Procédures modérées

3 850 souris privées de système immunitaire complet vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées puis disséquées. Chacune reçoit sous la peau un fragment de tumeur prélevé sur un patient métastatique, quelques-unes une injection de cellules tumorales dans le cœur, et celles qui reçoivent un traitement subissent un prélèvement de sang hebdomadaire à la mandibule qui laisse des hématomes plusieurs jours. Le porteur retient des souris dépourvues de poils parce que la tumeur se suit mieux sous la peau et que les poils rayent les lames des microtomes, et prévoit 670 animaux par an rien que pour entretenir les lignées de xénogreffes. Il écrit qu'il n'est pas possible de se passer de ces greffes pour proposer des traitements personnalisés aux patients, tout en notant que ces souris sont plus exposées aux infections opportunistes.

Objectifs

Depuis ces dernières années, l’incidence des cancers augmente de par le monde. Avec l’avancé des traitements, la survie des patients s’est améliorée. Toutefois, la maladie métastatique reste un problème majeur et implique une morbidité et une mortalité importante. Dans le cancer, la maladie métastatique est un problème majeur et une cause importante de décès. Si les chiffres sont difficiles à obtenir, une étude estime que 66.7 pourcent des décès par cancers sont dues à des métastases. Leur traitement est rendu d’autant plus difficile que ces métastases ont tendance à résister aux traitements conventionnels. C'est pourquoi nous cherchons à identifier des biomarqueurs de résistance ou de toxicité aux anti-cancéreux, dans l’optique du développement de nouveaux traitements personnalisés.

Bénéfices attendus

La première partie du projet doit permettre de maintenir et de mettre en place de nouveaux modèles de xénogreffes de tumeurs humaines issues de prélèvements métastatiques de patients. Le recrutement des prélèvements métastatiques greffés est fonction de l'incidence des métastases dans chaque type de cancer. Pour le cancer du sein, qui est aujourd’hui le cancer le plus diagnostiqué et la 5eme cause de décès par cancer dans le monde, la maladie métastatique est responsable de la majorité des décès avec, pour ces cas, une médiane de survie à 5 ans de 30 pourcent. Outre les cancers du sein, les autres types de cancers très pourvoyeurs de métastases sont les cancers de la prostate, du pancréas, du poumon, du rein, le cancer colorectal et le mélanome. Le cancer du poumon, du rein et le mélanome métastatiques ont un pronostique particulièrement sombre avec une survie à 5 ans inférieure à 10 pourcent. Ces modèles de xénogreffe consistent à greffer un fragment tumoral humain sous la peau de la souris et constituent des modèles uniques et particulièrement pertinents pour l'étude de la pathologie humaine. Une fois établis, ces modèles doivent permettre de mieux comprendre les mécanismes de développement des tumeurs humaines, ainsi que permettre de proposer des traitements personnalisés aux patients. La seconde partie; qui consiste à traiter les souris xénogreffées avec des thérapeutiques déjà utilisées dans le cadre du soin, ou de nouveaux composés innovent; doit permettre de proposer des nouvelles alternatives au traitement de ces pathologie, comprendre les mécanismes d'échappement des tumeurs et, dans le cas de nouveaux composés, évaluer leur potentiel thérapeutiques en vue d'essais cliniques. L'objectif étant d'améliorer la prise en charge des patients.

Procédures

Les animaux utilisés sont immundéficients. Leur système immunitaire n'est pas complet ce qui limite les risques de rejets de la greffe. Tous les animaux de ce projet seront greffés avec des tumeurs humaines. La plupart recevront un fragment sous-cutané. A de rares exceptions, certains animaux pourront recevoir une injection sanguine de cellules tumorales. Dans les 2 cas, le geste s'effectue sur animal anesthésié et la durée de l'acte ne dépasse pas les 5 minutes. Les greffes sous cutanées se feront sous analgésie générale. Les injections sanguines de cellules tumorales se feront sous analgésie locale. Une partie des animaux xénogreffés sera traité afin d'évaluer l'efficacité des traitements sur la progression des tumeurs. Dans ce cas, les modalités de traitement varient. Les modalités retenues étant le gavage, l'injection intra-péritonéale et l'injection intraveineuse. Le choix des voies d'injection et des posologies étant soumis à la molécule thérapeutique employée. Les animaux en traitement seront également soumis à un prélèvement de sang hebdomadaire effectué à la mandibule. Le traitement et le prélèvement d'un animal s'effectue sur animal vigile et ne dure pas plus d'une minute.

Impact sur les animaux

La xénogreffes d'une tumeur humaine ; dans la mesure où il s'agit d'insérer un petit fragment tissulaire en sous-cutané ; est un acte peu invasif et peu douloureux. Les injections sanguines présentent un risque hémoragique au moment de l'injection. La croissance des xénogreffes sous cutanées occasionnera une gêne pour l'animal si elle est trop volumineuse. En sous cutanée, les greffes sont peu métastatiques et nous n'avons pas constaté que cela entrainait une diminution du bien-être animal. Les cellules tumorales injectées dans le sang auront une dissémination systémique entrainant la formation de tumeurs dont nous suivrons l'évolution par l'évaluation des signes cliniques de l'animal. Enfin, les traitements qui seront réalisés n'entraineront pas d'effets indésirables majeurs dans la mesure où les doses, les voies et les fréquences d'administration seront établies à partir de la pratique clinique. Les nuisances sont liées à la contention, l'insertion de la canule de gavage et la piqure à l'aiguille. Les prélèvements de sang à la mandibule occasionnent des hématomes localisés pendants quelques jours. Les souris sont immunodéficientes car athymiques, mais nous n'avons pas constaté d'impact de ce caractère sur leur qualité de vie. L'immunodéficience des animaux utilisés peut leur conférer une sensibilité aux infections opportunistes plus grandes.

Devenir

Tous les animaux de ce projet seront euthanasiés à la fin de l'expérimentation. La survenue de l'euthanasie est soumise à l'atteinte des points limites fixés. La dissection complète des animaux est systématique après l'euthanasie. Les prélèvements effectués permettent d'effectuer des analyses histologiques et moléculaires. Le recueil systématique des échantillons participe au raffinement des modèles.

Remplacement

L’objectif de notre projet est de pouvoir étudier les mécanismes de résistance aux traitements de tumeurs métastatiques de patients. Des cultures de cellules peuvent être réalisées dans certains cas mais avec des résultats très variables. Par ailleurs, la culture cellulaire sélectionne un type cellulaire, et on perd donc la richesse et l’organisation structurelle de la tumeur telle qu’elle existe chez le patient. Ceci constitue un biais analytique important car on sait qu'une tumeur est constituée d'une variété de cellules tumorales, plus ou moins sensibles aux agents thérapeutiques. Les cellules et les structures qui entourent les tumeurs jouent également un rôle dans les mécanismes de résistance. C’est pourquoi il n’est actuellement pas possible de nous passer de ces modèles de xénogreffes pour la prise en charge personnalisée des patients et la mise au point de nouveaux agents thérapeutiques.

