionnelle efficace sont 1) de tester des repas complets avec un apport optimisé à la fois en protéines de qualité et en fibres mais aussi avec un apport limité en facteurs antinutritionnels et 2) d’améliorer l’utilisation des nutriments par l’hôte à l’aide d’une stratégie d’amélioration du microbiote intestinal via l’apport d’un probiotique. Ce projet mettra en oeuvre un modèle de mini-porcs.

Bénéfices attendus

Le bénéfice attendu de ce projet est l’élaboration de stratégies nutritionnelles adaptées à des situations physio-pathologiques. Le projet devrait donner à la fois des indications quant à la biodisponibilité des macro et micro-nutriments de régimes optimisés et des pistes sur leurs effets sur la santé de l’hôte. L’objectif principal est de trouver une matrice alimentaire qui soit la plus digestible possible permettant ainsi de contre-carrer un état physio-pathologique tel que l’insulino-résistance ou la résistance anabolique post-prandiale observée lors du vieillissement.

Procédures

Chaque animal subira une seule demi-journée (3h) d’intervention chirurgicale pour la pose de cathéters permanents, de sonde débit-métrique et de canule iléale et/ou gastrique (1h de préparation pré-opératoire, et 2 h entre l’incision cutanée et le réveil de l’animal). Une période de récupération de 15 jours sera observée , entre la chirurgie et la première journée de prélèvements. Chaque animal participera au final à 6 cinétiques post-prandiales d’une durée de 7h suivie d’une période de récupération de 7 jours minimum entre chaque cinétique. Lors d’une journée de prélèvement, les animaux recevront le matin comme seul aliment un des régimes à tester. Des prélèvements de sang seront réalisés simultanément dans les 2 cathéters avant et après le repas selon la cinétique de 10 prélèvements sanguins en simultanés sur chaque vaisseau pour chaque animal, étalés sur une journée de 9 heures. Pour chacune des journées de prélèvements, 2.7 ml de sang seront prélevés sur chaque cathéter à chaque point de cinétqiue. Le volume total prélevé sera de 54 ml par cinétique (moins de 5% du volume sanguin de l'animal).

Impact sur les animaux

Des douleurs abdominales peuvent être ressenties par l’animal suite à l’intervention chirurgicale. Elles peuvent se manifester dans les premiers jours suivant l’opération, mais après cette période de récupération, elles restent mineures.

Devenir

En fin d'expérimentation les animaux seront euthanasiés, afin de récupérer le matériel implanté et d'effectuer des prélèvements d'organes pour l'évaluation de l'effet des régimes sur la santé musculaire des animaux.

Remplacement

La biodisponibilité des nutriments fait intervenir de nombreux processus biologiques coordonnés et régulés, qui à ce jour ne peuvent pas être reproduits in vitro.

Réduction

L'effectif prévu dans le schéma expérimental (8 animaux maximum inclus dans le schéma expérimental de la procédure 1 et 6 animaux par lot dans la procédure 2) est réduit à son minimum en tenant compte de la variabilité du principal paramètre mesuré (apparition des acides aminés dans le sang), estimée à partir de nos précédentes études sur la biodisponibilité des nutriments réalisées avec un design expérimental similaire. Cette variabilité est liée non seulement de la variabilité interindividuelle des animaux, mais aussi à la qualité des prélèvements effectuées et à la précision des données obtenues par l’analyse biochimique. Ces aspects sont parfaitement maitrisés par les expérimentateurs du projet qui ont une longue expérience dans le domaine. Le fait d’utiliser un schéma expérimental en carré latin permet de diminuer significativement le nombre d’animaux utilisés (chaque animal étant son propre témoin). L'équipe de recherche impliquée dans le projet a une longue expérience sur l'utilisation d'animaux porteurs de canules digestives et de cathéters sanguins, ce qui permet de réduire au maximum le nombre d'animaux utilisés dans le projet, et de prévenir les processus douloureux. L’analyse statistique des données cinétiques (concentrations artérielles en acides aminés, flux de matière sèche et d’azote dans l’intestin chez le porc), sera réalisée avec l’animal comme variable aléatoire, et le temps, le repas et l’interaction temps x repas, comme facteurs. Pour les données représentant la valeur moyenne d’une variable (par exemple la digestibilité) une analyse de variance classique sera réalisée (repas, animal, semaine de prélèvement, comme effets principaux).

Raffinement

L’approche développée sera peu invasive, et peu traumatisante pour l’animal. La douleur imposée aux animaux pendant l’expérimentation est liée à l’acte chirurgical lequel se déroule sous anesthésie général avec monitoring des constantes vitales. Les animaux recevront pendant 6 jours un traitement analgésique et spamolytique, mais après cette période de récupération, elles restent mineures. Pendant la période de récupération, les animaux sont surveillés régulièrement (visite toutes les 2 h pendant la journée). L'évaluation de la gêne et de la douleur est faite par observation du comportement des animaux : reprise de l'alimentation, du transit intestinal, posture, vocalises, réactivité et la température corporelle. Pendant toute la durée de la période d'expérimentation, les animaux seront hébergés dans des cages, individuelles, au sol de taille réglementaire avec des copeaux de bois comme litière leur permettant de réaliser une activité de fouissage, et avec des parois latérales en plexiglass pour que les animaux puissent se voir et interagir entre eux. Leur environnement est enrichi à l’aide d’une chaîne en métal fixée sur les parois et de ballons. La pièce est à température régulée. Les animaux ont libre accès à l'eau.

Choix des espèces

Le porc présente un certain nombre de similitudes anatomiques et physiologiques avec l'homme. C’est la raison pour laquelle il est fréquemment utilisé comme modèle pour les études de nutrition. Le mini-porc permet de travailler sur des adultes (à stabilité pondérale) d'une taille compatible avec l'expérimentation animale. Il présente de plus l'avantage d'avoir un système digestif très proche de celui de l'Homme et d'accepter de manger tous types d'aliments. Ce modèle animal est reconnu par la communauté scientifique comme pertinent pour des études sur la digestibilité d'aliments avec un tranférabilité facilité à des études de la physiologie humaine. La procédure expérimentale est réalisée sur des animaux en fin de croissance (âge>10 mois), afin de bénéficier d'une stabilité pondérale pendant la totalité de la période d'expérimentation.

Exposées à la lumière bleue neuf heures par jour pendant quatorze jours, 192 souris subissent des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue pour des analyses post-mortem. Elles passent deux séances d'imagerie ultrasonore fonctionnelle de deux heures chacune sous anesthésie générale, dont le porteur attend une chute de température et une baisse des fréquences cardiaque et respiratoire. L'objet déclaré est de comprendre par quels circuits la lumière bleue devient un message douloureux dans la photophobie, symptôme fréquent de la migraine et du syndrome de l'œil sec. Le porteur note que les souris fuient la lumière bleue, comportement qu'il rapporte à un stress, et espère identifier à terme de potentielles cibles thérapeutiques.

Objectifs

La photophobie, une perturbation sensorielle douloureuse provoquée par la lumière, est un symptôme courant des troubles neurologiques et ophtalmologiques. La photophobie est hétérogène et varie d'une personne à l'autre ; une partie de l'hétérogénéité provient des différents troubles qui manifestent ce symptôme. On soupçonne aujourd'hui que l'exposition chronique à la lumière (surtout celle proche des bandes spectrales bleue/violet) pourrait avoir un rôle délétère dans l'épidémiologie et l'évolution des symptômes de la photophobie. En effet, de nombreux patients se plaignent d'une sensibilité accrue à ce type de lumière lorsqu'ils travaillent sur des écrans et/ou dans des lieux éclairés par une lumière artificielle (dans la plupart des cas, il s'agit de tubes fluorescents et/ou de LED). Le fait qu'aujourd'hui ces lumières artificielles nous entourent presque partout a aggravé la situation clinique de ces patients. Des cellules spécialisées sensibles à la lumière ont été identifiés dans la rétine et pourraient expliquer la raison d'être de la photophobie chez les personnes aveugles. Bien que cette découverte semble faire progresser la compréhension du mécanisme de la photophobie, la manière dont la lumière fonctionne en tant que stimulus de la douleur reste incompris. Ce projet a pour but de mettre en évidence l'impact spécifique de la lumière bleue au niveau cérébral, ce qui a été peu exploré jusqu'à présent. A cette fin, nous enregistrerons l’activité hémodynamique dans différentes régions du cerveau suite à des stimulations lumineuses à différentes longueurs d’onde, chez des animaux avant et après le développement d’une photophobie induite par une exposition à la lumière bleue ainsi que chez des animaux contrôles ayant été exposés de façon chronique à une lumière jaune et des animaux naïfs n’ayant pas été exposés.

