Procédures modérées

Gavées quatre jours avec des antibiotiques puis vingt-huit jours avec des probiotiques, 384 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour l'analyse de leur tube digestif. L'objet du projet est de dérégler leur microbiote intestinal avec une dose légère d'antibiotique, puis de tester quels régimes, prébiotiques ou probiotiques le rétablissent. Le porteur reconnaît que la contention et le gavage constituent des nuisances, avec un risque de fausse route entraînant la mise à mort immédiate de l'animal, et propose comme raffinement des "caresses avant le gavage". Il affirme qu'aucun effet indésirable n'est attendu "selon plusieurs études" qu'il ne cite pas, et indique administrer les antibiotiques dans l'eau de boisson au détriment de la précision des quantités ingérées.

Objectifs

L’objectif de ce projet consiste à perturber l’équilibre du microbiote intestinal en utilisant un traitement antibiotique léger. Plusieurs régimes sont ensuite testés pour évaluer leur capacité à rétablir ou non l'équilibre intestinal. Ces régimes sont constitués de macronutriments (protéines, lipides, glucides), de probiotiques (microorganismes bénéfiques pour l’organisme) ou prébiotiques (substances non digestives favorables au développement de la flore intestinale).

Bénéfices attendus

Expertiser l'impact d'une dose légère d'antibiotique sur l'homéostasie intestinale. Voir l'impact de certains produits (macronutriments, prébiotiques et probiotiques) sur le microbiote intestinal. Trouver des méthodes alternatives pour améliorer l'homéostasie intestinale par des régimes riches en macronutriments,, prébiotiques ou probiotiques.

Procédures

1)Gavage qui dure 4 jours pour les antibiotiques. (20 secondes par souris) 2) Gavage de probiotiques 28 jours. (20 seconde par gavage par souris) 3)Prelevement de féces une fois par semaine. (Maximum 15 minutes par prelevement) 4) Prise du poids une fois par semaine. (15 seconde paar souris) 5) Prise d'urine une seule fois à la fin du porotocole. (Maximum 15 minutes par prelevement)

Impact sur les animaux

Le modèle avec une dose légère d'antibiotique ne génère pas de diarrhée. Aucun effet indésirable n'est attendu selon plusieurs études. Par ailleurs, bien que réalisée par du personnel compétent, la préhension et la contention ainsi que le geste de gavage constituent des nuisances pour les animaux. Le stress, l'introduction accidentelle de liquide ainsi que la perte de poids sont des complications physiologiques et psychologiques que les manipulateurs vont essayer d'éviter.

Devenir

384 souris seront mises à mort pour analyser l'impact des modifications de la flore intestinale sur le tube dijestif.

Remplacement

Une grande étude in vivo est réalisée en amont de ce modèle. L'impact de 240 souches probiotiques, prébiotiques et macronutriment (lipides) a été réalisé in vitro sur des cellules de l'intestin. Seuls les produits avec un fort impact sont retenus pour la phase in vivo. Présélectionner les produits in vitro est une étape très importante vu le nombre de produits qui ne vont pas être sélectionnés pour la phase in vivo. Cependant, l'impact des antibiotiques passe essentiellement par le microbiote intestinal et seul le modèle animal peut offrir la possibilité de perturber le microbiote intestinal ainsi que les effets de cette perturbation sur l'homéostasie intestinale..

Réduction

Pour réduire au maximum le nombre de souris utilisables pendant la partie in vivo, un grand travail in vitro estréalisé en amont. Les macronutriments, prébiotiques et probiotiques ne présentent que 10 % des produits testés in vitro 90 % des produit testé ne passeront pas à l'étape in vivo. Concernant la partie biostatistique et pour avoir des résultats statiquement interprétables au niveau de l’étude de la flore intestinale, les groupes seront composés de 8 animaux.

Raffinement

Le choix du modèle animal implique automatiquement la prise en compte des mesures de raffinement liées au nombre de souris par cage qui respectera le confort animal. Dans ce modèle le nombre de souris programmé est de 8 souris par cage en portoir ventilé. L’enrichissement des cages et l’entretien des animaux en présence de professionnels et scientifiques expérimentés est la première préoccupation des meneurs de ce projet. Le suivi quotidien des animaux 7 jours sur 7 permettra d’améliorer leurs conditions de vie en captivité en diminuant les sources de stress. Mettre en place une surveillance constante des animaux pendant les procédures expérimentales, pour détecter rapidement tout signe de détresse ou de malaise. Pré-entraîner les animaux à des procédures non douloureuses pour réduire le stress lors des manipulations ultérieures. Utiliser des méthodes de renforcement positif telque les caresses avant le gavage pour faciliter la coopération des animaux. Afin d’éviter de faire subir 2 gavages par jour aux animaux, l’administration des antibiotiques se fera par l’intermédiaire de l’eau de boisson. Cette option prend en compte le bien-être des animaux au détriment de la précision des quantités ingérées. Établir des critères clairs définissant les points limites à ne pas dépasser en termes de détresse, de douleur ou desouffrance animale. Mettre en place des protocoles pour arrêter immédiatement toute procédure en cas de dépassement des points limites, les critéres d'arret par rapport à la souffrance seront les suivants: •score supérieur ou égal à 10 selon critères de jugement •comportement de l’animal : animal isolé par rapport au milieu extérieur, posture inhabituelle, piloérection. •fèces ; décoloration et/ou présence de sang. Au cas ou le gavage abime la trachée ou fait fausse route l'animal est immediatement mis à mort. En cas de souffrance l'utilisation d'analgésique est envisagable.