Réduction

Le nombre d’animaux prévu pour maintien des lignées de xénogreffes a été évalué en fonction de notre expertise de plusieurs années dans le domaine. Pour chaque tumeur, 4 souris sont greffées pour limiter le risque d’échec de prise de greffe. Ce risque varie en fonction de l’agressivité tumorale. Nous utilisons en moyenne 670 souris pour entretenir ces xénogreffes par an. Pour 5 ans, 3350 animaux seront donc nécessaires. Pour les traitements, 10 animaux par groupes est un nombre minimum pour avoir une puissance statistique suffisante. Nous testons une dizaine d’agents ou de combinaisons d’agents thérapeutiques par an, soit 100 animaux traités par an (soit 500 pour 5 ans). Pour 5 ans, 3850 animaux seront nécessaires.

Raffinement

Pour les xénogreffes réalisées en sous-cutanée, les animaux sont anesthésiés. La technique chirurgicale de greffe est peu douloureuse mais une analgésie générale est donnée au préalable. Pour les xénogreffes de cellules tumorales en intracardiaque, les animaux sont anesthésiés durant toute la procédure. La posologie des traitements administrés aux animaux est adaptée des traitements faits chez l’homme. Les doses administrées sont donc bien en dessous des doses létales et la toxicité des molécules se rapproche des effets observés chez l’homme. Les traitements sont administrés par gavage, intraveineuse ou intrapéritonéale. Afin de limiter les nuisances subies par les animaux tout au long du projet, des points limites suffisamment précoces ont été établis. Un suivi quotidien des animaux est opéré par du personnel qualifié. Les animaux sont élevés en groupe sociaux (4-5 par cage) avec enrichissement. Les conditions d’hébergement sont conformes à la réglementation. Une surveillance quotidienne est assurée par le personnel de l'animalerie et les membres de l'équipe de recherche. Les souris utilisées sont immunodéficientes mais nous n'avons pas constaté d'impact de ce caractère sur leur qualité de vie. Néanmoins, conformément aux recommandations du fournisseur, les animaux seront hébergés en cages à couvercles filtrant. Le change sera effectué sous atmosphère contrôlée et propre. Enfin, la stérilisation des consommables (litière, enrichissement, eau et nourriture) et des équipements (cages, portoirs, bouteilles, etc.) limitera le risque d'infection chez ces animaux.

Choix des espèces

Ce projet utilise des souris immunodéficientes adultes, de 6 semaines. Le caractère d'immunodéficience limite le risque de rejet de la greffe des cellules humaines Par ailleurs, le choix d’animaux dépourvus de poils nous permet de suivre plus facilement le développement sous cutané de la tumeur. L’évaluation de la taille tumorale est facilitée. L’absence de pilosité est un critère important pour les analyses histologiques. En effet, les poils ont tendance à rayer les rasoirs de microtomes. Les souris xénogreffées sont choisies jeunes adultes afin de maximiser les chances de prise de greffe. En effet, les cellules de la graisse brune situées entre les omoplates constituent un terreau nutritif pour les tumeurs xénogreffées, favorisant leur développement. Cette graisse brune disparait avec l’âge.

Immunodéficientes par construction, donc vulnérables à la moindre infection, 180 souris reçoivent sous la peau des cellules de cancer du sein humain. Elles vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour analyser les tissus, dans le seul but de vérifier in vivo une hypothèse déjà établie en culture cellulaire et sur des cohortes de patientes. Le porteur affirme que cette vérification exige un "organisme entier" dans lequel cellules et médiateurs circulent, et annonce une veille bibliographique pour éviter de refaire des expériences déjà publiées. La tumeur peut faire perdre l'appétit et le poids aux souris, que le porteur prévoit de mettre à mort dès l'atteinte des points limites fixés.

Objectifs

Le cancer du sein est le cancer le plus fréquent des cancers féminins. Il représente 33 pour cent des cancers de la femme. En 2023, en France, on estime à 61 214, le nombre de nouveaux cas, soit une augmentation de 0,3 pour cent par an depuis 2010. Nous avons mis en évidence, via des études in vitro et des analyses ex vivo sur des cohortes de patients, que l’absence de notre gène d’intérêt est impliquée dans la progression du cancer du sein. L’objectif de ce projet est de valider in vivo cette hypothèse.

Bénéfices attendus

Le dépistage rapide du cancer du sein, qui touche 1 femme sur 3 dans le monde (par an), est un défi important pour la santé publique. Ce projet nous permettra de valider un gène non connu comme un nouveau facteur pronostique et diagnostique de cette maladie.

Procédures

Tous les animaux du projet seront soumis à une inoculation de cellules tumorales (1 injection sous-cutanée sous anesthésie, 3 min/souris/injection). Tous les animaux seront manipulés brièvement (moins d’une minute) tous les 2-3 jours pour mesurer la croissance tumorale. Les animaux seront euthanasiés à la fin de la procédure par une méthode réglementaire.

Impact sur les animaux

Certains effets indésirables peuvent être observés chez la souris lors des expérimentations, notamment la manipulation et la contention régulière peuvent leur engendrer un certain stress. Les sites d’injections peuvent s’infecter. L’anesthésie peut induire un stress thermique. Par ailleurs, la croissance tumorale peut entrainer une baisse ou perte d’appétit qui peut causer une perte de poids des animaux. Les souris immunodéficientes présentent une sensibilité accrue aux infections.

Devenir

Tous les animaux à la fin de la procédure seront euthanasiés selon une méthode réglementaire. La procédure requiert l’injection de cellules tumorales, ce qui implique l’impossibilité de garder les souris en vie à la fin de l’expérience. De plus, des analyses seront effectuées sur tissus et organes post-mortem.

Remplacement

Cette étude ne peut être conduite qu’in vivo, car il est essentiel d’utiliser un modèle reproduisant au mieux l’environnement tumoral. Cela se traduit par la nécessité d’utiliser un organisme entier dans lequel les cellules et les médiateurs de l’organisme peuvent circuler, permettant ainsi une représentation plus fidèle des interactions biologiques complexes à l’intérieur du corps.

Réduction

Ce projet prévoit l’utilisation d’un maximum de 180 souris. Pour sa réalisation, des groupes de 15 souris seront utilisés afin de garantir une évaluation statistique robuste des effets analysés. Nous appliquerons des tests statistiques pour comparer l’effet étudié entre les groupes, les croissances tumorales et la survie des animaux. Dans un souci de réduction du nombre des animaux contrôles, nous chercherons à regrouper les expérimentations lors que cela est possible. Une veille bibliographique attentive et continue sera réalisée afin de vérifier que les expériences planifiées n'ont pas déjà été rapportées dans la littérature scientifique existante. Plusieurs tissus seront prélevés et soumis à diverses analyses (immunologiques, histologiques ou de biologie cellulaire et moléculaire) pour extraire le maximum de données de chaque expérimentation. Ces tissus seront également partagés avec nos collaborateurs dans le but de réduire le nombre d’animaux utilisés.