Bénéfices attendus

La photophobie est un symptôme courant des troubles neurologiques (ex : migraine, 1 à 2 pour cent de la population générale) et ophtalmologiques (ex : syndrome de l’œil sec, 15 à 20 pour cent de la population âgée de plus de 65 ans). Elle se caractérise par une hypersensibilité à la lumière qui provoque alors des céphalées et des vives douleurs dans les yeux. Un exposition chronique à la lumière bleue (écrans, LEDs) induit une photophobie. Ce projet a pour but d’élucider par quels mécanismes la lumière bleue induit un message douloureux dans le cas d’une photophobie. Puisqu’il y a peu de données disponibles, une première étape est de mettre en évidence les régions cérébrales en lien avec la vision et la douleur activées par une stimulation lumineuse dans un modèle de photophobie ainsi que la plasticité cérébrale dans la photophobie. Pour ce faire, nous disposons d’un modèle murin de photophobie induite par la lumière bleue que nous comparerons à un modèle contrôle (exposition à la lumière jaune). En mettant en évidence les différentes régions cérébrales impliquées dans la photophobie ainsi que la plasticité cérébrale inadaptée qui se développe, nous espérons ainsi pouvoir non seulement mieux comprendre et décrire ce phénomène pathologique mais également identifier de potentielles voies à visée thérapeutique pour la prise en charge de la photophobie.

Procédures

Dans le cadre de ce projet les animaux seront exposés à différentes conditions de lumière (jaune ou bleue), 9h par jour durant 14 jours. L’ensemble des animaux auront deux sessions d’imagerie fonctionnelle ultrasonore qui dureront chacune 2h par animal et qui se feront sous anesthésie générale. La totalité des tests réalisés durant l’imagerie sera effectuée sous anesthésie générale. Cette procédure comprend une euthanasie qui sera réalisée selon une méthode réglementaire effectuée sous anesthésie générale et analgésie.

Impact sur les animaux

Lors de l’exposition à la lumière bleue, les souris adoptent un comportement de fuite/soustraction face à la lumière bleue reflétant un stress. Lors de l’imagerie, l’anesthésie prolongée des animaux pourrait induire des effets indésirables sur les constantes vitales de l’animal : chute de température, baisse des fréquences cardiaque et respiratoire.

Devenir

Des prélèvements et analyses post-mortem sont nécessaires ce qui implique l’euthanasie des animaux par une procédure réglementaire à la fin de chaque procédure.

Remplacement

L’utilisation d’animaux vivants se justifie par la nécessité de mettre en évidence des circuits neuronaux complexes impliqués dans la douleur cornéenne et qui impliquent l’ensemble de l’encéphale. Le modèle que nous utilisons ne peut pas être remplacé par une approche alternative in-vitro car la douleur cornéenne chronique est une pathologie complexe qui ne peut être modélisée qu’au niveau de l’animal entier. Une approche intégrative sur l’animal entier reste incontournable. Notre projet de recherche porte sur l’étude de réseaux neuronaux complexes présents dans un cerveau entier. Bien que ces questions soient posées pour aider à une meilleure compréhension des pathologies humaines et l’amélioration de leur traitement, une première étape nécessite l’utilisation de rongeurs.

Réduction

Nous utiliserons au maximum 192 animaux dans ce projet. Afin de respecter la règle de réduction, nous utiliserons un nombre limité d’animaux et de groupes tout en procédant à des tests statistiques pour une interprétation fiable des résultats. La taille des effectifs a été estimée grâce à un calcul de puissance. Nous procéderons à une étude longitudinale : chaque animal sera suivi dans le temps et sera son propre contrôle.

Raffinement

Afin de réduire le stress et l’anxiété, les animaux seront reçus une semaine avant le début des expérimentations. L’hébergement des animaux est effectué en confinement adapté à la stabulation de lignés de souris. Les conditions d’hébergement ont été optimisées pour réduire le stress des animaux : présence d’enrichissement dans les cages (copeaux de bois compacté, tube en carton) et maintien des animaux en groupe de 4 congénères afin d’éviter le stress de l’isolement. La nourriture et l’eau de boisson sont fournies ad libitum. La température de la zone d’hébergement est maintenue à 22 Degrés Celsius et suit un cycle d’éclairage non inversé 12h jour/12h nuit. Le taux d’humidité des cages est contrôlé (55 pour cent). Les animaux seront observés et manipulés quotidiennement afin de minimiser le stress et la douleur qui seront évalués à l’aide de points limites. Toute observation anormale sera notée dans un tableau des points limites et nous suivrons l’échelle décisionnelle que nous avons définie. L’application de cette échelle permettra de modifier la procédure en cours avec l’administration d’un traitement antalgique, et/ou de décaler dans le temps les actes prévus par la suite ou enfin d’euthanasier l’animal en dernier recours. Afin de minimiser le stress et la variabilité lors du test comportemental, les animaux suivront une session d’habituation au test durant 5 jours avant le début de l’exposition à la lumière bleue ou jaune. L’animal aura libre accès à l’ensemble du complexe dans une période de 5 minutes, c’est-à-dire les deux compartiments (illuminé ou sombre) et le couloir central reliant les deux compartiments. Pour l’imagerie, aucun acte ne sera entrepris avant que l’animal ne soit stabilisé pour ces différentes constantes (couverture thermostatée et suivi des fréquences cardiaque et respiratoire).

Choix des espèces

Le développement de modèles précliniques chez la souris est hautement reconnu et utilisé en routine pour la recherche portant sur la douleur oculaire. La souris de laboratoire est l'animal de choix car (1) elle possède les structures cérébrales adéquates, (2) nous avons accès éventuellement à tous les outils génétiques requis. Ce projet de recherche portant sur la photophobie nécessite d’utiliser des animaux adultes, âgés de plus de 6 semaines dont les circuits neuronaux sont établis puisque ce projet porte sur l’identification de modifications dysfonctionnelles de ces réseaux. Stade de développement à l’arrivée à l’animalerie : souris mâles et femelles d’une souche commerciale couramment utilisée adultes de 7 semaines.

Cathéter posé dans la veine de la queue, 45 minutes d'imagerie sous anesthésie, prélèvement de 30 microlitres de sang : chaque souris porteuse de tumeurs greffées enchaîne ces gestes pour qu'un médicament radioactif soit suivi dans son corps. 2 370 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées en fin d'étude pour mesurer la radioactivité de leurs organes. Le porteur annonce que les meilleurs candidats passeront ensuite en clinique, et affirme qu'aucun modèle en laboratoire ou sur ordinateur ne reproduit la complexité d'une tumeur. Il évoque des points limites établis lors d'expérimentations préliminaires sans les énoncer, et reprend l'effectif de 2 370 souris déjà déclaré dans le projet jumeau EU1, au texte quasi identique.

Objectifs

Cette étude cherche à mieux comprendre comment des médicaments radioactifs se déplacent dans le corps et se concentrent sur des cibles précises, comme certaines cellules cancéreuses ou leur environnement. Ces médicaments radioactifs sont utilisés pour créer des images médicales pour le diagnostic du cancer ou pour traiter le cancer de manière ciblée. Notre étude vise à comparer différents formats de médicaments radioactifs afin d'obtenir des images avec un bon contraste et de limiter l’exposition des organes sains aux radiations. Ces médicaments radioactifs sont faits de plusieurs parties, et chacune peut influencer la façon dont le médicament se répartit et s'accumule dans les différents organes. Notre étude vise à identifier les meilleures combinaisons ou les effets précis de chacune de ces parties.

Bénéfices attendus

Ce projet vise à tester, sur des modèles animaux, l’efficacité de médicaments radioactifs pour détecter et traiter le cancer de manière ciblée. À la fin de l’étude, les médicaments présentant le meilleur ciblage et la meilleure distribution dans le corps pourront être testés en clinique. Plus largement, ce projet permettra de mieux comprendre comment les différentes parties de ces médicaments influencent leur parcours dans le corps et leur capacité à atteindre les zones ciblées.