Choix des espèces

Le protocole sera réalisé avec des souris, car c'est le modèle expérimental le plus utilisé pour l'étude de la santé intestinale et du microbiote. Les modèles murins ont été particulièrement utiles pour mieux comprendre certaines fonctions du microbiote des mammifères, et nous considérons donc qu'ils sont adaptés à nos recherches. Le debut des traitement à 6 semaines coincide avec le debut de maturation de la flore intestinale. Avant la prise des antibiotiques la flore intestinale presentera un indice de diversité trés élevé, l'impact des antibiotiques sur la flore intestinale sera plus important.

1 204 souris génétiquement modifiées vont être utilisées, toutes tuées et leur cerveau prélevé, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune subit deux opérations du crâne sous anesthésie, de 45 à 120 minutes, puis apprend une tâche récompensée par de l'eau, tête immobilisée, quarante minutes par jour pendant deux mois. La récompense repose sur une restriction hydrique, les souris recevant la moitié de leur consommation d'eau habituelle et perdant 10 % de leur poids, perte que le porteur décrit comme impossible à éviter. Il écrit par ailleurs qu'aucune souffrance inhérente n'est associée à l'usage de ces souris transgéniques et que l'habituation garantit qu'elles ne ressentent "ni stress ni anxiété".

Objectifs

L’autisme est un trouble neurodéveloppemental caractérisé par des déficits sociaux, des comportements répétitifs et les altérations sensorielles. Il est estimé qu'à l'échelle mondiale, environ un enfant sur 34 est atteint d'autisme. Malgré la prévalence de l’autisme, les mécanismes neurobiologiques responsables des changements du comportement ne sont pas bien compris. Une meilleure compréhension de la neurobiologie de l’autisme est cruciale pour la gestion des symptômes des personnes autistes, le développement d'approches thérapeutiques innovantes, ainsi que pour l’amélioration du diagnostic. L'objectif de ce projet est d’utiliser des souris génétiquement modifiées, possédant les traits de l’autisme, pour étudier de manière plus approfondie les altérations neuronales dans l’autisme. Dans cette étude, qui se déroule dans 2 établissements utilisateurs, nous avons donc choisi de nous concentrer sur deux régions du cerveau qui sont similaires entre la souris et l'homme. Nous proposons de développer et d'utiliser une nouvelle expérience comportementale visant à identifier à la fois les altérations comportementales et les modifications physiologiques cérébrales dans ces souris modèles de l’autisme. Ces mesures nous permettront de tester quels mécanismes cellulaires peuvent être responsables des altérations comportementales liées à l'autisme. Finalement, nous pourrons tester grâce à cette tâche comportementale, si une intervention pharmacologique ciblant ces mécanismes peut corriger les altérations comportementales présentes au niveau sensoriel dans l’autisme. Nous utiliserons pour cela, une molécule expérimentale qui a déjà été testée dans des essais cliniques chez l'homme et dont le profil de sécurité et la pharmacocinétique sont bien définis.

Bénéfices attendus

Des études de dépistage à grande échelle menées aux États-Unis suggèrent que la prévalence de l'autisme est de 1 enfant sur 34. Bien qu'il n'existe pas d'études de cette ampleur en Europe, la prévalence de l'autisme est probablement similaire. Les symptômes sensoriels affectent la grande majorité des personnes atteintes d'autisme et ont des conséquences fortement négatives sur leur vie quotidienne. Par exemple, ils pourront avoir des difficultés pour s’intégrer dans une classe bruyante, des difficultés pour manger certains aliments ou pour porter certains vêtements. Ces symptômes sont une source majeure de stress pour les familles concernées. La compréhension des processus neurophysiologiques qui sont à l’origine de ces difficultés sensorielles peut apporter des informations importantes sur la façon dont le fonctionnement du cerveau est altéré dans l'autisme. De telles études peuvent conduire à l'identification des mécanismes moléculaires, cellulaires et cérébrales qui sont responsables des perturbations sensorielles, révélant ainsi de nouvelles cibles pour le développement de traitements pharmacologiques visant à améliorer des symptômes tels que la surcharge sensorielle ou l'hyper/hypo-réactivité sensorielle. De telles études nécessitent des approches invasives et des manipulations qui ne sont pas possibles dans un cadre clinique. Nous pensons que notre étude permettra de mieux comprendre les types de cellules et les circuits impliqués dans l'altération de la perception multisensorielle. Elle fournira des biomarqueurs précliniques pour l'évaluation de nouveaux médicaments expérimentaux. Elle nous permettra d'évaluer l'efficacité d'un médicament expérimental existant qui a été proposé comme traitement de l'autisme. Notre étude a le fort potentiel de fournir des informations qui, à terme, amélioreront la vie des personnes diagnostiquées autistes. Ces connaissances peuvent également renforcer l'autonomie et le bien être des personnes autistes en leur permettant de comprendre pourquoi elles se sentent comme elles le font dans certaines situations.