Raffinement

Les souris utilisées dans ce projet présentent un phénotype considéré comme dommageable du fait que ce soit des animaux immuno-déficients. Elles seront hébergées donc, afin d’assurer leur protection, au sein de notre structure dans une zone d’expérimentation dédié aux animaux immunodéprimés, sur portoirs ventilés et toute manipulation sera faite sous hotte pour ne pas perdre leur statut et éviter que leur phénotype ne s’exprime (développement d’une quelconque maladie). Des tests de statut sanitaire réguliers montrant l’absence d’infection des animaux par des pathogènes opportunistes sont réalisés chaque mois dans l’animalerie, dans le cadre de l’hébergement de ces animaux. Les animaux seront soumis à 7j d’acclimatation dès leur arrivée dans la structure. Les conditions d’hébergement seront conformes à la réglementation et adaptées en accord avec le personnel de l’animalerie (les animaux disposeront de nourriture et d’eau ad libitum; le milieu est enrichi à l’aide de coton de nidification, bâtons à ronger et tunnels en cartons). Les souris seront soumises à un suivi quotidien afin d’évaluer leur niveau de stress et leur poids sera mesuré une fois par semaine tout au long de l’expérience de croissance tumorale. Toutes les interventions seront effectuées par des personnes expérimentées et éloignées des animaux hébergés. Les manipulations seront réalisées dans le souci constant de réduire au maximum l’inconfort et la souffrance des animaux (anesthésie, tapis chauffants, désinfection, ...). Les critères définis pour atteindre un point limite seront strictement appliqués, et les souris seront euthanasiées à la fin de l’étude ou en cas d’atteint de ces points limites préétablis.

Choix des espèces

Le choix d’utiliser la souris dans cette étude est justifié par des considérations scientifiques et éthiques. Tout d’abord, la souris est un organisme complet et fonctionnel dont le système immunitaire peut être comparé à celui de l’homme, ce qui en fait un modèle pertinent. De plus, sa génétique est bien caractérisée, ce qui facilite les études génétiques et moléculaires. La souris est largement reconnue et utilisée comme modèle animal standard dans la recherche scientifique, notamment dans les études précliniques. Sa large utilisation au sein de la communauté scientifique internationale permet une meilleure comparabilité des résultats et une meilleure validation des observations entre différentes études. Nous disposons d’installations adaptées pour les souris, ainsi que d’une expertise solide en matière de techniques d’expérimentation animale et de suivi microbiologique et vétérinaire des animaux. Les animaux seront utilisés au stade adulte (à partir de 6 semaines) afin de disposer d’un organisme avec un processus de développement terminé.

Soumises à un régime hyperlipidique pendant quinze semaines, mises à jeun de façon répétée et passées vingt-cinq à trente fois dans un test d'apprentissage, 255 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Toutes sont tuées, le prélèvement de sang se faisant directement dans le cœur sous anesthésie. Le projet cherche le rôle du récepteur aux xénobiotiques AhR dans la détection des lipides par la bouche, dans un contexte d'obésité. Le porteur qualifie ces tests de non invasifs et de gravité légère, puis relève lui-même que la répétition des épreuves et les privations de nourriture justifient un classement en modéré, sans nommer un seul des tests employés.

Objectifs

Le récepteur nucléaire d’aryl hydrocarbone (AhR) est impliqué dans la toxicité des substances comme les dioxines, dans les maladies du foie et des reins, et sur le fonctionnement du système immunitaire. Des études ont également mis en évidence l'influence de l'AhR sur la perméabilité intestinale. Cependant, aucune étude n'a encore analysé son rôle dans la détection orale des lipides Or, une perturbation de ce système de détection lipidique peut avoir des conséquences néfastes sur le métabolisme et le comportement. Les individus en condition d’obésité présentent un dérèglement de ce système. Cette étude vise ainsi à décrypter le rôle de l'AhR dans la détection orale des lipides, notamment dans un contexte d’obésité. En menant cette recherche, nous espérons contribuer à une meilleure compréhension des mécanismes impliqués dans l'obésité et ouvrir la voie à de nouvelles approches thérapeutiques.

Bénéfices attendus

Les perspectives par rapport aux résultats obtenus devraient : - Etablir les rôles « physiologiques » de l’AhR au niveau de la sphère orale - Déterminer si les effets obésogènes des xénobiotiques environnementaux ligands de AhR, pourraient avoir pour origine des interactions sur la détection orale des lipides

Procédures

La composition corporelle des animaux sera évaluée 4 fois dans un dispositif non invasif durant 2 minutes. Les souris seront soumises à des tests comportementaux non invasifs : les souris sont placées dans les dispositifs puis replacées dans leur cage de vie. Un test permettant d'analyser le niveau d'anxiété et la mobilité des souris aura lieu durant 30 minutes et n'aura lieu qu'une fois. Un test permettant l'analyse de la perception orale aura lieu 4 fois durant 30 minutes. Un test qui permet l'analyse de la préférence alimentaire aura lieu durant 16h dans leur cage de vie, 2 fois. Un test qui évalue la motivation des souris à consommer un aliment appétissant aura lieu 4 fois durant 10 minutes maximum. Un test qui permet l'analyse de l'apprentissage aura lieu entre 25 et 30 fois durant 3 minutes maximum. Un prélèvement intracardiaque sera effectué sous anesthésie, de moins d’une minute.

Impact sur les animaux

La majorité des analyses sont des études du comportement alimentaire des animaux. N'étant pas invasifs, ces tests sont de gravité légère. En revanche, la gravité des procédures a été placée en modérée, à cause des mises à jeun et de la répétition des différents test qui peuvent stresser les animaux. En effet, les effets indésirables attendus sont un stress dû aux mises à jeun et la possibilité de bagarres qui nécessitera l’isolement des animaux pour la réalisation de ces tests qui seront minimisés aux durées d’expérimentation. Les autres nuisances possibles sont associées à l’utilisation d’un régime gras (hyperlipidique) qui entrainera un surpoids chez les animaux (sauf le modèle de souris spécifique utilisé dans ce projet, étant résistantes au développement de l’obésité). La durée du régime (15 semaines) qui sera appliquée permet de mettre en place une obésité mais sans aller jusqu’au développement d’une insulino-résistance ni d’un diabète. Les animaux en régime hyperlipidique peuvent également avoir des difficultés à se mouvoir en raison du surpoids. Toutefois, cela n’a jamais été observé sur la durée (15 semaines) du régime. Les animaux pourront également être stressés à cause des manipulations, un minimum de personnel, auquel les souris auront été habituées, réaliseront les protocoles.

Devenir

A l’issue de chaque procédure, tous les animaux seront euthanasiés sous anesthésie afin de réaliser des prélèvements sanguins et tissulaires.

Remplacement

Le remplacement est impossible car il s’agit d’étudier des processus physiologiques mettant en jeu plusieurs organes (intestin, tissu adipeux et foie). Il est donc indispensable de recourir au modèle animal pour une approche intégrée. Ce projet est couplé à des expériences réalisées in vitro dans l’objectif à terme de développer des études sur la détection des lipides dans ces modèles cellulaires sans nécessité d’avoir recours à des animaux.