Procédures

- injection sous-cutanée (30 sec/animal). - Anesthésie dans une boite chauffée (3 min/animal) - Placement d’un cathéter dans la veine de la queue (1 min/animal). - Imagerie (maximum : 45 min/animal) - Prélèvement de 30 μL de sang (1min/animal).

Impact sur les animaux

Effets indésirables direct : - douleur associée à une injection sous-cutanée - douleur associée à une injection intraveineuse - douleur associée à un prélèvement sanguin. Effets indésirables indirect conséquence des produits injectés: - croissance tumorale - perte de poids. Les souris immunodéficientes pourraient développer des pathologies du fait de leur manque de défenses immunitaires néanmoins nous ne nous attendons pas à observer ce phénotype dommageable grâce aux conditions d’hébergement (hébergement dans une enceinte, capots filtrants) et les mesures sanitaires en place (port d’EPI par les expérimentateurs, désinfection des surfaces de travail).

Devenir

La totalité́ des animaux seront mis à mort en fin d’étude car pour nos objectifs scientifiques des mesures de radioactivité et analyses complémentaires sur des organes d’intérêts sont nécessaires, rendant le prélèvement final de ces organes obligatoire.

Remplacement

Il n'existe pas encore de modèles en laboratoire ou sur ordinateur capables de reproduire toute la complexité d'une tumeur et de prédire précisément comment un médicament radioactif se répartira dans le corps.

Réduction

Nous utilisons le moins d'animaux possible tout en nous assurant que les résultats obtenus soient fiables. Étudier les médicaments radioactifs nécessite plusieurs groupes de comparaison, mais grâce à des techniques d’imagerie non invasives, nous pouvons limiter le nombre d’animaux, car il n’est pas nécessaire de les sacrifier à chaque étape de l’étude. La taille des groupes a été calculée avec l’aide de spécialistes en statistiques pour garantir que les résultats soient valides, en tenant compte des données que nous avons déjà obtenues. Pour analyser ces résultats, nous utiliserons différents tests statistiques pour comparer les groupes ou évaluer les courbes de survie.

Raffinement

Les animaux feront l’objet d’une surveillance quotidienne par les mêmes membres du personnel. Les signes de douleur, souffrance, angoisse, changement de comportement ou d’aspect physique seront classés et rapportés. Les expérimentateurs sont formés pour reconnaître ces signes. De manière plus spécifique, des mesures de prise en charge de la douleur éventuelle et des points limites spécifiques ont été mis en place lors d'expérimentations préliminaires. Les animaux seront hébergés par 5 ou 10 en fonction de la taille des cages et le nombre d’animaux par groupes mais l’hébergement individuel sera proscrit. L’eau et la nourriture seront donnés ad libitum. Au minimum une sorte d’enrichissement sera mis dans chaque cage (sizzle-dri ou tubes en polycarbonate). Les souris possédant un système immunitaire faible sont hébergées et manipulées dans des conditions visant à prévenir les risques d’infections avec des pathogènes. L’imagerie est une méthode non invasive permettant de réduire la douleur à son minimum. De plus, la majorité des procédures est réalisée sous anesthésie sur lit chauffant réduisant l’inconfort potentiel à son minimum et permettant ainsi le raffinement de l’étude.

Choix des espèces

Il n’existe pas d’autres solutions que d’utiliser des animaux pour ces expériences, car elles nécessitent d’étudier directement dans un organisme vivant comment le médicament se répartit, agit et est éliminé. Les souris sont particulièrement adaptées à ces études, car leur façon de digérer, transformer et éliminer les substances est très proche de celle de l’être humain. Age 6-8 semaines, animal adulte. Les cancers évalués (pancréatique, sein, colorectal) étant dominants dans la population adulte, les animaux utilisés seront donc en âge adulte.

L'exposition professionnelle aux nanoplastiques, sur les sites de recyclage ou en impression 3D, sert de motif à ce suivi de nanoparticules de plastique PET dans l'organisme. 40 rats, 20 femelles et 20 mâles, vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Sous anesthésie, chacun est intubé et reçoit dans la trachée une solution de nanoparticules marquées au carbone 14, avant réveil par antidote, puis un séjour d'un à cinq jours en cage à métabolisme pour collecter urines et selles. Ils sont tués par groupes de quatre à 1 heure, 4 heures, 24 heures, 7 jours et 28 jours, pour mesurer la radioactivité du sang, des poumons, du foie, des reins, de la rate, du cerveau et des organes reproducteurs. Le porteur retient le rat comme l'espèce préconisée par les recommandations de l'OCDE en toxicocinétique.

Objectifs

Les nanoplastiques sont omniprésents dans l’environnement mais aussi sur certains lieux de travail (sites de recyclage, usines de production de textiles, entreprises d’impression 3D,…). Cependant peu de d’informations sont disponibles quant à leur devenir dans l’organisme à la suite de l’exposition des salariés. En milieu professionnel, l’inhalation est la voie majeure d’exposition à ce type de particules. Afin de suivre la distribution dans l’organisme, la méthode la plus sensible consiste à utiliser des particules radiomarquées. Ce projet a donc pour objectif d’étudier le devenir et la distribution dans l'organisme ainsi que l'élimination (toxicocinétique) sur une période maximale de 28 jours chez le rat de nanoparticules de polyéthylène téréphtalate (PET) marquées avec un traceur radioactif, le carbone 14. Cette analyse de toxicocinétique se fera après l'administration directe des nanoparticules dans le poumon de rats après intubation de l'animal sous anesthésie générale (administration par instillation intratrachéale).

Bénéfices attendus

Ce projet apportera des connaissances nouvelles sur la toxicocinétique de nanoparticules de PET. Au-delà des données de biodistribution, il pourra aider à développer des modèles de toxicocinétique permettant de limiter le recours aux animaux de laboratoire. Il sera aussi une source d'information sur la potentielle dangerosité de ces nanoparticules administrées par voie pulmonaire dans d'autres organes que le poumon en fonction des quantités détectées.

Procédures

Cinq groupes de 4 rats femelles et cinq autres groupes de 4 rats mâles recevront, sous anesthésie (à l'aide de médicaments spécifiques), une solution contenant des nanoparticules marquées avec un traceur radioactif, le carbone 14 par instillation dans les voies respiratoires. Après l'administration, les rats seront réveillés grâce à une injection d'un médicament antidote spécifique. L'ensemble de l'expérience (anesthésie, instillation, et réveil des animaux) ne durera pas plus d'une heure. Les rats seront ensuite mis à mort à différents temps : 1 heure, 4 heures, 24 heures, 7 jours et 28 jours après l'administration des nanoparticules. Les animaux seront mis à mort dans le respect du bien-être animal. Divers fluides et organes (sang, poumon, ganglions lymphatiques proches des poumons, foie, reins, rate, cerveau, organes reproducteurs mâles et femelles) seront prélevés pour mesurer la radioactivité qu'ils contiennent. Les rats mis à mort 24 heures après l'administration de nanoparticules seront placés dans des cages spéciales (cages à métabolisme) pendant cette période post administration de 24 heures afin de collecter leurs urines et leurs selles. Ceux mis à mort après 7 jours ou 28 jours seront également placés dans le même type de cages pendant une période pouvant aller jusqu'à 5 jours, en fonction des niveaux de radioactivité observés dans leurs urines et leurs selles.

Impact sur les animaux

Au-delà de l’inconfort causé par l’anesthésie et l’instillation intratrachéale, le projet aura un impact limité sur le bien-être des animaux. Le placement en cage à métabolisme pendant 24 h ou jusqu'à 5 jours pour les temps post-exposition 7 jours et 28 jours consistera la plus grande source d’inconfort post-exposition. Il n’est pas attendu que la quantité de particules administrée ou la dose de radioactivité aient une incidence majeure sur la santé des animaux.

Devenir

Les animaux sont mis à mort à la fin de la procédure afin de collecter le sang et les tissus d’intérêt dans l’objectif de quantifier la radioactivité présente et ainsi estimer la biodistribution des nanoparticules.

Remplacement

A ce jour, en l’absence de connaissances suffisantes, il est nécessaire d’utiliser des animaux de laboratoire pour étudier la biodistribution dans l'organisme entier et l’excrétion de nanoparticules de PET. Ces travaux concourront cependant à développer des modèles mathématiques de toxicocinétique permettant à terme de limiter le recours à des animaux de laboratoire.