Procédures

Tous les animaux inclus dans les expériences comportementales seront soumis à deux interventions chirurgicales sous anesthésie et analgésie : la première durera environ 45 à 90 minutes, et la deuxième durera de 90 à 120 minutes (EU « A »). Pour comprendre les mécanismes neurobiologiques sous-jacent de l'autisme, les animaux apprendront à effectuer une tâche comportementale non aversive et non douloureuse, basé sur les récompenses, pendant 45 minutes par jour (EU « B »). En même temps, nous effectuons des mesures de l'activité des neurones du cerveau (EU « B »). Afin de permettre ces enregistrements, les animaux sont entraînés à accepter une contention partielle (immobilisation de la tête). Pour s'assurer que les animaux ne ressentent ni stress ni anxiété, ils seront progressivement habitués à l'installation et à l’immobilisation de leur tête d’une minute à 35 minutes, pendant 5 jours (EU « B »). Cela permet aux animaux d’apprendre que cette immobilisation est réversible et non douloureuse. Lorsqu'ils seront à l'aise avec le dispositif (pas de signes de détresse, capables de manger et boire), l'entraînement à la tâche comportementale commencera. Chaque session de travail comportemental dureras 40 minutes, et les sessions seront répétées quotidiennement pendant 2 mois (EU « B »). Tous les animaux inclus dans les expériences visant à définir l'activité du cerveau hors cadre comportemental seront soumis à une intervention chirurgicale sous anesthésie et analgésie, qui durera 90 minutes (EU « A »). Pour s'assurer que les animaux ne ressentent ni stress ni anxiété, ils seront progressivement habitués à l'installation et à l’immobilisation de la tête d’une minute à 35 minutes, pendant 5 jours (EU « B »). Cela permet aux animaux apprendre que cette immobilisation est réversible et pas douloureuse. Lorsqu'ils seront à l'aise dans le dispositif (pas de signes de détresse, capables de manger et boire), l’enregistrement de l’activité du cerveau commencera (EU « B »).

Impact sur les animaux

1) Chirurgies: Les animaux seront soumis à des interventions chirurgicales sous anesthésie et analgésie. Le risque d'inconfort, de douleur, d'infection et/ou de perte de poids est inhérent à ces procédures. 2) Immobilisation partielle : L’enregistrement de l’activité neuronale des différents groupes des neurones nécessite de maintenir la tête de l'animal dans une position fixe. Cette méthode n'est pas douloureuse et est bien établie dans la littérature, mais elle provoque un malaise pendant les premiers séances. 3) Restriction hydrique : Notre tâche comportementale nécessite la mise en place d’une récompense. Après notre étude précédente, nous avons choisi une récompense hydrique (nécessitant la restriction de l’eau). La perte de poids (10 % du poids initial de l'animal) ne peut être évitée car les souris reçoivent une ration d'eau correspondant à 50 % de leur consommation d'eau ad libitum.

Devenir

Toutes les souris seront euthanisiées et leurs cerveaux seront prélevés pour des analyses post-hoc.

Remplacement

Les expériences proposées dans cette étude nécessitent des circuits neuronaux intacts et des mesures à la fois physiologiques et comportementaux. Un modèle animal est absolument nécessaire pour reproduire la complexité de ces interactions neuronales et ne peut pas être remplacé par les études in vitro ou in silico. Les études cliniques ne sont pas adaptées à notre objectif expérimental des approches invasives sont nécessaires pour répondre à notre question scientifique. Les circuits neuronaux sont bien conservés chez les différentes espèces mammifères et sont donc susceptibles d'être fonctionnellement similaires chez les rongeurs et les humains. L’utilisation des modèles de plus faible sensibilité neuronale (tels que la mouche à vinaigre) n’est pas adaptée non plus à notre projet, car cet organisme ne possède pas la structure cérébrale ciblée par notre étude.

Réduction

Une conception expérimentale minutieuse garantira la reproductibilité des résultats et, avec des techniques d'analyse statistique appropriées, l'utilisation d'animaux sera réduite au minimum. Les protocoles comportementaux, physiologiques, et pharmacologiques ont déjà été mis en place pour une étude précédente sur la perception tactile. Une première étude pilote a été réalisée pour modifier les protocoles comportementaux pour étudier la perception multisensorielle. Cette première étude nous a permis de déterminer le nombre d'animaux nécessaires pour réaliser ces expériences et avoir des résultats statistiquement valides. Cela nous a permis d'assurer la crédibilité de nos résultats avant de procéder à l'étude principale. Les données comportementales, physiologiques, et pharmacologiques seront recueillies auprès des mêmes animaux. Les injections du traitement seront précédées par les injections contrôles dans les mêmes animaux. Toutes les expériences seront réalisées par groupe de 6 à 8 souris, et notre stratégie sur le nombre des souris nécessaire sera adaptée aux résultats. Ces mesures nous permettront de réduire le nombre d'animaux utilisés dans l'étude et de mesurer simultanément plusieurs paramètres.