Réduction

Les effectifs ont été minimisés tout en garantissant une pertinence biologique et une solidité statistique afin d’obtenir des résultats fiables. De plus, les analyses seront réalisées rapidement, dans le but d’arrêter les expérimentations dès que l’effectif sera suffisant pour obtenir des résultats fiables et diminuer ainsi le nombre d’animaux utilisé à son minimum.

Raffinement

Hormis les périodes de tests de comportement les animaux seront hébergés trois par cages transparentes, pour garantir le maintien des interactions sociales. Les animaux seront hébergés dans des conditions optimales avec un enrichissement de leur milieu adapté. Ils bénéficieront d’un suivi quotidien de leur état général. Lors des procédures expérimentales, les actes susceptibles d’entrainer une souffrance ou une douleur seront réalisés soit sous anesthésie locale soit sous anesthésie générale pour le prélèvement sanguin intracardiaque, par des personnes expérimentées. S’agissant d’un projet nécessitant l’utilisation d’animaux vivants, l’utilisation de techniques non invasives et indolores ainsi que de tests comportementaux est privilégiée afin d’acquérir les paramètres physiologiques nécessaires au projet tout en respectant les questions d’éthiques en expérimentation animale et la règle des 3Rs. Enfin, un nombre restreint d’expérimentateurs disposant d’une formation et d’une qualification adéquate à l’expérimentation animale interviendra dans ce projet.

Choix des espèces

Beaucoup d’études sur la thématique associée au projet ont été réalisées chez la souris. La confrontation de nos résultats avec la littérature s’avèrera donc plus pertinente. En effet, la souris et notamment la lignée C57Bl/6 est un modèle couramment utilisé dans les études sur l’obésité et les organes associés. D’autre part, dans le cas présent, le modèle transgénique utilisé est également sous fond génétique C57Bl/6, ce qui permet d’éviter le passage sous un autre fond génétique et la génération d’animaux que cela engendre. Les animaux seront à l’âge adulte car tous les systèmes biologiques étudiés doivent être matures, hors phase de puberté et avant la phase de dégénérescences physiologiques liées à l’âge.

Préparer les études réglementaires à venir est la fonction déclarée de ce projet cadre, qui prévoit jusqu'à cinquante études par espèce sur cinq ans, avec trente rats ou cinquante souris par étude. 2 500 souris et 1 500 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, 1 000 d'entre eux étant réutilisés ensuite dans d'autres projets, à des fins de formation ou pour constituer des bibliothèques de tissus, les autres étant tués. Un même animal peut subir une vingtaine d'interventions par semaine, dont douze prélèvements de sang, jusqu'à seize heures en cage métabolique et autant de mise à jeun. Le porteur ne nomme aucun des tests comportementaux employés, désignés par les seuls domaines explorés, locomotion, sociabilité, communication, sensoriel, et fonde le recours au rongeur sur une exigence réglementaire, la norme ICH M3(R2).

Objectifs

Ce projet ne comporte qu’une seule procédure, au sein de laquelle seront réalisées des études exploratoires multidisciplinaires dans un modèle rongeur. Ces études peuvent servir à mettre en évidence la nécessité de travailler avec un type de rongeurs en particulier, en recherchant/vérifiant les homologies avec l'Homme (par exemple vérification de la liaison du candidat médicament à sa cible pharmacologique dans cette espèce). Ces études peuvent permettre de comprendre grâce à des investigations perfectionnées les mécanismes de toxicité (toxicité rénale, hépatique, testiculaire, etc.) ou de carcinogénicité observée dans des études précédentes, d'établir la pertinence de certains effets observés chez le rongeur en comparaison avec l’Homme (ex : effets sur le système immunitaire, recherche de biomarqueurs, effets sur le comportement), avec pour but d'assurer la santé des patients humains (composés pharmaceutiques) et/ou la sécurité des personnes exposées (produits chimiques). Elles permettent également de sélectionner un composé possédant un rapport efficacité/toxicité optimal dans une espèce rongeur. Ces études sont aussi utilisées pour choisir une voie d'administration efficace et adaptée chez le rongeur, ou pour démontrer la validité de nouvelles techniques d'investigations. Il est prévu d'utiliser en moyenne 30 rats, ou 50 souris par étude, et de réaliser jusqu'à 50 études par espèce sur la durée du projet (5 ans).

Bénéfices attendus

Ces études peuvent servir à mettre en évidence la nécessité de travailler avec un type de rongeurs en particulier. De plus ces études permettent d’obtenir des données sur la réponse immunitaire, la toxicité éventuelle du composé, et aussi de bien choisir les doses dans les premières études règlementaires. Ces études permettent d’obtenir une meilleure connaissance du composé et du modèle animal, pour une meilleure conception/design des études réglementaires à suivre, que ce soit du point de vue du choix des doses, mais aussi dans le choix des voies d’administrations, du nombre d’animaux, etc. D’un point de vue éthique, une réduction du nombre d’animaux dans les études futures est potentiellement possible, et la douleur, souffrance, angoisse ou dommages durables sera minimisée au maximum. L’utilisation de tests neurocomportementaux dans le cadre de ce projet permet une approche par des méthodes non invasives, dans le cadre des 3Rs (Raffinement).

Procédures

Les animaux sont traités par différentes voies (principalement orale mais aussi par injection intramusculaire, voies sous- cutanée ou intraveineuse, etc.) de façon journalière ou hebdomadaire avec le composé d’intérêt. La durée de l’administration est généralement rapide (quelques secondes à quelques minutes) et peut atteindre 1 heure maximum, dans le cas de perfusions intraveineuses. La durée des études varie entre 1 jour et 1 an. Des prélèvements sanguins (sur animal vigile placé dans un tube de contention ou sous anesthésie) et des recueils d’urines et /ou de feces sont également possibles pour bilan hémato-biochimique ou hormonal par exemple ; ils sont réalisés à une fréquence et aux volumes conformes aux recommandations éthiques en vigueur. Tout prélèvement dépassant ces recommandations devra être justifié et fera l'objet d'une réévaluation par le comité d'éthique (balance bénéfice/ contrainte pour l'animal). La manipulation des animaux durant les interventions est généralement inférieure à 1 heure par animal par jour (en considérant, par exemple, une journée avec 1 administration + 6 prélèvements sanguins soit environ 30 min). Jusqu’à une vingtaine d’interventions peuvent être réalisées par animal et par semaine (en considérant, par exemple, une administration quotidienne et 12 prélèvements sanguins dans la semaine). Une mise en diurèse en cage métabolique, n’excédant pas 16h est aussi possible. Une mise à jeun temporaire (en présence d’eau) peut être nécessaire (maximum 16h). Pour les tests de comportements, ils sont toujours faits après une administration unique par test, les tests sont non invasifs, avec manipulation et contraintes limitées des animaux et observation par suivi video (domaines explorés : locomotion, sociabilité, communication, sensoriel), d’une durée maximale d’une heure ; un seul test est réalisé par jour maximum et dans la limite de 3 dans la même semaine d’examen, sur une durée d’étude de 3 mois maximum. Dans tous les cas où l’hébergement individuel est requis , les animaux restent en contacts visuels, auditifs et olfactifs avec les autres animaux en hébergement individuel ou non.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables attendus correspondent : - aux effets pharmacologiques du produit administré (ex : action au niveau du système nerveux central), - à l’inconfort, au stress et/ou à la douleur transitoires liés aux procédures (prélèvements, administration répétée, contention, mise à jeun éventuelle) ; - aux effets systémiques du composé testé (ex : pertes de poids, baisse de consommation alimentaire). - à l’hébergement individuel (rare) en cas de nécessité absolue

Devenir

Si l’état de santé des animaux le nécessite, l’avis et/ou l’intervention d’un vétérinaire seront requis, mais si la souffrance d'un animal est jugée trop importante et si aucun soin ne peut lui être apporté, il sera euthanasié selon une procédure éthiquement acceptable. Chaque fois que cela sera envisageable (ex : animaux contrôles), les animaux seront réutilisés dans d’autres projets, ou à des fins de formation, ou pour réaliser des bibliothèques de tissus.