Réduction

Grâce au recours à des nanoparticules de PET radiomarquées, il ne sera pas nécessaire de disposer de groupes témoins pour analyser les résultats. Par ailleurs, le nombre d’animaux utilisés est réduit au minimum nécessaire pour pouvoir interpréter les résultats. Enfin, cette étude portera tout d’abord sur le temps 24 heures. Les temps plus courts (1 et 4 heures) ou longs (7 et 28 jours) ne seront réalisés qu’en fonction des résultats obtenus sur les temps courts et de la sensibilité de la méthode.

Raffinement

Les administrations par instillation intratrachéale seront réalisées sous anesthésie. En dehors de la période de 24 heures (ou éventuellement 5 jours pour les groupes 7 jours et 28 jours) en cage à métabolisme, les animaux seront hébergés par deux en présence d’enrichissement adapté (tunnel en polycarbonate rouge). Au vu des données de la littérature et de notre expérience, les procédures expérimentales utilisées dans ce projet ne sont pas considérées comme générant une souffrance sévère chez l’animal. Les points limites suivants seront cependant appliqués: 1) perte de poids supérieure à 20% au cours de la procédure; 2) modification de l'apparence physique (défaut de toilettage, piloerection importante); 3) altération de la respiration; 4) difficulté à se mouvoir et 5) détresse marquée lors de la manipulation. L’atteinte de points limite entrainera la mise à mort de l’animal dans le respect du bien-être animal. L'évaluation de cette atteinte de points limites sera réalisée au travers d'une grille de score.

Choix des espèces

Le rat de laboratoire possède un système pulmonaire relativement évolué présentant de nombreuses similitudes avec celui de l’être humain. Les données de toxicocinétique chez cette espèce sont extrapolables à l’être humain. Le rat est l’espèce préconisée dans les recommandations internationales (en particulier celles de l'OCDE) relatives à l'étude de la toxicocinétique des agents chimiques. Des animaux jeunes adultes de 10 semaines seront utilisés. Cela correspond à un stade du développement en accord avec les études de toxicologie qui requièrent des animaux jeunes et exempt de toute pathologie.

Les souris utilisées sont immunodéficientes et portent des tumeurs pancréatiques, mammaires ou colorectales greffées, une fragilité que le porteur compte contenir par l'hébergement en enceinte filtrante. 2 370 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, pour comparer des formats de médicaments radioactifs destinés au diagnostic et au traitement ciblé du cancer. Chacune reçoit une injection sous-cutanée, une anesthésie, un cathéter dans la veine de la queue, jusqu'à 45 minutes d'imagerie et un prélèvement de 30 microlitres de sang, avec croissance tumorale et perte de poids annoncées comme effets indésirables. Toutes sont tuées en fin d'étude pour mesurer la radioactivité accumulée dans leurs organes.

Objectifs

Cette étude cherche à mieux comprendre comment des médicaments radioactifs se déplacent dans le corps et se concentrent sur des cibles précises, comme certaines cellules cancéreuses ou leur environnement. Ces médicaments radioactifs sont utilisés pour créer des images médicales pour le diagnostic du cancer ou pour traiter le cancer de manière ciblée. Notre étude vise à comparer différents formats de médicaments radioactifs afin d'obtenir des images avec un bon contraste et de limiter l’exposition des organes sains aux radiations. Ces médicaments radioactifs sont faits de plusieurs parties, et chacune peut influencer la façon dont le médicament se répartit et s'accumule dans les différents organes. Notre étude vise à identifier les meilleures combinaisons ou les effets précis de chacune de ces parties.

Bénéfices attendus

Ce projet vise à tester, sur des modèles animaux, l’efficacité de médicaments radioactifs pour détecter et traiter le cancer de manière ciblée. À la fin de l’étude, les médicaments présentant le meilleur ciblage et la meilleure distribution dans le corps pourront être testés en clinique, Plus largement, ce projet permettra de mieux comprendre comment les différentes parties de ces médicaments influencent leur parcours dans le corps et leur capacité à atteindre les zones ciblées.

Procédures

- injection sous-cutanée (30 sec/animal). - Anesthésie dans une boite chauffée (3 min/animal) - Placement d’un cathéter dans la veine de la queue (1 min/animal). - Imagerie (maximum : 45 min/animal) - Prélèvement de 30 μL de sang (1min/animal).

Impact sur les animaux

Effets indésirables direct : - douleur associée à une injection sous-cutanée - douleur associée à une injection intraveineuse - douleur associée à un prélèvement sanguin. Effets indésirables indirect conséquence des produits injectés: - croissance tumorale - perte de poids. Les souris immunodéficientes pourraient développer des pathologies du fait de leur manque de défenses immunitaires néanmoins nous ne nous attendons pas à observer ce phénotype dommageable grâce aux conditions d’hébergement (hébergement dans une enceinte, capots filtrants) et les mesures sanitaires en place (port d’EPI par les expérimentateurs, désinfection des surfaces de travail).

Devenir

La totalité́ des animaux seront mis à mort en fin d’étude car pour nos objectifs scientifiques des mesures de radioactivité et analyses complémentaires sur des organes d’intérêts sont nécessaires, rendant le prélèvement final de ces organes obligatoire.

Remplacement

Il n'existe pas encore de modèles en laboratoire ou sur ordinateur capables de reproduire toute la complexité d'une tumeur et de prédire précisément comment un médicament radioactif se répartira dans le corps.

Réduction

Nous utilisons le moins d'animaux possible tout en nous assurant que les résultats obtenus soient fiables. Étudier les médicaments radioactifs nécessite plusieurs groupes de comparaison, mais grâce à des techniques d’imagerie non invasives, nous pouvons limiter le nombre d’animaux, car il n’est pas nécessaire de les sacrifier à chaque étape de l’étude. La taille des groupes a été calculée avec l’aide de spécialistes en statistiques pour garantir que les résultats soient valides, en tenant compte des données que nous avons déjà obtenues. Pour analyser ces résultats, nous utiliserons différents tests statistiques pour comparer les groupes ou évaluer les courbes de survie

Raffinement

Les animaux feront l’objet d’une surveillance quotidienne par les mêmes membres du personnel. Les signes de douleur, souffrance, angoisse, changement de comportement ou d’aspect physique seront classés et rapportés. Les expérimentateurs sont formés pour reconnaître ces signes. De manière plus spécifique, des mesures de prise en charge de la douleur éventuelle et des points limites spécifiques ont été mis en place lors d'expérimentations préliminaires. Les animaux seront hébergés par 5 ou 10 en fonction de la taille des cages et le nombre d’animaux par groupes mais l’hébergement individuel sera proscrit. L’eau et la nourriture seront donnés ad libitum. Au minimum une sorte d’enrichissement sera mis dans chaque cage (sizzle-dri ou tubes en polycarbonate). Les souris possédant un système immunitaire faible sont hébergées et manipulées dans des conditions visant à prévenir les risques d’infections avec des pathogènes. L’imagerie est une méthode non invasive permettant de réduire la douleur à son minimum. De plus, la majorité des procédures est réalisée sous anesthésie sur lit chauffant réduisant l’inconfort potentiel à son minimum et permettant ainsi le raffinement de l’étude.

Choix des espèces

Il n’existe pas d’autres solutions que d’utiliser des animaux pour ces expériences, car elles nécessitent d’étudier directement dans un organisme vivant comment le médicament se répartit, agit et est éliminé. Les souris sont particulièrement adaptées à ces études, car leur façon de digérer, transformer et éliminer les substances est très proche de celle de l’être humain. Age 6-8 semaines, animal adulte. Les cancers évalués (pancréatique, sein, colorectal) étant dominants dans la population adulte, les animaux utilisés seront donc en âge adulte.

Des cellules de cancer du sein triple négatif sont injectées à des souris, la tumeur mammaire est retirée sous anesthésie deux à trois semaines plus tard, puis les métastases pulmonaires sont suivies par imagerie une fois par semaine pendant quatre semaines. 780 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour des analyses post-mortem. Le porteur décrit un travail préalable sur lignées cellulaires humaines et organoïdes pulmonaires, et réserve à l'animal l'étude de la progression métastatique elle-même. Sur les nuisances attendues, il retient la piqûre, "gêne de courte durée", puis mentionne des métastases pulmonaires capables d'entraîner une gêne respiratoire.