Raffinement

Tous les résultats scientifiques sur les facteurs influençant le bien-être des animaux ainsi que la capacité des animaux à ressentir et à exprimer la douleur, la souffrance, l'angoisse et les dommages durables seront pris en compte. Les expériences seront conçues et réalisées de la manière la plus éthique possible. Des souris transgéniques seront utilisées pour explorer les déficits multisensorielles dans les modèles de souris d’autisme, et aucune souffrance inhérente n'y est associée. Le bien-être des animaux est impératif pour cette étude. Afin de garantir le moins de gêne et de souffrance pour les animaux, le matériel adéquat sera mis à disposition des personnes autorisées, compétentes et dûment qualifiées, qui respecteront rigoureusement les procédures mises en place. Pour les chirurgies: Utilisation d'anesthésiques, d'analgésiques, d'un anti-inflammatoire, d'une crème pour les yeux et d'un tapis chauffant pour maintenir la température de l'animal. Tous les animaux seront manipulés en utilisant les techniques les moins stressantes possibles, conformément à la littérature : l'utilisation d'un tunnel ou des mains en forme de coupe. Les animaux seront transférés entre les deux sites dans leurs cages d'origine, pendant leur phase active, et placés dans l'obscurité à l'intérieur d'un chariot. . Pendant la restriction en eau, les animaux seront pesés chaque jour, et leur alimentation en eau sera ajustée afin de s'assurer qu'ils ne dépassent jamais une perte de poids de 10 %. Un tube et du matériel de nidification seront placés dans chaque cage afin de garantir la poursuite de tous les comportements normaux de l'animal. Les animaux seront placés dans des cages collectives afin de garantir des interactions sociales. L'hydrogel qui sera fourni comme source d'eau est considéré comme un enrichissement car les animaux le manipulent abondamment avec leurs pattes avant. Les animaux seront habitués à la pièce d’expérimentation. Les animaux seront progressivement habitués à la fixation de la tête pour garantir un stress minimal. Tous les animaux exploreront librement l'installation avant et après chaque session, en marchant et en grimpant sur ses différentes parties. Les stimulations tactiles et auditives utilisées pendant la tâche comportementale ne sont pas douloureuses et ne provoquent pas des crises d’épilepsie. Des points limites spécifiques et des mesures conservatrices pour chaque phase de la procédure sont définis.

Choix des espèces

L’utilisation des souris transgéniques a été privilégiée pour rester cohérent avec les études antérieures effectuées au sein de notre équipe. Les rongeurs ont des systèmes somatosensoriel et auditif très développés et sont considérés comme une espèce modèle pour les études concernant le traitement de certains types d'informations sensorielles. De plus, à ce jour la souris est la seule espèce de mammifère pour laquelle il est possible, facilement, de modifier le génome afin de créer des modèles de maladies humaines. L'étiologie de l'autisme a une forte base génétique. Les modèles transgéniques impliquant la manipulation (suppression ou modification des gènes à haut risque pour l'autisme) sont considérés comme les modèles ayant une forte « valeur de construction ». Conformément aux études précédentes, pour explorer le comportement en même temps que l'activité cérébrale, les souris auront 4-5 semaines au début des chirurgies, 8-9 semaines au début de la tâche comportementale. Pour l'exploration de l'activation du cervelet, les souris auront 10 -12 semaines au début de la procédure.

160 souris immunodéficientes vont être utilisées, chacune portant une tumeur humaine greffée sous la peau du flanc et recevant jusqu'à trente-deux injections intraveineuses sur seize semaines, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles sont attrapées et maintenues six fois par semaine pour la mesure de la tumeur et la pesée, et subissent des prélèvements de sang sous anesthésie légère. Cinq lignées de cancer humain leur sont greffées, du sein, du pancréas, du poumon, du foie et un mélanome, pour comparer un groupe traité par microARN à un groupe sous placebo. Toutes sont tuées pour que les tumeurs soient collectées, tandis que l'avancée annoncée pour les patients reste écrite au conditionnel.