Remplacement

Les explorations dans ce projet s'appuient parfois/souvent sur des études vitro préalables, mais ne peuvent pas être menées in vitro. Il n’existe pas toujours de méthode alternative in vitro pour mettre en évidence certains effets, en raison notamment de la complexité que représente un organisme vivant. Il n'existe pas de méthodes alternatives à l'heure actuelle qui permettent de remplacer les tests neurocomportementaux prévus dans ce projet.

Réduction

Le nombre d’animaux par groupe est très variable en fonction du design de l’étude : un ou deux sexes, animaux satellites ou non pour analyses, nombre de temps intermédiaires pour des sacrifices ou analyses spécifiques, type de marqueurs mesurés (sensibilité des méthodes d’analyse), comparaison avec des composés de référence, etc En se basant sur des tests statistiques, comprenant a minima des tests de normalité, analyse de la variance et tests comparant les moyennes des groupes, le nombre d’animaux utilisés sera le minimum possible en fonction de ces considérations et des objectifs de l’étude.

Raffinement

L'état général des animaux est surveillé quotidiennement. Les paramètres suivants peuvent être contrôlés régulièrement (en fonction des signes attendus) afin d’évaluer l’état de santé des animaux : poids corporel, consommation de nourriture et/ou d’eau, température corporelle, signes cliniques, morbidité/mortalité (liste non exhaustive). Toute anomalie est signalée au Directeur d’étude et si besoin, au vétérinaire selon la sévérité et le degré d’urgence. Si un ou plusieurs points limites sont atteints (perte de poids continue, signes locaux ou généraux ne pouvant être traités/soulagés, etc.), que la douleur de l’animal ne peut être soulagée ou que l’inconfort ne peut pas être suffisamment limité à son minimum, la décision d'interrompre le traitement ou d'euthanasier l'animal sera prise. Des techniques de prélèvement sanguin (ex : via veine caudale, sublinguale, jugulaire, sous-mentonnière, mandibulaire, saphène, etc.) sont utilisées selon les bonnes pratiques vétérinaires et procédures internes validées, quand elles sont compatibles avec les volumes de sang/fréquences à obtenir. Certains traitements sont réalisés sous anesthésie pour éviter le stress, le douleur ou l’inconfort, comme les administrations intramusculaires et intra-articulaire. Les rongeurs sont hébergés en groupe (il doit être évité le plus possible tout hébergement individuel d’individus). Cependant, certaines situations expérimentales exigent l’hébergement individuel et devront être dûment argumentées (comportements antisociaux comme chez la souris mâle, voie d’administration dermale, par exemple). Pour certains produits (exemple : CNS) une période d'habituation aux doses peut être effectuée sur les animaux avant la toute première administration.

Choix des espèces

Au-delà des aspects opérationnels (manipulation), le recours à une espèce rongeur dans le développement préclinique est une exigence réglementaire (ICH M3(R2), CPM/SWP1042). C’est aussi une espèce de laboratoire très largement utilisée en recherche biomédicale (littérature et connaissance très larges) qui permet le classement de produits chimiques dans de nombreuses classifications de dangers. Le rat est souvent utilisé car il reste d'une taille suffisante pour l'observation des lésions (la souris étant petite et plus sujette à variabilité ou parfois plus sensible à certaines classes de produits) ou car il est le seul modèle validé (exemple perturbateur endocrinien). La souris est parfois préférée au rat pour raison d’homologies avec l’homme (exemple paramètres immunologiques). Le choix de l’espèce/souche est dicté par différents facteurs dont notamment : résultats déjà existants, métabolisme vitro et/ou pharmacocinétique/pharmacodynamique, ou incompatibilité avec une autre espèce animale, par exemple. Les animaux ont en général 5 à 12 semaines d’âge en début de traitement pour assurer une administration pendant la phase de croissance. Dans certains modes d'administration, (voie dermale, souris) les animaux pourront être plus âgés de quelques semaines pour répondre à des conditions expérimentales particulières (ex : pour avoir un poids plus élevé, ou un âge en adéquation avec la maturité sexuelle) ou pour des raisons scientifiques (ex : maturité du système immunitaire). Les animaux ne doivent pas être gravides. Cet âge permet, selon les modes d’administration choisis, de réaliser des analyses avant le premier jour de traitement (prises de sang, pesées corporelles, ophtalmologie, etc.) ainsi que de prévoir une période d’acclimatation suffisante après réception des animaux.

2 247 souris vont être utilisées, toutes tuées, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, les receveuses recevant à elles seules 9,5 grays d'irradiation corporelle totale en une journée, fractionnés en deux séances espacées de six heures. Les donneuses reçoivent une injection quotidienne de substance inflammatoire pendant un mois, une injection sublétale endommageant les cellules, ou 2 grays d'irradiation, avant d'être tuées pour prélever leurs cellules souches du sang. Chez les receveuses dont le greffon ne parvient pas à reconstituer le système sanguin détruit, le porteur décrit une détresse modérée cinq jours après la transplantation, et fixe des points limites qui vont de l'incapacité à se redresser à la peau ulcérée. L'espoir déclaré est de trouver comment lutter contre le vieillissement du sang, quand la destruction du système sanguin de plusieurs centaines de souris est, elle, le point de départ du protocole.

Objectifs

Les principaux objectifs de ce projet sont de comprendre les mécanismes moléculaires qui sous-tendent le vieillissement du sang (capacité réduite à se régénérer, à se différencier et à produire un répertoire complet de cellules sanguines et immunitaires matures). En impactant la fonction des cellules souches hématopoïétiques (CSH) (qui peuvent se transformer en tous les types de cellules sanguines), le vieillissement et les facteurs environnementaux tels que l'exposition à l'irradiation, la chimiothérapie ou l'inflammation chronique qui déclenchent un vieillissement prématuré, sont fortement associés à un risque accru de développer de nombreux troubles de santé liés à l'âge tels que les cancers et les maladies cardiaques, par le biais d'une baisse de l'immunité et d'une augmentation des infections et de l'inflammation.