Objectifs

La progression métastatique des cancers reste le principal défi en oncologie. Le cancer du sein occupe la première position parmi les cancers féminins, et son sous-type le plus agressif, dit « triple négatif », métastase principalement dans le poumon. Les projets de notre équipe visent à comprendre les mécanismes qui permettent aux cellules cancéreuses d’atteindre le tissu pulmonaire. Dans notre équipe, nous utilisons le modèle organoïde pour étudier l’interaction entre le tissu pulmonaire et les cellules du cancer du sein. Nos données montrent que la présence de cellules cancéreuses qui métastasent spécifiquement dans le poumon in vivo modifient l’expression de gènes liés à la réponse inflammatoire dans le poumon. Notre hypothèse est donc la suivante : les cellules cancéreuses induisent un état pro-inflammatoire et donc pro-métastatique dans le poumon via une communication à distance. En partant de nos données ex vivo, notre objectif en utilisant le modèle animal est de comprendre le rôle de ces gènes liés à la réponse inflammatoire dans l’établissement de la niche métastatique pulmonaire. En modélisant la progression métastatique dans des souris sauvages ou déficientes de ces gènes, nous cherchons à comprendre la dynamique du microenvironnement pulmonaire dans le contexte des métastases.

Bénéfices attendus

Les résultats issus de ce projet avanceront notre compréhension des processus métastatiques, essentielle pour arriver à terme de mieux prendre en charge des patients atteints de cancer, tout d’abord en cas de rechutes, mais surtout à les prévenir. Notre projet vise le cancer du sein triple négatif, le sous-type le plus agressif du premier cancer détecté chez les femmes, pour lequel les avancements thérapeutiques sont les plus urgents. Nous envisageons que la compréhension du rôle de gènes liés à la réponse inflammatoire dans la prévention des métastases pulmonaires pourrait donner suite aux études évaluant le potentiel thérapeutique des molécules ciblant ces gènes.

Procédures

Dans un premier lot, les animaux vigiles seront injectés avec des cellules tumorales (durée du geste

Impact sur les animaux

Les nuisances attendues lors de l’administration des cellules par injections intraveineuses ou injections dans l’abdomen seront celles liées à la piqûre elle-même (gène de courte de durée). L’injection de cellules tumorales causera le développement des tumeurs au niveau mammaire ou des métastases pulmonaires, qui pourront entrainer respectivement une gêne à la mobilité ou une gêne respiratoire.

Devenir

Tous les animaux sont mis à mort pour des analyses post-mortem.

Remplacement

Nous utilisons plusieurs stratégies de remplacement : (1) Tout d’abord, pour étudier les mécanismes intrinsèques aux cellules tumorales de propension métastatique, nous disposons de plusieurs lignées cellulaires humaines de cancer du sein triple négatif qui diffèrent dans leurs potentiels et tropismes métastatiques. Nous utilisons donc systématiquement ces modèles in vitro. (2) Pour mieux comprendre l’interaction entre les cellules tumorales et le tissu pulmonaire, nous utilisons le modèle organoïde. Nous dérivons des organoïdes pulmonaires des cellules souches pluripotentes humaines, et procédons aux co-cultures avec les cellules de cancer du sein. Seuls les gènes candidats dont nous aurons montré l’importance dans ces deux systèmes seront ensuite étudiés in vivo. Cependant, la progression métastatique est un processus multi-organe, qui implique plusieurs étapes complexes, et enfin l’établissement dans le tissue secondaire. Modéliser ce processus ex vivo reste encore un défi à atteindre. Nous envisageons donc à procéder à l’utilisation des organoïdes vascularisés, et ensuite assemblés avec les cellules immunitaires pour mieux modéliser la progression métastatique. Cependant, l’animal vivant reste le modèle le plus adapté pour l’étude de progression tumorale, surtout métastatique, car ce processus est multi-organe. L'apprentissage des gestes techniques sera réalisé dans un premier temps sur mannequins puis sur cadavres frais.

Réduction

Nous allons utiliser le nombre minimal d’animaux suffisant pour obtenir des résultats significatifs. Nous utiliserons systématiquement l’imagerie pour les suivis de la progression métastatique dans le poumon. Cette méthode permet d’éviter la mise à mort des animaux à différents temps pour le suivi des métastases pulmonaires. Chaque mise à mort des animaux sera exploitée et optimisée en récoltant un maximum de prélèvements, permettant ainsi de diminuer le nombre d’animaux à utiliser. Dans les procédures où la tumeur primaire est enlevée chirurgicalement, les tumeurs seront récupérées pour différentes analyses. L'utilisation de mannequins ou de cadavres pour l'apprentissage des gestes techniques permettra de limiter le nombre d'animaux utilisés.

Raffinement

Une grille de score est mise en place pour évaluer de façon objective l’état des animaux, et les valeurs seuil sont définies pour commencer les soins nécessaires ou mettre à mort les animaux. Les gestes invasifs ou nécessitant l’immobilité de l’animal seront réalisés sous anesthésie générale avec recours aux analgésiques si nécessaire. Toutes les mesures seront prises pour éviter l’hypothermie, la déshydratation et le stress respiratoire liés à l’anesthésie. Les soins post-opératoires seront mis en place pour réduire la douleur et l’inconfort des animaux : surveillance accrue, analgésie, prévention des infections, aliment hydraté. L'apprentissage des gestes techniques sera réalisé de manière séquentielle, sur mannequin puis sur cadavre frais avant de passer à l'animal vivant. L'acquisition du geste technique sear validée, par des opérateurs expérimentés, grâce à des critères précis et précoces.

Choix des espèces

La souris est le modèle de choix pour étudier la biologie de cancer en général, et pour comprendre le processus métastatique en particulier. Cela est dû au fait que les systèmes de plusieurs organes (y compris pulmonaire, vasculaire, immunitaire) sont comparables à ceux de l’homme et très bien caractérisés depuis plusieurs décennies. De plus, le modèle souris et les procédures utilisées sont très bien établis et standardisés dans le domaine. La disponibilité de lignées génétiquement modifiées et de souris immunodéficientes est un autre atout très important pour la faisabilité des expériences et pour les greffes de cellules humaines. Les souris adultes, âgées de 8-12 semaines seront utilisées pour toutes les expériences. Le cancer du sein se manifeste chez les femmes adultes, et les souris de cet âge sont couramment utilisées pour modéliser la progression métastatique par greffe des cellules cancéreuses

Opérées pendant une heure par le cou pour boucher puis rouvrir une artère du cerveau, 48 souris passent à l'IRM sous anesthésie pendant l'occlusion et sont traitées par un activateur de la protéine Epac1 ou par un placebo. Dans ces procédures d'un niveau de souffrance modéré, elles perdent du poids et présentent des déficits sensorimoteurs, comme une paralysie partielle d'un côté du corps, et celles qui font une hémorragie sous-arachnoïdienne sont tuées sans réveil après l'IRM. Le porteur affirme que les lésions du cerveau "n'engendrent pas de douleur", la douleur portant selon lui surtout sur la cicatrice du cou, et prévoit de la buprénorphine jusqu'à la fin. Il écrit que le suivi est "volontairement limité à 24h post-AVC", alors que le protocole prévoit sept jours de survie avant une IRM terminale. Toutes sont tuées après cette dernière IRM pour prélever leur cerveau.

Objectifs

L’accident vasculaire cérébral ischémique (AVCi) est une maladie fréquente et invalidante. Comprendre les mécanismes impliqués dans la formation des lésions cérébrales suite à un AVCi est devenu une priorité pour développer de nouvelles stratégies thérapeutiques en neuroprotection et améliorer le devenir des patients. L’objectif global du projet est d’évaluer l’effet protecteur à long-terme d’un nouveau traitement ciblant la protéine Epac1 dans un modèle murin d’AVC transitoire. Des études préliminaires in vitro et ex vivo sur cette nouvelle cible thérapeutique suggèrent un effet protecteur de l’activation d’Epac-1 sur le cerveau en condition d’AVC. Afin de confirmer ces résultats et d’aller plus loin dans l’exploration des effets in vivo de Epac-1 dans l’AVCi à long terme, nous allons évaluer les conséquences d’une activation d’Epac-1 à l’aide d’un agoniste (qui favorise l’expression de la cible thérapeutique) par imagerie par résonance magnétique (IRM) multiparamétrique. Pour vérifier que ces résultats sont maintenus à plus long terme, nous allons réaliser un suivi des animaux traités avec l’agoniste ou le placebo pendant 7 jours, Notre hypothèse est que l’activation d’Epac-1 devrait diminuer la taille des lésions, protéger la barrière hématoencéphalique et ainsi améliorer le pronostic des animaux.