Objectifs

En France, avec près de 430 000 nouveaux cas de cancers (incidence) et à 150 000 décès (mortalité) en 2023, les cancers représentent l’une des principales causes de mortalité. Le nombre de nouveaux cas de cancers détectés correspond à près de 1 200 cas par jour sur une année. Les cancers les plus fréquents sont ceux du pancréas, du sein, du côlon-rectum et du poumon. Dans ce contexte, les microARNs (miARNs) sont de petites molécules régulant la biologie des cellules cancéreuses. Ils sont actuellement très étudiés en oncologie et représentent de nouvelles cibles thérapeutiques. Notre objectif est de démontrer l’efficacité de ces candidats sur l’inhibition de la croissance des cellules tumorales humaines dans un modèle de greffes sous-cutanées chez la souris immunodéficiente. Ainsi, 1 lignée de cancer du sein, 1 lignée de cancer du pancréas, 1 lignée de cancer du poumon, 1 lignée de cancer du foie et 1 lignée de mélanome seront utilisées. L’étude de l’effet de ces miARNs sur la croissance des tumeurs de souris greffées avec des cellules cancéreuses, consistera à comparer un groupe de souris traitées avec le médicament à un groupe de souris traitées avec un placebo.

Bénéfices attendus

A ce jour, la mise en évidence de nouveaux traitements ou de nouvelles combinaisons de traitements représenterait une avancée majeure dans la prise en charge thérapeutique des patients atteints de cancer du sein, du pancréas, du poumon, du foie et de mélanome de type agressif et réfractaire. Notre étude s’attache à proposer de nouveaux traitements ou de nouvelles combinaisons de traitements afin de contrecarrer la résistance aux traitements et les mécanismes d’échappement.

Procédures

Des cellules humaines seront injectées en sous cutané (1 fois, 5 minutes), ceci entrainera le développement d'une tumeur au niveau du flanc. Les animaux seront pris en contention 3 fois/ semaine (1 minute) pour la mesure de la tumeur et 3 fois /semaine (30 secondes) pour la prise de poids, pendant 16 semaines maximum et subiront une prise de sang (45 secondes). Lors des traitements thérapeutiques (durée de 4 à 16 semaines), les animaux subiront des injections intra-veineuses (8 fois minimum à 32 fois maximum, 20 secondes) et un prélèvement sanguin (sous anesthésie légère).

Impact sur les animaux

Le développement d’une tumeur après inoculation de cellules tumorales peut entrainer une gêne à la locomotion dans de très rares cas. Lors des traitements, les animaux subiront des injections intra-veineuses répétées et un prélèvement sanguin (sous anesthésie légère). Ceci pourrait entrainer une irritation au point d’injection et une légère douleur. Les contentions multiples pour les traitements, le suivi tumoral ou la prise de poids peuvent entrainer un stress.

Devenir

Les animaux seront tous mis à mort à la fin de la procédure expérimentale, afin de collecter les tumeurs pour analyses.

Remplacement

Notre laboratoire développe des modèles cellulaires en 3 dimensions (type sphéroïdes, tumoroïdes et organoïdes) permettant de remplacer une partie des études précliniques chez la souris en testant in vitro l’efficacité des miARNs. Seuls les miARNs ayant montré un effet significatif sur l’inhibition de l’agressivité des cellules tumorales ont été choisis dans cette étude. Bien que pertinents, ces systèmes comportent des limites et ne récapitulent pas toute la complexité du développement tumoral chez l’homme ce qui explique le recours à des animaux.

Réduction

Afin de réduire au maximum le nombre d’animaux utilisés, nous avons utilisé un test statistique ainsi que des résultats préalables, détaillés dans la littérature. Grâce à ces approches, nous avons déterminé que des groupes expérimentaux composés de 10 animaux permettront d’obtenir des résultats statistiquement corrects et qui ne compromettront pas l’interprétation de nos résultats. Les travaux seront réalisés sur des souris femelles pour les modèles de cancer du sein et sur des souris mâles pour les autres cancers.

Raffinement

Les animaux seront hébergés en groupe dans un milieu enrichi pour limiter leur stress. Les animaux seront surveillés hebdomadairement par le personnel animalier lors du change et quotidiennement par les personnes en charge de l’expérimentation afin d’observer leur comportement, leur apparence et tous signes qui permettraient d’identifier des indications révélatrices de souffrance animale. Toutes les expériences et manipulations des animaux seront effectuées afin d’assurer le bien-être animal et de réduire au minimum le niveau de stress des animaux. Les animaux seront anesthésiés pour la greffe cellulaire. Ils seront anesthésiés et recevront un analgésique lors du prélèvement sanguin. Les animaux seront également suivis périodiquement avec des points limites définis en lien avec le site d’implantation des cellules tumorales. Si l’un des points limites définis est atteint, l’animal sera mis à mort.

Choix des espèces

Dans le cadre de notre étude, nous utilisons des modèles qui sont bien caractérisés dans la communauté scientifique. L’utilisation de souris mâles et femelles permet une analyse statistique plus étendue en comparaison des mammifères de plus grandes tailles et représente un modèle de choix compte tenu des similitudes avec l’Homme. Dans le cadre de notre étude, nous utilisons des modèles qui sont bien caractérisés au laboratoire ou par ailleurs. Dans ce contexte, les modèles de souris immunodéficientes représentent les modèles les mieux caractérisés pour la mise en place de greffe de cellules humaines sans rejet. Nous utiliserons des souris adultes d’âge homogène de 8 à 12 semaines. A ces âges, les animaux présentent des caractéristiques adultes et sont réceptifs à la prise de greffes à 100%.