Bénéfices attendus

Dans ce projet, nous testerons si l'activation de certains gènes sauteurs de notre génome, connus sous le nom d'éléments transposables, entraîne des changements fonctionnels dans les CSH et leur production de cellules myéloïdes avec l'âge et après un stress tel que la chimiothérapie, l'irradiation ou le stress inflammatoire, et si les éléments transposables sont impliqués dans les propriétés inflammatoires des CSH âgées, des progéniteurs myéloïdes et des cellules matures. Cela nous permettra d'identifier un mécanisme de vieillissement et pourrait donc offrir des moyens de lutter contre le vieillissement du système sanguin et les maladies du sang liées à l'âge.

Procédures

Les souris donneuses sont injectées par voie intrapéritonéale avec une substance qui induit une inflammation (6μg/souris/jour pendant un mois, et l'injection peut être réalisée en 3 secondes), injectées par voie intraveineuse avec une substance qui peut causer du stress et des dommages cellulaires (dose unique sublétale, la procédure d'immobilisation des souris et d'injection de la substance peut être réalisée en 25 minutes), irradiation corporelle totale (2Gy une fois chez les souris, la durée de l'irradiation est de 3 minutes), ou subissent un vieillissement naturel. Après chaque traitement, les souris sont euthanasiées et les CSH sont collectées, triées et examinées en vue d'une coculture puis d'une transplantation dans des souris receveuses. Les souris receveuses seront irradiées pendant 11 minutes dans un irradiateur à rayons X, où la dose de 9,5 Gy sera divisée en deux : 5 Gy le matin, et 6 heures plus tard, une autre dose de 4,5 Gy. Les souris receveuses subiront des injections intravasculaires (une par souris receveuse, l'injection de cellules dure environ 15 secondes) et des prélèvements sanguins (le prélèvement dure environ 15 secondes, 3 prélèvements sanguins par souris à 4, 8 et 12 semaines après la transplantation).

Impact sur les animaux

La piqûre de l'aiguille pour l'injection intraveineuse pendant les traitements des procédures, ou pendant les procédures de transplantation, provoque une légère douleur de courte durée. L'incapacité des greffons à restaurer le système sanguin (éliminé par l'irradiation) entraîne une détresse modérée chez l'animal 5 jours après la transplantation.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés à la fin de chaque procédure afin d'isoler et d'étudier les cellules souches sanguines (qui peuvent se transformer en tous les types de cellules sanguines).

Remplacement

Ce protocole étudie l'interaction entre différentes cellules, telles que les cellules souches sanguines (qui peuvent se développer en tous types de cellules sanguines), et les cellules de leur micro-environnement, telles que les cellules myéloïdes. Aujourd'hui, il n'existe pas de système in vitro adapté à l'étude du processus de production des cellules sanguines qui soit comparable au corps des mammifères et qui établisse un micro-environnement dans lequel les CSH peuvent rester à l'état de sommeil. Seules certaines expériences peuvent être réalisées in vitro, comme les essais de formation de colonies, et ce sont celles qui seront utilisées. Il est donc indispensable de réaliser des expériences in vivo sur des souris.

Réduction

Afin de réduire le nombre d'animaux utilisés, chaque groupe contiendra le nombre minimum nécessaire pour la quantité de matériel nécessaire à l'expérience et pour obtenir des résultats statistiquement pertinents. Nous effectuerons 3 répétitions pour vérifier si la variation est significative. Si les deux premières expériences donnent le même résultat, la troisième expérience sera annulée afin de réduire le nombre d'animaux utilisés.

Raffinement

Pendant toute la durée des expériences, les souris seront surveillées par nous-mêmes et par les zootechniciens, et les critères de finalité humaine (arrêt/euthanasie des animaux) seront appliqués si l'un des critères suivants est observé: (1) Portage/mouvement : déficience grave (immobile lors d'un réveil prolongé (>15 minutes); ne bouge pas lorsqu'on le pousse ou fait de faibles tentatives de mouvement; s'effondre et est incapable de se redresser; agitation continue (>1 minute). (2) Posture: gravement altérée. (3) Pelage: gravement altéré / perte de poils (piloérection généralisée, c'est-à-dire pelage très rêche sur la majeure partie de la surface du corps). (4) Peau: Ulcérée. (5) Poids corporel : Perte >20 %.

Choix des espèces

La souris est le système idéal pour étudier le processus de production des cellules sanguines, car le système sanguin est très bien conservé entre les souris et les humains. En outre, le vieillissement du système sanguin est bien défini et l'approximation des âges pertinents entre l'homme et la souris est connue. Les animaux utilisés pour les expériences seront âgés de 2 à 4 mois, mâles et femelles. Chez ces jeunes souris, le pool de CSH est faible, mais la capacité à reconstituer le système sanguin est élevée.

Une dizaine de séances d'imagerie sous anesthésie et une injection quotidienne dans le péritoine ou par gavage attendent chaque animal, sur quarante jours de traitement. 3 264 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour prélever la tumeur, le foie, la rate et les poumons. Elles reçoivent des cellules tumorales sous la peau puis dans le sang pour former des métastases pulmonaires, le porteur listant parmi les effets attendus l'irritation et l'infection des points d'injection, l'absence de toilettage, et pour le gavage la suffocation, le saignement et une salivation excessive. L'effectif s'appuie sur des groupes de douze animaux, sans que le RNT indique combien de groupes ni combien de molécules aboutissent à 3 264 souris.

Objectifs

L'objectif de ce projet est d'évaluer l'efficacité de traitements anticancéreux sur différents cancers solides et l'apparition des méstatases (mélanome, cancers gastriques, pancréas et côlon) en utilisant des petites molécules dérivées d'antidiabétiques, seules ou en combinaison avec les thérapies actuelles qui stimule le système immunitaire. Nous allons étudier la potentialité de ces molécules à induire une mort immunogénique (=les cellules cancéreuses sécrétent des facteurs qui permettent l'activation du système immunitaire qui va les éliminer). Ceci permettra de proposer de nouvelles solutions aux patients en échec thérapeutique.

Bénéfices attendus

Ces dernières années des résultats encourageants ont été obtenus un inhibiteur d'une protéine majoritairement altérée dans les mélanomes. Cependant, ces réponses restent transitoires. De nouvelles thérapies, qui réactivent la réponse immunitaire chez les patients, ont aussi été développées. Mais, seul 10 à 30% des patients répondent positivement. Il est donc important de développer de nouvelles molécules pour la mise en place de thérapies ciblées et de combiner ces nouvelles molécules avec les thérapies qui stimulent le système immunitaire, déjà utilisées chez les patients afin de voir si nos dérivés sont capables de potentialiser leurs effets. Grâce à cette étude, nous allons voir les effets de nos composés d’une part sur les tumeurs primitives (mélanome, cancer du pancréas, côlon et gastrique) et d’autre part sur les métastases pulmonaires. Et la mise en place d’une immunité anti tumorale permettra de proposer un nouveau moyen d’éliminer les cellules cancéreuses.