Bénéfices attendus

Si l’effet neuroprotecteur de la modulation d’Epac-1 est prouvé, cela validera Epac-1 comme une nouvelle cible thérapeutique. Il sera possible de proposer un nouveau traitement de l’AVCi, avec l’espoir à terme de limiter les séquelles neurologiques pour les patients victimes d’un AVC.

Procédures

Chirurgie de 60 minutes IRM sur animaux ansthésiés d’environ 60 min Mesures neurofonctionnelles de 10 min

Impact sur les animaux

Suite à l'accident vasculaire cérébral, les animaux perdent du poids et présentent des déficits neurofonctionnels sensorimoteurs (par exemple hémiparésie et diminution de la sensibilité des vibrisses). La douleur concerne principalement la cicatrice due à l’abord chirurgicale (le cou) car les dommages au niveau du parenchyme cérébral n’engendrent pas de douleur (raison pour laquelle les patients présentant un AVC tardent à se rendre aux urgences). Les animaux sont gardés en vie pendant 7 jours puis ils sont mis à mort à l’issue de l’examen IRM terminal. La principale complication du modèle est le décès par œdème malin ou hémorragie sous-arachnoïdienne (

Devenir

Les animaux seront mis à mort pour permettre le prélèvement du cerveau pour les analyses complémentaires postmortem (étude des mécanismes).

Remplacement

Cette étude in vivo vient compléter des études déjà réalisées in vitro, ex vivo et in vivo qui ont montré le rôle de la protéine Epac-1 dans l'ischémie-reperfusion. L’utilisation du modèle animal adéquat (permettant une ischémie et une reperfusion) conditionne la validité de l’évaluation des traitements et la possibilité de transfert en clinique. L’utilisation d’animaux est egalement justifiée par le rôle central de l’imagerie in vivo dans ces procédures.

Réduction

Le nombre minimal et suffisant d'animaux a été estimé par une étude statistique en prenant en compte la variabilité attendue du modèle et les critères d'exclusion (absence d'infarct cérébral, hémorragie sous-arachnoïdienne). L’utilisation de l’IRM longitudinale permet de réduire le nombre d’animaux car chaque animal est son propre contrôle (on peut rapporter la taille de lésion par la taille de l’atteinte initiale en perfusion ou en diffusion en perocclusion chez chaque individu). Enfin, lors des prélèvements finaux, d'autres tissus pourront être prélevés et conservés en concertation avec nos collaborateurs au moment de la mise en place du projet afin de limiter, optimiser et valoriser au mieux les prélèvements et le nombre d'animaux utilisés dans cette étude.

Raffinement

L’imagerie réalisée pendant l'accident vasculaire cérébral permet de sélectionner des animaux avec une occlusion artérielle correcte, et une lésion cérébrale significative. La variabilité du modèle est ainsi limitée. L’IRM per-occlusion est également efficace pour détecter les animaux présentant un hémorragie sous-arachnoïdienne précoce (

Choix des espèces

Les animaux utilisés pour cette étude seront des souris car il existe une littérature importante rapportant l’utilisation de cette souche pour la recherche translationnelle sur les AVCi. En particulier, cette souche de souris a peu d'artères collatérales dans le cerveau ce qui permet d'avoir une lésion ischémique plus reproductible d'un animal à un autre. D'autre part, leur pigmentation de peau blanche rend plus facile la pose du cathéter caudal pour les examens IRM nécessitant l’administration d’un agent de contraste (imagerie de perfusion et de perméabilité). Les animaux auront entre 6 et 8 semaines (adultes) : la maturité cérébrale est atteinte et le poids suffisant pour la mise en place d’un cathéter veineux caudal pour l’injection des agents de contraste.

Injectées d'une toxine bactérienne dans l'abdomen, prélevées de 20 microlitres de sang à la queue sous anesthésie gazeuse, 144 souris subissent des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le dernier jour, sous anesthésie profonde, la peau du crâne est ouverte pour observer la moelle osseuse au microscope à travers l'os, pendant trois heures. Le porteur anticipe pour cette étape un risque d'hypothermie, un dessèchement des yeux et une douleur liée à la durée de l'anesthésie, et attribue aux cycles répétés d'anesthésie et de réveil une nuisance modérée. Toutes les souris sont tuées par prélèvement de 800 microlitres de sang à l'aorte abdominale ou à la suite de la chirurgie crânienne, gestes qu'il qualifie de terminaux.

Objectifs

Les plaquettes sanguines, qui jouent un rôle vital dans l’arrêt des saignements, sont produites dans la moelle osseuse à partir des mégacaryocytes, des cellules remarquables par leurs grandes tailles et leur noyau polyploÏde. Les processus de différenciation et de maturation vers la lignée mégacaryocytaire (mégacaryopoïèse) s’effectuent sous l’influence du microenvironnement médullaire, incluant notamment des macrophages qui ont pour rôle principal la phagocytose. Des observations récentes au laboratoire mettent en évidence l’existence, dans la moelle osseuse, des nombreuses interactions entre les mégacaryocytes et les macrophages et leur implication dans la mégacaryopoïèse et la production éventuelle de plaquettes. Les macrophages jouent un rôle essentiel dans l’initiation, le maintien et la résolution de l’inflammation. De plus, on sait que les conditions de stress telles que l’inflammation ont un impact significatif sur le phénotype et la fonction des macrophages. Ainsi, il sera intéressant d’étudier l’impact de l’inflammation sur l’interaction entre les macrophages et les mégacaryocytes dans le microenvironnement de la moelle osseuse avec un accent particulier sur son influence sur la mégacaryopoïèse et la production de plaquettes.

Bénéfices attendus

Les retombées de ce projet sont cognitives et cliniques. Sur le plan fondamental, il vise à comprendre l’impact de l’inflammation sur la mégacaryopoïèse et à la production de plaquettes sanguines. Sur le plan clinique, une meilleure compréhension du rôle des macrophages dans la maturation des mégacaryocytes et la formation des plaquettes notamment dans les maladies inflammatoires permettra de mieux comprendre la régulation du nombre de plaquettes produites par des mégacaryocytes dans les conditions pathologiques, et à plus long terme, de contribuer à faire avancer les traitements adaptés chez les patients avec l’inflammation systémique et risque de thrombose. Les données recueillies concernant l’effet induit par l’infection permettront de mieux comprendre les mécanismes impliqués à la fois dans le développement des maladies parodontales et leur implication dans la perturbation de l'homéostasie de la moelle osseuse et sur la mégacaryopoïèse et à la production de plaquettes sanguines ainsi que des pathologies associées par exemple thrombose afin de pouvoir, par la suite développer de nouvelles thérapeutiques. La mise en évidence de nouveaux mécanismes, notamment l’identification de nouveaux récepteurs et/ou molécules, permettra de mieux comprendre les interactions entre les maladies parodontales et les maladies générales, ces bactéries ayant été retrouvées, à distance au niveau d’organes tels que le foie, le cœur et les vaisseaux, et la moelle notamment. Les mécanismes impliqués semblent mettre en jeu une activation exacerbée, locale et à distance, de la réponse immune innée induisant une sécrétion amplifiée de médiateurs de l’inflammation aboutissant à la destruction tissulaire. L’amélioration des connaissances mécanistiques et moléculaires permettra à terme d’améliorer les stratégies de prise en charge des patients atteints de comorbidités et de développer de nouvelles approches pharmacologiques spécifiques.

Procédures

Les injections en IP se font en une fois et les prélèvements 20µL de sang à la queue se font sous anesthésie courte à l'isoflurane 2% de 10 minutes en début et en fin d'expérience. La dissection du crâne et l'immobilisation de l'animal sous le microscope se fait le dernier jour de l'expérience, sous anesthésie profonde. Injection en ip pour l'anesthésie profonde en 1x. Injection sc de l'analgésique : 1x Anesthésie gazeuse au masque 2% 10 minutes pour les étapes de prélèvements à la queue et 0.5% 3h pour l'observation au travers du crâne le dernier jour. Chirurgie crâniale : sous anesthésie profonde en ip pour 30 minutes. Le prélèvement de sang de 800µl à l'aorte abdominale sous anesthésie profonde est terminal. Tous les animaux seront mis à mort en fin d'expérimentation.