Trois heures de chirurgie du thorax, puis deux actes chirurgicaux supplémentaires à deux mois et trois jours d'intervalle, le dernier se terminant par la mise à mort : 80 cochons vont être utilisés sur cinq ans dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Des sondes de mesure et un câble de pacemaker sont implantés dans leur cœur, puis une insuffisance cardiaque leur est provoquée par stimulation cardiaque et pression artérielle élevées, pour tester des traitements de protection du muscle cardiaque. Le porteur juge probable qu'une partie des animaux supporte mal ce traitement, avec baisse d'activité, perte d'appétit et amaigrissement en fin de protocole. Tous sont tués pour l'étude du cœur au microscope, alors que le projet annonce des bénéfices valant "autant pour la santé humaine que pour la santé animale".

Objectifs

L’insuffisance cardiaque est une maladie grave qui se définit par l’incapacité du coeur à pomper suffisamment de sang pour répondre aux besoins de l’organisme. Elle survient généralement chez des individus majoritairement âgés dont la santé est fragilisée depuis plusieurs années par des troubles cardiaques ou respiratoires ou par de l’hypertension. Elle se présente par un essoufflement et une fatigue disproportionnés par rapport à l’effort produit, d’abord uniquement à l’effort, puis aussi au repos. Dans les cas les plus avancés apparaissent dyspnée, toux nocturne, oedème (des poumons, des membres inférieurs), ascite, cardiomégalie. Le nombre de cas d’insuffisance cardiaque a augmenté au cours des 30 dernières années, en raison de l’amélioration des traitements des troubles cardiaques et avec le prolongement de l’espérance de vie des personnes atteintes. L’insuffisance cardiaque est une cause importante de mortalité, et le taux de survie 5 ans après le diagnostic est d’environ 50%, avec au moins 165000 hospitalisations et plus de 70000 décès annuels en France. C’est pourquoi nous étudions l’insuffisance cardiaque avec un modèle de porc avec ou sans troubles métaboliques (insulino-résistance et dyslipidémie) à pression artérielle et stimulation cardiaque élevées, car nous avons grand besoin de comprendre sa physiopathologie et de trouver de nouvelles stratégies visant à prévenir ou à réduire la progression du dysfonctionnement du coeur. Notre projet prévoit d’utiliser au maximum 80 porcs sur 5 ans. La fréquence cardiaque, la taille du cœur, l’anatomie coronaire, l’innervation, la circulation collatérale native du porc sont très proches de celle de l’Homme. Le plan général du projet est de pratiquer une chirurgie afin d’implanter des sondes de mesure de l’activité cardiaque (pression aortique et ventriculaire gauche, débit aortique et coronaire) et un câble de stimulation de pacemaker, et après une période de repos, d’induire une insuffisance cardiaque afin d’évaluer l’effet d’un traitement thérapeutique grâce aux sondes implantées, mais aussi grâce à des mesures échocardiographiques et à l’analyse de sang et de tissus cardiaques prélevés. Le premier traitement prévu est une thérapie cellulaire basée sur les cellules dérivées des cardiosphères, cellules pluripotentes obtenues par mise en culture de fragments cardiaques et permettant une régénération du tissu de l’organe. D’autres traitements pourront être testés par la suite, tel un basé sur l’ANGPTL4.

Bénéfices attendus

Le projet permet d’évaluer de manière très prédictive des stratégies de protection cardiaque, dont les résultats bénéfiques à long terme valent autant pour la santé humaine que pour la santé animale, et jouent sur l’amélioration globale de la qualité de vie, grâce à une amélioration de la fonction cardiaque.

Procédures

Chaque animal sera soumis 1 seule fois à une chirurgie thoracique réalisée sous anesthésie générale d’environ 3 heures, puis environ 2 mois plus tard à un acte chirugical percutané sous anesthésie générale d’environ une demie-heure, puis 3 jours plus tard à un acte chirugical percutané sous anesthésie générale se terminant par la mise à mort. Tous les autres actes sont indolores et consistent en des soins, ou à des échocardiographies ou à des enregistrements de paramètres hémodynamiques effectués sous sédation légère afin que l’animal soit bien calme.

Impact sur les animaux

L’insuffisance cardiaque se caractérisant essentiellement par une fatigue chronique, il est probable qu’un certain nombre d’animaux supportent moins bien ce traitement, ce qui entrainera une baisse d’activité et une perte d’appétit avec une stabilisation, voire une légère baisse de leur poids en toute fin de protocole.

Devenir

Tous les animaux sont mis à mort pour récupérer le coeur afin d'en faire l'étude histologique.

Remplacement

Aucune méthode alternative ne permet actuellement de tester totalement une stratégie de protection cardiaque sans passer finalement par l’expérimentation animale. Les traitements envisagés ont déjà été testés in vitro ou sur des animaux de petite taille (rongeurs) aux caractéristiques cardiaques trop dissemblables de l’Homme. Seuls des essais effectués sur un modèle d’étude cardiaque proche de l’Homme sont scientifiquement acceptables pour envisager une extrapolation vers la pratique clinique humaine.