Procédures

Les animaux subiront : - 1 injection sous cutanée de cellules tumorales (5 secondes) - 1 injection/ jour dans le péritoine avec nos molécules ou 1 traitement oral/ jour avec nos molécules (5 secondes) pendant la durée du traitement. - 1 injection en intra veineuse de cellules tumorales (10 secondes) - 1 injection/ jour dans le péritoine avec nos molécules ou 1 traitement oral/ jour avec nos molécules (5 secondes) pendant la durée du traitement L’imagerie des animaux se fera le jour de l’injection des cellules, le lendemain puis tous les 4 jours pendant la durée du traitement. Les souris seront endormies (par inhalation) pendant environ 15 min et subiront une injection dans le péritoine (5 secondes) pour chaque imagerie. Les animaux subiront environ 10 imageries (pour un traitement de 40 jours) - 2 injections en sous cutané des cellules tumorales (5 secondes/ injection) 7 ou 8 injections dans le péritoine (5 secondes/ injection) Aucun prélèvement ne sera effectué sur les souris vigiles.

Impact sur les animaux

Lors des injections des cellules tumorales en sous-cutané, il peut y avoir un risque d’irritation et de gonflement aux zones d’injection. Pour les traitements en injection dans le péritoine, il peut y avoir un risque d’irritation, gonflement, infection aux zones d’injection et absence de toilettage. Pour les traitements oraux, les risques sont la suffocation, saignement et salivation excessive. Pour l’étude des métastases, lors de l’injection intra-veineuse, il peut y avoir gonflement, irritation et infection à la zone d’injection, et absence de toilettage. Lors de l’anesthésie gazeuse pour imager les souris, il peut y avoir hypothermie et prostration au réveil.

Devenir

A la fin de chaque expérimentation, les animaux seront mis à mort. Nous prélèverons la tumeur et les organes (foie, rate, poumons) afin de réaliser les études qui nous apporterons le plus de renseignements possibles sur le fonctionnement de nos nouvelles molécules thérapeutiques.

Remplacement

Nous avons tout d’abord caractérisé et testé nos composés in vitro et sélectionné les plus efficaces sur les cellules tumorales et l’innocuité sur les cellules normales. Il est maintenant nécessaire de passer chez le rongeur afin d’avoir une approche plus physiologique. Nous pourrons ainsi déterminer lesquels de ces traitements sont les plus efficaces avec les modèles cancéreux utilisés (mélanome, cancer du côlon, gastrique et pancréas) sur les tumeurs primaires, les métastases et la mise en place d’une immunité antitumorale. Le passage chez l’animal est crucial avant le développement potentiel de ces molécules chez l’homme, ce qui permettrait une alternative à l’échec thérapeutique des traitements actuels.

Réduction

Avant le début de l’étude, il est important de faire des statistiques prédictives. Il s’agit de trouver le nombre d’animaux minimum à utiliser pour avoir des résultats significatifs. Pour notre étude, des groupes de 12 animaux seront adaptés à ces exigences.

Raffinement

Les souris seront maintenues dans un milieu enrichi (igloo, tigettes qui permettent aux souris de réaliser un nid). Elles seront hébergées en portoirs ventilés à raison de 5 souris par cage. Le suivi quotidien qui est réalisé permet de prévenir toute souffrance ou mal être. L’intervention se fait immédiatement. De plus, lors ce suivi, nous mesurons les tumeurs ainsi que le poids des souris, 3 fois / semaine. Pour la procédure qui nécessite une anesthésie gazeuse : les animaux seront mis sur un tapis chauffant le temps de leur réveil, afin d’éviter l’hypothermie.

Choix des espèces

La souris est un mammifère ayant des similitudes génétiques avec l'homme. Elle a un cycle de vie court, un cycle de reproduction bien établi, ainsi qu'une faible taille, ce qui permet d'avoir des conditions d'hébergement plus faciles. Par ailleurs la souris est un modèle reconnu et déjà validé pour l'étude du développement tumoral et de la mise en place d'une immunité antitumorale. Dans notre étude, les souris sont utilisées à 6 semaines. Elles sont commandées à 5 semaines et acclimatées pendant 1 semaine dans notre animalerie. La croissance tumorale est optimale chez les souris de cet âge et ceci est cohérent avec les expériences déjà effectuées au laboratoire ainsi qu’avec les données de la littérature.

424 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, tous tués pour l'analyse de leurs tissus. Sevrés à un mois, ils reçoivent jusqu'à deux injections sous la rétine sous anesthésie générale, subissent jusqu'à six examens du fond d'œil et trois électrorétinogrammes, et jusqu'à quatre prélèvements de sang à la jugulaire portant chacun sur 10 à 15 % de leur volume sanguin. Le projet teste des outils de thérapie génique contre la maladie de Stargardt et sert aussi, selon les finalités déclarées, à la formation professionnelle. Le porteur justifie le choix du rat par la taille de l'œil, cinq fois plus gros que celui de la souris, qui facilite l'injection et permet, écrit-il, de récolter suffisamment de matériel après la mort de l'animal.

Objectifs

La maladie de Stargardt est une maladie génétique rare qui touche les yeux, et plus particulièrement la rétine, une partie essentielle pour voir. Elle affecte surtout une zone appelée la macula, qui nous permet de voir les détails et de bien voir en plein jour. Environ 1 personne sur 8 000 à 10 000 est concernée par cette maladie. Dans la rétine, il y a des cellules qui réagissent à la lumière, appelées photorécepteurs, qui utilisent de la vitamine A. Mais quand ces cellules captent de la lumière, elles produisent des déchets toxiques. Normalement, une protéine, la ABCA4, aide à se débarrasser de ces déchets. Cependant, quand il y a un problème dans le gène ABCA4, les déchets s'accumulent et détruisent ces cellules, ainsi que d'autres cellules importantes dans l’œil. Pour l’instant, il n’y a pas de traitement pour cette maladie. Des chercheurs essaient d’utiliser une technique appelée thérapie génique pour corriger le gène ABCA4. Ils envisagent d’utiliser CRISPR/Cas9, un outil pour modifier les gènes. Le problème, c’est que le gène ABCA4 est trop grand pour être inséré facilement dans les cellules avec les méthodes actuelles, comme avec des vecteurs viraux (des virus modifiés qui servent de transporteurs). Les scientifiques cherchent donc à améliorer ces vecteurs et à essayer d’autres solutions, comme utiliser des mini-versions du gène ou des "nanoblades", sortes de petites "lames" moléculaires, avec des lentivirus (autres types de transporteurs). Les nanoblades ont déjà été testées dans d’autres parties du corps, mais pas encore dans l’œil. Enfin, un autre souci avec les vecteurs viraux est qu’ils peuvent déclencher une réaction du système immunitaire ou que leur effet ne dure pas assez longtemps. Les chercheurs doivent donc bien évaluer ces nouvelles approches pour trouver la meilleure solution pour traiter la maladie de Stargardt.