Impact sur les animaux

Les injections et prélèvements de sang (seulement une fois) présentent un risque léger de douleurs à la queue et de saignements légers : nuisances légère. Les protocoles liés au LPS (toxine bactérienne) ont déjà bien été établis au laboratoire et les souris ne présentent pas de signes manifestes de gêne, de détresse ou de perte de poids : nuisance légère. En raison de la répétition des cycles d'anesthésie gazeuse et de réveil, nous anticipons un stress supplémentaire des animaux : nuisance modérée. En ce qui concerne les expériences par microscopie au travers du crâne de l'animal anesthésié, nous anticipons un risque d'hypothermie, un dessèchement oculaire et un risque de douleur liée à la durée de l'anesthésie de longue durée : nuisance modérée.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de l'expérimentation puisque les expériences auquelles ils sont soumis sont terminales que ce soit par prélèvement à l'aorte abdominale ou suite à une chirurgie craniale.

Remplacement

Cette approche in vivo permettra de confirmer les résultats obtenus par l’approche in vitro ayant permis de mettre en évidence des preuves de concept et l’identification de nouveaux mécanismes moléculaires associant bactériémie et l’inflammation systémique car il n’est pas possible de reproduire de manière fidèle la complexité des interactions tissulaires et cellulaires de la moelle osseuse in vitro. Un modèle expérimental d’injection intra-péritonéale permettra de mimer la situation clinique observée à savoir la bactériémie associée avec l’inflammation systémique. Les expériences nécessitent un animal adulte vivant, car elles posent la question du fonctionnement du système hématopoïétique in vivo dans sa totalité, à l’état homéostatique, en faisant appel à une multitude de cellules qui interagissent dans toute la complexité du vivant et en particulier la circulation sanguine. Nous avons par ailleurs remarqué que la morphologie des mégacaryocytes et la production des cytokines, diffèrent fortement dans des mégacaryocytes en culture par rapport à ceux observés in vivo.

Réduction

Le nombre d’animaux sera réduit par l’emploi de méthodes statistiques adaptées. Les mécanismes seront dans un premier temps évalués in vitro dans des cultures cellulaires pour déterminer les cibles d’intérêt physiopathologiques et thérapeutiques. A la fin des expériences les animaux seront euthanasiés et les moelles osseuses récupérées, fixées et stockées pour des observations ultrastructurales ultérieures, limitant ainsi le nombre de souris. Le nombre de souris déterminé permettra d’obtenir des résultats statistiques solides. Enfin, le maximum de prélèvements seront réalisés sur une même souris (sang, fémurs, tibia).

Raffinement

Le raffinement se fera par une prise en compte du bien-être animal (enrichissement du milieu comprenant la mise à disposition de languettes de papier et d’un large tube en carton. Ce tube est utilisé comme refuge ou bien déchiqueté par les rongeurs comme substrat permettant, en complément des languettes de papier et de la litière, la composition d’un nid et soins quotidiens aux animaux) et par l’établissement de points limites permettant de limiter la douleur et la souffrance de l’animal. Les expériences seront raffinées afin de limiter l’angoisse, l’inconfort, le stress et la douleur associés aux procédures expérimentales. Les moyens de raffinement des expérimentations sont les suivants : - Pendant l’hébergement, les animaux sont élevés en groupe dans un environnement calme et non stressant et privilégié avec un minimum de manipulation. Le milieu est enrichi avec de la frisure de papier, des carrés de cellulose et des bâtonnets de coton afin de permettre aux souris de confectionner leur nid et structurer leur environnement. Des croquettes sont déposées sur le fond de la cage pour favoriser le comportement de fouissage. - Les expériences intravitales et les prélèvements à l'aorte ont toujours lieu sur des souris profondément anesthésiées. Lors de la chirurgie pour les expériences intra vitales sous anesthésie une analgésie par injection sous cutanée de buprénorphine et de lidocaïne est apportée.- Les prélèvements de sang à la queue seront réalisés sous anesthésie gazeuse, nous appliquerons un tampon hémostatique pour arrêter le saignement avant de replacer l'animal dans sa cage. A la fin de l’expérimentation, les animaux sont sacrifiés avant leur réveil. Une fiche de suivi avec les points limites définis sera mise en place afin de pouvoir contrôler l’état des animaux tout au long du protocole expérimental. Quand un score de 4 est observé, la souris est mise à mort par inhalation progressive de CO2. Quand un score de 2 est observé, une attention particulière est apportée à l’animal et une décision est prise : augmentation de l’enrichissement, soins, euthanasie. Concrètement, lors de la surveillance quotidienne des animaux, nous observerons attentivement l’aspect des souris pour s’assurer de l’absence de signes extérieurs d’infection tels que des lésions cutanées ou des écoulements nasaux ou oculaires. Une attention particulière sera apportée au niveau des sites d’injection des substances pour s’assurer qu’il n’y a pas d’infections.

Choix des espèces

La souris est largement utilisée pour étudier et modéliser la biologie et la physiologie humaine. De nombreux outils ont été développés pour suivre chez cet animal la production des plaquettes sanguines à partir de leur précurseurs MKs. La connaissance de la souris et notre expertise d’imagerie adaptés à cette problématique conduisent à choisir cet animal pour l’étude. Le prélèvement à l'aorte se fera sur des souris adultes sans distinction entre 8 et 35 semaines, il est connu que la moelle des souris plus agées change et présente plus de cellules graisseuses de type adypocyte interférent dans nos études. Par contre l’approche d’imagerie intravitale requière des animaux à un stade de développement jeune (de 4 à 8 semaines) car ils ont l’os du crâne suffisamment fin pour laisser passer la lumière.

Jusqu'à 25 injections intracérébrales sur animal éveillé, une à deux neurochirurgies de 45 minutes, une à deux semaines en cage individuelle : 6 496 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour prélever le cerveau et d'autres tissus. Le régime hyperlipidique imposé peut doubler leur poids initial, et des jeûnes de 4 à 24 heures alternent avec des tests de tolérance au glucose et à l'insuline. Le porteur veut comprendre le rôle des cellules immunitaires de l'hypothalamus dans la prise de poids, et présente la souris comme un bon modèle prédictif du contrôle de la prise alimentaire humaine. Les retombées thérapeutiques annoncées restent suspendues à l'hypothèse de départ, qu'il formule au conditionnel, "dans le cas où nos résultats supporteraient cette hypothèse".

Objectifs

L’obésité est un fléau dans nos sociétés modernes. Cette maladie chronique touche presque un quart de la population mondiale et s’accompagne de nombreuses comorbidités (diabète, maladies cardio-vasculaires, anxiété, cancers…). Afin d’envisager de nouvelles thérapies pour lutter contre l’obésité, il est notamment nécessaire de mieux connaître les phénomènes biologiques qui régulent la prise alimentaire et le poids corporel. Le cerveau orchestre cette régulation en engageant une « communication » avec les différents organes du corps. Pour cela, il reçoit des signaux les renseignant sur l’état énergétique de l’organisme. Ces signaux sont captés par des neurones spécialisés, situés dans l’hypothalamus. Outre les neurones, certaines populations de cellules immunitaires du cerveau sont aussi impliquées dans la régulation du poids corporel. L’hypothalamus réagit à la consommation d’un régime hypercalorique riche en graisses (High fat diet, HFD), en déclenchant une neuroinflammation locale, qui correspond à une activation des cellules immunitaires hypothalamiques. On peut imaginer que c’est un peu comme quand les cellules immunitaires réagissent à un microbe. Cette inflammation est néfaste à long-terme car elle dérègle le fonctionnement des neurones hypothalamiques, et donc le contrôle du poids corporel. Dans ce projet, nous souhaitons mieux comprendre comment fonctionnent les différentes cellules immunitaires hypothalamiques dans le développement de l’inflammation en réponse à un régime HFD qui déclenche l’obésité. Ces connaissances permettront de mettre en place des stratégies pour mieux limiter l’inflammation, prévenir la prise de poids et les comorbidités associées à l’obésité. Notre ambition à terme est de permettre l’ouverture de nouvelles pistes thérapeutiques pour les patients atteints d’obésité. Pour cette étude, nous allons utiliser des approches pharmacologiques et génétiques (utilisation d’animaux mutés génétiquement). Nous utiliserons un modèle animal d’obésité, c’est-à-dire des animaux nourris avec une alimentation hypercalorique obésogène (HFD). Nous réaliserons un suivi métabolique des animaux (prise alimentaire, tests métaboliques et comportementaux), ainsi que de nombreuses études moléculaires à partir des cellules cérébrales isolées. Ce projet comprend huit procédures.