Réduction

Il est prévu d’utiliser le minimum d’animaux pour chaque stratégie testée, et le nombre par lot est fixé à 8. De plus, à chaque fois que c’est possible, les animaux des lots témoins sont mutualisés pour chaque stratégie.

Raffinement

Des antalgiques, des anesthésiques et des tranquillisants sont utilisées à des doses adaptées (voir détails plus bas). Nous ne pensons pas observer de différences comportementales entre avant et après les actes chirurgicaux. Des signes indicatifs de gêne inhérents au modèle expérimental seront probablement observés en fin de protocole, et cette période sera particulièrement surveillée afin qu’elle soit le plus courte possible pour l’animal. Ils sont suivis quotidiennement et bénéficient de sciure pour satisfaire leurs réflexes de fouissage, et d’objets « manipulables » pour améliorer leur qualité de vie. Ils sont logés à plusieurs avant leur chirurgie.

Choix des espèces

L’animal choisi est le modèle le plus adapté pour ce projet, et validé depuis plusieurs années dans notre laboratoire. Le porc, par sa fréquence cardiaque, la taille de son myocarde, son anatomie coronaire, son innervation et l’absence de circulation collatérale native, est un modèle proche de l’Homme. Il permet de réaliser des études précliniques très prédictives sur le plan cardiovasculaire. Porc fermier à 2 mois ½ (25kg), âge minimal souhaité et poids maximal souhaité pour commencer les expérimentations. Mini-porc Yucatan à 9 mois (40kg), avec un poids devant rester stable le temps de l’expérimentation, la différence d’âge se justifiant par la longue mise en place des troubles métaboliques.

Toutes tuées en fin de procédure pour que soient prélevés les segments de leur tube digestif, 280 souris femelles vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles sont suivies pendant près de six semaines, reçoivent jusqu'à vingt gavages oro-gastriques pour être infectées par Clostridioides difficile puis réinfectées et traitées aux antibiotiques deux fois par jour pendant huit jours, subissent deux injections dans l'abdomen et deux prélèvements de sang par la joue sous anesthésie. L'infection provoque des diarrhées et une perte de poids que le porteur qualifie de légère à modérée et spontanément résolutive en deux à trois jours. Le recours exclusif à des femelles est justifié non par la biologie de l'infection mais par la "nécessité" de cohérence avec les essais antérieurs de l'équipe.

Objectifs

Clostridioides difficile est une bactérie capable de coloniser le microbiote digestif après sa perturbation par des antibiotiques (ATB). Une fois implanté dans le tube digestif, cette bactérie va provoquer une diarrhée sous l’action des toxines qu’elle produit. Les infections à C. difficile (ICD) sont caractérisées par un taux important de récidive (25% des cas), parfois multiples et particulièrement invalidantes pour les patients malgré un traitement antibiotique bien conduit. A ce jour, les déterminants conduisant à la récidive sont encore mal connus. Plusieurs hypothèses non exclusives ont été avancées pour expliquer leur survenue notamment 1) la persistance de la perturbation du microbiote induite initialement par les antibiotiques, voire la perturbation additionnelle induite par les antibiotiques utilisés dans le traitement des ICD ; 2) une réponse immune non efficace pour neutraliser l’action des toxines produites par la bactérie ; 3) la persistance de la bactérie sous sa forme sporulée (forme de résistance non sensible à l’action des antibiotiques) ou sa survie dans des niches écologiques digestives non accessibles aux antibiotiques. L'utilisation d'animaux dans le cadre de ce projet a pour objectif de mieux comprendre le processus de colonisation digestive et les déterminants favorisant une disparaition complète de la bactérie du tube digestif ou au contraire la récidive et notamment la rechute à partir de bactéries persistantes dans le tractus digestif sous une forme ou dans une niche écologique particulière à identifier

Bénéfices attendus

Les données qui seront obtenues au cours de ce projet permettront de mieux comprendre le mode de survie de C. difficile au sein du tractus digestif (forme et localisation) permettant la récidive de l'infection et d'identifier des espèces bactériennes associées à la colonisation et à la décolonisation digestive de C. difficile. Elle permettra également de préciser la cinétique de mise en place d'une réponse immune efficace avec la prodcution d'anticorps neutralisant l'action des toxines et son rôle dans le processus de protection de l'hôte contre l'action des toxines produites par la bactérie. Ces données sont essentielles pour identifier et construire les bases de nouvelles stratégies de prévention de traitement des ICD complémentaires aux antibiotiques et limiter le risque de récidive que ce soit par l'utilisation de probiotiques de nouvelles génération et/ou de stratégies d'immunisation notamment la vaccination.