Bénéfices attendus

En thérapie génique, plusieurs facteurs peuvent provoquer une réaction du système immunitaire, comme la quantité de vecteur utilisé, le type de gène ajouté, ou la façon dont le traitement est administré. Pour la maladie de Stargardt, le gène ABCA4 est très grand, ce qui complique son insertion dans les vecteurs viraux habituels, comme les AAV (Virus Adéno-Associés). Cette étude vise à trouver la meilleure manière de corriger le gène ABCA4 et s’assurer qu’il n’y a pas de réponse immunitaire après l'insertion du gène dans l’œil. La technique CRISPR/Cas9 (outil moléculaire qui permet de couper des parties ciblées de l'ADN), déjà testée pour une autre maladie des yeux, offre de l’espoir pour traiter la perte de vision due à la maladie de Stargardt. L’utilisation d’un minigène permettrait de réparer plusieurs parties du gène ABCA4 en même temps, ce qui pourrait aider de nombreux patients avec des mutations différentes. En combinant les lentivirus et les nanoblades, les chercheurs espèrent améliorer l’efficacité du traitement, cibler précisément les cellules touchées, réduire la quantité de vecteur viral nécessaire et rendre l’intégration du gène plus sûre dans les cellules. Si cette approche fonctionne, elle pourrait non seulement soigner la maladie de Stargardt, mais aussi d’autres maladies liées à des gènes similaires

Procédures

(i) Injection sous-rétinienne (ISR) : Geste réalisé sous anesthésie générale avec anesthésie locale, durée de la chirurgie 30 minutes maximum. Pour l’évaluation de certaines stratégies, jusqu’à deux ISR seront réalisées, espacées de 3 semaines. (ii) Imagerie rétinienne (FO-OCT : Fond d’œil – Tomographie en Cohérence Optique) : Geste réalisé sous anesthésie générale avec anesthésie locale, durée de l’examen 30 minutes maximum. Si les animaux sont gardés 3 mois (temps maximum post injection), ils auront au maximum 6 FO-OCT. (iii) Imagerie rétinienne (ERG : Electro-Rétinogramme) : Geste réalisé sous anesthésie générale avec anesthésie locale, durée de l’examen 30 minutes maximum. Si les animaux sont gardés 3 mois (temps maximum post injection), ils auront au maximum 3 ERG. (iv) Prélèvements sanguins : Geste réalisé sous anesthésie générale, un volume sanguin correspondant à 10-15% maximum du volume sanguin circulant de l'animal sera prélevé au niveau de la veine jugulaire après anesthésie gazeuse de l'animal. Durée de l’anesthésie 10 minutes maximum. Si les animaux sont gardés 3 mois (temps maximum post injection), ils auront au maximum 4 prélèvements sanguins qui seront espacés d’au moins 2 semaines. Toutes les anesthésies seront espacées d’au moins une semaine pour laisser un temps de récupération à l’animal.

Impact sur les animaux

A ce jour, l’administration sous rétinienne de vecteurs chez le rat n’a pas d’effet délétère notable sur la morphologie et la fonction rétinienne ni sur l’état de santé général de l’animal. Nous nous attendons donc à une douleur minime liée à l’injection. Le modèle rat est un modèle qui tolère bien des injections de fortes doses de vecteur en sous rétinien. Cette douleur ne devrait pas dépasser les 12 heures post chirurgical. Les anesthésies répétées peuvent stresser les animaux mais celles-ci seront espacées d’au moins une semaine et les animaux seront surveillés au moins une heure après leur réveil par l’expérimentateur, la récupération devrait être rapide car les animaux seront soit sous anesthésie gazeuse ou recevront un réversif (en cas d’anesthésie fixe) pour accélérer le réveil et la récupération de l’animal.

Devenir

L'euthanasie des animaux est nécessaire pour obtenir les échantillons de tissus sur lesquels s'appuieront les analyses moléculaires, biochimiques, immunologiques et histologiques réalisées.

Remplacement

Des premiers tests ont été réalisés sur des cellules en laboratoire pour évaluer l'efficacité de différents systèmes de thérapie génique. Cependant, ces modèles en laboratoire ne peuvent pas reproduire toute la complexité des interactions biologiques présentes dans un organisme vivant. Cela rend difficile la reproduction de ces résultats dans un corps vivant. En laboratoire, il est aussi impossible de vérifier la répartition du traitement dans le corps ou son efficacité thérapeutique complète. La rétine de l'œil, qui est une structure complexe faite de plusieurs couches de neurones et de cellules nourricières, ne peut pas être recréée parfaitement en laboratoire. Même avec des méthodes utilisant des cellules souches, il est difficile de tester les interactions complexes du cycle visuel. C'est pourquoi l'utilisation de modèles animaux est essentielle pour étudier comment les gènes se comportent dans la rétine avant de commencer les essais cliniques sur l'homme. Les rats sont préférés aux souris pour ces études car leurs yeux sont cinq fois plus gros, ce qui facilite l'injection et assure une meilleure répartition du traitement. De plus, la taille de leurs yeux permet de récolter suffisamment de matériel pour les analyses après leur mort.

Réduction

Nous utiliserons le nombre minimum d'animaux nécessaire pour nos expériences. Ce nombre est basé sur des tests similaires que nous avons déjà effectués. En examinant les études publiées et notre propre expérience en laboratoire, nous avons déterminé que 8 animaux par groupe sont suffisants pour obtenir des résultats fiables. Après l’expérience, nous nous attendons à obtenir des variables (liées à nos données) ordinales. Nous ne pouvons pas raisonnablement supposer que les données seront normalement distribuées, par conséquent, nous pensons essentiellement utiliser des tests statistiques pour analyser les données générées par l’expérience.

Raffinement

Toutes les interventions sur les animaux seront réalisées sous anesthésie générale et locale pour minimiser la douleur. Si nécessaire, des analgésiques et anti-inflammatoires seront ajoutés. Les animaux seront surveillés chaque jour et le vétérinaire sera informé dès que des signes de détresse apparaîtront pour adapter les soins. Pour leur bien-être, les animaux seront hébergés par paire dans des cages enrichies avec du papier froissé, des bûchettes de bois et des tunnels. Si un animal doit être hébergé seul, nous augmenterons les éléments d'enrichissement pour lui. Ils auront toujours accès à la nourriture et à l'eau en permanence. Nous appliquerons des critères d'arrêt stricts pour intervenir rapidement en cas de souffrance, en fournissant des traitements pour la douleur ou en prenant la décision d'une euthanasie si nécessaire.

Choix des espèces

Nous utilisons des rats Long Evans, qui ne sont pas albinos, car leur vision est moins affectée par l'âge, ce qui est important pour analyser l'effet des traitements sur la structure de la rétine. Pour tester l'efficacité, nous utilisons des rats génétiquement modifiés pour avoir la maladie de Stargardt. Ces rats, provenant de la lignée Sprague Dawley, ont été créés avec la technologie CRISPR/Cas9, qui nous a permis de produire des rats n’exprimant plus le gène ABCA4 (ABCA-/-). Nous avons confirmé que ce modèle présente les caractéristiques attendues de la maladie, avec des problèmes métaboliques dans la rétine similaire à ceux observés chez les patients. Les rats seront des jeunes sevrés (à l’âge d’un mois) pour que leur manipulation soit plus aisée et que l’injection soit plus simple. Plus l’âge augmente plus la taille de l’œil est importante et plus le maintien de l’œil pour l’injection est complexe. Si l’injection est simplifiée, elle prendra moins de temps, l’anesthésie sera de plus courte durée et les résultats seront plus reproductibles.