Bénéfices attendus

Les informations tirées de la réalisation de ce projet permettront de mieux comprendre le rôle des cellules immunitaires hypothalamiques dans le développement de l'obésité et les dérèglements métaboliques en réponse à un régime riche en calories, ainsi que les changements inflammatoires sous-jacents dans l’hypothalamus. Dans une perspective thérapeutique à plus long terme, ces données seront utiles pour des tentatives de modulation des cellules immunitaires hypothalamiques afin de contrer les troubles métaboliques, dans le cas où nos résultats supporteraient cette hypothèse.

Procédures

1) Analyse de la composition corporelle sur tous les animaux vigiles : 5 min, entre 2 et 5 fois. Nombre d’animaux : 6496. 2) Neurochirurgie sous anesthésie et antalgie, 45 min, entre 1 et 2 fois. Nombre d’animaux : 1712 (1 chirurgie) et 384 (2 chirurgies). 3) Test de tolérance au glucose (GTT) et d’insuline (ITT) sur animaux vigiles : Entre 4 et 6 mesures de glycémie sur une goutte de sang. Chaque mesure dure 10sec, espacées de 10 min), répétée 2 fois (GTT) et 1 fois (ITT). Nombre d’animaux : 3648 (GTT) et 1248 (ITT). 4) Enregistrements de la consommation de nourriture, d’eau, d’oxygène et l’activité physique. Durée : entre 1 et 2 semaines en hébergement individuel. Nombre d’animaux : 992 pour une semaine, 1392 pour deux semaines. 5) Injections intracérébrales de composés pharmacologiques, sur animaux vigiles : Durée : 3-4 min (contention d’une minute maximum). Répétition : entre 14 (toutes les 24h) et 25 fois (tous les 4 jours). Nombre d’animaux : 384 pour le groupe « 14 fois », 864 pour le groupe « 25 fois ». 6) Injections intrapéritonéales de composés pharmacologiques, sur animaux vigiles : Durée : 30 sec max, entre 1 et 9 injections. Nombre d’animaux concernés : 1120. 7) Tests comportementaux de la mesure de l’anxiété. Durée : entre 10 et 40 min, répété 1 fois pour chaque test, espacé de 2 jours. Nombre d’animaux : 2400.

Impact sur les animaux

1. Stress induit par l’hébergement individuel : ceci ne sera réalisé uniquement lorsque la prise alimentaire individuelle est nécessaire. 2. Stress de contention lors de l’analyse de composition corporelle. Ce stress est cependant d’une durée limitée, l’analyse ne prenant que 5 minutes au maximum. 3. Prise de poids consécutive au régime gras HFD. La prise de poids estimée (basée sur nos études antérieures) ne devrait pas dépasser le double du poids initial. 4. Perte de poids consécutive au jeûne (4h ou 24h). 5. Perte de poids/appétit post-opératoire. Suite aux incisions chirurgicales, une douleur post-opératoire est attendue. La reprise de poids est attendue dès le deuxième à troisième jour post-opératoire (basée sur nos études antérieures). 6. Stress induit par les tests comportementaux. La durée réduite de chacun des tests (moins d’une heure, sans manipulation) n’induit pas de nuisances sévères (pas de perte de poids attendue).

Devenir

À l’issue de chaque procédure, les animaux seront mis à mort et des tissus seront récupérés (cerveaux ou autres), pour des études réalisées post-mortem.

Remplacement

Le but de ce projet est de comprendre le rôle des cellules immunitaires présentes dans une région du cerveau sur la régulation du poids, de la masse grasse et du taux de sucre dans le sang (glycémie). Dans ce contexte, la région cérébrale que nous étudions n’est pas isolée, et interagit avec d’autres structures du cerveau mais également avec des organes périphériques (foie, pancréas, tissu adipeux…). Les effets que nous étudions sont donc la résultante de cette communication entre divers réseaux de neurones et la périphérie. Des interactions aussi complexes ne peuvent être modélisées in vitro, et certains des effets étudiés comme le comportement alimentaire nécessitent un animal vivant. De même, il n’existe aucun modèle informatique qui pourrait remplacer l’animal dans le cadre de cette étude. Enfin, les modèles d’animaux génétiquement modifiés (pour tester nos hypothèses) sont largement développés chez la souris.

Réduction

Ce projet a fait l’objet d’études réalisées in vitro (cultures primaires de cellules) afin de tester différentes hypothèses en amont. Nous avons utilisé des tests mathématiques (test de puissance) pour déterminer le nombre minimum d’animaux nécessaire pour obtenir des résultats exploitables statistiquement. Afin de réduire le nombre d’animaux utilisés, nous avons optimisé la stratégie de croisements des animaux reproducteurs afin d’utiliser tous les animaux d’une même portée (animaux contrôles et génétiquement modifiés sont frères et sœurs) et donc ne pas multiplier le nombre de portée avec des animaux qui ne présenteraient pas les caractéristiques (génotype) attendues. De plus, nous avons regroupé dans la mesure du possible nos différents tests métaboliques sur les mêmes animaux, de manière à obtenir un maximum d’information à partir des mêmes animaux. En particulier, l’analyse de la composition corporelle (masse grasse vs masse maigre) est réalisée dans un appareil qui ne nécessite pas la mise à mort des animaux. Cela nous permet ainsi de réaliser plusieurs mesures à des temps différents sur les mêmes animaux, au lieu d’avoir recours à des lots différents. Pour l’analyse des résultats, nous comparerons les différents groupes expérimentaux avec l’aide de différentes tests statistiques adaptés au type de mesures comparées.

Raffinement

Nous avons défini différents points de raffinement tout au long de l’étude : 1) Période d’habituation avant utilisation en expérimentation de 1 semaine minimum. La surveillance des animaux sera quotidienne et renforcée durant les périodes expérimentales et au constat possible de dégradation du bien-être des animaux. 2) L’évaluation de la prise alimentaire individuelle nécessite parfois l’hébergement individuel des animaux. Pour compenser le manque d’interactions sociales, les cages, transparentes et enrichies, seront rapprochées au maximum les unes des autres (maintien d’interactions olfactives, visuelles et sonores). L’environnement sonore permettra de limiter le stress des bruits extérieurs (radio). 3) Notre étude nécessite des chirurgies qui seront réalisées sous anesthésie générale avec un protocole analgésique ainsi que l’évaluation du maintien du bien-être animal. 4) Des points limites précoces et terminaux appropriés ont été définis avec l’utilisation d’un tableau (arbre décisionnel pour chaque composante étudiée : anatomique, physiologique et comportementale). Si le bien-être animal venait à se dégrader, des mesures conservatoires et des critères d’arrêt de l’expérimentation seront rapidement mis en place, en accord avec notre vétérinaire.

Choix des espèces

La régulation du poids corporel, du comportement alimentaire et de la glycémie sont depuis longtemps étudiés chez la souris, qui représente donc une espèce adaptée à ce type d’études. De très nombreux modèles d’obésités ont été développés chez la souris. De nombreux modèles génétiquement modifiés existent et permettent l’étude de mécanismes moléculaires précis. De plus, la souris est une espèce de prédilection pour la création d’animaux modifiés génétiquement, d’autant que son cycle de reproduction court permet d’avoir un nombre suffisant d’animaux rapidement. Enfin, la forte proximité biologique entre l’homme et la souris en ce qui concerne le contrôle de la prise alimentaire fait de la souris un bon modèle prédictif. En particulier, dans le cadre de cette étude, les effets cérébraux d’un régime hypercalorique est retrouvé à la fois chez la souris et chez l’Homme. Toutes les souris de cette étude seront adultes, elles arriveront entre 3 et 7 semaines d’âge dans notre animalerie, mais nous ne commencerons les expériences qu’à partir de l’âge de 8 semaines. Cet âge est celui auquel on estime que le crâne a fini sa croissance, ce qui nous permet d’utiliser des atlas de référence pour la réalisation de la neurochirurgie ainsi que de s’affranchir des effets de la croissance pubertaire.