Procédures

Les animaux seront suivis tous les jours longitudinalement pendant près de 6 semaines. Au cours de cette période, ils seront soumis à 2 injections intrapéritonéales sous anesthésie locale du point d’injection (durée de l'IP 30 secondes à 1 minute), à des gavages oro-gastriques (de 1 à 20 selon les procédures) pour l’infection et la réinfection et l'administration biquotidienne des traitements antibiotiques pendant 8 jours (durée du gavage 30 secondes à 1 minute). Il sera également réalisé des prélèvements quotidiens de selles, à 2 prélèvements de sang par voie submandibulaire sous anesthésie générale (durée 2 à 3 minutes).

Impact sur les animaux

Le poinçonnage aux oreilles peut provoquer une douleur légère de courte durée. Les piqures d’aiguille pour les injections intrapéritonéales peuvent provoquer une douleur légère de courte durée. Les gavages orogastriques des animaux pour d’une part pour provoquer une infection digestive et d’autre part pour l’administration par voie orale des antibiotiques du traitement de l’infection peuvent provoquer un stress durant le geste dont la durée est courte. L’infection digestive par C. difficile peut provoquer chez les animaux infectés des signes digestifs de type diarrhée, avec perte de poids légère à modérée liée à une déshydratation légère. Ces signes seront spontanément résolutifs après 2 à 3 jours et l’infection dans ce modèle n’est ni sévère, ni mortelle. Au cours de l’infection, les animaux seront suivis quotidiennement : observation clinique, pesée, recueil des selles et changement de litières. Cette surveillance quotidienne n’occasionne aucune douleur mais peut également provoquer une angoisse légère dans la mesure où elle nécessite de manipuler l’animal. Au cours de ces essais, un prélèvement de sang sera réalisé par voie sous mandibulaire susceptible de provoquer une douleur légère et de courte durée liée à l’incision et un stress du à la manipulation de l’animal mais minimisée par l’anesthésie préalable des animaux.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés à la fin de chaque procédure expérimentale car le prélèvement de différents segments du tube digestif permettra d’identifier le site de persistance de la bactérie dans le tube digestif potentiellement à l’origine des récidives des ICD.

Remplacement

Le recours à l'animal est indispensable pour étudier les différents facteurs impliqués dans le processus de colonisation et décolonisation digestive de C. difficile. Aucun modèle in vitro, ex vivo ou in silico n'est capable de reproduire la complexité du processus infectieux dans son intégralité (réponse immune et perturbation du microbiote digestif). Pour les études portant sur le microbiote, les essais de colonisation chez l'animal restent une étape incontournable pour étudier son rôle, car même les expériences sur modèles cellulaires en trois dimensions ou en biofermenteurs modélisant le tube digestif ne permettent pas de reproduire idéalement le processus infectieux global.

Réduction

La méthodologie de ce projet a été construite sur la base des données déjà collectées au sein de notre équipe et celles de la littérature. Cette expérience acquise nous a ainsi permis de nous focaliser sur les points d’intérêt importants de suivi des animaux et de ne pas démultiplier inutilement les temps de suivi. De plus, une planification statistique rigoureuse a permis de réduire au maximum le nombre d'animaux utilisés au nombre de 280, tout en préservant la validité statistique des résultats de l'étude. L’étude de la rechute, à distance du premier épisode, est intégrée dans l’essai de suivi cinétique de la colonisation et de disparaition digestive lors de ce premier épisode afin de limiter le nombre d’essai et d’animaux nécessaires. Enfin, les groupes contrôles des animaux ont été mutualisés aussi souvent que possible.

Raffinement

Les animaux seront hébergés avec suffisamment d'espace, par groupe de 4 par cage avec un tunnel de carton et du papier pour construction de nids comme enrichissement. Les animaux seront surveillés quotidiennement et leur entretien sera effectué dans des conditions soigneusement contrôlées pour s'assurer qu'ils subissent le minimum de stress possible. Les litières seront changées quotidiennement pendant la période d’infection et les animaux auront un accès direct et illimité à l'eau de boisson et à la nourriture. Du gel hydrique sera mis dans les cages afin de faciliter la réhydratation des animaux pendant toute la période des signes cliniques de diarrhées. La procédure d'expérimentation sera pratiquée en utilisant des anesthésiques permettant de limiter la souffrance des animaux qui bénéficieront d'une procédure d'euthanasie anticipée avec une sortie d'étude prématurée en cas d'atteinte des points limites éthiquement non acceptables.

Choix des espèces

Le modèle d’infection chez la souris est maintenant établi et classiquement utilisé dans les protocoles d’étude de la colonisation et d’infection digestive par C. difficile par toutes les équipes de recherche travaillant sur ce sujet. Ce modèle se rapproche de l'histoire naturelle de l’ICD non compliquée observée chez l'Homme. Les souris seront manipulées à l'âge de 6 ou 8 semaines. Ce choix est motivé par la nécessité de travailler à la fois sur des animaux ayant atteint l'âge adulte et qui répondent au modèle de colonisation et d'infection par C. difficile déjà décrit par notre équipe et d’autres équipes. Enfin, le choix d’animaux femelles est également motivé par la nécessité de cohérence et d'homogénéité avec nos essais précédents sur la même thématique.